WO2001071026A2

WO2001071026A2 - Kit, verfahren und mikroarray zur bestimmung des geschlechtes eines menschlichen fötus

Info

Publication number: WO2001071026A2
Application number: PCT/EP2001/003133
Authority: WO
Inventors: Stefanie WASCHÜTZA
Original assignee: Adnagen Ag
Priority date: 2000-03-20
Filing date: 2001-03-19
Publication date: 2001-09-27
Also published as: AU2001263793A1; WO2001071026A3

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Diagnose-Kit für die Bestimmung des Geschlechtes eines menschlichen Fötus aus einer mütterlichen Blutprobe mit mindestens einem Paar Oligonukleotide (Reverseprimer, Forwardprimer), wobei die beiden Oligonukleotide eines Paares als Primer zur Amplifikation mittels Polymerasekettenreaktion jeweils eines der beiden komplementären Stränge eines gesuchten DNS-Abschnittes geeignet sind, der Teil des menschlichen Y-Chromosomes ist.

Description

kommen kann.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Diagnose-Kit, ein Verfahren, ein Mikroarray sowie Verwendungen hierfür anzugeben, mit denen eine sehr frühzeitige, sichere, nicht-invasive und zuverlässige Bestimmung des Geschlechtes eines, menschlichen Fötus möglich ist.

Diese Aufgabe wird durch das Diagnose-Kit nach Anspruch 1, das Verfahren nach Anspruch 24, den Mikroarray nach Anspruch 21 sowie die Verwendung nach Anspruch 31 gelöst. Vorteilhafte Weiterbildung des erfindungsgemäßen Diagnose-Kits, Verfahrens sowie des Mikroarrays bzw. der erfindungsgemäßen Verwendung sind- in den jeweiligen abhängigen Ansprüchen gegeben.

Das erfindungsgemäße Diagnose-Kit enthält mindestens ein Paar Oligonukleotide, die als Reverseprimer und Forwardprimer bei der Amplifikation mittels Polyme- rasekettenreaktion erforderlich sind. Derartige Oligonukleotide werden auch bei dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt. Die Oligonukleotide der Paare sind dabei so ausgesucht, daß bei Einsatz dieser Oligonukleotide in einer Poly erasekettenreaktion ein DNS-Abschnitt einer menschlichen DNS erfolgt, der Teil der DNS des menschlichen Y-Chromosomes ist. Erfolgt eine Amplifikationen eines DNS-Abschnittes bei einer derart durchgeführten Polymerasekettenreaktion, so kann einfach festgestellt werden, ob ein Y- Chromosom in der untersuchten DNS-Substanz vorliegt oder nicht. Folglich läßt sich sicher feststellen, ob der Fötus männlichen (Y-Chromosom positiv) oder weiblichen Geschlechts (Y-Chromosom negativ) ist.

Vorteilhafterweise weisen die Oligonukleotide die folgenden Sequenzen auf:

GAA TGT ATT AGA ATG TAA TGA ACT TTA und TTC CAT TCC ATT CCA TTC CTT TCC TTT,

wobei letztere Sequenz vorteilhafterweise mit dem Fluorophor Carboxyfluorescein markiert ("Farn") ist. In diesem Falle kann ein einfacher Nachweis amplifi- zierter DNS über die von diesem ausgesandte Fluoreszenzstrahlung erfolgen, beispielsweise mittels des Gerätes PE ABI Pris Genetic Analyzer 310™ der Firma PE Biosystems.

Vorteilhafterweise werden bei dem Verfahren eingesetzt bzw. enthält das Diagnose-Kit ein zweites Primerpaar, das zur mplifikation einer DNS geeignet ist, die Teil des menschlichen X-Chromosomes ist. In diesem Falle ist es weiterhin möglich, das grundsätzlich immer vorliegende fötale X-Chromosom sowie die beiden mütterlichen X-Chromosomen zu detektieren bzw. bei einer quantitativen Auswertung auch das Vorliegen zweier fötaler X-Chromosomen neben den beiden mütterlichen X-Chromosomen zu erfassen. In letzterem Falle liegt dann ein Fötus weiblichen Geschlechtes vor. Grundsätzlich kann jedoch dieses Primerpaar auch dazu verwendet werden, einen Standard bzw. eine Kontrolle für den korrekten Ablauf der Amplifikation zu erhalten.

