DE10049363A1 - Verfahren, Diagnose-Kit und Mikroarray zur Bestimmung des Rhesusfaktors - Google Patents

Verfahren, Diagnose-Kit und Mikroarray zur Bestimmung des Rhesusfaktors

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Abstract

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren, ein Diagnose-Kit, ein Mikroarray (z. B. DNS-Chip) sowie deren Verwendung zur Bestimmung des Rhesus-Faktors eines Menschen, insbesondere eines menschlichen Fötus zur Verwendung beispielsweise im Bereich der Medizin, insbesondere in der Pränatal-Diagnose. DOLLAR A Das erfindungsgemäße Diagnose-Kit enthält mindestens ein Paar Oligonukleotide (Reverseprimer, Forwardprimer), wobei die beiden Oligonukleotide des Paares als Primer zur Amplifikation mittels Polymerasekettenreaktion jeweils eines der beiden komplementären Stränge eines DNS-Abschnittes des menschlichen RhD-Gens geeignet sind.

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Ver­ fahren, ein Diagnose-Kit, ein Mikroarray (z. B. DNS- Chip) sowie deren Verwendung zur Bestimmung des Rhe­ sus-Faktors eines Menschen, insbesondere eines menschlichen Fötus. Derartige Verfahren und Diagnose- Kits werden im Bereich der Medizin, insbesondere in der Pränatal-Diagnose, verwendet.
Ziel derartiger Pränatal-Diagnosen ist es, den Rhe­ sus-Faktor eines Menschen, insbesondere eines Fötus, zuverlässig zu erfassen.
Der Rhesus-Faktor besitzt große klinische Bedeutung, insbesondere für hämolytische Krankheiten von Neuge­ borenen, Unverträglichkeitsreaktionen bei Transfusio­ nen und bestimmten hämolytischen Autoimmunkrankhei­ ten. Die Antigene des Rhesusfaktorsystems werden auf Polypeptiden exprimiert, die durch zwei stark homolo­ ge Gene RhD und RhCE exprimiert werden. Das RhD- Antigen legt fest, ob ein Mensch Rhesus-positiv oder Rhesus-negativ ist. Verschiedene RhD-Varianten ent­ stehen aufgrund von Genkonversion zwischen RhD- und RhCE oder durch Mutationen in dem RhD-Gen, die einen Aminosäurenaustausch bewirken.
Nach dem Stand der Technik stehen für die Bestimmung des Rhesus-Faktors serologische Verfahren zur Verfü­ gung.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Diagnose-Kit, ein Mikroarray, ein Verfahren sowie Verwendungen hierfür anzugeben, mit dem eine sichere und zuverlässige Bestimmung des Rhesus-Faktors eines Menschen möglich ist.
Diese Aufgabe wird durch das Diagnose-Kit nach An­ spruch 1, den Mikroarray nach Anspruch 21, das Ver­ fahren nach Anspruch 24 sowie die Verwendung nach An­ spruch 42 gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen des erfindungsgemäßen Diagnose-Kits, des erfindungsgemä­ ßen Verfahrens und der erfindungsgemäßen Verwendung sind in den jeweiligen abhängigen Ansprüchen gegeben.
Das erfindungsgemäße Diagnose-Kit enthält mindestens ein Paar Oligonukleotide, die als Reversprimer und Forwardprimer bei der Amplifikation mittels Polymera­ se-Kettenreaktion erforderlich sind. Derartige Oligo­ nukleotid-Paare werden auch bei dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt. Die Oligonukleotide dieses Paa­ res sind dabei so ausgesucht, daß bei Einsatz dieser Oligonukleotide in einer Polymerase-Kettenreaktion ein DNS-Abschnitt einer menschlichen DNS amplifiziert wird, der Teil der DNS des menschlichen RhD-Genes ist. Erfolgt eine Amplifikation eines DNS-Abschnittes bei einer derart durchgeführten Polymerase-Ketten­ reaktion, so kann einfach festgestellt werden, ob ein RhD-Gen in der untersuchten DNS-Substanz vorliegt oder nicht. Folglich läßt sich mit hoher Wahrschein­ lichkeit feststellen, ob der Mensch Rhesus-positiv oder Rhesus-negativ ist.
Vorteilhaft ist es, wenn zur Amplifikation sechs Oli- gonukleotid-Paare eingesetzt werden bzw. in dem Kit enthalten sind, durch die bei Rhesus-positiven Indi­ viduen sechs Amplifikate gebildet werden, während in Rhesus-negativen Individuen keines der Fragmente er­ zeugt wird. Das erfindungsgemäße Kit und Verfahren erlaubt bei geeigneter Auswahl der Oligonukleotid- Paare weiterhin die Erfassung von Rhesus-Subtypen, die durch den Verlust eines oder mehrerer RhD-Exons zustande kommt (RhD/RhCE-Genkonversion dieser Berei­ che) und sich serologisch durch eine schwächere Immu­ nogenität auszeichnen.
Vorteilhafterweise werden bei den Verfahren einge­ setzt bzw. enthält der Kit also mehrere Paare Oligo­ nukleotide, die beispielsweise jeweils einen Ab­ schnitt aus verschiedenen Exons (Kodierteilbereiche) des RhD-Gens amplifizieren. So lassen sich auch ver­ schiedene Untergruppen des Rhesusfaktors erfassen, indem mittels einer Multiplex-Polymerase-Kettenreak­ tion nicht nur das Vorhandensein des RhD-Gens gene­ rell festgestellt wird, sondern auch mögliche Ände­ rungen in einzelnen Exons dieses RhD-Gens. Vorteil­ hafterweise weisen die Oligonukleotide eines Paares jeweils eine der folgenden Sequenzpaare auf:
TCGGTGCTGATCTCAGTGGA und ACTGATGACCATCCTCATGT
bzw.
CACATGAACATGATGCACA und CAAACTGGGTATCGTTGCTG
bzw.
