DE10143776A1 - Verfahren und Kit zur Diagnostik oder Behandlungskontrolle von Brustkrebs - Google Patents
Verfahren und Kit zur Diagnostik oder Behandlungskontrolle von BrustkrebsInfo
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Diagnostik oder Behandlungskontrolle von Brustkrebs bei einem Menschen, wobei in einer Blutprobe des Menschen das Vorhandensein oder Fehlen von mRNS erfaßt wird, die für mindestens eines der Tumormarkerproteine EGF-R, CEA, Stanniocalcin, CK20, MAGE-3 und/oder CA-15 (III) kodiert und daraus auf das Vorhandensein von Mammakarzinomzellen in der Blutprobe und damit auf mögliche Metastasierung geschlossen wird.
Description
- Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren und ein Kit zur Diagnostik oder Behandlungskontrolle von Brustkrebs bei einem Menschen.
- Bei der Krebsnachsorge ist es von Relevanz, ein Rezidiv maligner Tumore anhand des Auftretens metastasierender Tumorzellen im Blut frühzeitig nachweisen zu können. Bei den derzeit angewandten Untersuchungsmethoden werden bei Krebspatienten sogenannte "Tumormarker" auf Proteinebene (immunologisch bzw. enzymatisch) quantitativ im Blut oder in anderen Körperflüssigkeiten ermittelt.
- Diese Nachweisverfahren sind für die Tumordiagnostik bzw. Behandlungskontrolle/Nachsorge nur bedingt geeignet, da erhöhte Tumormarkerwerte auch durch nicht- Tumorerkrankungen (z. B. Entzündungen des Magen-Darm- Traktes, Leberzirrhose, Virusinfekte), starkes Rauchen oder durch eine Schwangerschaft hervorgerufen werden können.
- Brustkrebs ist die häufigste Diagnose, wenn eine Tumorerkrankung bei Frauen festgestellt wird (26,4% aller Neuerkrankungen). Trotz massiver Bemühungen, die in Früherkennung, Behandlung und Nachsorge aufgewendet werden, rangiert diese Erkrankung immer noch an erster Stelle krebsbedingter Todesursachen bei der Frau. Die Erkrankungszahlen in den westlichen Industrieländern nehmen in den vergangenen Jahren trotz verstärkter Bemühungen um die Früherkennung weiter zu. Problematisch ist die hohe Metastasierungsrate nach Erstbehandlung, die in der Mehrzahl der Fälle bereits nach 1-3 Jahren zum Tod der Patientin führt. Hauptgrund hierfür ist die Streuung von Tumorzellen in frühen Stadien der Tumorentwicklung. Neben der Ersterkennung eines Mammakarzinoms ist daher insbesondere der frühest mögliche Nachweis metastasierender Zellen für eine erfolgreiche Behandlung von entscheidender Bedeutung. Ebenso kann im klinischen Stadium I ein definitiver Negativnachweis hilfreich sein, wenn zu entscheiden ist, ob die Patientin mit einer Chemotherapie oder einer Operation belastet werden muß.
- Die derzeit verwendeten diagnostischen Methoden sind ungenau, wenn es um die Beurteilung der malignen Potenz von Resttumoren nach durchgeführter Chemotherapie in den metastasierenden Stadien geht. Einige klinische Studien weisen auf eine prognostische -Bedeutung von disseminierten Tumorzellen hin. Dennoch sind zahlreiche methodische Aspekte kritisch und bisher nicht hinreichend standardisiert. Somit müssen weiterhin Nachweise für eine okkulte - oder restliche - Metastasierung gefunden werden, die eine rechtzeitige Einordnung in die vielfältigen primär kurativen therapeutischen Optionen zulassen.
- Dem Bestreben nach Verbesserung der Heilungschancen wird heute einerseits über Suche und Verwendung neuer Tumormarker, andererseits über Sensitivitätssteigerung bei den verwendeten Methoden nachgekommen.
- Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren und ein Kit zur Verfügung zu stellen, mit dem auf einfache, sichere und wiederholbare Weise eine Diagnostik oder Behandlungskontrolle von Brustkrebs möglich ist.
- Diese Aufgabe wird durch das Verfahren nach Patentanspruch 1 sowie das Kit nach Patentanspruch 27 und den Mikroarray nach Patentanspruch 44 gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen des Verfahrens, des Kits und des Mikroarrays werden in den jeweiligen abhängigen Ansprüchen gegeben.
- Erfindungsgemäß wird mittels des erfindungsgemäßen Kits bzw. des erfindungsgemäßen Verfahrens in einer Blutprobe eines Menschen das Vorhandensein oder Fehlen von mRNS der Tumormarkerproteine EGF-R, CEA und/oder Stanniocalcin erfaßt.
- Da im Blut Gesunder die RNAs der beschriebenen Marker nicht exprimiert vorliegen, zeigt sich eine direkte Korrelation zwischen einem positiven RT-PCR-Nachweis dieser Tumormarker und zirkulierenden Tumorzellen im Blut, die zu einer Metastasierung führen können.
- Da einzelne Marker in therapieabhängiger Weise unterschiedlich exprimiert werden und Brustkrebs eine ausgeprägte Heterogenität im Expressionsmuster von Brustkrebszellen aufweist, ist es vorteilhaft, eine Kombination von Tumormarkern zu untersuchen, um alle im Blut zirkulierende Tumorzellen zu erfassen. Hierdurch lassen sich Tumorzellen auch dann erkennen, wenn die Expression eines bestimmten Markers bei einem Patienten bzw. in einem Krankheitsstadium relativ gering ist, was sonst zu einem vermeintlich negativen Ergebnis führen könnte. Die Verwendung weiterer Marker stößt jedoch meist deswegen auf Grenzen, weil mononukleäre Blutzellen eine Hintergrundexpression ("illegitime Transkription") aufweisen, die eine exakte Analyse behindern.
- Für die Erkennung von Brustkrebszellen wird daher erfindungsgemäß die folgende Kombination aus Markern vorgeschlagen:
- - EGF-R
- - CEA
- - Stanniocalcin.
- Als Alternative ergibt sich eine Kombination der Marker CK20, MAGE-3 und CA-15(III) als vorteilhaft für den Nachweis von Mammakarzinomzellen.
- Für die Amplifikation von Abschnitten der Marker CK20, MAGE-3 und CA-15(III) können die in der nachfolgenden Tabelle angegebenen Primer verwendet werden. Marker für Mammakarzinom
- Die hierzu zur Amplifikation geeigneten PCR- Bedingungen werden in der folgenden Tabelle gegeben. PCR-Bedingungen
- Bei der Anwendung von RT-PCR-Systemen zum Nachweis von Tumorzellen ist aufgrund der sehr hohen Amplifikationsrate die Spezifität ein kritischer Punkt. Geringste Kontaminationen, etwa durch Fremd-RNA oder illegitime Transkription, können hierbei das Ergebnis verfälschen.