Dieses zweite Primerpaar enthält vorteilhafterweise zwei Oligonukleotide mit folgenden Sequenzen:

CTG TGC TCT CAA AAC CCA CC und CAC TGC AGC AAT AAA ATA GT,

wobei die erste dieser beiden Sequenzen mit dem Fluo- Q> 01 J sQ P 3 Ω l_l- tr 3 ö p. O O Φ Φ s: cn 01 ^ Hl o ö 01 Φ P. Hi Hl H φ Ω F- y φ tr O: y φ Φ ςu: i Φ F- y P. 11 H φ TJ 0 Ω F" O Φ Ω 1-1 F- O o F> O l-i tr Φ Hi y iQ Ω Φ P< 03 fco cn y Φ i-i Φ Hi cn F- F- Hi y Φ F- H y Hi φ t-i F^* y TJ φ r- S φ y Φ F- Φ 1-5 O t O rt 01 φ tr y O ^• . ιQ F- o rt IQ o y

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Erfindungsgemäß kann das Diagnose-Kit und das Verfahren sowie der Mikroarray auch dahingehend weitergebildet werden, daß im Falle des Diagnose-Kits nicht nur Oligonukleotide für die Bestimmung des Geschlechtes des Fötus wie oben beschrieben, sondern auch weitere Oligonukleotid-Paare für weitere Bestimmungen beigegeben bzw. im Falle des Verfahrens oder Mikroarrays verwendet werden.

In diesem Falle ist es dem Anwender möglich, auf einfache Art und Weise nicht nur eine Bestimmung des Geschlechtes des Fötus, sondern zugleich auch weitere molekularbiologische Tests durchzuführen.

Erfindungsgemäß wird das Verfahren, das Diagnose-Kit bzw. der Mikroarray verwendet, indem zuerst eine ma- ternale Blutprobe genommen wird. Diese aternale Blutprobe kann nun auf verschiedene Weise weiterverarbeitet werden.

Zum einen werden die DNS-haltigen Bestandteile der maternalen Blutprobe anschließend aufkonzentriert . Dies erfolgt beispielsweise durch Blutsatz, gegebenenfalls unterstützt durch Anzentrifugation zur Beschleunigung der Sedimentation^* der zellulären Bestandteile. Durch diesen Schritt konzentriert sich die Zellfraktion in einem Blutsatz, der sich für die nachfolgende DNS-Isolierung eignet.

Der Blutsatz wird aufgenommen und eine Lyse der mütterlichen Erythrozyten sowie der nukleierten fötalen Erythrozyten durchgeführt, wodurch die DNS aus den fötalen Erythrozyten^* freigesetzt wird.

Anschließend erfolgt eine hochtourige Zentrifugation,

gesamt nimmt dabei die zellfreie fötale DNS im Laufe der Schwangerschaft stetig zu, im letzten Trimester der Schwangerschaft so gar sehr stark.

In einem weiteren Schritt kann dann diese zellfreie fötale DNS aus dem Plasma/Serum in herkömmlicher Weise, beispielsweise mit kommerziell erhältlichem Kit, isoliert werden und ist damit für die weitere Untersuchung zugänglich.

Sowohl die DNS, die aus den fötalen nukleierten Zellen aus der maternalen Blutprobe als auch die DNS, die aus dem Serum/Plasma der maternalen Blutprobe gewonnen wurde, wird anschließend weiterverarbeitet, indem eine spezifische Amplifikation der nachzuweisenden DNS-Abschnitte in der in dem Pellet enthaltenen DNS mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) bzw. Multiplex-PCR durchgeführt wird. Hierzu werden nun das erfindungsgemäße Diagnose-Kit bzw. die darin enthaltenen Primer-Paare verwendet.

Anschließend wird die a plifizierte DNS nachgewiesen. Dies kann einerseits durch einen erfindungsgemäßen Mikroarray oder auch durch Auftrennen über Gelelektrophorese erfolgen. Sofern eines der Oligonukleotide aus einem Primer-Paar mit einem Fluorophor markiert ist, kann der Nachweis auch über die Detektion der entsprechenden Fluoreszenz erfolgen. Dies kann beispielsweise mittels eine Genetic Analyzers 310™ der Firma PE Biosystems™ erfolgen. Letzteres Verfahren weist eine sehr hohe Sensitivität und Zuverlässigkeit auf.

Die erhaltenen Fluoreszenzdaten werden ausgewertet und als Nachweis für das Geschlecht des Fötus eingesetzt. Wird beispielsweise wie oben beschrieben oder auch an einer Zelle eines Mikroarrays eine Fluoreszenz erfaßt, die von einem Oligonukleotid herrührt, das zu dem Primer-Paar gehört, das zur Amplifikation eines DNS-Abschnittes aus einem Y-Chromosom geeignet ist, so liegt zwangsläufig bei dem Fötus das männliche Geschlecht vor, da die mütterlichen Bestandteile in der Blutprobe selbst kein Y-Chromosom aufweisen. Wird zugleich ein Primer-Paar eingesetzt, das zur Amplifikation von DNS geeignet ist, die in dem menschlichen X- Chromosome enthalten ist, so sollte auch diese DNS amplifiziert worden und nachweisbar sein.

Wird lediglich das X-Chromosome nachgewiesen, so kann auf das weibliche Geschlecht des Fötus geschlossen werden.