GTGGATGTTCTGGCCAAGTT und CACCTTGCTGATCTTACC
bzw.
GTGGCTGGGCTGATCTACG und TGTCTAGTTTCTTACCGGCAAGT
bzw.
AGCTCCATCATGGGCTACAA und ATTGCCGGCTCCGACGGTATC
bzw.
AACAGGTTTGCTCCTAAATATT
und
AAACTTGGTCATCAAAATATTTAACCT
Diese Oligonukleotidpaare führen im Falle des Vorhan­ denseins der entsprechenden Exons des RhD-Gens zur Amplifikation der Exons 3, 4, 5, 6, 7 bzw. des Exons 9 des RhD-Gens. Zur leichteren Unterscheidung der einzelnen Amplifikationsprodukte kann jeweils ein Oligonukleotid eines Primerpaares mittels eines Fluo­ rophors markiert sein, so daß eine Auswertung bei­ spielsweise mittels ABI Genetic Analyzer™ der Firma PE Biosystems™ möglich ist.
Vorteilhafterweise enthält das Diagnose-Kit weiterhin die zur Durchführung einer Polymerase-Kettenreaktion erforderlichen Substanzen, wie sie bereits von ver­ schiedenen Herstellern angeboten werden.
Die Bestimmung des Vorhandenseins bzw. der alleli­ schen Variabilität des RhD-Gens kann mittels eines Mikroarrays, z. B. DNA-Chips, erfolgen, wobei die ein­ zelnen Zellen des Chips Oligonukleotide aufweisen, die spezifisch mit bestimmten Abschnitten des RhD- Gens, beispielsweise der Exons 3 bis 7 und/oder 9 hy­ bridisieren. Zum Aufbau und der Funktion eines Oligo­ nukleotid-Mikroarrays wird beispielhaft allgemein auf die EP 0 373 203 verwiesen. Die Bestimmung kann dabei mit oder ohne Amplifikation des gesuchten DNS- Abschnitts und ohne oder nach einem geeigneten Re­ striktionsverdau des gesuchten DNS-Abschnitts erfol­ gen.
Das erfindungsgemäße Verfahren, der erfindungsgemäße Nukleinsäure-Chip und insbesondere das erfindungsge­ mäße Diagnose-Kit besitzt den großen Vorteil, daß je­ der Laborarzt und jedes medizinische Labor sowie je­ des wissenschaftliche Labor, das derartige Untersu­ chungen durchführen möchte, die wesentlichen bzw. sämtliche aufeinander abgestimmte Substanzen gegebe­ nenfalls in einem einzigen Diagnose-Kit zur Verfügung erhält, so daß die aufwendigen bzw. jegliche Vorbe­ reitungsarbeiten für die Labore entfallen und auf einfache Weise der Rhesus-Faktor eines Menschen, ins­ besondere eines Fötus, bestimmt werden kann. Insbe­ sondere sind die Primer-Oligonukleotide entwickelt und bereits ausgetestet, so daß die Hauptarbeit bei der Entwicklung entsprechender Amplifikationsprozedu­ ren entfällt. Denn die Auswahl geeigneter Oligonu­ kleotide, die dann in der Praxis auch tatsächlich zu dem gewünschten, sicheren Resultat führen, ist kei­ neswegs trivial und für ein medizinisches oder wis­ senschaftliches Labor nicht ohne weiteres durchzufüh­ ren.
Mit dem vorgestellten Verfahren, dem Mikroarray und Diagnose-Kit ist es insbesondere erstmals möglich, die Bestimmung des Rhesus-Faktors eines Fötus aus dem Blut der Mutter nichtinvasiv in großem Maßstab und am jeweiligen Ort auf einfache und kostengünstige Weise durchzuführen. Denn hierzu benötigt der einzelne La­ borarzt bzw. das einzelne medizinische Labor ledig­ lich noch eine Tischzentrifuge, einen herkömmlichen Thermocycler (PCR-Gerät) sowie gegebenenfalls ein Ge­ rät zur Auftrennung der einzelnen DNS-Fragmente. Der­ artige Geräte sind jedoch in vielen medizinischen La­ bors bereits vorhanden. Dies kann beispielsweise eine Gelelektrophoreseeinheit oder ein Kapillarelektropho­ resegerät sein.
Ein derartiges herkömmliches Kapillarelektrophorese­ gerät wird beispielsweise von PE BiosystemsTM unter dem Namen PE ABI Genetic Analyzer 310TM vertrieben. Entsprechende Thermocycler für die Amplifikation der DNS werden beispielsweise von der Firma PE Biosy­ stemsTM unter dem Namen Gene Amp 2400TM bzw. auch Gene Amp 9700TM vertrieben.
Erfindungsgemäß kann das Diagnose-Kit auch dahinge­ hend weitergebildet werden, daß dem Diagnose-Kit nicht nur Oligonukleotide für die Bestimmung des Rhe­ sus-Faktors des Fötus, wie oben beschrieben, sondern auch weitere Oligonukleotidpaare für weitere Bestim­ mungen beigegeben werden. Entsprechend können in wei­ teren Zellen des Chips entsprechende Oligonukleotide angeordnet sein, die mit DNS-Abschnitten weiterer, zu erfassender Gene hybridisieren.
In diesem Falle ist es dem Anwender möglich, auf ein­ fache Art und Weise nicht nur eine Bestimmung des Rhesusfaktors des Fötus, sondern zugleich auch weite­ re molekularbiologische Tests durchzuführen.
Erfindungsgemäß wird das Verfahren, der Mikroarray und das Diagnose-Kit zur Bestimmung des fötalen Rhe­ sus-Faktors verwendet, indem zuerst eine maternale Blutprobe genommen wird. Diese maternale Blutprobe kann nun auf verschiedene Weise weiterverarbeitet werden.
