DE69031984T2 - Ein nichtinvasives verfahren zur trennung und zum nachweis von fetaler dna - Google Patents

Ein nichtinvasives verfahren zur trennung und zum nachweis von fetaler dna

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Description

    Finanzierung
  • Die hierin beschriebene Arbeit wurde durch das National Institute of Health and Children's Hospital Medical Center unterstützt.
    • Hintergrund
  • Eine Vielzahl von fötalen Zelltypen -- Thrombocyten, Trophoblasten, Erythrocyten und Leukocyten -- durchqueren die Plazenta und zirkulieren vorübergehend im Blut der Mutter (Schroder, J., J. Med. Genet., 12:230-242 (1975); Douglas G.W. et al., Am. J. Obstet. Gynec., 78:960-973 (19959)). Es gibt eine Vielzahl von Berichten über die Anstrengungen, fötale Zellen von Zellen der Mutter zu trennen, die im Blut der Mutter vorhanden sind, aber niemand war bei der Isolierung von Zellen erfolgreich, von denen anschließend gezeigt werden konnte, daß sie fötale DNA enthielten. Die Unterscheidung von fötalen Zellen von Zellen der Mutter war aus verschiedenen Gründen nicht erfolgreich, einschließlich der geringen Zahl fötaler Zellen in Proben des mütterlichen Bluts und der Tatsache, daß die morphologischen Unterschiede gering sind (z.B. sind Trophoblasten die einzigen fötalen Zellen, die von Zellen der Mutter allein morphologisch unterschieden werden können).
  • Andere berichten über Untersuchungen des peripheren Blutes von schwangeren Frauen auf Zellen fötalen Ursprungs. Die fötale Identifikation beruhte auf dem Vorliegen eines einzigen zytogenetischen Markers, dem Y-Chromosom. Lymphocyten mit einem mutmaßlichen "XY" Karyotypen wurden in den mütterlichen Kreislauf bereits nach der 14. Schwangerschaftswoche festgestellt (Walknowska, J., et al., The Lancet, 1119-1122 (1979)).
  • Die Möglichkeiten der Zellflußanalyse veranlaßte viele zu dem Vorschlag, daß fötale Zellen durch die Verwendung eines Zellflußmeßgeräts erhalten werden und solche Zellen für pränatale genetische Diagnosen verwendet werden könnten. Obwohl von derartig ausgewählte Zellen gesagt wurde, daß sie aufgrund von Analysen der Zelloberflächenantigene, der Morphologie oder cytogenetischer Kriterien fötalen Ursprungs seien, gab es jedoch keine Bestätigung, daß die Zellen fötale DNA enthalten. Ein Verfahren, durch das fötale DNA aus dem Blut der Mutter während der Schwangerschaft erhalten werden könnte, könnte wertvoll sein, insbesondere falls es die Durchführung einer pränatalen Diagnose durch ein nicht-invasives Verfahren ermöglichte. Sowohl Am. J. Murian Genetics 45 (1989) A252 und Pediatric Research 25 (1989) 139A Abs. No. 8/8 offenbaren die Anreicherung von kernhaltigen lötalen Erythrocyten aus Blutproben der Mutter durch Flußsortierung, nachfolgende Rohextraktion von fötaler DNA und anschließende Amplifikation durch PCR und Southem Blotting mit einer für Y-Chromosomen spezifischen Sonde.
    • Offenbarung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung ist ein in vitro-Verfahren zur Abtrennung oder Isolierung von im Blut schwangerer Frauen vorhander fötaler DNA, von mütterlicher DNA, sowie ein in vitro-Verfahren zum Naachweis der Gegenwart von oder zur Quantifizierung ausgewählter fötaler DNA in fötaler DNA, welches zur nichtinvasiven prenatalen Diagnose oder als Analyseverfahren zweckmäßig ist.
