EP0458831A1 - Malignitätstest (krebs-test) mit verwendung von der polymerasekettenreaktion - Google Patents

Malignitätstest (krebs-test) mit verwendung von der polymerasekettenreaktion

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EP0458831A1
EP0458831A1 EP90903145A EP90903145A EP0458831A1 EP 0458831 A1 EP0458831 A1 EP 0458831A1 EP 90903145 A EP90903145 A EP 90903145A EP 90903145 A EP90903145 A EP 90903145A EP 0458831 A1 EP0458831 A1 EP 0458831A1
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EP
European Patent Office
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vitro
product
sequence
pcr
dna
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Withdrawn
Application number
EP90903145A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Viktor Dr.Dr.Med. Balazs
Margit Dr.rer.nat. BALAZS-FRÖHLICH
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BALAZS, VIKTOR, DR. DR. MED.
Original Assignee
Individual
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • Malignancy test (cancer test) using the polymerase ette ⁇ reaction.
  • the invention relates to a method for the detection of the specific mRNA sequence (target sequence) of substances of cancer cell origin from an acellular biological fluid according to the preamble of claim 1.
  • This phenomenon is actually the functional mimicry at the molecular biological and cellular level of the main features of the malicious process itself: promotion of one's own existence at the expense of the host.
  • a large spectrum of normal and malignant cells is able to take up mRNA from its environment if it is presented protected by lipid, lipoprotein or other substances.
  • the mRNA then exerts its messenger activity in the recipient cells.
  • the translation product of the mRNA taken up is produced by these cells until the replenishment from the environment reaches from the circulation.
  • the recipient cell has acquired a new phenotypic quality, a new ability to produce, which it either does not have or cannot express genetically.
  • Phenotype lending is one of the most important mechanisms by which the malignant cells achieve their main goals:
  • the influencing messages essentially go in two directions:
  • the enzyme profile of the otherwise normal liver of malignant carriers is more similar to the malignant cells than in normal humans.
  • transcripts or their fragments of cellular oncogenes which are activated by over-transcription in malignant diseases, from the blood plasma of malignancy carriers by i vitro hybridization can be detected.
  • Phenotype borrowing from these transcripts can cause phenomena similar to AI. and Bl. cause in malignant diseases, or transfer production capabilities of growth factors, enzymes or other substances in host cells which are removed from the tumor. The environment of these host cells could become attractive for the incoming metastatic cancer cells and then feed them with growth factors and other substances.
  • the inhibition of phenotypes by mRNA of malignant origin simultaneously prevents its own functions in the recipient cells of the host, which can lead to a reduction in the local and systematic defense mechanisms of the host.
  • Small fragments of transcripts from cancer cell origin also have inhibitory activity.
  • RNA transfer process is a very complicated, arduous method and is not sensitive enough to give positive results even in the early stages of malignancy.
  • the detection of the mRNA or its specific fragments of the substances of cancer cell origin in the bloodstream of malignancy carriers in accordance with the method of the invention can serve as a sensitive and well practicable test method which already provides important information about the malignant diseases in the early stages fundamental fundamental molecular-genetic changes in the malignant cells, their activities, the possible interaction can deliver between tumor and host by mRNA at a time when the cancer cell mass cannot be visualized with the usual method and cannot be reached for a histological examination.
  • the circulating mRNA transcripts or their specific fragments can be detected using very sensitive and specific methods.
  • One such technical possibility is in vitro hybridization and the other is the in vitro enzymatic multiplication of the specific target sequence of the respective mRNA by polymerase chain reaction, PCR (polymerase chain reaction).
  • the polymerase chain reaction which has been known since 1985 (Science 230: 1350-1356), is a reliable, relatively simple method for obtaining the desired sequence of low-concentration DNA from tissue, cells and even from a single hair in vitro synthesize and amplify.
  • the amplified product is then easily identifiable by a spectrum of different methods including in vitro hybridization with corresponding, labeled DNA or oligonucleotide samples.
  • PCR has been used to spots or traces of the cellular body fluids (blood, semen) or Kör ⁇ perzellen detect and identify.
  • the mRNA sequences can also be amplified by PCR in vitro if the corresponding complementary DNA (cDNA) is first synthesized by reverse transcription and this is amplified by PCR.
  • cDNA complementary DNA
  • This RNA amplification has so far only been used for cells and cellular body fluids such as blood, especially to identify RNA viruses in the blood cells.
  • two oligonucleotide primers are used which are complementary to the sequences which flank the desired specific sequence, a primer for the 3'-strand, a primer for the 5'-strand, they "designate" the sequence that synthesize and amplify the DNA polymerase enzyme.
  • the target-specific sequence can be amplified by PCR to such an extent that the direct detection of the product is possible.
  • the PCR products can be visualized by their labeling and do not have to be detected by in vitro hybridization.
  • the PCR has so many plans Share, such as high specificity, very high sensitivity, which is in the same or an order of magnitude higher than in vitro hybridization and it is easier, faster and automatable. Therefore PCR is particularly suitable for the detection of the mRNA sequence of the substances of cancer cell origin from an acellular biological fluid such as blood plasma and can serve as a sensitive malignancy test for diagnosis, early detection and monitoring of malignant diseases.
  • the sensitivity of the mRNA detection method according to the invention is significantly greater (lies in the region of 10 " 18 g) than the detection methods of the translation products, ie the substances themselves (lies in the region of pg).
  • Antibodies to the translation product either produced by the host or introduced (submitted) for therapy purposes, do not affect the test results in the mRNa transcript detection.
  • RNA transcripts or their specific fragments are omitted or excreted in detectable amounts and in a form protected from degrading enzymes only by malignant cells. That is why their detection (in the bloodstream) from the blood plasma is diagnostic, on the contrary with their translation product, which can also be produced by normal cells (such as: oncogene products; some tumor markers).
  • the half-life of the mRNA transcripts is considerably shorter (60 min for onc-fos, onc-myc; 7 hours for CEA) than their translation products (several days for oncogene products, more than one week for CEA).
  • the tumor cells present in the bloodstream cannot leave the circulation and thus cannot metastatize. This is particularly important during and after surgery as a large number of cancer cells can enter the bloodstream.
  • the lower (20 - 25%) success rate of the various forms of immunotherapy can be explained, at least in part, by the phenotype loan, because the host cells cannot participate sufficiently because of this, or the cells which have been proliferated and activated in vitro shortly after their Administration in the malignant carrier host inhibited in its function, ineffective can be.
  • the sensitivity of the malignancy test is increased by at least 4 to 5 orders of magnitude in comparison to the hybridization alone or PCR alone.
  • the activation of two or more cellular oncogenes by increased transcription or by mutation is generally considered to be a very important step in the emergence, maintenance and progression of the malignant transformation. This increase in transcription can be multiple or even 100 times that. reach normal values. Because of the peculiarities of malignant cells and the malignant tumors, the activated oncogene transcripts or their fragments can enter the bloodstream and be protected or partially protected there without further significant degradation, and they can pass through from the blood plasma of patients with an active malignant process a sensitive method such as in vitro hybridization can be detected. This method can be used as a malignancy test are and is suitable as a screening test or progress control test (monitoring) in order to detect relatively small amounts of malignant cell mass which cannot be recognized with the usual diagnostic methods in clinical practice.
  • the oncogene-specific mRNA sequences also detect such oncogenes in the blood plasma which are present there in an even lower concentration than others, such as, for example, the transcripts or transcript fragments of the oncogenes which are activated by point mutation and not by increased transcription and therefore their concentration is lower in the malignant cells and subsequently also in the blood plasma compared to oncogenes which have been activated by increased transcription and even in vivo amplification.
  • the plasma-oncogene profile oncogenes whose mRNA sequence is present in the blood plasma
  • can better reflect the cancer cell-oncogene profile oncogenes that are activated in the malignant cells).
  • the goal of cancer research and clinical oncology is the molecular kular-genetically causal, rational, meaningful therapy.
  • knowledge and especially early knowledge of which oncogenes are actually activated in the malignant cells are very important.
  • These oncogenes can serve as a good target of a molecular-genetically meaningful therapy, and can be attacked at several levels, namely (a) at the gene level: by preventing transcription; (b) at the transcript level: by preventing translation of the activated oncogenes; (c) or at the oncogene product level: by preventing the function of the OKP.
  • very stimulating results with cancer cell cultures are known in vitro.
  • An oligonucleotide with a specific sequence for the initiation of protein synthesis is preferably taken up by the cancer cells in larger amounts than by normal cells and inhibits the translation of the targeted oncogene RNA transcripts, with the result that the cancer cells lose their properties and are no longer malignant multiples ⁇ adorn. This possibility is a good candidate to develop a causal therapy in practice.
  • the anti-cancer cell antibodies are bound with chemotherapeutic, toxic or radioactive substances, therapeutic effects can be achieved in animals and patients, but the success rate is generally not very high.
  • chemotherapeutic, toxic or radioactive substances therapeutic effects can be achieved in animals and patients, but the success rate is generally not very high.
  • Several factors are responsible for this, one of which is the difference in the expression of the targeted antigen on the different cancer cells of the same tumors because of their diversification.
  • Better results can be achieved by targeting several antigens on the cell surface at the same time immunologically attacks.
  • the oncogene products of the activated oncogenes would be particularly suitable, in particular those which have their oncogene product in the cell membrane and those which do not occur in normal cells at all, such as the oncogene products altered by point mutation or some tumor markers.
  • Another advantage is that the oncogene transcripts or their sequences can be detected as early as is not possible with the most sensitive immune method.
  • the immunological detection of products of the oncogenes as a malignancy test is not suitable because the normal and the pathological values (in malignancies) overlap, and some abnormal but non-aligning states produce higher values than the malignancies, apart from that much lower sensitivity of the immunological methods compared to the present invention.
  • Another particular advantage is that changes in the activation of the oncogenes during the follow-up can be more reliably and earlier reflected by the plasma oncogene profile than in previous methods.
  • oncogene changes associated with a deterioration in the prognosis due to diversification of the cancer cells, or with an amplification of one of the activated oncogenes can be detected at an early stage and the appropriate therapy can be initiated in good time.
  • the disappearance of an existing oncogene transcript or the appearance of a new oncogene transcript not yet present in the blood plasma or its sequence is also a sign of the deterioration in progressiveness.
  • the possibility of therapy with mRNA requires careful monitoring of the mRNA used or its specific sequence in the bloodstream.
  • the method of the invention is very suitable for these purposes because of its very high sensitivity and reliable specificity.
  • the invention has for its object to detect specific mRNA sequences of the substances of cancer cell origin from an acellular biological fluid, even if they or their fragments are present in a very low concentration and degraded to a certain extent, but have the specific sequence and for in vitro Amplifizie ⁇ tion are suitable, and this process so as Malignticianstest, be ⁇ to use Sonder as a very sensitive screening test.
  • RNA or its fragments are prevented by using an effective and reliable RNase inhibitor, which does not cause RNA to emerge from the cells, even when the cellular biological fluid is being sampled. Since the chosen RNase inhibitor does not cause RNA to escape from the cells before and during their removal, it is important because this sensitive method can detect even small contamination.
  • the PCR products can be radioactive or non-radioactive already during the PCR by incorporating marked components or primers be marked and visualized in this way.
  • the unlabelled PCR products can be identified by direct detection after ethidium bromide staining, or by their size, or according to their sequence either by sequence analysis or especially with in vitro hybridization.
  • the method is suitable as a malignancy test, especially for early detection.
  • the cellular biological fluid (such as blood, exudates, etc.) is mixed with a reliable RNase inhibitor which does not cause RNA cell leakage when the sample is taken and the cells are removed.
  • the total RNA is mixed with an aqueous medium under the constant action of the RNase inhibitor and in the presence of a detergent and a proteolytic enzyme such as Proteinase K and at 37 degrees C for 5 to 8 h in one Incubated buffer solution.
  • yeast tRNA is added as a carrier (50 ⁇ g / ml) and extracted with phenol and chloroform at 60 ° C and precipitated with alcohol at -20 ° C.
  • the extract can be further purified quickly using ion exchange column chromatography.
  • the blood plasma RNA is mixed with a buffer solution, which is composed according to the optimal mode of action of the selected reverse transcriptase (Tris.Cl. ph 8.3, KC1, MgCl 2 ). It also contains RNasin, reverse transcriptase enzyme, each of the four deoxyribonucleoside triphosphates, the 3'primer all in sufficient concentration. The total reaction mixture is then incubated for a total of 20 microliters at 37 degrees C for 30 minutes.