- Durch die Verwendung der Immunzytochemie mit monoklonalen Antikörpern gegen Tumorzellantigene kann eine Steigerung der Spezifität des Tumorzell-Nachweises erzielt werden (Nachweisquote von 1 Tumorzelle auf 107 mononukleären Blutzellen). Die Tumorzellen werden dabei mittels spezifischer Antikörper bzw. einer Antikörpermischung von mononukleären Blutzellen getrennt. Die Trennung kann mittels Magnetpartikel (Dynal), an die die Antikörper gebunden werden, erfolgen. Dies wird im folgenden detaillierter beschrieben.
- Eukaryontische Zellen tragen eine Vielzahl unterschiedlicher Moleküle an Ihrer Zelloberfläche. Entsprechend des Ursprungs und der Funktion der einzelnen Zelle unterscheidet sich die Kombination der exprimierten Oberflächenmoleküle, so daß zelltyp- spezifische Muster entstehen. Zur Erkennung dieser zelltyp-spezifischen Muster werden Antikörper genutzt. Antikörper binden mit hoher Spezifität an ihr Antigen, hier an ausgewählte Oberflächenmoleküle. Diese Eigenschaft wird genutzt, um Zellen mittels spezifischer Antikörperbindung anhand ihrer Zelltyp- spezifischen Muster zu erkennen und voneinander zu unterscheiden.
- Die Expression spezieller Oberflächenproteine unterscheidet Tumorzellen von nichttransformierten Zellen dieses Zelltyps. Da sich dieses spezielle Muster der Oberflächen-Antigene bei Tumorzellen auch von den Blutzell-typischen Mustern unterscheidet, können Tumorzellen im Blut unterschieden werden. Um Tumorzellen zu identifizieren, werden Antikörper, die diese speziellen Oberflächenproteine spezifisch erkennen, als Werkzeuge genutzt. Die spezifische Antikörperbindung wird für verschiedene Analyse- und Separations- Methoden nutzbar gemacht.
- Aufgrund der intensiven Bindung von speziell dafür selektionierten Immunglobulinen ist neben der Erkennung von Zellen über deren Oberflächenepitope auch eine Separierung der erkannten Zellen von nicht erkannten möglich.
- Für die durchflußzytometrische Analyse werden Antikörper mit Fluoreszenzfarbstoffen gekoppelt. Vereinzelte Zellen werden in einem konstanten Flüssigkeitsstrom einzeln an einer Lichtquelle (Laser) vorbeigeleitet. Bei Beleuchtung der Zellen werden die an den Antikörpern gebundenen Fluoreszenzfarbstoffe angeregt und strahlen Licht bestimmter Wellenlängen ab. Das abgestrahlte Licht wird detektiert und das gemessene Signal digitalisiert gespeichert. Das Lichtsignal kann einzelnen Zellen zugeordnet werden. Die Antikörper-markierte Zelle wird so erkannt und kann nun von anderen Zellen getrennt werden. Zur Trennung werden die Zellen in kleinsten Tropfen vereinzelt. Nach Erkennung der Antikörper-markierten Zelle wird der entsprechende Tropfen in ein Auffangbehältnis gelenkt.
- Für die magnetische Separation werden Antikörper mit pseudomagnetischen Partikeln gekoppelt. Nach Einbringen der pseudomagnetischen Partikel in ein Magnetfeld wandern die Partikel im magnetischen Feld. Bei der Bewegung in diesem magnetischen Feld werden Zellen, an die diese gekoppelten Antikörper gebunden sind, mitgerissen und von anderen Zellen getrennt.
- Zur Tumorzellenerkennung mittels Magnetpartikel werden folglich an pseudomagnetische Partikel, die eine definierte Anzahl an chemisch aktivierten Stellen auf ihrer Oberfläche besitzen, Antikörper kovalent gekoppelt. Über die Spezifität der Antikörper wird die Spezifität der Trennung bestimmt. Eine Tumorzellen enthaltende Blutprobe wird mit Antikörper gekoppelte Magnetpartikel versetzt; dann werden Partikel und Blut relativ zueinander bewegt. Jene (Tumor-)Zellen, die von den Festphase-gebundenen Antikörpern erkannt und damit fest gebunden werden, folgen der Bewegung der Partikel. Hierdurch ist es möglich, bei Anlegen eines magnetischen Feldes, die Partikel mit den daran gebundenen Zellen aus dem Blut herauszuziehen (z. B. an die Wand des Trenngefäßes). Das auf diese Weise Tumorzellen-depletierte Blut kann gegen andere Lösungen ausgetauscht werden, wobei die über Magnetpartikel separierten Zellen bis zum Abschalten/Entfernen des Magnetfeldes vor Ort verbleiben und für weitere Anwendungen zur Verfügung stehen.
- Vorteilhafterweise können für die Erkennung der Tumorzellen spezifische Antikörper-Mischungen verwendet werden, die entweder allgemein auf Tumorzellen oder auch spezifisch für Brustkrebszellen-Erkennung optimiert sind. Beispielsweise eignet sich zur Erkennung von Tumorzellen im Blut eine Kombination der Antikörper MOC-31 (Fa. Novocastra) und Ber-EP-4 (Fa. DAKO).
- Eine Erkennung, die speziell auf Brustkresbzellen gerichtet ist, kann durch eine weiter optimierte Antikörpermischung gemäß der nachfolgenden Tabelle:
erzielt werden. Dies beruht auf der selektiven Expression bestimmter Oberflächenproteine, die Brustkrebszellen von anderen Krebszellen unterscheidet. - Derartige Antikörpermischungen zeigen im Vergleich zu den jeweils separat eingesetzten Antikörpern bei der Zellerkennung und Zelltrennung unabhängig von der angewandten Methode eine erhöhte Sensitivität.
- Im folgenden sollen einige Beispiele erfindungsgemäßer Nachweise für Brustkrebszellen in Blutproben beschrieben werden.
- Es zeigen:
- Fig. 1 einen Nachweis von PCR-Produkten mit Elektrophorese;
- Fig. 2A bis 2C einen Tumormarkernachweis mittels Light Cycler; und
- Fig. 3 den Nachweis einer Zelltrennung mittels Antikörper-markierter Magnetpartikel.