Bei diesem Verfahren ist zu beachten, daß vorteilhafterweise keine Trennung der Bestandteile der maternalen Blutprobe beispielsweise in eine zelluläre oder nichtzelluläre Fraktion oder beispielsweise in eine Fraktion mit ausschließlich maternalen bzw. ausschließlich .fötalen Bestandteilen durchgeführt wird. Das Verfahren ist daher sehr einfach durchzuführen.

Im folgenden sollen einige Beispiele erfindungsgemäßer Kits beschrieben werden.

Figur 1 zeigt ein Trenngel/

Figur 2 zeigt Ergebnisse einer Fluoreszenzauswertung;

Figur 3 zeigt ein weiteres Trenngel;

Figur 4 zeigt eine zu Figur 3 parallele Fluores- zenzauswertung; und

Figur 5 zeigt eine weitere Fluoreszenzauswertung.

Als Beispiel eines erfindungsgemäßen Verfahrens wurde einer Schwangeren eine frische Blutprobe entnommen und in EDTA-Puffer, beispielsweise in standardisiert kommerziell verfügbaren EDTA-Röhrchen, aufgenommen. Anschließend wurde über Nacht ein Blutsatz durchgeführt. Alternativ kann _.die Probe auch bei geringen g- Werten anzentrifugiert werden. Von diesem Blutsatz wurden 500 μl in 900 μl Erythrozyten-Lysis-Puffer des Wizard^®-Kits der Firma Promega^® aufgenommen. Daraufhin wurde in einer Sorvall^®-Zentrifuge (Rotor SM 24) für 30 Minuten bei 50.000 g zentrifugiert . Hierdurch werden die vorwiegend maternalen Lymphozyten sowie die nach der Lysis der kindlichen Erythrozyten zellfrei vorliegende DNS pelletiert.

Aus dem Pellet wird nun mittels -eines herkömmlichen kommerziellen DNS-Isolierungs-Kit (z.B. Wizard-Kit der Firma Promega^®) die DNS isoliert. Die gewonnene DNS wird in 20 μl Rehydrierungs-Lösung gemäß den jeweiligen DNS-Isolierungs-Kit aufgenommen.

Mit der so gewonnenen DNS wird nun eine Poly erase- Kettenreaktion (PCR) mit den folgenden Primern XI, X2 Yl, Y2 durchgeführt:

XI CTG TGC TCT CAA AAC CCA CC,

X2 CAC TGC AGC AAT AAA ATA GT,

Yl GAA TGT ATT AGA ATG TAA TGA ACT TTA,

Y2 TTC CAT TCC ATT CCA TTC CTT TCC TTT.

Der Primer XI ist dabei mit dem grünen Fluoreszenzfarbstoff HEX (4,7,2^,,4',5^!,7'-Hexachloro-β- Carboxyfluorescein) und der Primer Y2 mit dem blauen Fluoreszenzfarbstoff FAM (Carboxyfluorescein der Firma PE Biosystems^®) markiert .

Das erfindungsgemäße Kit enthält sämtliche Substanzen, die für die PCR nötig sind. Im vorliegenden Beispiel ist dies der folgende PCR-Mastermix:

Taq-Puffer bezeichnet dabei einen Taq DNA Polymerase Storage Buffer (Taq-Buffer B) , der in wäßriger Lösung enthält: Tris-HCI 20 mM (pH=8,0 bei 25 °C) , KC1 100 mM, EDTA 0,1 mM, DTT 1 mM, Glycerol 50 % (v/v), Tween20 0,5 % (v/v), Nonidet-P40 0,5 % (v/v) und beispielsweise von Promega Corp. (Cat.-No: M166B) ertrieben wird.

Als Taq-Polymerase kann eine herkömmliche Polymerase z.B. der Firma Promega^®' eingesetzt werden. Es werden insgesamt im vorliegenden Beispiel 7 PCR-Reaktionen durchgeführt, die sich durch die verwendete DNS- Template-Konzentration im PCR-Ansatz unterscheiden:

Die PCR-Reaktion selbst wurde mit folgenden Thermozy- klen geführt:

94 °C für 5 Minuten

35 Zyklen mit der folgenden Abfolge:

^'94 °C für 1 Minute, 55 °C für 45 Sekunden und 72 °C für 45 Sekunden;

abschließend 72 °C für 5 Minuten.