  • Bei dem vorliegenden Verfahren können kernhaltige fötale Erythrocyten aus einer Blutprobe der Mutter durch einen detektierbaren Stoff isoliert werden, der an die kernhaltigen fötalen Zellen, aber nicht an die Zellen der Mutter bindet und der anschließend aus der Probe der Mutter abgetrennt wird, so daß eine Anreicherung an kernhaltigen fötalen Erythrocyten in der Probe erreicht wird. In einer Ausführungsform des vorliegenden Isolationsverfahrens wird zumindest ein detektierbar markierter monoklonaler Antikörper, der für ein Antigen spezifisch ist, das auf den kernhaltigen fötalen Erythrocyten vorhanden ist, nicht aber für ein Antigen, das auf Zellen der Mutter vorhanden ist, mit einer Blutprobe der Mutter kombiniert und, sobald er an die kernhaltigen fötalen Erythrocyten gebunden ist, von der Blutprobe der Mutter abgetrennt. Alternativ wird zumindest ein detektierbar markierter monoklonaler Antikörper verwendet, der für ein Antigen spezifisch ist, das auf Zellen der Mutter vorhanden ist, aber nicht für ein Antigen, das auf kernhaltigen fötalen Erythrocyten vorhanden ist. In einer weiteren Ausführungsform werden die zwei Arten monoklonaler Antikörper verwendet.
  • Falls der detektierbare Marker ein Fluoreszenzmolekül ist, wird die Trennung durch Zellflußanalyse durchgeführt, wobei die fluoreszenzmarkierten Moleküle von den unmarkierten Molekülen getrennt werden. Dies führt zu einer Trennung der kernhaltigen fötalen Erythrocyten von den Zellen der Mutter und daher der fötalen DNA von DNA der Mutter. Daß diese Trennung aufgetreten ist, kann unter Verwendung bekannter Technik, wie beispielsweise Mikroskopie oder Bestimmung fötalen Hämoglobins, überprüft werden.
  • Bei dem vorliegenden Verfahren zur Bestimmung des Vorkommens einer ausgewählten DNA-Sequenz (oder Sequenzen) werden die wie oben beschrieben isolierten Zellen auf einem festen Träger aufgetragen, wie beispielsweise ein Objektträger, und auf Chromosomenanomalien unter Verwendung einer in situ-Hybridisierung untersucht. Bei dieser Ausführungsform wird eine ausgewählte Nukleinsäuresonde, wie beispielsweise eine markierte DNA-Sonde für chromosomale mit einer angeborenen Anomalie assozuerte DNA, mit der fötalen DNA unter Bedingungen kombiniert, die dazu geeignet sind, daß Hybridisierung von komplementären Sequenzen auftritt. Detektion und/oder Quantifizierung der markierten Sonde nach der Hybridisierung führt zu einer Bestimmung und/oder Quantifizierung der fötalen DNA, an die die Sonde hybridisiert wurde.
  • Das vorliegende Verfahren zur Bestimmung des Vorkommens von ausgewählter fötaler DNA ist für eine pränatale Einschätzung oder diagnostische Zwecke nützlich, wie beispielsweise zur Bestimmung des Geschlechts des Fötus, Beurteilung von Chromosomenanomalien und Bestimmung des Vorhandenseins von anomalen, mit Krankheiten des Menschen assoziierten Genen.
  • Ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens, bei dem kernhaltige fötale Erythrocyten isoliert werden, liegt darin, daß diese Zellen zuverlässig von Zellen mütterlichen Ursprungs abgetrennt werden. Weil diese Zellen kernhaltig sind und daher ein vollständiges Komplement an fötalen Genen enthalten, wird durch das vorliegende Verfahren zusätzlich die vollständige fötale DNA zugänglich. Das vorliegende Verfahren zur Bestimmung und/oder Quantifizierung einer ausgewählten fötalen DNA-Sequenz ist nicht nur infolge der Vorteile, die mit dem vorliegenden Verfahren zur Isolierung von fötalen Zellen zusammenhängen wertvoll, sondern auch, weil es eine nicht-invasive Technik ist, die früh in der Schwangerschaft angewendet werden kann.
    • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • Fig. 1 ist eine schematische Darstellung des erfindungsgemaßen Verfahrens, bei dem kernhaltige fötale Zellen von Zellen der Mutter isoliert werden und DNA der fötalen Zellen auf das Auftreten einer bestimmten fötalen DNA-Sequenz hin überprüft werden.