Zum einen werden die DNS-haltigen Bestandteile der maternalen Blutprobe anschließend aufkonzentriert. Dies erfolgt beispielsweise durch Blutsatz, gegebe­ nenfalls unterstützt durch Anzentrifugation zur Be­ schleunigung der Sedimentation der zellulären Be­ standteile. Durch diesen Schritt konzentriert sich die Zellfraktion in einem Blutsatz, der sich für die nachfolgende DNS-Isolierung eignet.
Der Blutsatz wird aufgenommen und eine Lyse der müt­ terlichen Erythrozyten sowie der nukleierten fötalen Erythrozyten durchgeführt, wodurch die DNS aus den fötalen Erythrozyten freigesetzt wird.
Anschließend erfolgt eine hochtourige Zentrifugation, beispielsweise bei 50.000 g für 30 Minuten, die zu einer Pelletierung von Zellen der Mutter und des Fö­ tus (z. B. Lymphozyten), der aus den fötalen Erythro­ zyten freigesetzten DNS des Fötus sowie zellfreier DNS vom Fötus mit Herkunft aus diversen Zelltypen, führt.
Daraufhin wird das Pellet aufgenommen und es erfolgt eine Lyse der Lymphozyten sowohl mütterlicher als auch fötaler Herkunft. Nach Proteinfällung werden die Proteine abzentrifugiert. Im Überstand befindet sich dann freie DNS der Mutter und des Fötus. Diese wird mit Isopropanol gefällt und anschließend abzentrifu­ giert. Das Pellet enthält dann die DNS von Mutter und Fötus und wird anschließend rehydriert.
Zum anderen kann für die Gewinnung der nachzuweisen­ den DNS auch das Plasma/Serum der maternalen Blutpro­ be verwendet werden. Hierfür wird gegebenenfalls zu­ erst mittels Blutsatz die Zellfraktion der Mutter und des Fötus in der Blutprobe absinken lassen oder durch anzentrifugieren abgetrennt. Der Überstand enthält dann zellfreie DNS, insbesondere zellfreie fötale DNS. Diese zellfreie DNS aus dem Plasma/Serum kann nun direkt abgetrennt werden. Bei diesem Verfahren wird der Anreicherungsschritt für die Zellen aus der ersten Variante vermieden. Denn eine Anreicherung oder Trennung der im Plasma/Serum enthaltenen DNS von Mutter und Fötus ist nicht erforderlich, da in dem Plasma/Serum etwa 800 mal mehr fötale DNS vorhanden ist als fötale DNS aus fötalen Zellen, die im mütter­ lichen Blut zirkulieren. Der Anteil der fötalen DNS an der gesamten im Plasma enthaltenen DNS liegt zwi­ schen ca. 3% und 7%. Insgesamt nimmt dabei die zellfreie fötale DNS im Laufe der Schwangerschaft stetig zu, im letzten Trimester der Schwangerschaft sogar sehr stark.
In einem weiteren Schritt kann dann diese zellfreie fötale DNS aus dem Plasma/Serum in herkömmlicher Wei­ se, beispielsweise mit kommerziell erhältlichem Kit, isoliert werden und ist damit für die weitere Unter­ suchung, z. B. durch Auftrag auf den erfindungsgemäßen Mikroarray, zugänglich.
Sowohl die DNS, die aus den fötalen nukleierten Zel­ len aus der maternalen Blutprobe als auch die DNS, die aus dem Serum/Plasma der maternalen Blutprobe ge­ wonnen wurde, wird gegebenenfalls anschließend wei­ terverarbeitet, indem eine spezifische Amplifikation der nachzuweisenden DNS-Abschnitte in der in dem Pel­ let enthaltenen DNS mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) bzw. Multiplex-PCR durchgeführt wird. Hierzu werden nun das erfindungsgemäße Diagnose-Kit bzw. die darin enthaltenen Primer-Paare verwendet.
Anschließend wird die amplifizierte DNS nachgewiesen.
Dies kann einerseits mittels des erfindungsgemäßen Mikroarrays oder durch Auftrennen über Gelelektropho­ rese erfolgen. Sofern eines der Oligonukleotide aus einem Primer-Paar mit einem Fluorophor markiert ist, kann der Nachweis über die Detektion der entsprechen­ den Fluoreszenz, beispielsweise in der entsprechenden Zelle des Chips, erfolgen. Dies kann beispielsweise jedoch auch mittels eine Genetic Analyzers 310TM der Firma PE BiosystemsTM erfolgen. Beide Verfahren wei­ sen eine sehr hohe Sensitivität und Zuverlässigkeit auf.
Die erhaltenen Fluoreszenzdaten werden ausgewertet und als Nachweis für den Rhesus-Faktor des Fötus ein­ gesetzt.
Bei dem vorliegenden Verfahren ist dabei zu beachten, daß keine Trennung der Bestandteile der maternalen Blutprobe beispielsweise in eine zelluläre oder nichtzelluläre Fraktion oder beispielsweise in eine Fraktion mit ausschließlich maternalen bzw. aus­ schließlich fötalen Bestandteilen durchgeführt wird. Das Verfahren ist daher sehr einfach durchzuführen.
Der Fall, bei dem sowohl die Mutter als auch der Fö­ tus Rhesus-positiv oder die Mutter als auch der Fötus Rhesus-negativ sind, weist medizinisch keinerlei Kom­ plikationen auf. Dasselbe gilt für den Fall, daß die Mutter Rhesus-positiv ist und der Fötus Rhesus­ negativ. Auch in diesem Falle treten keinerlei medi­ zinische Komplikationen auf.