- In einem ersten Beispiel erfolgte eine RNA-Aufarbeitung aus 1 ml EDTA-Vollblut mit dem QIAamp RNA Blood Mini Kit (Fa. Qiagen, Hilden). Kontaminationen mit genomischer DNA wurden durch einen zusätzlichen DNA-Verdau auf der Säule mittels RNase-free DNase Set, Fa. Quiagen, Hilden) vermieden.
- Die RNA-Aufarbeitung aus 1 ml EDTA-Vollblut wurde fotometrisch über den Quotienten 260 : 280 nm verifiziert. Zur Qualitäts- und Quantitätsbestimmung kann dabei 1 µl des Ansatzes durch elektrophoretische Trennung auf einem RNA 6000 Chip über den Agilent Bioanalyzer 2100 analysiert werden.
- Die isolierte RNA wurde in einem entsprechenden Volumen zusammen mit Oligo(dT)15-Primern (Fa. Promega, Mannheim) für 5 Minuten bei 65°C denaturiert und anschließend direkt auf Eis inkubiert. Die cDNA-Synthese erfolgte mittels des Sensiscript™ Reverse Transkriptase Kit, (Fa. Qiagen, Hilden) in einem 20 µl Reaktionsansatz gemäß Tabelle 1 bei 37°C für 1 Stunde mit nachfolgender Inaktivierung der reversen Transkriptase für 5 Minuten bei 95°C und anschließender Abkühlung auf Eis. Tabelle 1 Komponenten der cDNA-Synthese
- Mit der so erzeugten cDNA wurde für jeden der gewählten Tumormarker Stanniocalcin, EGF-R, CK20, CEA sowie als interne Kontrolle für β-Aktin eine Multiplex- PCR durchgeführt. Der PCR-Ansatz ist in der folgenden Tabelle 2 dargestellt. Tabelle 2 PCR-Ansatz
- Für jeden Tumormarker wurde dabei ein Primerpaar eingesetzt, das aus der nachfolgenden Tabelle 3 hervorgeht. Tabelle 3 Liste der PCR-Primer
- Die für die Tumormarkereinzelnachweise eingesetzten Primerkombinationen und -mengen sind in der folgenden Tabelle 4 aufgeführt. Tabelle 4 Auflistung der Primermengen und Primerkombinationen
- Die PCR wurde unter den in Tabelle 5 angegebenen PCR- Bedingungen und mit den in Tabelle 6 angegebenen Marker-spezifischen Schmelz-Temperaturen und Zyklenzahlen durchgeführt. Tabelle 5 PCR-Bedingungen
Tabelle 6 Marker-spezifische Annealingtemperatur und Zyklenzahl
- 1 µl des so erzeugten PCR-Produktes wurde in einem Agilent Bioanalyzer 2100 auf einem DNA-Chip (500) aufgetrennt und das Trennergebnis elektronisch dokumentiert. Die Ergebnisse zeigt die Fig. 1. In dieser Figur zeigt Spur 1 eine 100 kb-Leiter sowie die Spuren 2-13 die Ergebnisse der entsprechenden Proben. Wie zu erkennen ist, zeigt Spur 5 ein PCR-Produkt für den Tumormarker Stanniocalcin, Spur 9 ein PCR-Produkt für den Tumormarker EGF-R und Spur 13 ein PCR-Produkt für den Tumormarker CEA, während sämtliche Proben mit biologischem Material Spuren 4, 5, 8, 9, 12, 13 PCR- Produkte für die interne Kontrolle β-Aktin enthalten.
- Die Spuren 2, 3, 6, 7, 10, 11 enthalten kein biologisches Material, so daß dort auch keine entsprechenden PCR-Produkte auftreten. Die sogenannte cDNA-Kontrolle ist ein Ansatz ganz ohne RNA, die sogenannte PCR- Kontrolle ist ein Ansatz ohne cDNA und die Negativ- Kontrolle ist ein Ansatz mit RNA einer gesunden Kontrollperson in Fig. 1. CEA steht für Carcinoembryonic Antigen, STC für Stanniocalcin und EGF-R für Epidermal Growth Factor Receptor in Fig. 1.
- Fig. 2 zeigt die alternative Analyse mittels Fluoreszens-basierender Echtzeit-PCR mittels interkallierender Fluoreszenzfarbstoffe.
- Dieser Tumormarkernachweis kann alternativ zur Block- PCR auch mittels Light Cycler (Fa. Roche, Basel) erfolgen.
- Die reverse Transkription der mRNA erfolgt wie oben beschrieben. Anschliessend wurde die PCR mit dem Light Cycler-DNA Master Sybr Green I Kit (Fa. Roche, Basel) nach Herstellerangaben unter den für jeden Tumormarker optimierten Bedingungen durchgeführt. Als Primer wurden dabei die in Tabelle 3 angegebenen Oligonukleotide verwendet. Tabelle 7 und Tabelle 8 zeigen den Ansatz für die PCR bzw. die PCR-Bedingungen im Light Cycler. Tabelle 7 PCR-Ansatz LightCycler
Tabelle 8 PCR-Bedingungen LightCycler
- Das Ergebnis dieser PCR und Auswertung durch Light Cycler Technologie ist in den Fig. 2A bis 2C dargestellt. In sämtlichen Fig. 2A bis 2C ist die Kontrollkurve mit 2 bezeichnet, während die Kurve, die für die Probe aufgenommen wurde, mit 1 bezeichnet ist.
- Bei dieser Analyse wird die Schmelzkurve der PCR- Produkte durch Cybr Green I Detektion analysiert. Die jeweilige Graphik der Fig. 2A bis 2C stellt dabei die gemessene Fluoreszenz in Abhängigkeit von der Temperatur dar. Die in den Kontrollansätzen auftretenden Fluoreszenzpeaks sind auf Primerdimere zurückzuführen.
- Fig. 2A stellt dabei die Schmelzkurvenanalyse des Stanniocalcin-PCR-Produktes dar. Der Schmelzpunkt des Hauptproduktes liegt bei 89,2°C und der Schmelzpunkt des Nebenproduktes bei 85,3°C. Derartige Fluoreszenzpeaks sind bei der Kontrollprobe nicht zu erkennen.
- Fig. 2B zeigt die Schmelzkurvenanalyse des EGFR-PCR- Produktes mit einem Schmelzpunkt bei 84,6°C.
- Fig. 2C zeigt die Schmelzkurvenanalyse des CEA-PCR- Produktes mit einem Schmelzpunkt bei 89,06°C zeigt.
- Alternativ zu den hier dargestellten Methoden können selbstverständlich auch herkömmliche Analysemethoden wie Agarose-Gelelektrophorese angewandt werden, bei denen beispielsweise 25 µl des oben dargestellten PCR-Produktes über ein 2,5%iges Agarosegel aufgetrennt werden und die DNS-Banden anschliessend mit Ethidiumbromid angefärbt und sichtbar gemacht werden. Die Dokumentation kann beispielsweise mit Hilfe des DUO Store Systems der Fa. Intas durchgeführt werden.