  • a buffer solution which is composed according to the optimal mode of action of the selected reverse transcriptase (Tris.Cl. ph 8.3, KC1, MgCl 2 ). It also contains RNasin, reverse transcriptase enzyme, each of the four deoxyribonucleoside triphosphates, the 3'primer all in sufficient concentration.
  • the total reaction mixture is then incubated for a total of 20 microliters at 37 degrees C for 30 minutes.
  • the reaction mixture is then mixed with 80 microliters of PCR buffer and 100 micrograms of bovine serum albumin, with the 3 'primer and the 5' primer and the thermostable Taq DNA poly erase enzyme, each in a suitable concentration.
  • the reaction mixture is then covered with mineral oil to prevent evaporation.
  • the primers are extended at 72 degrees C for 1 min. The cycle is started again by heating and repeated 40 to 50 times.
  • reaction mixture is left at 72 degrees C for 10 minutes and then cooled in ice.
  • the multiplication during PCR is detected by ethidium bromide staining in comparison to the negative control.
  • the size of the product or products can be identified by electrophoresis in gel or by chromatography or according to their sequence.
  • the products can be labeled with radioisotope, biotin, enzymes, fluorescent dyes or other substances during the amplification by labeled components or primers and then recognized according to the labeling.
  • each reaction mixture is applied to nylon or nitrocellulose filters and immobilized by baking at 80 degrees C for 60 ml, prehybridized at 60 degrees C in a suitable buffer and then in the presence of 2 x 10 6 cqm of end-labeled oncogene specific oligonucleotide samples per ml hybridized for 5 to 7 h at 60 degrees C. Washing is carried out at 60 degrees C in 0.75 M NaCl / 0.075 Na citrate, 0.% SDS. The result of the hybridization is visualized by autoradiography.
  • the products of the simultaneous pooled PCR can be identified at the same time.
  • the unlabeled corresponding samples are immobilized on a solid support, such as a nylon filter, and brought into contact with the (bio tin) labeled PCR products in order to hybridize with one another.
  • the results are visualized by a color reaction due to enzyme affinity.
  • a series of purified molecular-cloned DNA containing the sequence as the code of the oncogenes is labeled either radioisotopically or non-radioisotopically (J. Mol Biol. 113: 237-251 1977).
  • the non-radioisotopic labeling can be done with biotin.
  • end labeling is used to achieve high specific activity.
  • DNA samples and oncogene-specific oligonucleotide samples labeled or unlabeled are commercially available (ONCOR, Inc. Gaithersburgh, Ma. 20877, USA; ONCOGENE SCIENCE Inc. Mineola, NY 11501, USA; Amersham, Little Chalfont, England).
  • a biotin labeling and visualization kit is commercially available (Amersham, Little Chalfont, England ONCOR, Gaithersburgh, USA). Oligonucleotides with the desired sequences can be ordered and obtained from the Custom Service in Europe and the USA.
  • stages a to c The risk of admixing the ubiquitous, highly resistant RNase enzyme from exogenous sources is particularly evident in all stages of the RNA phase of the process (stages a to c) through the use of baked glassware, autoclaved solutions, baked spatulas, tools, dry chemical preparations, distilled from glass, reduced with autoclave-sterilized water, and wearing gloves.
  • yeast tRNA 50 ⁇ g / ml
  • an equal volume of phenol and chloroform-isoamyl alcohol 24: 1
  • the interphase is additionally extracted once as above and the combined aqueous phases are treated once with chloroform-isoamyl alcohol as above but at room temperature.
  • the nucleic acid is precipitated by alcohol in the presence of Na acetate (0.3 M, pH 5.2) at -20 degrees C and centrifuged. The sediment is dissolved and subjected to RNase-free DNase enzyme treatment.
  • RNase-free DNase enzyme and MgCl 2 are mixed to the plasma RNA solution (50 mM Tris.Cl, pH 7.5 in 1 mM EDTA) and in the presence of RNase inhibitors at 37 degrees C. incubated for 30 min, then phenol-chloroform is extracted and in the presence of Na acetate (pH 5.2, 0.3 M) the RNA is precipitated with 70% ethanol at -20 ° C.
  • RNA fraction which preferably has poly (A) + RNA.
  • the RNA-liproprotein fraction can be separated from the serum of malignancy carriers by flotation in a KBr density gradient (discontinuous: 1,006-1,221 g / ml) after 16 hours of flotation in an ultracentrifuge at 105,000 xg; it is separated as an opal band visible between the HDL and LDL fractions.
  • the eluate can be used directly for in vitro hygridization or for PCR amplification, or after alcohol precipitation and DNase treatment.
  • the sediment is then in a buffer solution which corresponds to the optimal effectiveness of the reverse transcriptase enzyme used (and the regulations of the respective manufacturer) (Bethesda Research Laboratories; promega Biotec, USA) (50 mM Tris.Cl, pH 8.3, 6mM MgCl 2 , 40 mM KC1, 1 nM dithiorheitol, 1 U RNasin).
  • the solution is supplemented with 100 mM of each deoxyribonucleoside triphosphate and 1000 U reverse transcriptase, 10 pM of the respective 3'PCR primer.
  • PCR buffer 50 mM Tris.Cl, 50 mM KCl, 2.5 mM MgCl 2 , 100 micrograms bovine serum albumin / ml, pH 8,440 pM 3'primer, 50 pM 5'primer and 1 U thermostabi
  • PCR buffer 50 mM Tris.Cl, 50 mM KCl, 2.5 mM MgCl 2 , 100 micrograms bovine serum albumin / ml, pH 8,440 pM 3'primer, 50 pM 5'primer and 1 U thermostabi
  • ⁇ Tag DNA polymerase (Perkin-Elmer-Cetus, USA; New England Biolab, (USA)) is mixed in.
  • Mineral oil is layered over the reaction mixture to prevent evaporation.
  • the RNa-cDNA complex is dissociated by heating to 95 degrees C for 20 seconds and the primers are anealed at 55 degrees C for 15 seconds, the extension of the primers takes place at 72 degrees C for 1 min. The cycle is started again by heating and repeated 40 to 50 times.
  • Thermal Cycler instrument Perkin-Elmer-Cetus, USA significantly facilitates the reliable and fast execution of the PCR.
  • Primer pairs to synthesize PCR products of different sizes An example:
  • Labeling of the PCR product is carried out during the amplification by incorporating either labeled deoxyribonucleoside triphosphate or labeled primers.
  • the label can be radioactive or non-radioactive such as: biotin, enzymes, dyes and other substances. Fluorescent dyes have found an advantageous use as a label for primers: these dyes, a different color for each amplifying sequence, who conjugate to the oligonucleotide primers (Applied Biosystem, Foster City, Ca, USA).
  • Labeled PCR products are identified by their labeling. In this case, the unincorporated marked elements must be removed (as above).
  • Radioactive-labeled PCR products are determined by measuring the radioactivity compared to the negative control, or visualized by agarose gel electrophoresis without prior treatment by autoradiography and even identified by the size of the product.
  • Biotin-labeled PCR products are recognized after the elimination of the unincorporated, labeled elements due to a color reaction due to enzyme affinity. Visualization kits are commercially available (ONCOR, Gaithersburgh, MD 20884 U.S.A.; Amersham, Little Chalfont, England).
  • PCR products labeled with fluorescent dyes are identified by their color using a fluorometer (Perkin-Elmer LS-5).
  • Electrophoresis in agarose or acrylic amide gel according to the size of the products. Visualization either by EB fluorescence or according to the marking. The size of the products is determined by comparison with markers of a known size running in parallel.
  • Ion exchange chromatography High resolution separation: The reaction mixture after amplification is placed on a Mono Q HR 5/5 column (Parmacia Uppsala, Sweden) and passed through the specified gradient of buffer solutions A and B at a flow rate of 0. 15 ml / min eluted. Buffer solution A: 20 mM Tris.Cl. pH 8.3, 0.4% M NaCl; Buffer solution B: A + 1.0 M NaCl. Gradient: 40 to 60% B in 2 h and 60 to 80% B in 6 h. Simultaneously multi-target sequence PCR (pooled PCR).
  • EB fluorescence is used to determine whether amplification has taken place or not, but which sequence (s) has been amplified must be determined with special additional measures.
  • identification is achieved by the product size.
  • the size of the different PCR products is programmed beforehand by selecting and inserting the corresponding primer pairs so that the product of each amplifying target sequence is synthesized and amplified in an individual, characteristic, different size during the PR (see example) . It is thus achieved that the PCR products are identified by their size with gel electrophoresis or by ion exchange chromatography
  • the third possibility for the differentiation of simultaneously amplified products is the identification by their sequence.
  • Sequence analysis is particularly suitable for checking the authenticity of enzyme activity.
  • scanning-tuning microscopy can be used to identify the PCR products. It is currently possible to differentiate only the purine and pyrimidine bases from each other with this microscopy. By improving the resolution capability of the microscope, it will be possible in the near future to identify the different bases, even from a concentrated RNA or DNA extract.
  • In vitro hybridization is the most practiced method for identifying nucleic acids according to their sequence, in their conventional form such as dot, slot or Southern blot.
  • the PCR product is immobilized on a solid substrate and is brought into contact with labeled specific oligonucleotide or DNa samples which are freely available in solution in order to hybridize with one another if there is a complementary sequence. The non-specifically bound samples are removed by washing.
  • the buffer in which the prehybridization took place is removed and with the buffer of the same composition, which also contains 2 ⁇ 10 6 cpm / ml of 5'-end-labeled, denatured oligonucleotides with an oncogene-specific sequence, or with added to the sequence containing the mutant codon of an oncogene (such as ras oncogenes) and incubated at 60 degrees C for 6 to 8 h to take place the hybridization.
  • the filters are then washed in a solution of 0.75 M NaCl, 0.075 M Na citrate, 0.1% SDS at 60 degrees C.
  • the visualization of the occurrence of the hybridization is achieved by autoradiography with the aid of an intensifying plate.
  • the buffer solution for prehybridization, hybrid and washing still contains tetramenthylammonium chloride (3 M tetramethyl ammonium chloride, 50 M Tris.Cl, pH 7.5, 2 mM EDTA, 0.3% SDS, 100 micrograms / ml sonicated Sa__mon sperm DNA, 5 x Denhardt's solution ( 1 x Denhardt's solution: Ficoll, polyvinylpirrolidone, bovine serum-alb ⁇ _min each 0.02%), in which case the filters are then washed twice in 2 x SSPE (1 x SSPE: 10 M Na-phosphate, p 7.2, 0.18 M NaCl, 1 mM EDTA, 0.1% SDS
  • the following known, 18 molecularly cloned human oncogene or its oncogene-specific sequences can be used as samples.
  • the oncogenes are grouped below according to their frequency of increased activity in human malignancies:
  • Group A fos, myc, Ha-ras, Ki-ras
  • Group B fes, yb, fms, N-ras, src, abl, raf, Ertf, N-mye
  • Group C Erb ⁇ , mos, sis, alu, bcr.
  • the oncogene samples are usually radioisotopically with P 32 (Spezifi ⁇ specific activity: 10 8-10 9 cpm / microgram) or labeled with biotin.
  • Okogen oligonucleotide samples including those which have a point mutation-modified sequence of oncogenes activated by point mutation, are radioisotopically labeled by end labeling in order to achieve high specific activity. If new oncogenes were discovered, additional oncogene oligonucleotide samples might be necessary, which can be used according to the diagnostic goal.
  • nylon filter membrane
  • UV light or by baking then wash with 200 ml of 5 x SSPE and 0.5% for 30 min at 55 degrees C to remove the unbound oligonucleotide.
  • a filter has several different oligonucleotide samples.
  • Each filter with the various specific oligonucleotide samples immobilized on it is composed in 4 ml of hybridization solution of 20 ul of the amplified, labeled (biotin) DNA and 5 x SSPE, 0.5% SDS.
  • the amplified DNA was mixed by mixing 400 iriM NaOH, 10 mM EDTA and was added quickly to the hybridization solution. Then incubate at 55 degrees C for 4 to 6 h. They are quickly with 2 x SSPE, 0.1% SDS at room temperature, once with the same solution at 55 degrees C for 10 min.
  • Oligonucleotides coupled to a poly-dT tail (several hundred BP long): This tail is then used to immobilize the samples on a piece of nylon filter by UV light so that the specific sequence or sequences of the fragment are free in Is a solution and so the hybridization takes place quickly.
  • the point mutation possibilities of some oncogenes are numerous and require quick examination procedures.