Kritisch ist lediglich der Fall, wenn die Mutter Rhe­ sus-negativ und der Fötus Rhesus-positiv sind. In diesem Falle ist die Gefahr gegeben, daß die Mutter gegen den Rhesus-Faktor des Fötus Antikörper bildet und beispielsweise bei nachfolgenden Schwangerschaf­ ten und in sehr seltenen Fällen bereits in der lau­ fenden Schwangerschaft Immunreaktionen auftreten. Ge­ nau dieser Fall kann jedoch durch das vorliegende Verfahren einfach erfaßt werden, da ein Rhesus­ positiver Befund der wie oben aufgearbeiteten Blut­ probe im Falle einer Rhesus-negativen Mutter, deren Rhesusfaktor in herkömmlicher Weise, spätestens zu Beginn der Schwangerschaft, serologisch bestimmt wur­ de, eindeutig auf einen Rhesus-positiven Fötus schließen läßt. Wird in diesem Falle beispielsweise eine Fluoreszenz erfaßt, die von einem Oligonukleotid herrührt, das zu einem Primerpaar gehört, das zur Am­ plifikation eines DNS-Abschnittes aus einem RhD-Gen geeignet ist, so liegt zwangsläufig bei dem Fötus ein Rhesuspositiver Befund vor, da gemäß der Annahme die mütterlichen Bestandteile selbst kein RhD-Gen aufwei­ sen. In diesem Falle kann die herkömmliche Prophylaxe erfolgen. Im Falle einer Rhesus-negativen Mutter er­ folgt bisher immer eine Prophylaxe, obwohl sie nur bei einem Rhesus-positiven Fötus erforderlich ist. Wird also mit dem erfindungsgemäßen Kit ein Rhesus­ negativer Fötus festgestellt, so kann nunmehr die bisher übliche Prophylaxe bei der Mutter unterblei­ ben.
Das erfindungsgemäße Verfahren, das erfindungsgemäße Diagnose-Kit und seine Verwendung sind also dafür ge­ eignet, den einzig medizinisch relevanten Fall gesi­ chert und auf einfache Weise nachzuweisen.
Weiterhin ist es mit dem erfindungsgemäßen Verfahren und Kit möglich, Rhesus-Subtypen, die durch den Ver­ lust eines oder mehrerer RhD-Exons zustande kommen (RhD/RhCE-Gen-Konversion dieser Bereiche) und sich serologisch durch eine schwächere Immunogenität aus­ zeichnen, nachzuweisen.
Im folgenden sollen einige Beispiele des erfindungs­ gemäßen Verfahrens unter Verwendung erfindungsgemäßer Kits beschrieben werden.
Fig. 1 zeigt die Meßergebnisse einer Rhesus­ positiven Kontrollprobe;
Fig. 2 die Ergebnisse einer Rhesus-negativen Kon­ trollprobe und
Fig. 3 die Ergebnisse eine Multiplex-PCR.
Als Beispiel eines erfindungsgemäßen Verfahrens wurde einer Schwangeren eine frische Blutprobe entnommen und in EDTA-Puffer, beispielsweise in standardisiert, kommerziell verfügbaren EDTA-Röhrchen aufgenommen. Anschließend wurden 5 bis 10 ml des mütterlichen Blu­ tes für 20 Minuten bei 3000 g zentrifugiert. Das Plasma wird vorsichtig von den pelletierten Blutbe­ standteilen getrennt und erneut für 20 Minuten bei 3000 g zentrifugiert. Der Überstand wird anschließend in ein neues Gefäß überführt. Die kernfreie fötale DNS verbleibt bei dieser Prozedur im Plasma. Die DNS wird dann durch die Standardprozeduren des QIAamp Blood KitsTM (Firma Qiagen, Hilden) isoliert und kann für die Bestimmung des Rhesus-Faktors mit einem Pri­ merpaar (Single PCR) oder mit mehreren Primerpaaren gleichzeitig (Rhesus-Faktor-Multiplex-PCR) im folgen­ den eingesetzt werden.
Die Anreicherung kann in einem weiteren Beispiel auch durch eine Percoll-Dichtegradienten-Zentrifugation erfolgen.
Dieses Verfahren nutzt die Tatsache, daß bei einer konstanten Zentrifugalkraft und Mediumviskosität die Sedimentationsrate von Partikeln proportional zur Größe der Partikel ist. In dem vorliegenden Beispiel wurde PercollTM als Zentrifugationsmedium verwendet. Es handelt sich dabei um ein Silika-Derivat, das standardmäßig zur Anreicherung bzw. Trennung von sub­ zellulären Partikeln verwendet wird.
Zunächst wird ein kontinuierlicher Percoll-Gradient erzeugt, der einen Dichtebereich von 1,02-1,113 g/ml abdeckt. Hierzu wurden 14 ml einer Percoll-NaCl- Lösung mit einer Dichte von 1,07 g/ml bei 30 Minuten und 20.000 g zentrifugiert. Anschließend wird dieser kontinuierliche Gradient mit 10 ml mütterlichem Blut überschichtet und für 5 Minuten bei 1000 g zentrifu­ giert.
Nach diesem Zentrifugationsschritt finden sich die mütterlichen Thrombozyten in der Serumschicht ober­ halb des Gradienten und werden mit einer Pasteuerpi­ pette entfernt und verworfen. In einem weiteren Zen­ trifugationsschritt bei 1000 g über 5 Minuten werden die verbliebenen, unterschiedlichen Blutzellentypen entsprechend ihrer jeweiligen Dichten aufgetrennt. Die Sedimentationsschicht mit den fötalen mononuklea­ ren Erythrozyten findet sich als Bande bei einer Dichte von 1,09-1,10 g/ml und kann mit einer Pa­ steurpipette entnommen werden. Sie wird daraufhin dreimal mit Phosphat-Puffer-Saline (PBS, pH = 7,4) gewaschen und in 1 ml PBS resuspendiert. Die DNS der mononuklearen Blutzellen wird dann durch die Stan­ dardprozeduren des QIAamp Blood KitsTM (Firma Qiagen, Hilden) isoliert und anschließend für die nachfolgen­ de Single-PCR oder Rhesus-Faktor-Multiplex-PCR einge­ setzt.