- Auch eine Fragmentanalyse mittels ABI Prism 310 Genetic Analyser (Fa. PE Applied Biosystems, Weiterstadt) kann zur Auswertung verwendet werden. Hierzu wird eine PCR mit fluoreszenzmarkierten Primern durchgeführt und anschließend beispielsweise jeweils 1 µl des jeweiligen PCR-Produktes in einer Verdünnung von 1 : 50 eingesetzt.
- Als weiterer Nachweis ist ein Nachweis mittels sequenzspezifischer fluoreszenzmarkierter Hybridisierungsproben möglich, die nach jedem Zyklus der PCR die Produktentwicklung verfolgen lassen. Anhand spezieller Standards kann dann auch ein Rückschluß auf die Menge an Ausgangs-RNS gezogen werden.
- Zentral für die Qualität der als Nachweisbasis isolierten RNS und der daraus synthesisierten cDNS ist die Anreicherung der hierfür verwendeten Zellfraktion aus der verwendeten Blutprobe. Hierfür stehen drei verschiedene Methoden zur Verfügung:
- 1 ml EDTA-Blut werden nach Zugabe von 5 Volumina Erythrozyten-Lysepuffer ("QIAmp Blood Kit", Qiagen; Hilden) für 20 Minuten auf Eis lysiert. Nach Abnehmen des Plasmas/Lysates von den pelletierten Zellen und Resuspension erfolgt eine erneute Zentrifugation bei 3000 × g für 20 Minuten. Nach Abnehmen des Überstandes steht die pelletierte Leukozytenfraktion für die RNA-Präparation zur Verfügung.
- Mittels eines über Zentrifugation erzeugten Dichtegradienten lassen sich Zellen unterschiedlicher mittlerer Volumendichte voneinander trennen. Mononukleare Blutzellen werden mittels eines Ficoll- Hypaque-Gradienten (Pharmacia, Uppsala, Schweden) separiert und anschließend zweifach mit PBS/1% FCS gewaschen.
- Die mononukleären Zellen aus der unter b) angereicherten Fraktion werden mit fluoreszenzmarkierten mononuklearen Antikörpern gegen tumorspezifische Oberflächenproteine inkubiert. Die markierten Zellen werden zweifach mit PBS gewaschen und im Anschluß werden 107 Zellen in 1 ml PBS resuspendiert. Für die Isolierung der Tumorzellen wird ein FACS Vantage SE-Durchflußzytometer (Becton Dickinson) verwendet. Über das CellQuest Programm erfolgen Datenaufnahme, Instrumentenkontrolle und Datenauswertung. Die sortierten Zellen werden in ein 1,5 ml-Reaktionsgefäß (gefüllt mit 1 ml PBS) überführt. Die RNS kann dann wie oben beschrieben isoliert werden.
- Alternativ kann auch die isolierte Fraktion der mononukleären Blutkörperchen, die nach einem der obigen Verfahren isoliert wurden, in Trizol- Reagenz (Gibco BRL, NY, USA) lysiert und mittels Pipette homogenisiert werden. Nach Chloroformextraktion wird die RNA-haltige wäßrige Phase in Isopropanol bei -80°C gefällt. Nach zweimaligem Waschen in 80%igem Ethanol wird das Pellet an der Luft getrocknet und anschließend in RNase-freiem Wasser resuspendiert.
- An diese Isolation der RNS schließt sich dann die reverse Transkription sowie der mRNA-Nachweis wie oben beschrieben an.
- Fig. 3 zeigt die Ergebnisse eines derartigen Isolationsverfahrens.
- In diesem Beispiel werden metastasierende Tumorzellen in peripherem Blut von Krebs-Patienten isoliert und mittels RT-PCR nachgewiesen.
- Die Expression spezieller Oberflächenproteine unterscheidet Tumorzellen von nichttransformierten Zellen dieses Zelltyps. Da sich dieses spezielle Muster der Oberflächen-Antigene bei Tumorzellen auch von den Blutzell-typischen Mustern unterscheidet, können Tumorzellen im Blut unterschieden werden. Um Tumorzellen zu identifizieren, werden Antikörper, die diese speziellen Oberflächenproteine spezifisch erkennen, als Werkzeuge genutzt. Die spezifische Antikörperbindung wird für das erfindungsgemäße Verfahren nutzbar gemacht. An pseudomagnetische Partikel, die eine definierte Anzahl an chemisch aktivierten Stellen auf ihrer Oberfläche besitzen, werden Antikörper kovalent gekoppelt. Über die Spezifität der Antikörper wird die Spezifität der Trennung bestimmt. Eine Tumorzellen enthaltende Blutprobe wird mit Antikörper gekoppelte Magnetpartikel versetzt; als Antikörper werden in verschiedenen Beispielen zwei verschiedene Mischungen von Antikörpern wie in den Tabellen 1 und 2 beschrieben verwendet; dann werden Partikel und Blut relativ zueinander bewegt, beispielsweise durch "Über-Kopf- Rotierer" in einem geschlossenen Behälter befindlicher Proben oder durch Bewegung der Partikel aufgrund von wechselnden Magnetfeldern. Jene (Tumor-)Zellen, die von den Festphase-gebundenen Antikörpern erkannt und damit fest gebunden werden, folgen der Bewegung der Partikel. Hierdurch ist es möglich, bei Anlegen eines magnetischen Feldes, die Partikel mit den daran gebundenen Zellen aus dem Blut herauszuziehen (z. B. an die Wand des Trenngefäßes). Das auf diese Weise Tumorzellen-depletierte Blut kann gegen andere Lösungen ausgetauscht werden, wobei die über Magnetpartikel separierten Zellen bis zum Abschalten/Entfernen des Magnetfeldes vor Ort verbleiben und für weitere Anwendungen zur Verfügung stehen. Tabelle 9 Antikörper-Mischung 1
- Mittels der Antikörpermischung in Tabelle 9 werden ganz allgemein Tumorzellen jedoch mit hoher Spezifität erfaßt. Dies beruht auf der selektiven Expression bestimmter Oberflächenproteine, die Krebszellen von anderen Zellen unterscheidet.
- Durch den Einsatz der Antikörpermischung wird ganz grundsätzlich im Vergleich zu separat eingesetzten Antikörpern bei der Zelltrennung unabhängig von der angewendeten Methode eine erhöhte Sensitivität nachgewiesen. Dies zeigt sich in Fig. 3, bei der im Teilbild A mit dem Antikörper BER-EP4 belegte magnetische Partikel, in dem Teilbild B mit dem Antikörper MOC-31 belegte magnetische Partikel und in dem Teilbild C ein Mix aus Partikeln die jeweils separat mit einem Antikörper belegt sind, eingesetzt wurden.