Die Primer XI und X2 als Forwafdprimer und Reverse- primer sind so ausgewählt, daß bei Vorliegen eines X- Chromosomes ein Fragment mit einer Länge von 207 Basenpaaren amplifiziert wird, während die Forward- und Reverseprimer Yl und Y2 so ausgewählt sind, daß sich bei Vorliegen eines Y-Chromosomes ein Fragment mit einer Länge von 248 Basenpaaren amplifiziert wird. Die Auswertung kann man nun beispielsweise über eine Gelelektrophorese verfolgen, was in Figur 1 dargestellt ist. Hierzu wird ein 2,5 %-iges Gel (Seakem LE^® Biozym^®) gegossen. Von den einzelnen PCR-Ansätzen wurden nach Amplifikation gemäß dem obigen PCR- Protokoll jeweils 20 μl in die einzelnen Taschen des Agarose-Gels aufgetragen. Weiterhin wurde ein Marker (100 bp-Leiter) aufgetragen und das Gel bei einer Spannung von 100 mV für 45 Minuten zur Auftrennung laufengelassen.

Figur 1 zeigt die Bahnen der jeweiligen Ansätze AI bis A7 sowie jeweils benachbart zu AI bzw. A7 je eine mit Sl bzw. S2 bezeichnete Bahn, die Standards enthalten. Sämtliche Bahnen AI bis A7 lassen die beiden Banden, die mit X bzw. Y bezeichnet sind, erkennen. Es handelt sich dabei um Banden für Nukleotidlängen von 207 Basenpaaren (X) bzw. 248 Basenpaaren (Y) .

Zwar wird bei dem vorgeschlagenen Verfahren bei Verwendung mütterlicher Blutproben als Ausgangsmaterial auch immer mütterliche DNS mitamplifiziert, so daß eine Bande für X-Chromosomen immer vorhanden sein sollte. Die Anwesenheit einer Bande mit 248 Basenpaaren für das Y-Chromosom weist jedoch eindeutig auf das Geschlecht des Fötus als männlich hin.

Erfindungsgemäß ist eine besonders einfache Analyse der PCR-Produkte möglich mittels Genetic Analyzer ABI 310^® von PE Biosystems^®. Ein derartiger Nachweis ist in Figur 2 für das vorliegende Beispiel dargestellt. Hierbei wurden von den einzelnen PCR-Ansätzen AI bis A7 jeweils 1:10 Vorverdünnung angelegt- und für die ABI-Fragmentanalyse dann jeweils 1 μl der einzelnen Vorverdünnungen verwendet .

Figur 2 zeigt die Ergebnisse der einzelnen PCR- Ansätze AI bis A7. Es ist leicht zu erkennen, daß auch bei dieser Analysemethode jeweils Fluoreszenz- Peaks nachgewiesen werden, die einer Länge von 207 Basenpaaren (bezeichnet mit X) und 248 Basenpaaren (bezeichnet mit Y) entsprechen. Auch hier steht also das Geschlecht des Fötus als männlich fest. In den jeweiligen Auswerteergebnissen sind weitere Peaks mit S bezeichnet, die einen internen zugegebenen Standard (Rox-Standard) darstellen. Diese Peaks sind nicht in sämtlichen Darstellungen AI bis A7 einzelnen bezeichnet, entsprechen sich jedoch jeweils.

Mit diesem Verfahren (Genetic-Analyzer 310 ABI) kann mittels fluoreszenzmarkierter Primer eine weitaus höhere Sensitivität als mit herkömmlicher Gelelektrophorese erzielt werden, wodurch sich dieses Verfahren besonders für die vorliegende Erfindung eignet.

Die fötalen Erythrozyten können auch vor der Polymerasekettenreaktion in der maternalen Blutprobe angereichert werden. In einem ersten Beispiel erfolgt die Anreicherung durch eine Percoll™-Dichtegradienten- Zentrifugation. Bei einer konstanten Zentrifugalkraft und Mediumviskosität ist die Sedimentationsrate von Partikeln proportional zur Partikelgröße. Diese Gesetzmäßigkeit nutzt das Verfahren der Dichtegradien- ten-Zentrifugation, wobei in diesem Beispiel Per- coll™ als Zentrifugations edium verwendet wird. Bei Percoll™ handelt es sich um ein Silika-Derivat, das standardmäßig zur Anreicherung/Trennung von subzellulären Partikeln verwendet wird.