Als ein weiteres Beispiel für eine Probenaufbereitung wird eine Blutprobe einer Schwangeren entnommen und in EDTA-Puffer, wie vorstehend ausgeführt, aufgenom­ men. Anschließend wird über Nacht ein Blutsatz durch­ geführt. Alternativ kann die Probe auch bei geringen g-Werten anzentrifugiert werden. Von diesem Blutsatz werden 500 µl in 900 µl Erythrozyten-Lysis-Puffer des WizzardTM-Kits der Firma PromegaTM aufgenommen. Darauf­ hin wurde in einer SorvallTM-Zentrifuge (Rotor SM 24) für 30 Minuten bei 50.000 g zentrifugiert. Hierdurch werden die vorwiegend maternalen Lymphozyten sowie die nach der Lysis der kindlichen Erythrozyten zell­ frei vorliegende DNS pelletiert. Aus dem Pellet wird nun mittels eines herkömmlichen kommerziellen DNS- Isolierungs-Kit (z. B. Wizzard-Kitz der Firma Prome­ gaTM) die DNS isoliert. Die gewonnene DNS wird in 20 µl der Dehydrierungslösung gemäß den jeweiligen DNS-Isolierungs-Kit aufgenommen.
Die Isolierung fötaler kernhaltiger Erythrozyten ist weiterhin mittels FACS-Durchflußcytometrie möglich. Hierzu erfolgt zunächst eine Anreicherung aller mono­ nuklearer Blutzellen mittels Percoll- Dichtegradienten-Zentrifugation (siehe oben). Die Se­ dimentationsschicht mit mononuklearen Blutzellen wird dabei mit einer Pasteurpipette entnommen, dreimal mit Phosphat-Puffer-Saline (PBS, pH = 7,4) gewaschen und schließlich in 1 ml PBS resuspendiert.
Im Anschluß an die Dichtegradienten-Zentrifugation werden 800 µl der erhaltenen Blutzellsuspension für 60 min bei 4°C mit einem Phycoerythrin-konjugierten monoklonalen Antikörper gegen das GlycophorinA-Ober­ flächenprotein (BD-PharMingen) und einem Fluorescein- Isothiocyanat (T9-FITC)-konjugierten monoklonalen An­ tikörper gegen den Transferrin-Rezeptor (CD36) (BD- PharMingen) inkubiert bzw. markiert. Ein dritter Fluoreszenz Kanal wird benutzt für die negative Dis­ kriminierung von T, B und NK Zellen. Die Endkonzen­ tration beider Antikörper beträgt jeweils 0,2 µg pro 107 Zellen. Die markierten Zellen werden zweimal PBS gewaschen und im Anschluß werden 107 Zellen in 1 ml PBS resuspendiert.
Für die Isolierung kernhaltiger Erythrozyten wird ein FACS Vantage SE-Durchflußzytometer (Becton-Dickinson) verwendet. Das System ist mit einem wassergekühlten dual Wellenlänge Argon-Laser (Emissionswellenlänge 488 nm und 365 nm-UV) und ein luftgekühlter Helium- Neon(HeNe) Laser konfiguriert und mit fluoreszieren­ den Beads (Becton Dickinson) kalibriert. Das Cell- Quest Programm wird verwendet für die Datenaufnahme, Instrumentkontrolle sowie die statistische Auswer­ tung. Die Sortierung der Blutzellen erfolgt mit Zell­ raten von 20.000-25.000 Zellen pro Sekunde, wobei die Zellgröße ("forward scatter"), und die Granulari­ tät, sowie die Oberflächenstruktur ("side scatter"), die Emission der grünen Fluoreszenz (Transferin- Rezeptor, T9-FITC), die Emission der orangen Fluores­ zenz (GlycophorinA, KC16-Rd) sowie die Emission der roten Fluoreszenz für die übrigen Parameter, wie CD45, CD3, CD19 und CD16/56 (APC oder Cy5 markiert), als Selektionskriterien verwendet werden. Um eine zu­ sätzliche Diskriminierung von kernhaltigen Zellen zu gewährleisten wird der Kernfarbstoff Hoechst 33342 verwendet. Die Anregung erfolgt gleichzeitig mit der UV-Linie des Enterprise Lasers. Die sortierten Zellen werden direkt in 1,5 ml Reaktionsgefäß, das mit 1 ml PBS gefüllt ist, überführt und können bei -20°C ge­ lagert werden.
Zwar wird bei dem vorgeschlagenen Verfahren die föta­ le DNS nicht vollständig von der mütterlichen DNS ge­ trennt. Sofern jedoch die Mutter Rhesus-negativ ist, weist ein positiver RhD-Nachweis jedoch immer auf ei­ nen Rhesus-positiven Fötus hin. Im Anschluß an die Isolierung der DNS wird eine Multiplex-PCR durchge­ führt.
Hierzu wurden die folgenden Primer verwendet, wobei jeweils ein Primer aus einem Primerpaar mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert ist. Die entsprechenden Primer werden in der folgenden Tabelle gegeben.
Tabelle 1
In der ersten Spalte der Tabelle ist dabei der Name des Primers angegeben. Weiterhin ist dort die Lokali­ sierung des zu amplifizierenden DNS-Abschnittes ange­ geben (Exon 3 bis 7, 9). In der zweiten Spalte der Tabelle ist die entsprechende Primersequenz angege­ ben, in der dritten Spalte der Fluoreszenzfarbstoff, mit dem der jeweilige Primer markiert ist. Dabei steht die Bezeichnung 5'-NED für das Fluorophor NEDTM der Firma PE Biosystems, die Bezeichnung 5'-HEX für den Farbstoff 4,7,2',4',5',7'-Hexachloro-6- Carboxyfluorescein und die Bezeichnung 5'-6-FAM für den Farbstoff Carboxyfluorescein.