  • One possibility is the simultaneous, pooled sequence PCR and the differentiation of the different products by different fluorescent dye labeling, by using labeled primer pairs, a primer of which is labeled with a different dye and complementary to the mutated sequence.
  • Each 5 to 6 mutated sequence is drawn with its own dyes, its own color. The amplification of these mutated sequences can be identified quickly and easily in a pooled PCR system.
  • PCR can be used for substances whose nucleotide sequence is not is known not to be carried out. In these cases, in vitro hybridization with the corresponding DNA samples is the method of choice.
  • the plasma RNA concentrate is denatured by incubation at 65 degrees C for 15 min and then by rapid cooling. Then the RNA is on a solid support such as nitrocellulose paper that was previously with 20 x NaCl / Cit. was equilibrated and then dried by a dotting apparatus (Schleicher & Schuell, Keene, New Hampshire USA). The nitrocellulose paper treated in this way is then baked in a vacuum oven at 80 ° C.
  • Prehybridization buffer Formamide (50% (Vol / V ⁇ l) 5 x NaCl / Cit; mM sodium phosphate, pH 6.5; sonicated denatured Salmon Sperma DN (250 micrograms / ml) and 0.2% per Bovine Serum Albumin (BSA); Ficoll and Polyinylpyrrolidon incubated for 6-8 hr at 55 degrees C.
  • the biotin-labeled oncogene and other samples are first denatured and become the prehybridization solution which contains the nitrocellulose paper with the plasma RNA immobilized thereon mixes.
  • the concentration of the sample or samples (pooled samples) is high: 600 ng / ml. In the case of pooled samples of 5 components, each 120 ng / ml. Hybridization at 55 degrees C for 7 to 10 h.
  • the hybridization is detected with the visualization kit according to the manufacturer's instructions (ONCOR, Gaithersburgh USA) after the prescribed washes.
  • biotin-labeled samples and visualization kits from ONCO enables rehybridization after removal of the hybridized samples.
  • the pooled samples (each 5) the plasma RNA can be tested relatively quickly and get a negative or a positive result with the Tester ⁇ ih * menschli chen malignancies frequently activated oncogenes.
  • the positive pool is then further tested with its components (the individual samples) by hybridization and / or by re-hybridization in order to determine the plasma oncogene profile. men.
  • the sensitivity of this method is in the range of 0.1 pg. Numerous other modifications are possible.
  • the intensity of the black spot after autoradiography due to the intensity of the color can be measured quantitatively and quantitative comparisons can thus be made.
  • a serial dilution is made from the plasma RNa with 10 microgram / ml yeast tRNa as diluent carrier RNA, then with each dilution first the reverse transcription, then the PCR, and the product by in vitro hybridization with corresponding specific oligonucleotide samples identified by other methods.
  • the highest dilution from which there is still a positive signal is de titer.
  • quantitative monitoring can be carried out during the monitoring of a patient during the observation period. In this way, one can observe, for example, amplification of one of the activated oncogenes. If the titer of one oncogene is increased disproportionately compared to the other oncogenes detectable in the plasma during the follow-up, this can increase the in vivo amplification of this oncogene, among other things. mean.
  • This method is particularly suitable for screening people who are particularly at risk of malignancy, such as people who are exposed to X-rays or radioactive radiation, workers in chemical or asbestos plants, patients with impaired immune systems (after chemotherapy) or members of families with genetic -conditional tendency for various malignant diseases.
  • Each mutated sequence in the pool is drawn with its own color by means of fluorescent dye-labeled primers, which is complementary to the mutated codon region.
  • the most sensitive test method is when the PCR products are detected by in vitro hybridization.
  • the reaction mixture is hybridized with the appropriately labeled oligonucleotide or pooled DNA samples after amplification.
  • the positive pooled PCR mixture is then further hybridized with labeled individual oligonucleotide or DNA samples in order to know which sequence was amplified in the pool.
  • a sensitivity can be achieved which is in the range of ag (10 -18 g). Theoretically, this means the detectability of some target sequences (3-5 target sequence pieces) in the plasma pattern.
  • This test is able to reflect not only the fundamental molecular-genetic changes, mainly responsible for the malignant transformation, its maintenance and progression, but also one of the most important ways of influencing the host organism by the malignant cancer cell population.
  • the activated oncogenes drive up the "motor” of the malignant cells, which have to be “switched back” in order for the host to be able to save the patient.
  • this method of the invention creates the most important prerequisites: the early detection of these events in each patient individually.

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Description

Maliqnitätstest (Krebs test) mit Vemendung von der Polymerase etteπ- reaktion.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis der spezifischen mRNA Sequenz (Target-Sequenz) von Substanzen von Krebszellursprung aus einer azellularen biologischen Flüssigkeit entsprechend dem Oberbe¬ griff des Anspruchs 1. -
Je mehr Information, je früher über die jeweilig gegebene bösartige Zellpopulation bekannt ist, desto besser kann ihr Wirt, der Patient gerettet werden. Es gibt eine ununterbrochene beidseitige Wechselwir¬ kung zwischen dem bösartigen Prozess und dem Wirt, seit die erste malignant transformierte Zelle entstanden ist.
Diese wechselseitige Interaktion ist ein sehr komplizierter, multifak¬ toraler und vielseitiger Mechanismus, in dem die mRNA von Küebszellur- sprung eine bedeutende Rolle spielen kann, welche unten in Einzelhei¬ ten geschildert wird.
1. Wir haben erstmals berichtet, daß die Blutplasma-RNA Franktion von Malignomträgern in protein-synthetisierenden Zeil-freien System als Mesenger funktioniert und die Translationsaktivität anderer mRNAs, wenn sie mit ihr in Kσmpetion sind, wesentlich verhindert.
2. Dies wurde in RNA-Transfer (Experimente) zu normalen Zellen später bestätigt: Das Translationsprodukt der Plasma-RNA von Malignαmträ- gern wurde in den Rezipientzellen produziert, während die Produk¬ tion das entsprechende normale Protein drastisch gehemmt wurde.
Dieses Phänomen ist eigentlich die funktioöelle Mimikry auf moleku¬ lar biologischer und zellularer Ebene der Hauptmerkmale des bösar¬ tigen Prozesses selbst: Förderung der eigenen Existenz auf die Kosten des Wirtes.
3. Es wurde bekannt, daß bösartige Zellen Poly (A)+RNA, geschützt in Lipoproteinhülle oder gebunden zu anderen Substanzen auslassen, bzw. ausscheiden und die in der überwältigenden Mehrheit der Pa¬ tienten mit bösartigen Krankheiten aus dem Blutplasma isoliert werden kann. Messenger RNA mehr als einer Substanz von Krebszellur¬ sprung kann in der Zirkulation von Malignomträgern vorkommen.
4. Ein großes Spektrum von normalen und bösartigen Zellen ist fähig mRNA aus ihrer Umgebung aufzunehmen, wenn diese durch Lipid, Lipo- protein oder durch andere Substanzen geschützt präsentiert ist. Die mRNA übt dann ihre Messenger Aktivität in den Rezipientzellen aus. Infolgedessen wird das Translationsprodukt der aufgenommen mRNA durch diese Zellen produziert so lange bis der Nachschub durch die Zirkulation aus der Umgebung reicht.
So hat die Rezipientzelle eine neue phänotypische Eigenschaft, eine neue Produktionsfähigkeit erworben, die sie genetisch entweder nicht hat, oder nicht ausdrücken kann.
Dieses neue biologische Phänomen und dessen Bedeutung wurde erstmals durch uns erkannt und mit der Bezeichnung "Phänotypausleih" ("pheno- type lending") versehen, etikettiert.
Der Phänotypausleih ist einer der wichtigsten Mechanismen, durch den die bösartigen Zellen ihre Hauptziele erreichen:
a. Förderung ihrer eigenen Existenz, b. Hinderimg (Hemmen) der Funktionen des Wirtes, sogar c. zwingen die bösartige Zellen die Wirtzellen das zu produzie¬ ren, was für den bösartigen Prozess vorteilig ist.
Die beeinflußenden Botschaften gehen im wesentlich in zwei Richtungen:
1. Aus der malignanten Zellpopulation zu den Wirtzellen.
2. Aus einer Subpopulation der bösartigen Zellen zu anderen Subpopula- tionen entweder
a. binnen des Tumors oder b. von den Muttertumorzellen zu weit entfernten etastatisieren- den Tumorzeil-Kolonien, und c. vice versa. Es gibt eine Anzahl von veröffentlichten klinischen und experimentel¬ len Beobachtungen, die Phänomene in Malignität beschreiben, in denen der oben genannte Informationsaustausch durch Phänotypausleih mit mRNA wirklich operational sein kann:
A. Klinische Beobachtungen
1. Das Enzymprofil der sonst normalen Leber von Malignαmträgern ist ähnlicher den bösartigen Zellen als bei normalen Menschen.
2. Normale Lymphozyten der überwältigenden Mehrheit der Patienten mit Myelαm haben das Myelαma-Protein als ihr Oberflächen-Im- munglobulin.
3. Normale Leukozyten der Malignomträger produzieren große Mengen von Enzymen mit baslamembran-destruierender Aktivität, die in normalem Zustand nicht tun.
B. Experimentelle Beobachtungen
1. Eine Subpopulation bösartiger Zellen, die nicht fähig ist zu metastatisieren wenn sie s.c. injiziert wird, wird aber meta- statisieren, nachdem in dasselbe Tier eine Subpopulation mit metastatisierendem Potential desselben Tumors i.v. injiziert wurde.
2. Eine Subpopulation von malignanten Zellen wurde resistent gegenüber einem Medikament mit dem sie zuvor niemals in Berüh¬ rung gekommen ist, wenn nur humorale Kontakte zwischen dieser und einer anderen Subpopulation, die gegenüber diesem Medika¬ ment resistent ist, etabliert wurde.
Die Liste ist nicht vollständig.
Hier muß erwähnt werden, daß Transkripte bzw. deren Fragmente von zellularen Onkogenen, die durch Übertranskription in bösartigen Krank heiten aktiviert sind, aus dem Blutplasma von Malignomträgern durch i vitro Hybridisierung nachgewiesen werden können. Phänotypausleih durch diese Transkripte kann ähnliche Phänomene wie AI. und Bl. in bösarti¬ gen Krankheiten verursachen, oder Produktionsfähigkeiten von Wachs¬ tums-Faktoren, Enzyme oder anderen Substanzen in Wirtzellen, die von dem Tumor entfernt sind, übertragen. So könnte die Umgebung dieser Wirtszellen für die ankommenden metastatisierenden Krebszellen attrak¬ tiv werden und dann diese mit Wachstums-Faktoren und anderen Substan¬ zen füttern. Der Phänotypausleih durch mRNA von bösartigem Ursprung hemmt, verhindert gleichzeitig in den Rezipientzellen des Wirtes die eigenen Funktionen, was zu der Verminderung der lokalen und der syste¬ matischen Abwehrmechanismen des Wirtes führen kann. Kleine Fragmente der Transkripte von Krebszellursprung haben auch Hemmungsaktivität.
Das Vorkommen des Phänotypausleih durch die zirkulierende mRNA wurde in Myelo -Patienten (A2 siehe Liste) durch uns und andere untersucht und bewiesen.
Es ist gelungen, die Produktion des Myeloma-Proteins in die normalen menschlichen Ly phozyten mit der Plasma-RNA von Myelαma Patienten zu übertragen, was auch die Verrr nderung der Produktion von eigenen Ober- flächen-Immunglobin verursacht hat. Das RNase-behandelte Sample der¬ selben Plasma-RNA war wirkungslos.
Das RNA-Transfer Verfahren ist aber eine sehr komplizierte, beschwer¬ liche Methode und nicht empfindlich genug um schon im Frühstadium der Bösartigkeit positive Ergebnisse zu geben.
Die spezifische mRNA-Se uenz der H und L Ketten, entsprechend der Kettenkombination dem jeweiligen Myelomaprotein wurde aus dem Blut¬ plasma der Myelαmapatienten nachgewiesen. Die Anwesenheit der mRNA in der Blutbahn ist die wichtigste Voraussetzung des Phänotypausleih. Deswegen kann der Nachweis der mRNA bzw. deren spezifischer Fragmente der Substanzen von Krebszellursprung in der Blutbahn von Malignom¬ trägern entsprechend des Verfahrens der Erfindung als ein sensitives und gut praktizierbares Testverfahren dienen, das schon in den Früh¬ stadien der bösartigen Krankheiten wichtige Informationen über die grundlegenden fundamentalen molekular-genetischen Veränderungen in den malignanten Zellen, deren Aktivitäten, die mögliche Wechselwirkung zwischen Tumor und Wirt durch mRNA liefern kann, in einem Zeitpunkt wenn die Krebszellmasse mit der üblichen Methode nicht visualisierbar und für eine histologische Untersuchung nicht erreichbar ist.