- Für jeden der Antikörper bzw. der Antikörpermischungen wurden insgesamt vier Messungen durchgeführt, bei denen 0, 10, 100 bzw. 1000 Karzinom-Zellen in 10 ml Blut inokuliert wurden. Die Spuren 1a bis 4a, 1b bis 4b bzw. 1c bis 4c zeigen dann den Nachweis von RNA nach RNA-Präparation und RT-PCR mit Tumormarkerspezifischen Primern wie oben beschrieben für Proben von jeweils 1 µl Volumen. Die Fig. 3 wurde dabei mittels elektrophoretischer Trennung in einem Agilent™ Bioanalyser 2100 gemäß Herstellerangaben ermittelt.
- Bei Verwendung von lediglich mit einem Antikörper markierten magnetischen Partikeln wie in den Fig. 3A und 3B wurde lediglich bei einem Gehalt von 1000 Zellen ein Nachweis positiv möglich. Bei Verwendung einer Antikörpermischung wie in Fig. 3C wurde bereits ein Nachweis bei nur 100 Zellen und damit um den Faktor 10 sensitiver erbracht.
- Bei diesem Beispiel wurden experimentelle Ergebnisse gezeigt, die nicht die maximale mögliche Sensitivität darstellen, sondern beispielhaft die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erreichbare Sensitivitätserhöhung demonstrieren sollen.
- Die erfindungsgemäße Vorrichtung und das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht es weiterhin, die sortierten und separierten Zellen anschließend beliebig weiter zu verwenden. Beispielsweise können diese in ein geeignetes Zellkulturmedium eingesetzt und in situ kultiviert werden.
- Da die Zellen nach der Trennung intakt sind, bleiben auch die Eigenschaften der Zellmembran und des Zellkerns erhalten. Dies eröffnet die Möglichkeit, mikroskopisch die Expression weiterer Oberflächenmarker untersuchen oder auch Chromosomen-Analysen durchzuführen. Die sortierten Zellen werden dazu auf Objektträger aufgebracht. Der Nachweis weiterer Oberflächenmarker kann cytochemisch oder über Fluoreszenzmikroskopie erfolgen. Ebenso können genetische Analysen durchgeführt werden, wie beispielsweise Chromosomenanalysen mittels FISH (Flurorescence in situ hybridisation) oder Karyogramm-Erstellung.
Claims (46)
1. Verfahren zur Diagnostik oder
Behandlungskontrolle von Brustkrebs bei einem Menschen,
dadurch gekennzeichnet, daß
in einer Blutprobe des Menschen das Vorhandensein
oder Fehlen von mRNS erfaßt wird, die für
mindestens eines der Tumormarkerproteine EGF-R, CEA,
Stanniocalcin, CK20, MAGE-3 und/oder CA-15(III)
kodiert und daraus auf das Vorhandensein von
Mamakarzinomzellen in der Blutprobe und damit auf
mögliche Metastasierung geschlossen wird.
2. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch,
dadurch gekennzeichnet, daß aus der Blutprobe
Tumorzellen abgetrennt bzw. angereichert werden und
der Nachweis an diesen Tumorzellen erfolgt.
3. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch,
dadurch gekennzeichnet, daß die Mamakarzinomzellen
mittels für Tumorzellen allgemein spezifischer
Antikörper und/oder mittels für
Mamakarzinomzellen spezifischer Antikörper oder Mischungen
derartiger Antikörper abgetrennt bzw. angereichert
werden.
4. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch,
dadurch gekennzeichnet, daß als Antikörper MOC-31
und/oder Ber-EP4 bzw. eine Mischung aus diesen
verwendet werden.
5. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden
Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als Antikörper
131-11741, E29, GP1.4 und/oder HMPV.2 bzw. eine
Mischung aus diesen allen verwendet werden.
6. Verfahren nach einem der beiden vorhergehenden
Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die
Mamakarzinomzellen mittels an Magnetpartikel
gebundener Antikörper abgetrennt bzw. angereichert
werden.
7. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch
gekennzeichnet, daß die Mamakarzinomzellen mittels
fluoreszenzassoziierter Durchflußzytometrie,
Dichtegradientenzentrifugation und/oder Zentrifugation
nach Erythrozytenlyse abgetrennt bzw.
angereichert werden.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch
gekennzeichnet, daß eine Zentrifugation der Blutprobe zur
Pelletierung der in ihr enthaltenen Leukozyten
durchgeführt wird.
9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch
gekennzeichnet, daß die RNS-haltigen Bestandteile der Probe
mittels Lyse der darin enthaltener Erythrozyten
und anschließender Pelletierung der
nichtlysierten Leukozyten aufkonzentriert werden.
10. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch
gekennzeichnet, daß die RNS-haltigen Bestandteile durch
mindestens eine Dichtegradienten-Zentrifugation der
Blutprobe zur Abseparierung und Gewinnung der in
ihr enthaltenen mononuklearen Blutzellen
aufkonzentriert werden.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 10,
dadurch gekennzeichnet, daß die gewonnenen
mononuklären Blutzellen mit fluoreszenzmarkierten
Antikörpern markiert und mittels
fluoreszenzassoziierter Zellsortierung (FACS) von der Probe
abgetrennt und gewonnen werden.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 11,
dadurch gekennzeichnet, daß die mononuklearen
Zellen der gewonnenen Fraktion lysiert und die mRNS
abgetrennt wird.
13. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß die mRNS in herkömmlicher Weise
unmittelbar aus der Vollblutprobe isoliert wird.
14. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch,
dadurch gekennzeichnet, daß anschließend an die
Isolation der mRNS ein DNS-Verdau durchgeführt
wird.
15. Verfahren nach einem der vorhergehenden
Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die gewonnene
mRNS in cDNS revers transkribiert wird und
anschließend das Vorhandensein oder Fehlen der cDNS
erfaßt wird, die dem Tumormarkerprotein
zugeordnet ist.
16. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch,
dadurch gekennzeichnet, daß zumindest ein
vorbestimmter Abschnitte der cDNS durch Polymerase-
Kettenreaktion ("PCR") vervielfältigt wird.
17. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch,
dadurch gekennzeichnet, daß zur Vervielfältigung
der cDNS eines oder mehrere Oligonukleotid-Paare
verwendet werden, die die folgenden Sequenzen
aufweisen:
AACCCATGAGGCGGAGCAGAATGA und CGTTGGCGATGCATTTTAAGCTCT
und/oder
AGTCGGGCTCTGGAGGAAAAGAAA und GATCATAATTCCTCTGCACATAGG
und/oder
AGAAATGACGCAAGAGCCTATGTA und
AACTTGTGTGTGTTGCTGCGGTAT.