  • Fig. 2 ist ein Autoradiogramm einer verdünnten männlichen DNA, die mit einer 222 bp- Sequenz amplifiziert wurde. Bahn 1: Kontrollreagenz, Bahn 2: φX174 Molekulargewichtsstandard, Bahn 3: 100 ng, Bahn 4: 10 ng, Bahn 5: 1 ng, Bahn 6: 200 pcg, Bahn 7: 10 pcg, Bahn 8: 1pcg.
  • Fig. 3 ist ein zusammengesetztes Autoradiogramm einer amplifizierten Patienten-DNA. Bahn 1: 10 ng normal männlich, Bahn 2: 10 ng normal weiblich, Bahn 3: Kontrollreagens, Bahn 4: φX174, Bahn 5: sortierte Zellen von Patient 1 (männlicher Fötus), Bahn 6: sortierte Zellen von Patient 2 (männlicher Fötus), Bahn 7: sortierte Zellen von Patient 3 (weiblicher Fötus), Bahn 8: sortierte Zellen von Patient 6 (weiblicher Fötus), Bahn 9: sortierte Zellen von Patient 7 (männlicher Fötus), Bahn 10: sortierte Zellen von Patient 8 (männlicher Fötus), Bahn 11: sortierte Zellen von Patient 9 (weiblicher Fötus), Bahn 12: Nabelschnurblut vom weiblichen Kind, dessen Zellen in Bahn 8 pränatal sortiert wurden.
  • Fig. 4 ist ein Diagramm, das die Bestimmung von Y-chromosomalen DNA-Sequenzen bei verschiedenen Stadien der Schwangerschaft von Frauen, die ein männliches Kind geboren haben, darstellt.
  • Fig. 5 ist eine Serie von Histogrammen (A bis F), die erhalten wurden, nachdem ein FITC-Antitransferrinrezeptor zur Bestimmung des Vorkommens von mononuklearen Zellen in Proben von nicht schwangeren Frauen verwendet wurde, denen männliche Zellen verabreicht wurden.
  • Fig. 6 ist ein zusammengesetztes Autoradiogramm von amplifizierter männlicher DNA, die in TfR&spplus;-Zellen bestimmt wurde, nachdem 10²-10&sup6; männliche Zellen zu Proben von nicht schwangeren Frauen zugegeben wurden und in TfR-Zellen, nachdem 10&sup5;- 10&sup6; männliche Zellen zu Proben von nicht schwangeren Frauen zugegeben wurden.
  • Fig. 7 ist eine Serie von Histogrammen (A bis H), die erhalten werden, nachdem Anti- HPCA-1-Antikörper zur Bestimmung der Gegenwart von mononuklearen Zellen in Proben von nicht-schwangeren Frauen verwendet werden, denen männliche Zellen beigefügt wurden.
  • Fig. 8 ist eine Photographie, die eine fluoreszierende Zelle infolge positiver Ergebnissen einer in situ-Hybridisierung einer pDP97-Sonde für Y-Chromosomen mit einer kernhaltigen fötalen roten Blutzelle darstellt.
    • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft den Gegenstand der Ansprüche. Die Erfindung schafft einen nicht-invasiven Zugang zur Bestimmung und/oder Quantifizierung fötaler DNA, die beispielsweise mit einer Krankheit oder einem Zustand verbunden ist, deren Einschätzung während der Schwangerschaft gewunscht wird. Sie stellt ebenfalls einen nicht-invasiven Weg zur Verfügung, durch den das Geschlecht eines Fötus bestimmt werden kann.
  • Das folgende ist eine Beschreibung auf Basis des Gegenstands des Verfahrens, des vorliegenden Verfahrens zur Isolierung kernhaltiger fötaler Zellen, die im Blut einer schwangeren Frau von den Zellen der Mutter abgetrennt werden und anschließend der Trennung fötaler DNA von mütterlicher DNA, und des vorliegenden Verfahrens zur pränatalen Bestimmung des Auftretens (Vorhandensein oder Abwesenheit oder Quantifizierung) von ausgewählter DNA in fötalen Zellen.