Die zirkulierenden mRNA Transkripte bzw. deren spezifischen Fragmente können mit sehr empfindlichen und spezifischen Methoden nachgewiesen werden. Eine solche technische Möglichkeit ist die in vitro Hybridi¬ sierung und die andere ist die in vitro enzymatische Vermehrung der spezifischen Target-Sequenz der jeweiligen mRNA durch Polymerase-Ket- ten-Reaktion, PCR (polymerase chain reaction) .
Die Polymerase-Ketten Reaktion, die seit 1985 bekannt ist (Science 230: 1350 - 1356), ist eine zuverlässige relativ einfache Methode, um die gewünschte Sequenz von in niedriger Konzentration vorhandener DNA aus Gewebe, Zellen und sogar aus einem einzigen Haar in vitro zu syn¬ thetisieren und amplifizieren. Das amplifizierte Produkt ist dann leicht identifizierbar durch ein Spektrum von verschiedenen Methoden inklusive in vitro Hybridisierung mit entsprechenden, markierten DNA bzw. Ologonukleotid-Proben. So hat PCR Verwendung gefunden, um Flecke oder Reste von zellularen Körperflüssigkeiten (Blut, Samen) oder Kör¬ perzellen aufzuspüren und zu identifizieren.
Die mRNA Sequenzen kann man auch durch PCR in vitro amplifizieren, wenn man zuerst durch Revers-Transkription die entsprechende komple¬ mentäre DNA (cDNA) synthetisiert und diese durch PCR amplifiziert. Diese RNA Amplifizierung wurde bisher nur für Zellen und zellulare Körperflüssigkeiten wie Blut verwendet, besonders um RNA-Viren zu identifizieren in den Blutzellen. Bei der PCR benutzt man zwei Ologo- nukleotid-Primere, die komplementär sind zu den Sequenzen, die die gewünschte spezifische Sequenz flankieren, ein Primer für den 3'Strang, ein Primer für den 5'Strang, sie "bezeichnen" die Sequenz, die das DNA-Polymerase Enzym synthetisieren und amplifizeren soll.
Durch PCR kann die Target-spezifische Sequenz in einem so großen Maß vermehrt werden, daß der direkte Nachweis des Produkts möglich ist. Bei Verwendung markierter Bauelemente bzw. Pri ere werden die PCR- Produkte durch ihre Markierung visualisierbar, und müssen nicht durc in vitro Hybridisierung nachgewiesen werden. Die PCR hat soviele Vor teile, wie hohe Spezifizität, sehr große Empfindlichkeit, welche in derselben oder mit einer Größenordnung höher liegt als die in vitro Hybridisierung und sie ist einfacher, schneller und automatisierbar. Darum ist PCR besonders geeignet für den Nachweis der mRNA-Sequenz der Substanzen von Krebszellursprung aus einer azellularen biologischen Flüssigkeit wie Blutplasma und kann als empfindlicher Malignitätstest für Diagnostik, Früherkennung und Monitoring bösartiger Krankheiten dienen.
Der Nachweis der mRNA Transkripten bzw. deren spezifischen Fragmente der Substanzen von Krebszellursprung als Malignitätstest hat viele Vorteile gegenüber dem Nachweis der Substanzen selbst:
1. Die Empfindlichkeit der mRNA-Nachweismethode gemäß der Erfindung ist wesentlich größer (liegt in der Region von 10"18 g) als die Nachweismethoden der Translationsprodukte, also der Substanzen selbst (liegt in der Region von pg) .
2. Antikörper gegen das Translationsprodukte, produziert entweder durch den Wirt, oder eingeführt (eingereicht) für Therapiezwecke, beeinflussen die Testresultate bei dem mRNa-Transkriptnachweis nicht.
3. RNA-Transkripte bzw. deren spezifischen Fragmente werden in erfa߬ baren Mengen und in von degradierenden Enzyme geschützter Form nur durch bösartige Zellen ausgelassen bzw. ausgeschieden. Darum ist ihr Nachweis (in der Blutbahn) aus dem Blutplasma diagnostisch, im Gegenteil mit ihrem Translationsprodukt, das auch durch normale Zellen produziert werden kann (wie zum Beispiel: Onkogenprodukte; einige Tumormarker) .
4. Die Halblebenszeit der mRNA-Transkripten ist wesentlich kürzer (60 min für onc-fos, onc-myc; 7 Stunden für CEA) als deren Transla¬ tionsprodukte (mehrere Tage für Onkogen-Produkte, mehr als eine Woche für CEA) .
Daraus ergeben sich wichtige praktische Vorteile für die Nachweisver¬ fahren der mRNA-Transkripten bzw. deren spezifischen Fragmente, welche mit dem Verfahren der Erfindung ausgenützt werden können, als Maligni¬ tätstest:
a. Jegliche Veränderungen können bedeutend früher und schneller erkannt werden; b. schneller können Therapie-Wirkung oder Wirkungslosigkeit beobachtet und beurteilt werden; c. der Therapieausgang jeder eingeleiteten Chemotherapie, oder Immuno(chemo)therapie kann man frühzeitig schon in ein bis zwei Tagen vorhersagen. Untersuchungen mit bösartigen Zellen haben gezeigt, daß die wirkungsvolle Chemotherapie zu wesent¬ licher Veπr nderung sogar zum kompletten Stillstand der Trans¬ kription der aktivierten Onkogene führt. So sind dann, in dem Blutplasma mRNA Transkripte bzw. deren Fragmente von aktivier¬ ten Onkogenen nicht mehr vorhanden, oder nur in verminderter Konzentration. Persistieren die Onkogen-spezifischen mRNA Sequenzen in der Blutbahn unvermindert weiter, bedeutet das die Unwirksamkeit der eingeleiteten Chemotherapie So kann die überflüssige Gefahr einer später unwirksam erwiesenen Chemo¬ therapie frühzeitig vermieden und eine neue Kombination von antineoplastischen Mitteln ganz individuell für den Patienten "nach Maß geschneidert" werden. d. Resistenzentstehung durch Multi-Medikament-Resistenz-Faktor kann noch frühzeitiger beobachtet werden und entsprechend behandelt werden.
5. Erkennen neuer Tumormarker oder Krebssubstanzen, die in Malignαm- trägern auch durch deren normale Zellen produziert werden: Ist die mRNA-Transkript bzw. deren spezifischen Fragmente von dieser Sub¬ stanz in der Zirkulation, in dem Blutplasma nachweisbar, ist die Produktionsfähigkeit dieser Substanz dann nicht oder nicht nur die eigene Eigenschaft der Wirtzellen, sondern die Folge von "Phänotyp¬ ausleih" durch die aus der Krebszelle stammenden zirkulierenden mRNA übertragene und so erworbene Eigenschaft.
So kann die Erscheinung und die Wirklichkeit in Einklang gebracht werden. Es gibt Phänomene, in denen die Wirklichkeit (diese Wirk¬ lichkeit) auf den ersten Blick erkennbar ist: Produktion des Myelαmaproteins als Oberflächenimmunoglobulin durch die sonst nor¬ malen Lymphozyten des Wirtes. Es gibt aber auch Erscheinungen, in denen dies nicht sofort erkennbar ist: Wenn die Produktion eines Enzymes, das gleichzeitig durch die Krebszellen, aber auch durch die sonst normale Leber in Malignomträgern produziert ist, erfolgt.
Diese Fälle können durch den Nachweis der entsprechenden mRNA.bzw. deren spezifische Fragmente in der Zirkulation geklärt werden.
6. Schließlich ergeben sich mehrere therapeutische Ausnutzungsmöglich¬ keiten aus der Kenntnis des zirkulierenden mRNA-Profils. Durch das Hemmen der Produktion, Ausscheidung oder der Translation der ent¬ sprechenden mRNA von Krebszellursprung kann für den Wirt nachteili¬ ge Wirkung oder für die bösartigen Zellen vorteilige Auswirkung schon sehr frühzeitig ausgeschaltet und vermieden werden, zum Bei¬ spiel durch Antisens-Oligonukleotid u.a..
a. Im Plas azytom kann die Verhinderung der Übertragung der Myelomaproteinproduktionsfähigkeit auf die normalen Lymphozy¬ ten des Wirtes in einem Frühstadium der Bösartigkeit die Inhi¬ bition des Immunsystems so wesentlich verhindert werden, damit das Immunsystem die relativ kleine Tumorzellmasse ohne weitere Chemotherapie eliminieren kann, wenn die Bösartigkeit frühzei¬ tig erkannt und entsprechend der oben erwähnten Möglichkeit behandelt wurde.
b. Durch die Verhinderung der Endothel-Basalmembran-destruieren- den Enzyme können die in der Blutbahn anwesenden Tumorzellen die Zirkulation nicht verlassen und so nicht metastatisieren. Dies ist besonders wichtig während und nach der Operation als größere Zahl von Krebszellen in die Blutbahn gelangen kann.
c. Mit dem Phenotypausleih kann die niedrigere (20 - 25%) Er¬ folgsrate der verschiedenen Formen von Immuntherapie, min¬ destens teilweise erklärt werden, weil deswegen die Wirtzellen nicht ausreichend mitwirken können, oder die in vitro vermehr¬ ten und aktivierten Zellen kurz nach ihrer Verabreichung in dem Malignαmträger-Wirt in ihrer Funktion gehemmt, wirkungslos werden können.
d. Durch Entfernung der Lipoprotein mRNA Komplexe, z. B. durch Hämoadsorption ähnlich wie für die Entfernung der gefährlichen Lipide in gewissen Formen von Hyperlipidämie schon Anwendung gefunden, oder durch andere geeignete Methoden (Plasmaphe- rese), in dem Frühstadium der Krankheit könnte die Beeinflus¬ sung des Wirtes durch die bösartigen Zellen unterbrochen werden, der so mit voller Kraft die bösartigen Zellen vernich¬ ten könnte. ,
Wenn man die in vitro Amplifizierung der spezifischen mRNA-Sequenzen mit der in vitro Hybridisierung kombiniert, vergrößert die Empfind¬ lichkeit des Malignitätstest um mindestens 4 bis 5 Größenordnungen im Vergleich zu der Hybridisierung allein oder PCR allein.
Früh bedeutet in der klinischen Onkologie Heilung, in mindestens 80 % bis 90 % der Fälle. Deshalb ist jede Methode.willkommen in dör klini¬ schen Praxis, die die Früherkennung bösartiger Prozesse zeitlich und prozentual wesentlich verbessern kann.
Einen Vorsprung mehrerer Monate bei der Früherkennung und so mehrere lebenswichtige Monate für die früheingeleitete Therapie die so zur vollständigen Heilung führen kann. Das ist der wichtigste Vorteil dieser Erfindung.
Die Aktivierung von zwei oder mehreren zellularen Onkogenen durch erhöhte Transkription oder durch Mutation wird allgemein als ein sehr wichtiger Schritt in dem Entstehen, der Aufrechterhaltung und in der Progression der bösartigen Transformation betrachtet. Diese Erhöhung der Transkription kann mehrfach oder sogar das 100-fache der. normalen Werte erreichen. Wegen der Besonderheiten bösartiger Zellen und der malignen Tumore können die aktivierten Onkogen-Transkripte bzw. deren Fragmente in die Blutbahn gelangen und dort geschützt oder teilweise geschützt ohne weitere wesentliche Degradierung vorhanden sein, und sie können so aus dem Blutplasma von Patienten mit aktiven bösartigen Prozeß durch eine empfindliche Methode wie in vitro Hybridisierung nachgewiesen werden. Diese Methode kann als Malignitätstest verwendet werden und ist geeignet als Screening Test oder Verlaufskontroll-Test (Monitoring), um relativ kleine Mengen maligner Zellmasse nachzuwei¬ sen, die man mit den üblichen diagnostischen Methoden in der klini¬ schen Praxis nicht erkennen kann.