In der letzten Spalte ist die Größe des Amplifika­ tionsproduktes angegeben, das bei einer PCR mit dem jeweiligen Primerpaar entsteht. Wie zu erkennen ist, ergeben sich zwei verschiedene Gruppen von Amplifika­ tionsprodukten mit Längen zwischen 52 und 91 Basen­ paaren bzw. Längen zwischen 108 und 153 Basenpaaren. Da diese ausreichend weit voneinander entfernt lie­ gen, kann in jeder der Gruppe einer der Farbstoffe wiederverwendet werden und dennoch eine zuverlässige Unterscheidung der einzelnen Amplifikationsprodukte erzielt werden.
Die PCR-Reaktionen wurden im vorliegenden Beispiel mit einem PCR-Blockcycler PE 9700 der Firma Applied Biosystems durchgeführt.
Als Reaktionsansatz wurde dabei die folgende Mischung verwendet, wobei als Reaktionsvolumen jeweils 100 µl eingesetzt wurden:
Die PCR wurde dabei mit dem folgenden Thermozyklus durchgeführt:
Zur Auswertung der PCR-Ergebnisse mittels ABI- Fragmentanalyse wurden die einzelnen PCR-Ansätze zu­ nächst unverdünnt eingesetzt, wobei für die einzelne Analyse jeweils 1 µl verwendet wurde.
Die jeweiligen Ergebnisse sind in den Fig. 1 und 2 dargestellt. Fig. 1 zeigt die Ergebnisse der PCR an einer serologisch für Rhesus-positiv bestimmten Blut­ probe mit jeweils verschiedenen Primerpaaren gemäß Tabelle 1. Es ist zu erkennen, daß in den Fig. 1A bis 1F jeweils eine starke Fluoreszenz von Amplifika­ tionsgsprodukten mit 108 Basenpaaren, 120 Basenpaa­ ren, 153 Basenpaaren, 52 Basenpaaren, 91 Basenpaaren bzw. 72 Basenpaaren Länge beobachtet wurden.
Die Signale im Bereich unterhalb von 40 Basenpaaren (s. insbesondere Fig. 1C) stammen vermutlich von un­ spezifischen Amplifikaten und beeinträchtigen das er­ findungsgemäße Verfahren nicht.
Fig. 2 zeigt die Ergebnisse einer PCR mit einer se­ rologisch als Rhesus-negativ bestimmten Blutprobe mit jeweils verschiedenen Primerpaaren gemäß Tabelle 1.
Es ist unmittelbar aus den Fig. 1A bis 1F zu er­ kennen, daß in dieser Blutprobe keine nennenswerten Mengen von Amplifikationsprodukten mit den zu erwar­ tenden Längen erfaßt werden konnten. Der serologische Befund wird folglich durch das erfindungsgemäße Ver­ fahren vollständig bestätigt.
Fig. 3 zeigt die Ergebnisse einer Multiplex-PCR, bei der sämtliche Primerpaare gemäß Tabelle 1 gleichzei­ tig eingesetzt wurden. Sämtliche PCR-Reaktionen wur­ den auf einem PCR-Blockcycler PE 9700 der Firma Applied Biosystems durchgeführt.
Für die PCR wurde folgender Reaktionsansatz bei einem Reaktionsvolumen von 50 µl verwendet:
Die PCR-Zyklen wurden mit folgenden Parametern durch­ geführt:
Die einzelnen PCR-Ansätze wurden zunächst unverdünnt eingesetzt, wobei für die Fragment-Analyse jeweils 1 µl verwendet wurde.
Fig. 3 zeigt die Ergebnisse zweier Messungen, wobei in Fig. 3A als PCR-Template zunächst Rhesus- positives Kontrollblut, wie es durch serologische Standardverfahren typisiert wurde, eingesetzt wurde. In Fig. 3B sind die Ergebnisse einer PCR mit einem PCR-Template aus Rhesus-negativem Kontrollblut zu se­ hen. Abweichend von den vorigen Messungen wurde in beiden Fällen das Albumin-Gen als Standard hinzuge­ fügt sowie die folgenden Primer:
Albumin fw: GCC CTC TGC TAA CAA GTC CTA C
sowie
Albumin rv: GCC CTA AIAA AGA AAA TCG CCA ATC
Der Vorwärtsprimer ("Albumin fw") ist dabei mit dem Fluoreszenzfarbstoff 5'-NedTM markiert.
Hierdurch ergab sich eine Bande bei 350 Basenpaaren für die Amplifikationsprodukte des Albumin-Gens.
In Fig. 3A sind weiterhin die jeweiligen Signale für die Amplifikationsprodukte sämtlicher 6 Primerpaare aus Tabelle 1 zu erkennen. Offensichtlich handelte es sich also um ein Rhesus-positives Blut, das hier un­ tersucht wurde.
In Fig. 3B ist zu erkennen, daß in einer entspre­ chenden Rhesus-negativen Kontrollprobe keinerlei Fluoreszenzbanden mit Ausnahme der Albuminbande bei 350 Basenpaaren beobachtet wurde. Das erfindungsgemä­ ße Kit, der erfindungsgemäße Mikroarray und das er­ findungsgemäße Verfahren eignen sich also auch mit Multiplex-PCR zur Unterscheidung zwischen Rhesus- negativem und Rhesus-positivem Blut sowie zur Bestim­ mung einzelner Subtypen.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims (42)

1. Diagnose-Kit für die Bestimmung des Rhesus- Faktors mit
mindestens einem Paar Oligonukleotide (Reverse­ primer, Forwardprimer),
wobei die beiden Oligonukleotide des Paares als Primer zur Amplifikation mittels Polymeraseket­ tenreaktion jeweils eines der beiden komplemen­ tären Stränge eines gesuchten DNS-Abschnittes geeignet sind, und
wobei der gesuchte DNS-Abschnitt Teil der DNS des menschlichen RhD-Gens ist.