AACCCATGAGGCGGAGCAGAATGA und CGTTGGCGATGCATTTTAAGCTCT
und/oder
AGTCGGGCTCTGGAGGAAAAGAAA und GATCATAATTCCTCTGCACATAGG
und/oder
AGAAATGACGCAAGAGCCTATGTA und
AACTTGTGTGTGTTGCTGCGGTAT.
18. Verfahren nach einem der vorhergehenden
Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als interne
Kontrolle die mRNS des Proteins β-Aktin bestimmt
wird.
19. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch,
dadurch gekennzeichnet, daß die mRNS für β-Aktin in
cDNS revers transkribiert und ein Abschnitt der
cDNS mittels Polymerasekettenreaktion
vervielfältigt wird.
20. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch,
dadurch gekennzeichnet, daß zur Vervielfältigung
der cDNS des β-Aktin ein Oligonukleotid-Paar
verwendet wird, wobei die Oligonukleotide des Paares
die folgenden Sequenzen aufweisen:
CTCTTCCAGCCTTCCTTCCT und AGCACTGTGTTGGCGTACAG.
CTCTTCCAGCCTTCCTTCCT und AGCACTGTGTTGGCGTACAG.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 20,
dadurch gekennzeichnet, daß der vervielfältigte
cDNS-Abschnitt durch geeignete Restriktionsenzyme
verdaut und anhand der erzeugten cDNS-Bruchstücke
das Vorhandensein oder Fehlen der mRNS eines
Tumormarkerproteins bestimmt wird.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 20,
dadurch gekennzeichnet, daß zum Nachweis der
amplifizierten cDNS-Abschnitte eine Gelelektrophorese
der PCR-Produkte durchgeführt wird.
23. Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 20,
dadurch gekennzeichnet, daß zum Nachweis der
amplifizierten cDNS-Abschnitte eine Fragmentanalyse
durchgeführt wird.
24. Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 20,
dadurch gekennzeichnet, daß während des Verlaufs
der Polymerasekettenreaktion die von den
Produkten erzeugte Fluoreszenz erfaßt und die
Produktentwicklung erfaßt wird (fluoreszenzbasierte
Echtzeit-PCR).
25. Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 20,
dadurch gekennzeichnet, daß zum Nachweis der mRNS
oder cDNS ein Nukleotid-Mikroarray nach einem der
Ansprüche 21 oder 22 verwendet wird.
26. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch,
dadurch gekennzeichnet, daß zum Nachweis der
amplifizierten cDNS das PCR-Produkt auf ein Nukleotid-
Mikroarray nach einem der Ansprüche 43 oder 44
aufgetragen wird.
27. Diagnose-Kit zur Diagnostik oder
Behandlungskontrolle von Brustkrebs mit mindestens einem Paar
Oligonukleotide (Reverseprimer, Forwardprimer),
wobei die beiden Oligonukleotide des Paares als Primer zur Amplifikation mittels Polymerasekettenreaktion jeweils eines der beiden komplementären Stränge eines gesuchten DNS-Abschnittes geeignet sind, und
wobei der gesuchte DNS-Abschnitt Teil der cDNS zu einem der CK20, EGF-R, CEA, Stanniocalcin, CK20, MAGE-3 und/oder CA-15(III) ist.
wobei die beiden Oligonukleotide des Paares als Primer zur Amplifikation mittels Polymerasekettenreaktion jeweils eines der beiden komplementären Stränge eines gesuchten DNS-Abschnittes geeignet sind, und
wobei der gesuchte DNS-Abschnitt Teil der cDNS zu einem der CK20, EGF-R, CEA, Stanniocalcin, CK20, MAGE-3 und/oder CA-15(III) ist.
28. Diagnose-Kit nach dem vorhergehenden Anspruch,
dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens vier
Paare Oligonukleotide (Reverseprimer,
Forwardprimer) enthält,
wobei die beiden Oligonukleotide der jeweiligen Paare als Primer zur Amplifikation mittels Polymerasekettenreaktion jeweils eines der beiden komplementären Stränge verschiedener gesuchter DNS-Abschnitte geeignet sind, und
wobei die gesuchten DNS-Abschnitt jeweils Teil der c-DNS zu verschiedenen Tumormarkerproteinen ausgewählt aus den Tumormarkerproteinen CK20, EGF-R, CEA und Stanniocalcin bzw. CK20, MAGE-3 und CA-15(III) sind.
wobei die beiden Oligonukleotide der jeweiligen Paare als Primer zur Amplifikation mittels Polymerasekettenreaktion jeweils eines der beiden komplementären Stränge verschiedener gesuchter DNS-Abschnitte geeignet sind, und
wobei die gesuchten DNS-Abschnitt jeweils Teil der c-DNS zu verschiedenen Tumormarkerproteinen ausgewählt aus den Tumormarkerproteinen CK20, EGF-R, CEA und Stanniocalcin bzw. CK20, MAGE-3 und CA-15(III) sind.
29. Diagnose-Kit nach einem der beiden vorhergehenden
Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es ein
weiteres Paar Oligonukleotide enthält, die
jeweils als Primer zur Amplifikation zumindest
eines Abschnitts eines der beiden komplementären
Stränge der cDNS zu dem Protein β-Aktin als
interne Kontrolle geeignet sind.
30. Diagnose-Kit nach dem vorhergehenden Anspruch,
dadurch gekennzeichnet, daß die beiden
Oligonukleotide eines Paares paarweise die folgenden
Sequenzen aufweisen:
AACCCATGAGGCGGAGCAGAATGA und CGTTGGCGATGCATTTTAAGCTCT
und/oder
AGTCGGGCTCTGGAGGAAAAGAAA und GATCATAATTCCTCTGCACATAGG
und/oder
AGAAATGACGCAAGAGCCTATGTA und
AACTTGTGTGTGTTGCTGCGGTAT.
AACCCATGAGGCGGAGCAGAATGA und CGTTGGCGATGCATTTTAAGCTCT
und/oder
AGTCGGGCTCTGGAGGAAAAGAAA und GATCATAATTCCTCTGCACATAGG
und/oder
AGAAATGACGCAAGAGCCTATGTA und
AACTTGTGTGTGTTGCTGCGGTAT.
31. Diagnose-Kit nach einem der beiden vorhergehenden
Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zumindest
jeweils eines der beiden Oligonukleotide eines
Paares von Oligonukleotiden mit Fluorophoren
markiert ist.