Mit dem Verfahren dieser Erfindung kann man z. B. die Onkogen-spezi- fische mRNA Sequenzen auch solcher Onkogene im Blutplasma nachweisen, die in noch niedrigerer Konzentration dort vorhanden sind als andere, wie zum Beispiel die Transkripte bzw. Transkriptfragmente der Onkoge¬ ne, die durch Punktmutation und nicht durch erhöhte Transkription aktiviert sind und deshalb ist ihre Konzentration niedriger in den bösartigen Zellen und nachfolgend auch im Blutplasma im Vergleich zu Onkogenen, die durch erhöhte Transkription und sogar in vivo Amplifi- zierung aktiviert wurden. So wird erreicht, daß das Plasma-Onkogen- Profil (Onkogene, deren mRNA-Sequenz im Blutplasma vorhanden sind) , das Krebszell-Onkogen Profil (Onkogene, die in den bösartigen Zellen aktiviert sind), besser wiederspiegeln kann. So könnte man aus dem Blutplasma nicht nur das Vorhandensein eines aktiven malignen Prozes¬ ses, sondern auch vorhersagen, welche Onkogene in der bösartigen Zel¬ len mindestens teilweise aktiviert sind, und zwar schon in einem Zeit¬ punkt, zu dem die Bösartigkeit noch nicht visualisierbar und so für histologische und molekular-genetische Untersuchungen noch nicht erreichbar ist.
Über 50 % der Adenomen mit präkanzerösen Veränderungen im Dickdarm haben durch Punktmutation aktivierte ras Onkogene (besonders Ki-ras), während die kanzerös-veränderten Adenomen in etwas niedrigerem Pro¬ zentsatz diese Onkogene haben. Die Mutation geschah am häufigsten mit den Ki-ras Onkogenen in Position des Kodons 12, GGT wird zu GAT mu¬ tiert in beiden Zuständen. Der Malignitätstest, durchgeführt ohne vorherige Amplifizierung der oben genannten mutierten Onkogen-Sequenz aus dem Blutplasma-RNA, gab negative Ergebnisse in beiden Zuständen, nach in vitro Amplifizierung wurde der Malignitätstest positiv nur im Falle von Krebs, aber nicht bei der präkanzerösen Adenomen. Dieses Beispiel zeigt deutlich, daß die Erfindung, trotz ihrer erhöhten Em¬ pfindlichkeit, ein zuverlässiger Malignitätstest ist.
Das Ziel der Krebsforschung und der klinischen Onkologie ist die mole- kular-genetisch kausale, rationale sinnvolle Therapie. In dieser Hin¬ sicht sind die Kenntnisse und besonders die frühzeitigen Kenntnisse, welche Onkogene eigentlich in den bösartigen Zellen aktiviert sind, sehr wichtig. Diese Onkogene können als gute Zielscheibe einer mole¬ kular-genetisch sinnvollen Therapie dienen, und zwar an mehreren Ebe¬ nen angegriffen werden, nämlich (a) an der Gen-Ebene: Durch Verhinde- rung der Transkription; (b) an der Transkript-Ebene: Durch Verhinde¬ rung der Translation der aktivierten Onkogene; (c) oder an der Onko- gen-Produkt-Ebene: Durch Verhinderung der Funktion des OKPs. Für a. und b. sind sehr stimulierende Ergebnisse mit Krebszeil-Kulturen in vitro bekannt.
Ein Oligonukleotid mit spezifischer Sequenz für die Initiation der Proteinsynthese wird durch die Krebszellen vorzugsweise in größeren Mengen aufgenommen als durch normale Zellen und hemmt die Translation der gezielten Onkogen RNA-Transkripte mit dem Ergebnis, daß die Krebs¬ zellen ihre Eigenschaften verlieren und nicht mehr bösartig multipli¬ zieren. Diese Möglichkeit ist ein guter Kandidat, eine kausale Thera¬ pie in der Praxis zu entwickeln.
Mit monoklonalen Antikörpern durchgeführte Experimente mit bösartigen Zellen oder mit Tumoren in Animalversuchen haben bewiesen, daß, solan¬ ge das OKP neutralisiert ist durch spezifische Antikörper, der bösar¬ tige Phänotyp verschwindet. Diese Beispiele zeigen deutlich, daß die molekular genetisch kausale sinnvolle Therapie im Prinzip gölich ist, und diese nicht vorstellbar ist ohne das frühzeitige Wissen, welche Onkogene in den bösartigen Zellen aktiviert sind. Hier hilft schon früh das Onkogen-Profil des Blutplasmas mit dem Verfahren dieser Er¬ findung.
Wenn man die anti-Krebszell Antikörper mit chemotherapeutischen, toxi¬ schen oder radioaktiven Substanzen bindet, kann man therapeutische Wirkung in Tieren und Patienten erreichen, jedoch ist die Erfolgsrate im allgemeinen nicht sehr hoch. Mehrere Faktoren sind dafür verant¬ wortlich, einer davon ist die Verschiedenheit in der Expression des gezielten Antigens an den verschiedenen Krebszellen derselben Tumore wegen ihrer Diversification. Bessere Ergebnisse kann man erreichen, wenn man gleichzeitig mehrere Antigene an der Zelloberiläche gezielt immunologisch angreift. Als solche Antigene wären die Onkogenprodukte der aktivierten Onkogene besonders geeignet, insbesondere solche, die ihr Onkogen-Produkt in der Zellmembran haben und solche, die in den normalen Zellen überhaupt nicht vorkommen, wie zum Beispiel die durch Punktmutation veränderten Onkogen-Produkte oder einige Tumormarker. Ein weiterer Vorteil ist, daß die Onkogen-Transkripte bzw. deren Sequenzen so früh nachzuweisen sind, wie dies mit der empfindlichsten Immunmethode nicht möglich ist.
Der immunologische Nachweis von Produkten der Onkogene als Maligni¬ tätstest ist nicht geeignet, weil die normalen und die pathologischen Werte (in Bösartigkeiten) einander überlappen, und einige abnormale aber nicht- alignante Zustände höhere Werte produzieren als die Bösar¬ tigkeiten, einmal abgesehen von der wesentlich niedrigeren Empfind¬ lichkeit der immunologischen Verfahren im Vergleich zu der jetzigen Erfindung.
Ein weiterer besonderer Vorteil ist noch, daß Veränderungen in der Aktivierung der Onkogene während der Verlaufskontrolle noch zuverläs¬ siger und früher reflektiert werden können durch das Plasma-Onkogen- Profil als die bei bisherigen Methoden. So kann man Onkogen-Verände- rungen die mit einer Verschlechterung der Prognose wegen Diversifika¬ tion der Krebszellen, oder mit einer Amplifizierung einer der akti¬ vierten Onkogene verbunden sind, schon frühzeitig erfassen und die entsprechende Therapie rechtzeitg einleiten. Das Verschwinden eines vorhandenen Onkogen-Transkripts oder Erscheinen eines neuen, im Blut¬ plasma noch nicht vorhandenen Onkogen Transkripts bzw. dessen Sequenz ist auch ein Zeichen der Verschlechterung der Progressivitat. Wenn die Proportion von zwei oder mehreren Onkogentranskripten zueinander sich im Blutplasma während der Verlaufskontrolle wesentlich verändert, kann dies die Amplifizierung in vivo eines der Onkogene reflektieren, was meistens eine Erhöhung der Agressivität und erhöhte Progressivitat der Bösartigkeit bedeuten könnte.
Der Mechanismus des Phänomens "Phänotypausleih" praktiziert durch die Natur, kann für therapeutische Zwecke durch Verabreichung von mRNA- Lipoprotein Komplexen nachgeahmt und ausgenützt werden, um 13
1. die fehlende Produktion von Substanzen zu substituieren,
2. die Produktion einer Substanz oder mehrerer Substanzen zu erhö¬ hen und so einen pathologischen Zustand zu bekämpfen,
3. oder die Produktion solcher Substanzen zu ermöglichen, dϊLö in dem menschlichen Organismus nicht vorkommen, aber therapeutisch»vortei¬ lig wäre.
Diese Therapiemöglichkeiten haben den großen Vorteil, daß die Wirkung steuerbar ist und durch Abbrechen der Verabreichung jederzeit beendet werden kann, im Gegenteil zum genetischen Transfer mit DNA,1 das aus mehreren Gründen an Patienten (Menschen) sowieso nicht praktizierbar ist.
Die Therapiemöglichkeit mit mRNA benötigt aber ein sorgfältiges* Moni¬ toring der angewandten mRNA bzw. deren spezifische Sequenz in der Blutbahn. Das Verfahren der Erfindung ist wegen seiner sehr hohen Empfindlichkeit und zuverlässigen Spezifizität für diese Zwecke sehr geeignet.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, spezifische mRNA-Sequenzen der Substanzen von Krebszellursprung aus einer azellularen biologi¬ schen Flüssigkeit nachzuweisen, auch wenn sie bzw. deren Fragmente in sehr niedriger Konzentration vorhanden und in gewissem Maß degradiert sind, aber die spezifische Sequenz haben und für in vitro Amplifizie¬ rung geeignet sind, und dieses Verfahren so als Malignitätstest, be¬ sonders als sehr empfindlichen Früherkennungstest, zu verwenden.
Diese Aufgabe wird durch das Verfahren nach Anspruch 1 gelöst. Durch die Verwendung eines wirksamen und zuverlässigen, aber RNA-Austritt aus den Zellen nichtverursachenden RNase-Hemmers schon bei der Probe¬ entnahme der zellularen biologischen Flüssigkeit, wird der Abbau der RNA bzw. deren Fragmente verhindert. Da der gewählte RNase Hemmer keinen RNA-Austritt aus den Zellen vor und während deren Entfernung verursacht, ist darum wichtig, weil diese sensitive Methode schon kleine Kontamination nachweisen kann.
Die PCR-Produkte können schon während der PCR durch Einbauen von mar¬ kierten Bauelementen oder Primeren radioaktiv oder nicht-radioaktiv markiert werden und so visualisiert werden. Die nicht-markierten PCR- Produkte können durch direkten Nachweis nach Ethidium Bromid Färbung, oder durch ihre Größe, oder entsprechend ihrer Sequenz entweder durch Sequenz Analyse oder besonders mit in vitro Hybridisierung identifi¬ ziert werden.
So wird ein hoher Grad von Empfindlichkeit, eine äußerst große Spezi- fizität, Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit erreicht. Wegen der Besonderheiten der bösartigen Zellen und Tumore ist das Verfahren als Malignitätstest, insbesondere für Früherkennung, geeignet.
Im folgenden wird die Erfindung genauer erklärt. Die zellulare biolo¬ gische Flüssigkeit (wie Blut, Exudate usw. ) wird mit einem zuverläs¬ sigen, RNA-Zell-Leckage nicht verursachenden RNase-Hemmer schon bei der Probenentnahme gemischt und die Zellen werden entfernt. Aus der so gewonnenen, azellularen biologischen Flüssigkeit wird die Gesamt-RNA unter ständiger Wirkung des RNase Hemmers und in Anwesenheit eines Detergens und einem proteolytischen Enzym, wie Proteinase K, mit einem wässrigen Medium vermischt und bei 37 Grad C für 5 bis 8 h in einer Pufferlösung inkubiert. Dann wird Hefe tRNA als Carrier (50 ug/ml) zugemischt und mit Phänol und Chloroform bei 60 Grad C extrahiert und mit Alkohol bei -20 Grad C präzipitiert. Das Extraktum kann durch Ion- Austausch Säulen Chromatographie noch schnell weiter gereinigt werden.
Die Blutplasma-RNA wird mit einer Pufferlösung vermischt, die zusam- mengeetzt ist entsprechend der optimalen Wirkungsweise der gewählten Revers-Transkriptase (Tris.Cl. ph 8.3, KC1, MgCl2), weiter enthält sie RNasin, Revers-Transkriptase Enzym, jede von den vier Deoxyribonu- kleosid-triphosphaten, das 3'Primer alle in ausreichender Konzentra¬ tion. Dann wird die Gesamt-Reaktionsmischung insgesamt 20 Mikroliter, bei 37 Grad C für 30 min inkubiert.
Danach wird die Reaktionsmischung mit 80 Mikroliter PCR-Puffer und 100 Mikrogramm Rinderserumalbumin, mit dem 3'Primer und dem 5'Primer sowie dem thermostabilen Taq DNA-Poly erase Enzym, jeweils in geeigneter Konzentration, gemischt. Die Reaktionsmischung wird dann mit Mineralöl überschichtet, um die Evaporation zu verhindern. Durch Erhitzen der Reaktionsmischung auf 95 Grad C für 20 see wird der RNA.cDNA Komplex dissoziert, und Annealing der Primere wird bei 55 Grad C für 15 see durchgeführt. Die Extension der Primere erfolgt bei 72 Grad C für 1 min. Durch Erhitzen wird der Zyklus wieder gestartet und 40 bis 50 mal wiederholt.