2. Diagnose-Kit nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß es sechs Paare Oli­ gonukleotide (Reverseprimer, Forwardprimer) ent­ hält,
wobei die beiden Oligonukleotide der jeweiligen Paare als Primer zur Amplifikation mittels Poly­ merasekettenreaktion jeweils eines der beiden komplementären Stränge verschiedener gesuchter DNS-Abschnitte geeignet sind, und
wobei die gesuchten DNS-Abschnitt Teil der DNS des menschlichen RhD-Gens sind.
3. Diagnose-Kit nach einem der vorhergehenden An­ sprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die gesuch­ ten DNS-Abschnitte Teil von Kodierteilbereichen des RhD-Gens sind.
4. Diagnose-Kit nach einem der vorhergehenden An­ sprüche, dadurch gekennzeichnet, daß je einer der gesuchten DNS-Abschnitte Teil der Kodier­ teilbereiche 3, 4, 5, 6, 7 oder 9 sind.
5. Diagnose-Kit nach einem der vorhergehenden An­ sprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es die zur Durchführung einer Polymerasekettenreaktion er­ forderlichen Substanzen enthält.
6. Diagnose-Kit nach einem der vorhergehenden An­ sprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es als zur Durchführung einer Polymerasekettenreaktion er­ forderliche Substanzen eine Pufferlösung, Mag­ nesiumchlorid, Desoxynukleotid-Triphosphate, so­ wie eine hitzestabile Polymerase enthält.
7. Diagnose-Kit nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß es als hitzestabile Polymerase eine Polymerase aus Thermus aquaticus (Taq-Polymerase) enthält.
8. Diagnose-Kit nach einem der vorhergehenden An­ sprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es als Po­ sitivkontrolle eine DNS-Probe mit dem jeweils gesuchten DNS-Abschnitt enthält.
9. Diagnose-Kit nach einem der vorhergehenden An­ sprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es weiter­ hin für eine Kontrollbestimmung einen Abschnitt einer für ein Albumin kodierenden DNS sowie zwei Oligonukleotide, die jeweils als Primer zur Am­ plifikation zumindest eines Abschnitts jeweils eines der beiden komplementären Stränge der für das Albumin kodierenden DNS geeignet sind, ent­ hält.
10. Diagnose-Kit nach einem der vorhergehenden An­ sprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zumindest jeweils eines der beiden Oligonukleotide eines Paares von Oligonukleotiden mit Fluorophoren markiert ist.
11. Diagnose-Kit nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß die Oligonukleotide verschiedener Paare mit verschiedenen Fluoropho­ ren markiert sind.
12. Diagnose-Kit nach einem der vorhergehenden An­ sprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die beiden Oligonukleotide eines Paares paarweise die fol­ genden Sequenzen aufweisen:
TCGGTGCTGATCTCAGTGGA und ACTGATGACCATCCTCATGT
bzw.
CACATGAACATGATGCACA und CAAACTGGGTATCGTTGCTG
bzw.
GTGGATGTTCTGGCCAAGTT und CACCTTGCTGATCTTACC
bzw.
GTGGCTGGGCTGATCTACG und TGTCTAGTTTCTTACCGGCAAGT
bzw.
AGCTCCATCATGGGCTACAA und ATTGCCGGCTCCGACGGTATC
bzw.
AACAGGTTTGCTCCTAAATATT und AAACTTGGTCATCAAAA­ TATTTAACCT
13. Diagnose-Kit nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß die Oligonukleotide mit folgender Sequenz
GTGGATGTTCTGGCCAAGTT bzw. AGCTCCATCATGGGCTACAA
mit dem Fluorophor Carboxyfluorescein markiert sind.
14. Diagnose-Kit nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß die Oligonukleotide mit der Sequenz
CACATGAACATGATGCACA bzw. AACAGGTTTGCTCCTAAATATT
mit dem Fluorophor 4,7,2',4',5',7'-Hexachloro-6- Carboxyfluorescein markiert sind.
15. Diagnose-Kit nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß die Oligonukleotide mit der Sequenz
TCGGTGCTGATCTCAGTGGA bzw. GTGGCTGGGCTGATCTACG
mit dem Fluorophor NEDTM der Fa. PE Biosystems markiert sind.
16. Diagnose-Kit nach einem der vorhergehenden An­ sprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Anleitung zur Durchführung der Polymer­ asekettenreaktion und/oder eine Anleitung zur Durchführung einer Fragment­ analyse enthält.
17. Diagnose-Kit nach einem der vorhergehenden An­ sprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Schema zur Auswertung der erhaltenen Meßergeb­ nisse enthält.
18. Diagnose-Kit nach einem der vorhergehenden An­ sprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es einen Mikroarray (DNS-Chip) enthält, wobei der Array eine Anzahl voneinander getrennter Zellen (Fel­ der) aufweist und in mindestens einer Zelle des Mikroarrays ein Oligonukleotid angeordnet ist, das mit dem gesuchten DNS-Abschnitt hybridi­ siert.
19. Diagnose-Kit nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß in mindestens einer weiteren Zelle des Mikroarrays ein weiteres Oli­ gonukleotid angeordnet ist und die Sequenz des Oligonukleotids, das in der mindestens einen Zelle angeordnet ist, sich von der Sequenz des weiteren Oligonukleotides unterscheidet.
20. Diagnose-Kit nach einem der beiden vorhergehen­ den Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß in mindestens zwei Zellen jeweils ein Oligonukleo­ tid angeordnet ist, wobei die in verschiedenen Zellen angeordneten Oligonukleotide jeweils mit verschiedenen gesuchten DNS-Abschnitten hybridi­ sieren.
21. Mikroarray, beispielsweise DNS-Chip, mit einer Anordnung von mehreren, voneinander getrennten Zellen (Feldern), dadurch gekennzeichnet, daß in mindestens einer Zelle des Mikroarrays ein Oli­ gonukleotid angeordnet ist, das mit einem DNS- Abschnitt hybridisiert, der Teil des menschli­ chen RhD-Gens ist.