32. Diagnose-Kit nach dem vorhergehenden Anspruch,
dadurch gekennzeichnet, daß die Oligonukleotide
verschiedener Paare mit verschiedenen
Fluorophoren markiert sind.
33. Diagnose-Kit nach einem der Ansprüche 27 bis 32,
dadurch gekennzeichnet, daß es zur Amplifikation
der cDNS zu β-Aktin ein Paar Oligonukleotide mit
den folgenden Sequenzen enthält:
CTCTTCCAGCCTTCCTTCCT und AGCACTGTGTTGGCGTACAG.
CTCTTCCAGCCTTCCTTCCT und AGCACTGTGTTGGCGTACAG.
34. Diagnose-Kit nach dem vorhergehenden Anspruch,
dadurch gekennzeichnet, daß zumindest jeweils
eines der beiden Oligonukleotide des Paares zur
Amplifikation der cDNS zu β-Aktin mit Fluorophoren
markiert ist.
35. Diagnose-Kit nach einem der Ansprüche 27 bis 34,
dadurch gekennzeichnet, daß es die zur
Durchführung einer Polymerasekettenreaktion
erforderlichen Substanzen enthält.
36. Diagnose-Kit nach einem der Ansprüche 27 bis 35,
dadurch gekennzeichnet, daß es als zur
Durchführung einer Polymerasekettenreaktion erforderliche
Substanzen eine Pufferlösung, Magnesiumchlorid,
Desoxynukleotid-Triphosphate sowie eine
hitzestabile Polymerase enthält.
37. Diagnose-Kit nach dem vorhergehenden Anspruch,
dadurch gekennzeichnet, daß es als hitzestabile
Polymerase eine Polymerase aus Thermus aquaticus
(Taq-Polymerase) enthält.
38. Diagnose-Kit nach einem der Ansprüche 27 bis 37,
dadurch gekennzeichnet, daß es als
Positivkontrolle eine DNS-Probe mit dem jeweils gesuchten
DNS-Abschnitt enthält.
39. Diagnose-Kit nach einem der Ansprüche 27 bis 38,
dadurch gekennzeichnet, daß es
eine Anleitung zur Durchführung der Polymerasekettenreaktion und/oder
eine Anleitung zur Durchführung einer Fragmentanalyse enthält.
eine Anleitung zur Durchführung der Polymerasekettenreaktion und/oder
eine Anleitung zur Durchführung einer Fragmentanalyse enthält.
40. Diagnose-Kit nach einem der Ansprüche 27 bis 39,
dadurch gekennzeichnet, daß es ein Schema zur
Auswertung der erhaltenen Meßergebnisse enthält.
41. Diagnose-Kit nach einem der Ansprüche 27 bis 40,
dadurch gekennzeichnet, daß es einen Mikroarray
(DNS-Chip) enthält, wobei der Array eine Anzahl
voneinander getrennter Zellen (Felder) aufweist
und in mindestens einer Zelle des Mikroarrays ein
Oligonukleotid angeordnet ist, das mit dem
gesuchten DNS-Abschnitt hybridisiert.
42. Diagnosekit nach dem vorhergehenden Anspruch,
dadurch gekennzeichnet, daß in mindestens einer
weiteren Zelle des Mikroarrays ein weiteres
Oligonukleotid angeordnet ist und die Sequenz des
Oligonukleotids, das in der mindestens einen
Zelle angeordnet ist, sich von der Sequenz des
weiteren Oligonukleotides unterscheidet.
43. Diagnose-Kit nach einem der beiden vorhergehenden
Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß in
mindestens zwei Zellen jeweils ein Oligonukleotid
angeordnet ist, wobei die in verschiedenen Zellen
angeordneten Oligonukleotide jeweils mit
verschiedenen gesuchten DNS-Abschnitten
hybridisieren.
44. Mikroarray zur Diagnostik oder
Behandlungskontrolle von Brustkrebs, beispielsweise DNS-Chip,
mit einer Anordnung von mehreren, voneinander
getrennten Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß in
mindestens einer Zelle ein Oligonukleotid
angeordnet ist, das mit einem DNS-Abschnitt
hybridisiert, der Teil der cDNS zu einem der
Tumormarkerproteine EGF-R, CEA, Stanniocalcin, CK20,
MAGE-3 und/oder CA-15(III) ist.
45. Mikroarray nach Anspruch 44 dadurch
gekennzeichnet, daß in zwei bis vier Zellen jeweils
verschiedene Oligonukleotide angeordnet sind, die
mit jeweils zwei bis vier verschiedenen DNS-
Abschnitten, die Teil der cDNS von jeweils
verschiedenen Tumormarkerproteinen ausgewählt aus
den Tumormarkerproteinen Tumormarkerproteine
CK20, EGF-R, CEA, Stanniocalcin, CK20, MAGE-3
und/oder CA-15(III) sind, hybridisieren.
46. Verwendung eines Diagnose-Kits, eines Mikroarrays
und/oder eines Verfahrens nach einem der
vorhergehenden Ansprüche zur Diagnose von Erkrankungen
oder Metastasierung oder zur Behandlungskontrolle
bei Brustkrebs.