Nach dem letzten Zyklus wird die Reaktionsmischung bei 72 Grad C für 10 min belassen und dann in Eis gekühlt.
Stattfinden der Vermehrung während PCR wird durch Ethidium Bromid Färbung im Vergleich zur Negativ-Kontrolle nachgewiesen. Das Produkt bzw. die Produkte können nach ihrer Größe durch Elektrophorese in Gel oder durch Chromatographie oder entsprechend ihrer Sequenz identifi¬ ziert werden.
Die Produkte können während der Amplifizierung durch markierte Bau¬ elemente oder Primere mit Radioisotop, Biotin, Enzyme, Fluoreszenz- farbstoffe oder anderen Substanzen markiert und dann entsprechend der Markierung erkannt werden.
Identifizierung der PCR Produkte mit höchster Empfindlichkeit und mit größter Spezifizität wird durch in vitro Hybridisierung erreicht.
10 Mikroliter von jeder Reaktionsmischung wird auf Nylon- oder Nitro- cellulose-Filter aufgetragen und durch Backen bei 80 Grad C für 60 mi immobilisiert, bei 60 Grad C im geeigneten Puffer Prehybridisiert und dann in Anwesenheit von 2 x 106 cqm von endmarkierten Onkogenspezifi- schen Oligonukleotid Proben pro ml für 5 bis 7 h bei 60 Grad C hybri¬ disiert. Wäsche wird bei 60 Grad C in 0.75 M NaCl/0,075 Na-citrat, 0. % SDS durchgeführt. Das Resultat der Hybridisierung wird durch Autora diographie visualisiert.
Durch eine Variante dieser Methode, die eigentlich deren Spiegelbild ist, können die Produkte der Simultan-Pooled PCR gleichzeitig identi¬ fiziert werden. Die unmarkierten entsprechenden Proben werden auf einem festen Träger, wie Nylon Filter, immobilisiert und mit den (Bio tin) markierten PCR Produkte in Kontakt gebracht, um miteinander zu hybridisieren. Die Resultate werden durch Enzymaffinität bedingte Farbreaktion visualisiert. Eine Reihe von gereinigter molekular-klonierter DNA, die die Sequenz als Code der Onkogene enthält, wird entweder radioisotopisch oder nicht-radioisotopisch markiert (j.Mol.Biol. 113:237-251 1977). Die nicht-radioisotopische Markierung kann mit Biotin geschehen. Im Fall von Oligonukleotid-Proben wird durch Endmarkierung durchgeführt, um hohe spezifische Aktivität zu erreichen.
DNA Proben und Onkogen-spezifisehe Oligonukleotid-Proben markiert oder unmarkiert sind kommerziell erhältlich (ONCOR, Inc. Gaithersburgh, Ma. 20877, USA; ONCOGENE SCIENCE Inc. Mineola, NY 11501, USA; Amersham, Little Chalfont, England). Ein Biotin Markierungs- und Visualisie- rungskit wird kommerziell angeboten (Amersham, Little Chalfont, England ONCOR, Gaithersburgh, USA) . Oligonukleotide mit den jeweiligen gewünschten Sequenzen kann man bei der Custom-Service in Europa und in den USA bestellen und erhalten.
Alle Maßnahmen werden unternommen, um die Kontamination mit der jewei¬ ligen Target-Sequenz vor, während und nach den Untersuchungsprozessen zu verhindern.
Die Gefahr einer Zumischung des ubiquitären, hochgradig resistenten RNase-Enzyms aus exogenen Quellen wird besonders in allen Etappen der RNA-Phase des Verfahrens (Stufen a bis c) durch Gebrauch von gebacke- nen Glaswaren, autoklavierten Lösungen, gebackenen Spatulas, Werkzeu¬ gen, trockenen chemischen Präparaten, von Glas destillierten, mit autoklavsterilisiertem Wasser, sowie Tragen von Handschuhen verrin¬ gert.
Das folgende Beispiel dient der weiteren Erläuterung der Erfindung ohne sie zu beschränken.
Beispiel
Es wird 10 ml Blut mit 20 IE Heparin entnommen und sofort mit einer Lösung von RNase-Hemmer wie RNasin (Promega Biotec Maidison WI. USA) Endkonzentration 2000 E/ml) vermischt. Das Blutplasma wird so schnell wie möglich separiert. Es wir din zwei Einweg-Plastik Centifugen-Röhr- chen je 2.5 ml Blutplasma pipettiert, eines wird tiefgekühlt für even¬ tuelle Wiederholung, oder für ergänzende Untersuchungen als Reserve aufbewahrt. Das andere wird gleich in Bearbeitung genommen.
Es wird ein Gemisch aus 0.2 M Tris.Cl (pH 8.5); 25 M Äthylendiamino- tetraessigsäure (EDTA); 2 % (Gew/vol) Natriu duodecylsulfat (SDS) und Proteinase K (Endkonzentration: 300 mikrogramm/ml) hinzugefügt und in der Anwesenheit von RNase-Hemmer bei 37 Grad C für 5 bis 8 h inku¬ biert.
Anschließend wird Hefe tRNA (50 ug/ml) zugemischt und danach wird ein gleiches Volumen Phänol und Chloroform-Isoamylalkohol (24 : 1) zuge¬ mischt und bei 60 Grad C für 15 min durch kräftiges Schütteln extra¬ hiert. Die Interphase wird zusätzlich einmal wie oben extrahiert und die kombinierte wässrigen Phasen werden einmal mit Chloroform-Isoamyl¬ alkohol wie oben aber bei Zimmertemperatur behandelt. Die Nuklein Säure wird durch Alkohol in der Anwesenheit von Na-acetat (0.3 M, pH 5.2) bei -20 Grad C precipitiert und centrifugiert. Das Sediment wird aufgelöst und einer RNase-freien DNase Enzym Behandlung unterzogen.
In diesem Falle wird RNase-freies DNase-Enzym und MgCl2 (zu 2 mM) zu der Plasma-RNA Lösung (50 mM Tris.Cl, pH 7.5 in 1 mM EDTA) vermischt und in Anwesenheit von RNase-Hemmer bei 37 Grad C für 30 min inku- biert, dann wird Phänol-Chloroform extrahiert und in Anwesenheit von Na-azetat (pH 5.2, 0.3 M) wird die RNA mit 70 % Äthanol bei -20 Grad C precipitiert.
Vor der DNase Behandlung kann ein weiteres Reinigungsverfahren durch Ion-Austausch-Säulen-Chromatographie ("The Extractror", Molecular Biosystem, San Diego, CA 92121) in ca. 30 min entsprechend der Vor¬ schriften des Herstellers durchgeführt werden.
Wenn man die Extraktion der RNA aus der RNA-Lipoprotein Fraktion durchführt, erhält man eine RNA-Fraktion, die vorzugsweise Poly (A)+RNA aufweist. Die RNA-Liproprotein Fraktion kann man aus dem Serum von Malignomträgern durch Flotation in KBr Density-Gradient (diskonti¬ nuierlich: 1.006 - 1.221 g/ml) nach 16-stündiger Flotation in einer Ultrazentrifuge bei 105.000 x g trennen, sie wird als ein opales Band zwischen den HDL und LDL Fraktionen sichtbar.
Das Eluat kann direkt für in vitro Hygridisierung oder für PCR Ampli- fizierung, oder nach Alkohol Prezipitation und DNase Behandlung ver¬ wendet werden.
Danach wird das Sediment in einer Pufferlösung, die der optimalen Wirksamkeit des verwendeten Revers-Transkriptase Enzyms (und der Vor¬ schriften des jeweiligen Herstellers) entspricht (Bethesda Research Laboratories; promega Biotec, USA) (50 mM Tris.Cl, pH 8.3, 6mM MgCl2 , 40 mM KC1, 1 nM Dithiorheitol, 1 E RNasin) . Die Lösung wird mit 1 mM von jedem Deoxyribonukleosid-Triphosphat und 1000 E Revers-Transkrip¬ tase, 10 pM von dem jeweiligen 3'PCR Primer auf 100 ul ergänzt.
Für jede Target-Sequenz bzw. jedes Pooled-Target Sequenz System werden 20 ul von dieser Reaktionsmischung bei 37 Grad C für 30 min inkubiert.
Zu dieser Reaktionsmischung werden 80 Mikroliter von PCR-Puffer (50 mM Tris.Cl, 50 mM KCl, 2.5 mM MgCl2 , 100 Mikrogramm Rinderserum¬ albumin/ml, pH 8.440 pM 3'Primer, 50 pM 5'Primer und 1 E thermostabi¬ les Tag DNA Polymerase (Perkin-Elmer-Cetus, USA; New England Biolab, (USA)) hinzugemischt. Mineralöl wird über die Reaktionsmischung ge¬ schichtet, um die Evaporation zu verhindern.
Durch Erhitzen auf 95 Grad C für 20 see wird der RNa-cDNA-Komplex dissociert und Anealing der Primere erfolgt bei 55 Grad C für 15 see, die Extension der Primere läuft bei 72 Grad C für 1 min ab. Durch Erhitzen wird der Zyklus erneut begonnen udn 40 bis 50 mal wiederholt.
Nach dem letzten Zyklus wird die Reaktionsmischung bei 72 Grad C für 10 min belassen und dann in Eis gekühlt. Das Instrument "Thermal Cycler" (Perkin-Elmer-Cetus, USA) erleichtert bedeutend die zuverläs¬ sige und schnelle Ausführung der PCR.
Primerpaare, um PCR Produkte von verschiedener Größe zu synthetisie¬ ren. Ein Beispiel:
Primerpaar für Ha-rasl2 Sequenz Größe des amplifiziert Produktes in Basispaar (
5'Primer (Sequenz) GACGGAATATAAGCTGGTGG 63 3'Primer (Sequenz) TGGATGGTCAGCGCACTCTT
Primerpaar für Ki-ras12
5'Primer (Sequenz) GACTGAATATAAACTTGTGG 108 3'Primer (Sequenz) CTATTGTTGGATCATATTCC
Primerpaar für Ki-ras61
5'Primer (Sequenz) TTCCTACAGGAAGCAAGTAG _ .128 3'Primer (Sequenz) CΑ<_ÄAAGÄAAGCCCTCCCCA
Eine Markierung des PCR Produktes wird während der Amplifizierung durch Einbau entweder von markierten Deoxyribonukleosid Triphosphat oder von markierten Primeren durchgeführt. Die Markierung kann radi aktiv oder nichtradioaktiv sein wie zum Beispiel: Biotin, Enzyme, Farbstoffe und andere Substanzen. Eine vorteilhafte Verwendung als Markierung für Primere haben Fluoreszensfarbstoffe gefunden: Diese Farbstoffe, für jede amplifizierende Sequenz eine andere Farbe, wer zu den Oligonukleotid Primere konjugiert (Applied Biosystem, Foster City, Ca, USA).
Der Nachweis der PCR Produkte, bzw. die Feststellung des Stattfinde der Amplifizierung ist durch mehrere Verfahrensweisen möglich:
Direkt-Methode nach Ethidium Brα id Färbung: Erst müssen die unink porierte Bauelemente und Primere entfernt werden. Die Reaktionsmi¬ schung wird zu 2.5 ml mit 10 mM Tris.Cl pH 8.0 verdünnt und auf ei Centricon -100 Microfiltration Rohr (Amicon) beladen und bei 5000 centrifugiert (Sorvall SS35, fixed angle rotor). DieJamplifizierte kann von dem Oberteil des Filters (45 - 50 ul) zurückgewonnen werd Ca. 5 ul werden dann auf einer Agarose-Platte, die 0.5 ug/ml Ethid Bromid enthält, aufgetragen und durch UV Transluminator induzierte Fluoreszenz im Vergleich zur Negativ-Kontrolle (gleiche Zusammense zung minus Plasma RNA, gleiche Behandlung) visualisiert und ausgewertet.
1. Markierte PCR Produkte werden durch ihre Markierung identifiziert. In diesem Fall müssen die uninkorporierten markierten Elemente entfernt werden (wie oben) .
a. Radioaktiv-markierte PCR Produkte werden durch Messen der Ra¬ dioaktivität im Vergleich zur Negativ-Kontrolle bestimmt, oder nach Agarose Gel Elektrophorese ohne vorherige Behandlung durch Autoradiographie visualisiert und sogar durch die Größe des Produktes identifiziert.
b. Biotin-markiert PCR Produkte werden nach Eliminierung der nicht¬ eingebauten, markierten Elemente durch Enzymaffinität bedingte Farbreaktion erkannt. Visualisierungs-Kits werden kommerziell angeboten (ONCOR, Gaithersburgh, MD 20884 U.S.A. ; Amersham, Little Chalfont, England) .
c. Mit Fluoreszenzfarbstoffen markierte PCR Produkte werden durch ihre Farbe mit Fluorometer (Perkin-Elmer LS-5) identifiziert.