    • Kernhaltige Erythrocyten als potentielle Quelle von fötalen Genen
  • Es wurde nun festgestellt, daß kernhaltige fötale Zellen, die im Blut einer schwangeren Frau vorhanden sind, eine Quelle fötaler Gene darstellen. D.h., es wurde gezeigt, daß kernhaltige fötale Erythrocyten (ebenfalls als fötale NRBC bezeichnet) von mütterlichem Blut isoliert oder getrennt werden können und daß DNA, die in den isolierten fötalen Zellen vorhanden ist, verwendet werden kann, um die fötalen Eigenschaften (z.B. Geschlecht, Vorhandensein oder Abwesenheit von Chromosomenanomalien) einzuschätzen.
  • Basierend auf folgender Begründung wurden kernhaltige fötale Erythrocyten zur Sortierung ausgewählt:
  • 1. In jeder auftretenden mütterlichen Blutung (fetomaternal hemorrhage), gleichgültig wie gering, sollte das Verhältnis fötaler Erythrocyten zu fötalen Lymphocyten genauso bleiben wie in dem gesamten fötalen Blut, daher sollten zur Analyse 1 000 mal so viele rote Zellen wie weiße Zellen zugänglich sein.
  • 2. Normale schwangere Frauen haben gewöhnlich keine zirkulierenden NRBC, deshalb sollten isolierte NRBC mit einer größeren Wahrscheinlichkeit fötalen Ursprungs sein.
  • 3. Die allermeisten Schwangerschaften sind blutgruppenkompatibel, d.h., daß das "übertragene" NRBC wahrscheinlich von der Mutter toleriert wird und in ihrem Kreislauf verbleibt.
  • 4. Weil sie kernhaltig sind, enthalten die NRBC einen vollständigen Satz fötaler Gene.
    • Fortschritte der Molkularbiologie können zur Sortierung der fötalen Zellen angewendet werden
  • Neuerliche Fortschritte der Molekularbiologie hatten eine enorme Auswirkung auf die Möglichkeit zur Identifizierung fötaler Zellen. Beispielsweise kann eine in situ- Hybridisierung mit Fluoreszenzmarkierung für diesen Zweck eingesetzt werden.
  • Die Entwicklung der Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction (PCR)) (Mullis, K., et al., Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol., 51:263-272 (1986)), mit ihrer Möglichkeit zur DNA-Analyse aus einer einzigen Zelle (Li, H., et al., Nature, 355:414-417 (1988), Handyside, AH., et al., Lancet 1:347-349 (1989)), hat die technischen Probleme gelöst, die mit der geringen Zahl fötaler Zellen im Blut der Mutter verbunden sind. Sie ermöglicht eine DNA-Diagnose aus einer einzigen Zelle.
  • Wie unten beschrieben, wurde von kernhaltigen fötalen Erythroblasten gezeigt, daß sie in Blut vorhanden sind, das von schwangeren Frauen erhalten wurde, so daß mütterliches Blut eine nützliche/zuverlässige potentielle Quelle an fötaler DNA darstellt, wobei kernhaltige fötale Zellen von Zellen der Mutter auf Basis von oberflächenantigenen Eigenschaften unterschieden wurden, was die Trennung von zwei Zelltypen voneinander ermöglicht, und lötale DNA, die in den abgetrennten kernhaltigen fötalen Zellen vorhanden ist, wurde analysiert und charakterisiert.
    • Nachweis von fötalen Gensequenzen im Blut der Mutter
  • Einer der ersten Schritte bei der Entwicklung des vorliegenden Verfahrens zur Isolierung kernhaltiger fötaler Zellen aus der mütterlichen Blutquelle war die Identifizierung von monoklonalen Antikörpern, die eine Identifikation und Abtrennung der fötalen Zellen von Zellen der Mutter erlauben, die in dem Blut vorhanden sind, das von einer schwangeren Frau erhalten wurde. Die Durchführung wird im Detail in den Beispielen beschrieben. Als Ergebnis wurde festgestellt, daß monoklonale Antikörper, welche Leukocyten der Mutter erkennen und monoklonale Antikörper, welche fötale Zelloberflächenantigene erkennen, zur Trennung mütterlicher und fötaler Zellen geeignet sind. Das folgende ist eine kurze Beschreibung von monoklonalen Antikörpern, von denen gezeigt wurde, daß sie zur Abtrennung kernhaltiger fötaler Zellen von mütterlichen Zellen geeignet sind, die in Blutproben der Mutter vorkommen. Bei dem vorliegenden Verfahren können auch andere monoklonale Antikörper verwendet werden, welche zwischen fötalen und mütterlichen Zellen basierend auf Differenzen der Oberflächenantigene unterscheiden. Das vorliegende Verfahren erfordert die Verwendung von zumindest einer Art Antikörper, welche für ein Oberflächenantigen spezifisch ist (oder erkennt), das auf kernhaltigen fötalen Zellen vorhanden ist, das für ein Obeflächenantigen spezifisch ist, das auf Zellen der Mutter vorhanden ist, aber nicht für beide spezifisch ist. D.h., daß das vorliegende Verfahren unter Verwendung eines oder mehrerer Antikörper durchgeführt werden kann, welches zwischen kernhaltigen Iötalen Zellen und Zellen der Mutter unterscheidet. Das vorliegende Verfahren kann unter Verwendung von Vollblut oder Blut, das behandelt oder bearbeitet wurde, um kernhaltige fötale Zellen anzureichem (die Konzentration zu erhöhen), durchgeführt werden.