Zunächst wird ein kontinuierlicher Percoll-Gradient erzeugt, der einen Dichtebereich von 1,02 - 1,13 g/ml abdeckt. Dafür werden 14 ml einer Percoll™-NaCl- Lösung (0,15 M NaCl) , die eine Dichte von 1,07 g/ml aufweist, 30 min bei 20000 g in einem Festwinkelrotor Typ F 0630 (Beck an Coulter) zentrifugiert . Anschließend wird der so erzeugte kontinuierliche Gradient mit 5 ml EDTA-Vollblut, d.h. in EDTA-Puffer beispielsweise in standardisierten, kommerziell verfügbaren EDTA-Röhrchen, aufgenommenes Vollblut, überschichtet und 15 min bei 1000 g zentrifugiert. Nach diesem Zentrifugationsschritt verbleiben u.a. die Thrombozyten in der Serumschicht oberhalb des Gradienten und werden mit einer Pasteurpipette entfernt. Ein zweiter Zentrifugationsschritt bei 1000 g für 15 min führt schließlich zur Trennung der verbliebenen, unterschiedlichen Blutzelltypen entsprechend ihrer jeweiligen isopycnischen Dichten. Die Sedimentationsschicht mit mono-nuklearen Blutzellen wird anschließend mit einer Pasteurpipette entnommen, dreimal mit Phosphat-Puffer-Saline (PBS, pH=7,4) gewaschen und schließlich in 1 ml PBS resuspendiert. Phosphat- Puffer-Saline (PBS, pH=7,4) enthält in wäßriger Lösung KC1 0,2 g/1, KH₂P0₄ 0,2 g/1, NaCl 8,0 g/1 und Na₂HP0₄ 1,15 g/1 und wird beispielsweise von Life Technologies (Cat.-No.: 14190-094) ertrieben. Die DNS der mononuklearen Blutzellen wird dann durch die Standardprozeduren des "QIAa p Blood Kit" (Qiagen, Hilden) isoliert und kann für eine Multiplex-PCR eingesetzt werden.

In einem zweiten Beispiel wurden die fötalen, kern- haltigen Erythrozyten mittels FACS-Durchflußzyto- metrie (FACS = fluoreszenzassoziierte Zellsortierung) isoliert. Es erfolgt zunächst eine Anreicherung aller mono-nuklearer Blutzellen mittels Percoll-Dichte- gradienten-Zentrifugtation (siehe oben) . Die Sedimentationsschicht mit mononuklearen Blutzellen wird dabei mit einer Pasteurpipette entnommen, dreimal mit Phosphat-Puffer-Saline (PBS, pH=7,4) gewaschen und schließlich in 1 ml PBS resuspendiert.

Im Anschluß an die Dichtegradienten-Zentrifugation werden 800 μl der erhaltenen Blutzellsuspension für 60 min bei 4 °C mit einem Phycoerythrin-konjugierten monoklonalen Antikörper, Hersteller: BD PharMingen (Cat.No.: 32595A) Klon: GA-R2 (HIR2) Isotype: Mouse IgG_2bΛ K gegen das GlycophorinA-Oberflächenprotein und einem Fluorescein-Isothiocyanat (T9-FITC) -konjugierten monoklonalen Antikörper, Hersteller: BD PharMingen (Cat.-No.: 30984X) Klon: CB38 (NL07) Isotype: Mouse IgM, K gegen den Transferrin-Rezeptor (CD36) inkubiert bzw. markiert. Ein dritter Fluoreszenzkanal wird benutzt für die negative Diskriminierung von T-, B- und NK-Zellen. Die Endkonzentration beider Antikörper beträgt jeweils 0,2 μg pro 10⁷ Zellen. Die markierten Zellen werden zweimal mit PBS gewaschen und im Anschluß werden 10⁷ Zellen in 1 ml PBS resuspendiert .

Für die Isolierung kernhaltiger Erythrozyten wird ein FACS Vantage SE-Durchflußzytometer (Becton-Dickinson) verwendet. Das System ist mit einem wassergekühlten Doppelwellenlängen-Argon-Laser (Emmissionswellenlän- gen 488 nm und 365 nm - UV) und einem luftgekühlten Helium-Neon- (HeNe) Laser konfiguriert und mit fluoreszierenden Beads (Becton Dickinson) kalibriert. Das CellQuest Programm, Hersteller: Becton Dickinson, Version: 3.3 (Cat.-No.: 342182) wird verwendet für die Datenaufnahme, Instrumentkontrolle, sowie die statistische Auswertung. Die Sortierung der BlutZellen erfolgt mit Zellraten von 20000 - 25000 Zellen pro Sekunde, wobei die Zellgröße ("forward scatter") , und die Granularität, sowie die Oberflächenstruktur ("side scatter"), die Emission der grünen Fluoreszenz (Transferin-Rezeptor, T9-FITC) , die Emission der orangen Fluoreszenz (GlycophorinA, KC16-Rd) sowie die Emission der roten Fluoreszenz für die übrigen Parameter, wie CD45, CD3, CD19 und CD16/55 (APC oder Cy5 markiert), als Selektionskriterien verwendet werden. Um eine zusätzliche Diskriminierung von kernhaltigen Zellen zu gewährleisten wird der Kernfarbstoff Hoechst 33342 eingesetzt. Die Anregung erfolgt gleichzeitig mit der UN-Linie des Argon-Lasers. Die sortierten Zellen werden direkt in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß, das mit 1 ml PBS gefüllt ist, überführt und können bei -20 °C gelagert werden.

Auch hier kann die DΝS der mononuklearen Blutzellen anschließend durch die Standardprozeduren des "QIAamp Blood Kit" (Fa. Qiagen, Hilden) isoliert und für eine Multiplex PCR wie im folgenden beschrieben, eingesetzt werden.