2. Nachweis unmarkierter Produkte durch ihre Größe:
Hier stehen zwei technische Möglichkeiten zur Verfügung. Vorherige Behandlung ist nicht notwendig:
a. Elektrophorese in Agarose oder Akrylamid Gel, entsprechend der Größe der Produkte. Visualisierung entweder durch EB-Fluoreszenz oder entsprechend der Markierung. Durch Vergleich mit parallel gelaufenen Marker mit bekannter Größe wird die Größe der Produk¬ te bestimmt.
b. Ionen-Austausch-Chromatographie (High Resolution Separation): Die Reaktionsmischung nach Amplifizierung wird auf eine Mono Q HR 5/5 Säule (Parmacia Uppsala, Schweden) gegeben und durch den angegebenen Gradienten von Pufferlösung A und B mit einer Flow- Rate von 0,15 ml/min eluiert. Pufferlösung A: 20 mM Tris.Cl. pH 8.3, 0.4 % M NaCl; Pufferlösung B: A + 1.0 M NaCl. Gradient: 40 bis 60 % B in 2 h und 60 bis 80 % B in 6 h. Simultan Multi-Target Sequenz PCR (Pooled PCR) .
Dieses Verfahren verursacht spezielle Schwierigkeiten für die Iden- tifizieirung mehrerer PCR Produkte amplifiziert in derselben Reak¬ tionsmischung in einem Röhrchen. In dieser Form von PCR werden meh als eine Sequenz entweder desselben Moleküls bzw. Fragments oder eine Sequenz von mehreren verschiedenen mRNAs bzw. deren Fragmente simultan amplifiziert, wenn die entsprechenden Primer-Paare in ausreichender Konzentration vorhanden sind.
In diesem Fall wird mit EB Fluoreszenz zwar nachgewiesen, ob Ampli- fizierung stattgefunden hat oder nicht, aber welche Sequenz(en) amplizifiert wurde(n), muß mit besonderen weiteren Maßnahmen be¬ stimmt werden. Im Fall der unmarkierten Produkte wird die Identifi zierung durch die Produktgröße erreicht. Dazu wird vorher die Größ der verschiedenen PCR Produkte durch Auswahl und Einsetzen der entsprechenden Primer-Paare so programmiert, daß das Produkt von jeder amplifizierenden Target-Sequenz in einer individuellen, charakteristischen, voneinander unterschiedlichen Größe während de PR synthetisiert und amplifiziert werden (siehe Beispiel). So wird erreicht, daß die PCR Produkte durch ihre Größe mit Gel Elektropho rese oder durch Ionen-Austausch Chromatographie identifizert werde
"_ Die zweite Möglichkeit ist die Differenzierung»der Produkte durch Farbe, wenn sie unterschiedlich, jede mit eigener Farbe durch Fluoreszenzfarbstoffe markiert wurden.
Die dritte Möglichkeit für die Differenzierung von simultan ampli- fizierten Produkten ist die Identifizierung_durch ihre Sequenz. Hier ergeben sich drei Lösungen, welche auch geeignet und notwendi sind die Authentizität der Taq Poly erase Tätigkeit wegen die vor¬ kommende "Misreading" und deren Amplifizierung zu kontrollieren:
a. Für Prüfung der Authentizität der Enzymtätigkeit ist besonder geeignet die Sequenz Analyse.
b. Im Prinzip kommt die Scanning-Tunelling Mikroskopie-für die Identifizierung der PCR Produkte in Frage. Zur Zeit ist es möglich, mit dieser Mikroskopie nur die Purin und Pyrimidin Bases voneinander zu differenzieren. Durch die Verbesserung der Auflösungsfähigkeit des Mikroskops wird es in der nächsten Zukunft möglich sein, die verschiedenen Basen zu identifizie¬ ren, sogar aus einem konzentrierten RNA bzw. DNA Extrakt.
c. Die in vitro Hybridisation ist die meist praktizierte Methode für Identifizierung von Nuklein Säuren entsprechend ihrer Sequenz, und zwar in ihrer konventioneller Form wie Dot-, Slot-, oder Southern-Blot. In dieser Form wird das PCR Produkt auf einem festen Substrat immobilisiert und wird mit frei in Lösung vorhandenem markiertem spezifischen Oligonu- kleotid oder DNa Proben in Kontakt gebracht um miteinander, wenn komplementäre Sequenz vorliegt, zu hybridisiren. Die unspezifisch gebundenen Proben werden durch Wäsche entfernt.
Aus jeder Reaktionsmischung wird 20 Mikroliter auf vorher mit 20 x SSPE befeuchtetem Nylon oder Nitrocellulose Filter mit einem Dotting- Apparat unter Einwirkung eines milden Vakuums aufgetragen, dann werden die Filter in kleinem Volumen von 20 x SSPE Lösung gewaschen und durch Backen bei 80 Grad C für 60 min immobilisiert. Dann werden die Filter in einer Lösung von 0.75 M NaCl, 0.075 M Natrium-citrat, pH 7.0, 20 mM Naphosphat, pH 7.0, 5 mM'EDTA, 200 Mikrogramm/ml Hefe-tRNA, 1 % Sarkosyl (Signma) für 60 min bei 60 Grad C prehybridisiert. Der Puf¬ fer, in dem die Prehybridisierung geschah, wird entfernt und mit dem Puffer von derselben Zusammensetzung, der noch 2 x 106 cpm/ml von 5'- End-markierten, denaturierten Oligonukleotiden mit Onkogen-spezifi- scher Sequenz, oder mit der Sequenz, die das mutierte Kodon eines Onkogens (wie ras Onkogene) enthält, zugemischt und wird bei 60 Grad C für 6 bis 8 h inkubiert um die Hybridisierung stattzufinden. Danach werden die Filter einer Wäsche in einer Lösung von 0.75 M NaCl, 0.075 M Na-citrat, 0.1 % SDS bei 60 Grad C unterzogen. Die Visualisierung des Stattfindens der Hybridisierung wird durch Autoradiographie mit Hilfe eines Verstärkerschildes erreicht.
Im Fall von Onkogen-Oligonukleotid-Proben, die die Sequenz mit dem mutierten Koden (wie Ki-ras, HS-ras, N-ras, Kodon 12, 13, 61) ist es vorteilhafter, wenn die Pufferlösung für Prehybridisierung, Hybridi- sierung und Wäsche noch Tetramenthylammonium-Chlorid enthält (3 M Tetramethyl-ammonium-Chlorid, 50 M Tris.Cl, pH 7.5, 2 mM EDTA, 0.3 % SDS, 100 Mikrogramm/ml sonizierte Sa__mon-Sperma-DNA, 5 x Denhardt's Lösung (1 x Denhardt's Lösung: Ficoll, Polyvinylpirrolidon, Rinderse- rum-albι_min je 0.02 %), durchgeführt. Die Filter werden in diesem Fal dann zweimal einer Wäsche in 2 x SSPE (1 x SSPE: 10 M Na-phosphat, p 7.2, 0.18 M NaCl, 1 mM EDTA, 0.1 % SDS) für 10 min bei Zimmertempera¬ tur unterzogen, dann werden sie mit 3 M Tetramethylammonium-Cl-Hybri- disierungspuffer minus Karrier-DNA und Denhardt's Lösung abgespült un danach in dieser Lösung für 30 bis 60 min bei 60 Grad C gewaschen. Di Filter werden durch Autoradiographie ausgewertet, wie oben.
Die folgenden bekannten, 18 molekular klonierten menschlichen Onkogen bzw. deren Onkogen-spezifischen Sequenzen können als Proben gebraucht werden. Die Onkogene sind hier unten ungefähr nach Häufigkeit ihres Vorkommens erhöhter Aktivität in menschlichen Bösartigkeiten grup¬ piert:
Gruppe A: fos, myc, Ha-ras, Ki-ras
Gruppe B: fes, yb, fms, N-ras, src, abl, raf, Ertf , N-mye
Gruppe C: Erb^, mos, sis, alu, bcr.
Die Onkogen Proben werden radioisotopisch meistens mit P32 (Spezifi¬ sche Aktivität: 108 - 109 cpm/Mikrogram ) oder mit Biotin markiert. Okogen-Oligonukleotid Proben inklusiv solche, die durch Punktmutation veränderte Sequenz von durch Punktmutation aktivierten Onkogenen auf¬ weisen, werden radioisotopisch durch Endmarkierung markiert, um hohe spezifische Aktivität zu erreichen. Sollten neue Onkogene entdeckt werden, wären gegebenenfalls weitere Onkogen-Oligonukleotid Proben notwendig, die entsprechend des diagnostischen Zieles verwendet werde können.
Es gibt ein in vitro Hybridisierungsverfahren, was das Spiegelbild de oben genannten konventionellen Methode ist. Bei diesem werden die unmarkierten verschienen Oligonukleotid Proben auf einem Stück Nylon- Filter immobilisiert und der Filter wird mit PCR Produkten, die wäh¬ rend der Amplifizierung dann mit Biotin markiert geworden sind, hybri disiert; Revers-Hybridisationsverfahren. 100 ul Oligonukleotide Probe Lösung (100 pmol; in lOmM Tris.Cl. 0.1 mM EDTA) wird auf Nylon filter (Membran) (Genetrans-45, Plasco Woburn, MA. USA) aufgetragen und durch UV Licht oder durch Backen immobili¬ siert, dann wird einer Wäsche mit 200 ml 5 x SSPE und 0.5 % für 30 min bei 55 Grad C um das nichtgebundene Oligonukleotid zu entfernen. Ein Filter hat mehrere verschiedene Oligonukleotide Proben.
Jeder Filter mit den daran immobilisierten verschiedenen spezifischen Oligonukleotid-Proben wird in 4 ml von Hybridisationslösung zusammen¬ gesetzt von 20 ul der amplifizierten, markierten (Biotin) DNA und von 5 x SSPE, 0.5 % SDS. Vorher wurde die amplifizierte DNA durch Mischung von 400 iriM NaOH, 10 mM EDTA und wurde so schnell zu der Hybridisa- tionslösung zugegeben. Dann wird bei 55 Grad C für 4 bis 6 h inku¬ biert. Die werden schnell mit 2 x SSPE, 0.1 % SDS bei Zimmertempera¬ tur, einmal mit derselben Lösung bei 55 Grad C für 10 min. gewaschen und einer kurzen Spülung zweimal in 2 x PBS (1 x PBS: 137 mM NaCl, 2.7 mM KC1, 8 MM Na2HP04 , 1.5 M KH2P04 , pH 7.4) bei Zimmertemperatur. Visualisierung entsprechend der Markierung.
Oligonukleotide, die mit einem poly-dT Tail (Schwanz) gekoppelt sind (mehrere Hundert BP lang) : Durch diesen Schwanz werden dann die Proben auf einem Stück von Nylon Filter durch UV Licht immobilisiert, so daß die spezifische Sequenz oder Sequenzen des Fragments frei in Lösung ist und so die Hybridisierung schnell stattfindet.
Die Punktmutationsmöglichkeiten einiger Onkogene sind zahlreich und benötigen schnelle Untersuchungsverfahren. Eine Möglichkeit ist die simultan, Pooled-Sequenz PCR und die Differenzierung der verschiedenen Produkte durch unterschiedliche Flureszenzfarbstoff-Markierung, durch Benutzung markierter Primer-Paare, ein Primer davon ist mit einem anderen Farbstoff markiert und komplementär zu der mutierten Sequenz. Jede 5 bis 6 mutierte Sequenz ist durch eigene Farbstoffe, eigene Farbe gezeichnet. So können in einem pooled PCR-System die Amplifizie¬ rung dieser mutierten Sequenzen identifiziert werden und zwar schnell und einfach.
Die PCR kann bei solchen Substanzen, deren Nukleotid Sequenz nicht bekannt ist, nicht durchgeführt werden. In diesen Fällen ist die in vitro Hybridisierung mit den entsprechenden DNA Proben die Methode de Wahl.