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ES02732726T ES2253533T3 (es) | 2001-09-06 | 2002-05-17 | Procedimiento para la deteccion cualitativa y/o cuantitativa de celulas. |
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US10/488,828 US20050014208A1 (en) | 2001-09-06 | 2002-09-06 | Method and kit for diagnosing or controlling the treatment of breast cancer |
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Families Citing this family (31)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6692952B1 (en) * | 1999-11-10 | 2004-02-17 | Massachusetts Institute Of Technology | Cell analysis and sorting apparatus for manipulation of cells |
ES2375724T3 (es) * | 2002-09-27 | 2012-03-05 | The General Hospital Corporation | Dispositivo microflu�?dico para seperación de células y sus usos. |
EP1604184A4 (de) * | 2003-02-27 | 2010-10-27 | Stephen A Lesko | Standardisierte bewertung von therapeutischer wirksamkeit auf basis zellulärer biomarker |
AU2004250131A1 (en) * | 2003-06-13 | 2004-12-29 | The General Hospital Corporation | Microfluidic systems for size based removal of red blood cells and platelets from blood |
US20050112622A1 (en) | 2003-08-11 | 2005-05-26 | Ring Brian Z. | Reagents and methods for use in cancer diagnosis, classification and therapy |
US20060003391A1 (en) * | 2003-08-11 | 2006-01-05 | Ring Brian Z | Reagents and methods for use in cancer diagnosis, classification and therapy |
US20050153309A1 (en) | 2003-12-22 | 2005-07-14 | David Hoon | Method and apparatus for in vivo surveillance of circulating biological components |
EP1776449A4 (de) * | 2004-03-03 | 2009-08-12 | Gen Hospital Corp | Magnetvorrichtung zur isolierung von zellen und biomolekülen in einer mikrofluidischen umgebung |
CA2576702C (en) * | 2004-08-11 | 2016-10-04 | Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University | Isolation, gene expression, and chemotherapeutic resistance of motile cancer cells |
US20070026417A1 (en) * | 2005-07-29 | 2007-02-01 | Martin Fuchs | Devices and methods for enrichment and alteration of circulating tumor cells and other particles |
JP2008538282A (ja) * | 2005-04-05 | 2008-10-23 | セルポイント ダイアグノスティクス, インコーポレイテッド | 装置および循環腫瘍細胞および他の粒子の濃縮および変更のための方法 |
US20070026413A1 (en) * | 2005-07-29 | 2007-02-01 | Mehmet Toner | Devices and methods for enrichment and alteration of circulating tumor cells and other particles |
US20070026415A1 (en) * | 2005-07-29 | 2007-02-01 | Martin Fuchs | Devices and methods for enrichment and alteration of circulating tumor cells and other particles |
US20070196820A1 (en) | 2005-04-05 | 2007-08-23 | Ravi Kapur | Devices and methods for enrichment and alteration of cells and other particles |
US20070020670A1 (en) * | 2005-07-07 | 2007-01-25 | Hematologics, Inc. | Methods for detecting and confirming minimal disease |
US8921102B2 (en) * | 2005-07-29 | 2014-12-30 | Gpb Scientific, Llc | Devices and methods for enrichment and alteration of circulating tumor cells and other particles |
US20070026416A1 (en) * | 2005-07-29 | 2007-02-01 | Martin Fuchs | Devices and methods for enrichment and alteration of circulating tumor cells and other particles |
US20090181421A1 (en) * | 2005-07-29 | 2009-07-16 | Ravi Kapur | Diagnosis of fetal abnormalities using nucleated red blood cells |
US20070059680A1 (en) * | 2005-09-15 | 2007-03-15 | Ravi Kapur | System for cell enrichment |
US20070059683A1 (en) * | 2005-09-15 | 2007-03-15 | Tom Barber | Veterinary diagnostic system |
US20070059781A1 (en) * | 2005-09-15 | 2007-03-15 | Ravi Kapur | System for size based separation and analysis |
EP2589668A1 (de) | 2006-06-14 | 2013-05-08 | Verinata Health, Inc | Analyse seltener Zellen mittels Probentrennung und DNA-Etiketten |
US20080050739A1 (en) * | 2006-06-14 | 2008-02-28 | Roland Stoughton | Diagnosis of fetal abnormalities using polymorphisms including short tandem repeats |
US8137912B2 (en) | 2006-06-14 | 2012-03-20 | The General Hospital Corporation | Methods for the diagnosis of fetal abnormalities |
US20080124721A1 (en) * | 2006-06-14 | 2008-05-29 | Martin Fuchs | Analysis of rare cell-enriched samples |
WO2007147074A2 (en) | 2006-06-14 | 2007-12-21 | Living Microsystems, Inc. | Use of highly parallel snp genotyping for fetal diagnosis |
EP2145188A4 (de) * | 2007-04-19 | 2010-06-30 | Wellstat Biologics Corp | Nachweis von her2/neu-protein aus nichtisolierten zirkulierenden krebszellen und behandlung |
CA2737643C (en) | 2008-09-20 | 2020-10-06 | Hei-Mun Fan | Noninvasive diagnosis of fetal aneuploidy by sequencing |
US8187979B2 (en) * | 2009-12-23 | 2012-05-29 | Varian Semiconductor Equipment Associates, Inc. | Workpiece patterning with plasma sheath modulation |
US20140147861A1 (en) * | 2012-05-04 | 2014-05-29 | The Regents of the University of Califomia | Markers to identify primary cells from tumor biopsies |
RU2537263C2 (ru) * | 2012-10-22 | 2014-12-27 | Федеральное Государственное Бюджетное Образовательное Учреждение Высшего Профессионального Образования "Нижегородский Государственный Университет Им. Н.И. Лобачевского" | Способ скрининга и мониторинга онкологических заболеваний и набор для его осуществления (варианты) |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1997007242A1 (en) * | 1995-08-16 | 1997-02-27 | Steven Lehrer | Method for detecting circulating breast cancer cells |
WO1997035589A1 (en) * | 1996-03-26 | 1997-10-02 | Kopreski Michael S | Method enabling use of extracellular rna extracted from plasma or serum to detect, monitor or evaluate cancer |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1991004059A2 (en) * | 1989-09-14 | 1991-04-04 | Baxter International Inc. | Method and useful apparatus for preparing pharmaceutical compositions |
US6165467A (en) * | 1991-07-20 | 2000-12-26 | Yoshihide Hagiwara | Stabilized human monoclonal antibody preparation |
ATE172890T1 (de) * | 1995-02-21 | 1998-11-15 | Iqbal W Dr Siddiqi | Apparat und verfahren zum mischen und trennen durch verwendung von magnetischen teilchen |
GB9518156D0 (en) * | 1995-09-06 | 1995-11-08 | Medical Res Council | Method of isolating cells |
-
2001
- 2001-09-06 DE DE10143776A patent/DE10143776A1/de not_active Withdrawn
-
2002
- 2002-09-06 US US10/488,828 patent/US20050014208A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1997007242A1 (en) * | 1995-08-16 | 1997-02-27 | Steven Lehrer | Method for detecting circulating breast cancer cells |
WO1997035589A1 (en) * | 1996-03-26 | 1997-10-02 | Kopreski Michael S | Method enabling use of extracellular rna extracted from plasma or serum to detect, monitor or evaluate cancer |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
Datenbank MEDLINE bei STN, AN 2000232140 zu: Selection of mRNA markers for detection of lymph node micrometastases in breast cancer patients, OOKA, M. u.a., ONCOLOGY REPORTS, (2000 May-June) 7(3) 561-6 (recherchiert am 06.05.2002) * |
Datenbank MEDLINE bei STN, AN 2002014550 zu: Tumor markers in breast cancer monitoring should be scheduled according to initial stage and follow-up time: a prospective study on 859 patients, GION, M. u.a., CANCER JOURNAL, (2001 May-June) 7 (3) 181-90 (recherchiert am 06.05.2002) * |
Detection of circulating tumor cells in carcinoma patients by a novel epidermal growth factor receptor reverse transcription-pcr assay, DELUCA, A. u.a., Clinical Cancer Research (2000) 6, 1439-1444 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20050014208A1 (en) | 2005-01-20 |
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