Mit der so isolierten DΝS aus kernhaltigen fötalen Erythrozyten wird dann die PCR durchgeführt.

Figur 3 zeigt ein weiteres Beispiel eines .Trenngels. Die Probenvorbereitung erfolgte dabei so wie im vorhergehenden Beispiel für die Figuren 1 und 2. Dabei wurde jedoch zum einen eine Probe für einen weiblichen Fötus und einen männlichen Fötus sowie eine Kontrollprobe untersucht. In den Spuren 1 und 7 ist jeweils eine 100 bp-Leiter aufgetragen. Die Spur 2 enthält dabei die Probe für den männlichen Fötus und Spur 4 diejenige für den weiblichen Fötus während Spur 6 die Kontrollprobe enthält. Wie zu erkennen ist, findet sich in Spur 4 lediglich das Fragment mit einer Länge von 207 Basenpaaren, während in Spur 2 sowohl eine Bande bei 207 Basenpaaren als auch eine Bande bei 248 Basenpaaren auftritt.

Figur 4 zeigt die Proben aus Figur 3 nach Analyse mittels einer ABI-Frequenzanalyse. Figur 4A zeigt dabei die Probe für den männlichen Fötus, bei dem sowohl ein Fragment bei 207 Basenpaaren für ein X- Chromosom als auch ein Fragment bei 248 Basenpaaren für ein Y-Chromosom auftritt. In Figur 4B, der Analyse der Probe für den weiblichen Fötus, erscheint dem- gegenüber lediglich eine Bande bei 207 Basenpaaren, was auf das Fehlen eines Y-Chromosoms hinweist. Die Ergebnisse der Figuren 3 und 4 entsprechen sich folglich vollständig.

Figur 5 zeigt ein weiteres Anwendungsbeispiel, bei dem fötales DNA-Ausgangsmaterial aus EDTA-Vollblut

(etwa 5 ml) einer Schwangeren verwendet wurde. Zunächst wird durch Zentrifugation das Plasma der maternalen Blutprobe gewonnen. Zu diesem Zweck wird das EDTA-Vollblut zweimal bei 3000 g für 30 min zentrifugiert. Aus dem Überstand bzw. Plasma wird anschließend über ein handelsübliches DNA-Isolierungs Kit

(QIAamp DNA Blood Kit oder QIAamp UltraSens Virus Kit, Qiagen, Hilden) die genomische DNA extrahiert, die neben maternalen Erbmolekülen auch fötales Material enthält. Die extrahierte DNA dient dann als Template für die beschriebene PCR-Reaktion.

Die verwendeten Oligonukleotide für die Polymerasekettenreaktion und die Durchführung der Polymerasekettenreaktion erfolgt wie oben im Beispiel zu den Figuren 1 und 2 beschrieben. Lediglich der PCR- Reaktionsansatz erfolgt wie in der nachfolgenden Tabelle:

Volumen Endkonz . gDNA-Template 22,5 μl

Taq-Puffer 5 μl l x

MgCl₂ 3 μl 1,5 mM

Nukleotide 1 μl 200 uM

Primer XI 1 μl 0,1 μM

Primer X2 1 μl 0,1 μM

Primer Yl 1,5 μl 0,15 μM

Primer Y2 1,5 μl 0,15 μM

H₂0 13,0 μl

Taq-Polymerase 0,5 μl 2,5 U

Reaktionsvolumen 50 μl Die Auswertung der PCR-Ansätze erfolgte über eine ABI-Fragmentanalyse wie oben beschrieben. Die einzelnen PCR-Ansätze wurden dabei zunächst unverdünnt eingesetzt, wobei für die ABI-Fragmentanalyse jeweils 1 μl verwendet wurde .

Figur 5 zeigt nun in Figur 5A eine erste Probe aus dem Vollblut einer Schwangeren, die einen weiblichen Fötus trug. Figur 5B zeigt die Ergebnisse einer Probe einer Schwangeren, die einen männlichen Fötus trug. Die Geschlechts-Typisierung der Föten wurde durch zytogenetische Standardverfahren nach Amniozentese verifiziert. Die mütterliche Blutprobe wurde dabei jeweils in der 15. Schwangerschaftswoche genommen.

Figur 5 zeigt nun, daß, wie zu erwarten, für den weiblichen Fötus lediglich ein Peak bei 207 Basenpaaren beobachtet wird, während in Figur 5B für den männlichen Fötus 2 Spitzen bei 207 Basenpaaren und 248 Basenpaaren ermittelt werden. Es handelt sich also in Figur 5B eindeutig um einen männlichen Fötus. Figur 5C zeigt demgegenüber eine Kontrollprobe, die keinerlei DNS aufwies . Dementsprechend wurden auch durch die PCR keine Fragmente vervielfältigt, so daß in Figur 5C lediglich die Marker-Fragmente zu erkennen sind.