22. Mikroarray nach Anspruch 21, dadurch gekenn­ zeichnet, daß in mindestens sechs Zellen jeweils verschiedene Oligonukleotide angeordnet sind, die mit jeweils sechs verschiedenen DNS- Abschnitten des menschlichen RhD-Gens hybridi­ sieren.
23. Mikroarray nach Anspruch 21 oder 22, dadurch ge­ kennzeichnet, daß die DNS-Abschnitte Abschnitte der Kodierteilbereiche (Exons) 3, 4, 5, 6, 7 und/oder 9 sind.
24. Verfahren zur Bestimmung des Rhesusfaktors eines Menschen, dadurch gekennzeichnet, daß die alle­ lische Variabilität und/oder das Vorhandensein des RhD-Gen in einer Blutprobe erfaßt und daraus der Rhesus-Typ und/oder der Rhesus-Subtyp des Menschen bestimmt wird.
25. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, da­ durch gekennzeichnet, daß das Vorhandensein ei­ nes oder mehrerer der Exons 4 bis 7 und/oder 9 des RhD-Gens erfaßt wird.
26. Verfahren nach Anspruch 24 oder 25, dadurch ge­ kennzeichnet, daß die Erfassung der allelischen Variabilität und/oder des Vorhandenseins des RhD-Gens mittels eines Mikroarrays nach einem der Ansprüche 18 bis 23 erfolgt.
27. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 26, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestimmung an einer Blutprobe der Person selbst erfolgt.
28. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 oder 26, dadurch gekennzeichnet, daß der Rhesusfaktor ei­ nes Fötus bestimmt wird, indem eine maternale Blutprobe untersucht wird.
29. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeich­ net, daß aus der maternalen Blutprobe eine Frak­ tion abgetrennt wird, die im wesentlichen föta­ le, kernhaltige Erythrozyten enthält und der Rhesus-Faktor an dieser Fraktion bestimmt wird.
30. Verfahren nach Anspruch 28 oder 29, dadurch ge­ kennzeichnet, daß die DNS-haltigen Bestandteile der maternalen Blutprobe zuerst aufkonzentriert werden und anschließend diese Fraktion unter­ sucht wird.
31. Verfahren nach Anspruch 30, dadurch gekennzeich­ net, daß zur Aufkonzentration der DNS-haltigen Bestandteile ein Blutsatz durchgeführt wird.
32. Verfahren nach Anspruch 30 oder 31, dadurch ge­ kennzeichnet, daß zur Aufkonzentration der DNS- haltigen Bestandteile eine Lyse darin enthalte­ ner nukleierter foetaler Erythrozyten durchge­ führt und anschließend die zellfrei vorliegende DNS abzentrifugiert und für die weitere Diagnose gewonnen wird.
33. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeich­ net, daß zur Bestimmung des Rhesus-Faktors des Fötus die zellfreie fötale DNS im Blutplasma der maternalen Blutprobe untersucht wird.
34. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 33, dadurch gekennzeichnet, daß aus der Blutprobe oder der Fraktion die DNS isoliert und zumindest teilweise vervielfältigt wird und anschließend die allelische Variabilität bzw. das Vorhanden­ sein oder Fehlens des RhD-Gens bestimmt wird.
35. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, da­ durch gekennzeichnet, daß die DNS durch Polyme­ rase-Kettenreaktion (PCR) vervielfältigt wird.
36. Verfahren nach einem der beiden vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die ver­ vielfältigte DNS durch geeignete Restriktionsen­ zyme verdaut und anhand der erzeugten DNS-Bruch­ stücke die allelische Variabilität bzw. das Vor­ handensein und/oder Fehler des RhD-Gens bestimmt wird.
37. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 36, dadurch gekennzeichnet, daß zur Vervielfältigung der DNS eines oder mehrere Oligonukleotid-Paare verwendet werden, die die folgenden Sequenzen aufweisen:
TCGGTGCTGATCTCAGTGGA und ACTGATGACCATCCTCATGT
bzw.
CACATGAACATGATGCACA und CAAACTGGGTATCGTTGCTG
bzw.
GTGGATGTTCTGGCCAAGTT und CACCTTGCTGATCTTACC
bzw.
GTGGCTGGGCTGATCTACG und TGTCTAGTTTCTTACCGGCAAGT
bzw.
AGCTCCATCATGGGCTACAA und ATTGCCGGCTCCGACGGTATC
bzw.
AACAGGTTTGCTCCTAAATATT und AAACTTGGTCATCAAAA­ TATTTAACCT
38. Verfahren nach Anspruch 37, dadurch gekennzeich­ net, daß die Oligonukleotide mit der Sequenz
GTGGATGTTCTGGCCAAGTT bzw. AGCTCCATCATGGGCTACAA
mit dem Fluorophor Carboxyfluorescein markiert sind.
39. Verfahren nach Anspruch 37, dadurch gekennzeich­ net, daß die Oligonukleotide mit der Sequenz
CACATGAACATGATGCACA bzw. AACAGGTTTGCTCCTAAATATT
mit dem Fluorophor 4,7,2',4',5'7'-Hexachloro-6- Carboxyfluorescein markiert sind.
40. Verfahren nach Anspruch 37, dadurch gekennzeich­ net, daß die Oligonukleotide mit der Sequenz
TCGGTGCTGATCTCAGTGGA bzw. GTGGCTGGGCTGATCTACG
mit dem Fluorophor NEDTM der Fa. PE Biosystems markiert sind.
41. Verfahren nach einem der Ansprüche 38 bis 40, dadurch gekennzeichnet, daß zum Nachweis der am­ plifizierten DNS die von der amplifizierten DNS abgegebenen Fluoreszenzstrahlung erfaßt wird.
42. Verwendung eines Verfahrens und/oder eines Dia­ gnose-Kits nach einem der vorhergehenden Ansprü­ che zur pränatalen Bestimmung des Rhesus-Faktors eines menschlichen Fötuses.
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