Das Plasma-RNA Konzentrat wird durch Inkubierung bei 65 Grad C für 15 min und dann durch rasche Abkühlung denaturiert. Danach wird die RNA auf einem festen Träger wie Nitrocellulose-Papier, das zuvor mit 20 x NaCl/Cit. equilibriert und dann getrocknet wurde durch einen Dotting Apparatus (Schleicher & Schuell, Keene, New Hampshire USA) aufgetra¬ gen. Danach wird das so behandelte Nitrocellulose-Papier für 2 h bei 80 Grad C im Vakuumofen gebacken, nach dem Backen wird in einer Lösu (Prehybridisierungspuffer): Formamide (50 % (Vol/Vόl) 5 x NaCl/Cit; mM Natriumphosphat, pH 6.5; sonizierte denaturierte Salmon Sperma DN (250 Mikrogramm/ml) und 0.2 % je Bovine Serum Albumin (BSA); Ficoll und Polyinylpyrrolidon für 6 - 8 hr bei 55 Grad C inkubiert.
Die Biotin markierten Onkogen und anderen Proben (markierte Proben bzw. Markierungs-Kit: ONCOR, Gaithersburgh, USA) werden erst denatu¬ riert und werden zu der Prehybridisierungslösung, die das Nitrocellu lose-Papier mit der daran immobilisierten Plasma-RNA enthält, ge¬ mischt. Die Konzentration der Probe bzw. der Proben (Pooled Proben) ist hoch: 600 ng/ml. Im Fall der Pooled Proben von 5 Komponenten, je 120 ng/ml. Hybridisierung bei 55 Grad C für 7 bis 10 h.
Das Stattfinden der Hybridisierung wird mit Visualisierungskit ent¬ sprechend der Herstellervorschriften (ONCOR, Gaithersburgh USA) , nac den vorgeschriebenen Wäschen nachgewiesen.
Verwendung Biotin markierter Proben und Visualisierungskits von ONCO ermöglicht die Rehybridisierung nach Entfernung der hybrisierten Proben.
Mit den Pooled-Proben (je 5) kann die Plasma-RNA mit dem ih*menschli chen bösartigen Krankheiten häufigsten aktivierten Onkogene relativ schnell getestet werden und ein negatives oder ein positives Tester¬ gebnis bekommen. Das positive Pool wird dann mit dessen Komponenten (die individuellen Proben) durch Hybridisierung und/oder durch Rehy¬ bridisierung weiter getestet um das Plasma Onkogen-Profil zu bestim- men.
Die Empfindlichkeit dieser Methode liegt im Bereich von 0.1 pg. Es sind zahlreiche weitere Modifizierungen möglich.
Intensität des schwarzen Flecks nach Autoradiographie durch die Inten¬ sität der Farbe kann quantitativ gemessen werden und so kann man quan¬ titative Vergleiche machen.
Quantitativer Test:
Es wird aus der Plasma-RNa eine Serienverdünnung gemacht mit 10 Mikro¬ gramm/ml Hefe-tRNa als Diluent Carrier RNA, dann wird mit jeder Ver¬ dünnung erst die Revers-Transkription, dann die PCR durchgeführt und das Produkt durch in vitro Hybridisierung mit entsprechenden spezifi¬ schen Oligonukleotiden-Proben durch andere Methoden identifiziert. Di höchste Verdünnung, aus der noch ein positives Signal ausgeht, ist de Titer. So können bei der Verlaufskontrolle eines Patienten, während der Beobachtungszeit, quantitative Vergleiche durchgeführt werden. Au diese Weise kann man zum Beispiel Amplifizierung eines der aktivierte Onkogene beobachten. Wenn während der Verlaufskontrolle der Titer eines Onkogens im Vergleich zum anderen in den Plasma nachweisbaren Onkogenen unproportionell erhöht wird, kann das die in vivo Amplifi- zierung dieses Onkogen u.a. bedeuten.
Diese Methode ist besonders geeignet für Screening von Personen, die durch Malignität besonders gefährdet sind, wie Personen die Röntgen oder Radioaktiv-Strahlung ausgesetzt sind, Arbeiter in Chemischen ode Asbest-Betrieben, Patienten mit beeinträchtigtem Immunsystem (nach Chemotherapie) oder Mitglieder der Familien mit genetisch-bedingter Neigung für verschiedene bösartige Krankheiten.
Wegen der erhöhten Sensitivität dieser Methode können solche nicht bösartige Fällen vorkommen, in den der Malignitätstest, ein positives Ergebnis liefert. Diefferenzierung ist durch die Verlaufskontrolle möglich. Bei nicht-bösartigen Fällen persistiert die Positivität vor¬ übergehend, klingt dann ab, im Gegenteil zu den bösartigen Fällen, wo die Positivität persistiert und dann steigt. Die gleichzeitige Vermehrung von mehreren Target-Sequenzen erleichte die Untersuchung der großen Anzahl von Substanzen wie Onkogene, oder Varianten von Puhk utationen. Beispiel: Drei PCR Systeme (Pooled PCR), jeweils programmiert für 5 Target Sequenzen, davon zwei für die häu¬ figst aktivierten Onkogene, und das dritte für andere Sequenzen von Krebszellursprung. EB Färbung zeigt in welchem System Amplifizierung stattgefunden hat und die vermehrte Sequenz(en) werden dann entspre¬ chend ihrer Größe, wenn sie so programmiert wurden, durch Chromato¬ graphie oder Elektrophorese in Gel identifiziert.
Noch schneller geht es, wenn fluoreszenzfarbstoffmarkierte Primere fü jede im Pool zu synthetisierende Sequenz eine eigene Farbe haben wer¬ den und die vermehrten Produkt(e) unter (mit) Fluorometer nach Entfer nung der uninkorporierten markierten Primere ohne größere Verzögerung entsprechend ihrer Farbe identifiziert werden.
Dasselbe kann man tun mit den punktmutierten Sequenzen. Jede mutierte Sequenz in dem Pool wird mit eigener Farbe gezeichnet durch fluores¬ zenzfarbstoff-markierte Primer, welches komplementär für die mutierte Kodonregion ist.
Die höchst empfindliche Testmethode liegt vor, wenn man die PCR Pro¬ dukte durch in vitro Hybridisierung nachweist. Im Fall der Pooled PCR wird die Reaktionsmischung nach Amplifizierung mit den entsprechend markierten Oligonukleotid bzw. Pooled DNA Proben hybridisiert. Die positive Pooled PCR Mischung wird dann mit markierten individuellen Oligonukleotid bzw. DNA Proben weiter hybridisiert, um zu wissen, welche Sequenz in dem Pool amplifiziert wurde. So kann man eine Em¬ pfindlichkeit erreichen, die in dem Bereich von ag (10-18 g) liegt. Theoretisch bedeutet das die Nachweisbarkeit von einigen Target-Se¬ quenzen (3 - 5 Target-Sequenzstücke) in dem Plasmamuster.
Durch dieses höchst empfindliche und im größten Maße spezifische Nac weisverfahren für die spezifische mRNA-Sequenz der Substanzen von Krebszellursprung entsteht ein Malignitätstest, der wegen der Beson¬ derheiten der bösartigen Zellen und Tumore für Diagnostik, Früherken nung, Screening und für Vorhersagen von Therapieausgang mit antineo- plastischen Mitteln geeignet ist.
Dieser Test ist fähig, nicht nur die fundamentalen molekular-geneti¬ schen Veränderungen, hauptsächlich verantwortlich für die bösartige Transformation, deren Aufrechterhaltung und Progression, sondern auch eine der wichtigsten Beeinflussungsweisen des Wirtorganismus durch die bösartige Krebszellpopulation, zu reflektieren.
Um Heilung zu erreichen, müssen beide Geschehnisse (Mechanismen) be¬ kämpft werden:
Die aktivierten Onkogene treiben den "Motor" der bösartigen Zellen hoch, die müssen "zurückgeschaltet" werden um den Wirt, den Patienten retten zu können.
Die Beeinflussung des Wirtorganismus durch die Krebszellpopulation auf die hier angegebene Weise, die zu der Schwächung der Abwehr und ande¬ rer Funktionen des Wirtes führt, muß verhindert werden .
Dazu schafft dieses Verfahren der Erfindung die wichtigste Voraus¬ setzungen: Das frühzeitige Erkennen dieser Geschehnisse in jedem Pati¬ enten individuell.

Claims

A n s p r ü c h e
1. Malignitätstest (Krebs-Test) durch in vitro enzymatische Vermehrun der spezifischen mRNA Sequenz der Substanzen von Krebszell-Ursprun aus einer azellular biologischen Flüssigkeit, bei den"man
a. aus der azellularen biologischen Flüssigkeit die RNA unter ständiger Wirkung eines zuverlässigen RNase-Hemmers konzen¬ triert, b. das Produkt der Stufe a. einer in vitro Reverstranskription unterzieht, um die komplementäre DNA (cDNA) zu synthetisieren c. das Produkt der Stufe b. benutzt, um die Target-spezifische Sequenz der gewünschten Substanz von Krebszell-Ursprung enzy¬ matisch in vitro wiederholt zu synthetisieren und so zu ver¬ mehren, und d. das Produkt der Stufe c. durch Bestimmung der Vermehrung der Nuclein Säure nachweist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Produkt der Stufe a. einer in vitro Hybridisierung mit dem ge¬ wünschten Oligonukleotid oder der DNA Probe vor der Stμfe b. unter zieht.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die in vit Vermehrung des Produkts der Stufe b. durch Polymerase-Ketten-Reak- tion (Polymerase-chain-reaction = PCR) wiederholt durchgeführt wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichne daß die azellulare biologische Flüssigkeit vorzugsweise menschli¬ ches Blutplasma ist.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die spezifische(n) Target Sequenz(en) zwei oder mehrerer Stubstanzen von Krebszell-Ursprung simultan in demselben System in vitiro enzy matisch vermehrt (Pooled PCR) .
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man bei der in vitro Simultan-Vermehrung mehrerer Substanzen von Krebszell- Ursprung jede Target-Sequenz für Synthese durch entsprechende Aus¬ wahl der Primerpaare so programmiert, daß jede in einer bestimm¬ ten, charakteristischen Größe synthetisiert.
7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß während der Pooled PCR die synthetisierenden Sequenzen durch Einbauen von mit Fluoreszenzfarbstoffen konjugierten Primeren so markiert werden, daß jedes Target-Sequenz-Produkt eine eigene Farbe hat und ent¬ sprechend identifiziert wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 und 3 bis 6, dadurch gekenn¬ zeichnet, daß die in vitro Vermehrung der Nuklein Säuren mit Ethidium-Bromid durch Farbreaktion bestimmt wird.
9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Produkt der Stufe c. nach seiner spezifischen Sequenz durch in vitro Hybridisierung, durch Sequenz-Bestimmung oder durch Scanning-Tun- nelling-Mikroskopie identifiziert wird.
10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Produkt der Stufe c. entsprechend seiner Größe durch Elektrophorese in Gel oder durch Säulen-Chromatographie identifiziert wird.
11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Produkt der Stufe c. Anspruch 1 schon während der PCR markiert wird,
a. durch Benutzung markierter Primere, oder b. durch Einbauen von markierten Nukleotiden, bei denen die Markierung radioisotopisch oder nicht radioisotopisch ist.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2 und 3 bis 9, dadurch ge¬ kennzeichnet, daß die in vitro Hybridisierung durchgeführt wird a. mit markierten DNA - oder Oligonukleotid Proben während die durch PCR vermehrte(n), unmarkierte(n) Target-DNA oder Oligo¬ nukleotide entweder an einem festen Substrat immobilisiert oder frei in Lösung sind, b. oder die durch PCR vermehrte(n) Target-DNA oder Oligonukleotid ist markiert frei in Lösung und die verschiedenen Onkogen Proben sind unmarkiert auf einem festen Substrat immobili¬ siert, wobei eine Hybridisierung nach entsprechender Behandlung durch den Nachweis der Markierungssubstanz bestimmt wird.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2, 6, 9 und 12, dadurch gekennzeichnet, daß man als Probe eine individuelle DNA oder Oli¬ gonukleotid Probe oder eine Mischung individueller DNA oder Oli¬ gonukleotide nimmt (pooled probe).
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, 9, 11 und 12, dadurch gekennzeichnet, daß man die markierten Proben, die mit der auf dem festen Träger gebundenen Target-DNA oder Oligonukleotid hybridi¬ sierte, entfernt, um das feste Substrat mit der daran verbliebenen Target-DNA oder Oligonukleotid mit einer neuen DNA oder Oligonu¬ kleotid Probe zu hybridisieren, rehybridisieren.
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