Dadurch, daß die vorliegende Erfindung ein entsprechendes Kit zur Durchführung des Verfahrens zur Verfügung stellt, ist es nunmehr jedem Laborarzt oder im medizinischen Bereich tätigen Labor, beispielsweise humangenetischen Labors, ohne weitere Entwicklungstätigkeit ohne weiteres möglich, auf einfache Weise eine Geschlechtsbestimmung für einen Fötus durchzuführen, bei dem die Risiken herkömmlicher Techniken aus- geschlossen werden können. Weiterhin ermöglicht das erfindungsgemäße Kit eine sehr rasche Geschlechtsbestimmung zum frühest möglichen Zeitpunkt der Schwangerschaft. Der frühest mögliche Zeitpunkt ist dabei nicht durch das erfindungsgemäße Verfahren oder den erfindungsgemäßen Kit eingeschränkt, sondern im wesentlichen durch gesetzliche Regelungen, die erst ab einem bestimmten Zeitpunkt der Schwangerschaft eine Geschlechtsbestimmung erlauben. Eine Geschlechtsbestimmung ist beispielsweise gesetzlich in der Bundesrepublik Deutschland erst nach Ablauf des ersten Trimesters der Schwangerschaft erlaubt. Dann jedoch ist eine rasche und sehr präzise und risikolose Bestimmung des Geschlechtes des Fötus nunmehr möglich.

Claims

Pa entariπprπche

1. Diagnose-Kit für die Bestimmung des Geschlechtes eines menschlichen Fötus mit

mindestens einem ersten Paar Oligonukleotide (Reverseprimer, Forwardprimer) ,

wobei die beiden Oligonukleotide des ersten Paares als Primer zur Amplifikation mittels Polymerasekettenreaktion jeweils eines der beiden komplementären Stränge eines gesuchten DNS- Abschnittes geeignet sind, und

wobei der gesuchte DNS-Abschnitt Teil der DNS des menschlichen Y-Chromosoms ist.

Diagnose-Kit- nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens ein zweites Paar Oligonukleotide (Reverseprimer, Forwardprimer) enthält,

wobei die beiden Oligonukleotide des zweiten Paares als Primer zur Amplifikation mittels Polymerasekettenreaktion jeweils eines der beiden komplementären Stränge eines weiteren gesuchten DNS-AbSchnittes geeignet sind, und wobei der weitere gesuchte DNS-Abschnitt Teil der DNS des menschlichen X-Chromosoms ist.

Diagnose-Kit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es die zur Durchführung einer Polymerasekettenreaktion erforderlichen Substanzen enthält.

Diagnose-Kit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es als zur Durchführung einer Polymerasekettenreaktion erforderliche Substanzen eine Pufferlösung, Magnesiumchlorid, Desoxynukleotid-Triphosphate, sowie eine hitzestabile Polymerase enthält.

Diagnose-Kit nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß es als hitzestabile Polymerase eine Polymerase aus Thermus aquaticus (Taq-Polymerase) enthält.

Diagnose-Kit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zumindest eines der beiden Oligonukleotide eines Paares von Oligonukleotiden mit einem Fluorophor markiert ist.

7. Diagnose-Kit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es als Positivkontrolle eine DNS-Probe mit dem gesuchten DNS-Abschnitt des X-Chromosoms und/oder des Y- Chro oso s enthä11.

Diagnose-Kit nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß die DNS-Probe eine klonierte DNS-Probe ist.

9. Diagnose-Kit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zumindest jeweils eines der beiden Oligonukleotide des ersten und/oder des zweiten Paares von Oligonukleotiden mit Fluorophoren markiert sind.

10. Diagnose-Kit nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß die Oligonukleotide des ersten und des zweiten Paares mit denselben Fluorophoren markiert sind.

11. Diagnose-Kit nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Oligonukleotide des ersten und des zweiten Paares mit verschiedenen Fluorophoren markiert sind.

12. Diagnose-Kit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Oligonukleotide des ersten Paares folgende Sequenzen aufweisen:

GAA TGT ATT AGA ATG TAA TGA ACT TTA und

TTC CAT TCC ATT CCA TTC CTT TCC TTT .

13. Diagnosekit nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß das Oligonukleotid mit folgender Sequenz

TTC CAT TCC ATT CCA TTC CTT TCC TTT mit dem Fluorophor Carboxyfluorescein markiert ist.

14. Diagnose-Kit nach einem der Ansprüche 2 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Oligonukleotide des zweiten Paares folgende Sequenzen aufweisen: CTG TGC TCT CAA AAC CCA CC und

CAC TGC AGC AAT AAA ATA GT .

15. Diagnose-Kit nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß das Oligonukleotid mit der Sequenz

CTG TGC TCT CAA AAC CCA CC mit dem Fluorophor 4, 7,2 ', 4', 5', 7 '-Hexachloro-6-

Carboxyfluorescein markiert ist.

16. Diagnose-Kit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Anleitung zur Durchführung einer DNS- Isolierung und/oder eine Anleitung zur Durchführung der Polymer- asekettenreaktion und/oder eine Anleitung zur Durchführung einer Fragmentanalyse enthält.

17. Diagnose-Kit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Schema zur Auswertung der erhaltenen Meßergebnisse enthält.

18-. Diagnose-Kit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es einen Nucleinsäure-Mikroarray (DNS-Chip) enthält, wobei der Array eine Anzahl Zellen (Felder) aufweist und in mindestens einer Zelle ein Oligonukleotid angeordnet ist, das mit dem gesuchten DNS-Abschnitt hybridisiert.

19. Diagnose-Kit nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß in mindestens einer weiteren Zelle des Mikroarrays ein weiteres Oligonukleotid angeordnet ist und die Sequenz des Oligonukleotides, das in der mindestens einen Zelle angeordnet ist, sich von der Sequenz des weiteren Oligonukleotides unterscheidet.

20. Diagnose-Kit nach einem der beiden vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß in mindestens zwei Zellen jeweils ein Oligonukleotid angeordnet ist, wobei die in verschiedenen Zellen angeordneten Oligonukleotide jeweils mit verschiedenen gesuchten DNS-Abschnitten hybridisieren.

21. Mikroarray, beispielsweise DNS-Chip, mit einer Anordnung von mehreren, voneinander getrennten Zellen (Feldern) , dadurch gekennzeichnet, daß in mindestens einer Zelle ein Oligonukleotid angeordnet ist, das mit einem DNS-Abschnitt hybridisiert, der Teil des menschlichen Y-Chromosoms ist.

22. Mikroarray nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß in mindestens einer weiteren Zelle ein weiteres Oligonukleotid angeordnet ist, wobei die Sequenz des Oligonukleotides, das in der mindestens einen Zelle angeordnet ist, sich von der Sequenz des weiteren Oligonukleotides unterscheidet.

23. Mikroarray nach Anspruch 21 oder 22, dadurch gekennzeichnet, daß in mindestens zwei Zellen jeweils ein Oligonukleotid angeordnet ist, wobei die in verschiedenen Zellen angeordneten Oligonukleotide mit verschiedenen gesuchten DNS- Abschnitten hybridisieren.

24. Verfahren zur Bestimmung des Geschlechtes eines menschlichen Fötus, dadurch gekennzeichnet, daß in einer maternalen Blutprobe mindestens ein gesuchter DNS-Abschnitt, der Teil der DNS des menschlichen Y-Chromosoms ist, durch eine Poly- merase-Kettenreaktion mittels mindestens eines Paares von Oligonukleotiden amplifiziert wird, wobei die beiden Oligonukleotide des mindestens einen Paares zur Amplifikation jeweils eines der komplementären Stränge des gesuchten DNS- Abschnittes geeignet sind, und zuletzt die amplifizierte DNS nachgewiesen wird.

25. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß vor der Amplifikation die DNS-haltigen Bestandteile in der maternalen Blutprobe zuerst aufkonzentriert werden.

26. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß zur Aufkonzentration der DNS-haltigen Bestandteile eine Sedimentation der maternalen Blutproben (Blutsatz) durchgeführt wird.

27. Verfahren nach einem der beiden vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zur Auf- konzentration der DNS-haltigen Bestandteile eine Lyse darin enthaltener nukleierter fötaler Erythrozyten durchgeführt ^' und anschließend die zellfrei vorliegende DNS abzentrifugiert und für die weitere Diagnose gewonnen wird.

28. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß aus der maternalen Blutprobe das Blut- plasma/Blutserum gewonnen wird und anschließend die gesuchten DNS-Abschnitte durch eine Polymerasekettenreaktion mittels der in dem Kit enthaltenen Oligonukleotide amplifiziert werden und zuletzt die amplifizierte DNS nachgewiesen wird.

29. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 28, dadurch gekennzeichnet, daß zum Nachweis der am- plifizierten DNS die von fluoreszenzmarkierten öligonukleotiden abgegebene Fluoreszenzstrahlung erfaßt wird.

30. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 29, dadurch gekennzeichnet, daß ein Kit nach einem der Ansprüche 1 bis 17 verwendet wird.

31. Verwendung eines Kits, eines Oligonukleotid- Mikroarray ύnd/oder eines Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur pränatalen, nicht-invasiven Bestimmung des Geschlechtes eines menschlichen Fötus.

32. Verwendung nach dem vorhergehenden Anspruch zur pränatalen, nicht-invasiven Bestimmung des Geschlechtes eines menschlichen Fötus aus einer maternalen Blutprobe.