  • Unten ist die Selektion und erfolgreiche Verwendung von monoklonalen Antikörpern beschrieben, welche zwischen kernhaltigen fötalen Erythrocyten und Zellen der Mutter unterscheiden. Dies sollte jedoch auch so verstanden werden, daß in einer ähnlichen Weise monoklonale Antikörper, welche die Selektion einer anderen kernhaltigen fötalen Zellart (oder Arten) ermöglichen, identifiziert und in dem vorliegenden Verfahren zur Trennung kernhaltiger fötaler Zellen von Zellen der Mutter (und daher fötale DNA-Quellen von mütterlicher DNA) verwendet werden können.
  • Erste Anstrengungen richten sich auf die Eliminierung von kontaminierenden Leukocyten der Mutter in der mononuklearen Zellschicht und Identifizierung von monoklonalen Antikörpern, die zur Durchführung dieser Trennung dienen können, welches zur Produktion einer mütterlichen Probe führt, die mit kernhaltigen fötalen Zellen angereichert ist.
  • HLe-1 (Becton-Dickinson Monoclonal Center, Mountain View, CA, Catalog ≠ 7463) ist ein monoklonaler Antikörper, der unmittelbar als Fluoresceinthioisocyanatkonjugat (FITC) erhältlich ist. Er erkennt ein Antigen, das auf Leukocyten erwachsener Menschen und auf sehr unreifen Erythrocytenvorläufern, aber nicht auf kernhaltigen ausgewachsenen Erythrocyten vorhanden ist (Loken, M.E., et al., Blood 69:255-263 (1987)). Daher werden Leukocyten der Mutter erkannt und gebunden, aber kernhaltige fötale Erythrocyten nicht, so daß eine Trennung der beiden möglich wird. Wie detailliert in Beispiel 1 beschrieben, wurde dieser markierte Antikörper verwendet, um Leukocyten der Mutter in der mononuklearen Zellschicht zu entfernen.
  • Wie ebenfalls (in Beispiel 1) beschrieben, wurde eine Kombination monoklonaler Antikörper für denselben Zweck (d.h. Elimination von Zellen der Mutter aus der Blutprobe) verwendet. Wie beschrieben, wurden Anti-Monocytenantikörper (M3) und Anti- Lymphocytenanti-körper (L4) verwendet, um mütterliche Zellen von der mononuklearen Zellschicht zu entfernen, die durch eine Dichtegradientzentrifiigation erhalten wurde.
  • Monoklonale Antikörper, welche kernhaltige fötale Zellen erkennen, aber keine mütterlichen Zellen erkennen, wurden ebenfalls identifiziert. Wie detailliert in Beispiel 1 beschrieben, wurde ein monoklonaler Antikörper identifiziert, welcher den Transferrinrezeptor erkennt. Es wurde von Erythroblasten gezeigt, daß sie das Transferrinrezeptor-Antigen auf ihren Zelloberflächen (Loken, M.R. et al., Blood, 69:255-263 (1987)) auf der BFU-E Stufe vor der Kernausschleusung ausbilden (Loken, M.R. et al., Blood, 69:255-263 (1987)). Der Transferrinrezeptor ist ebenfalls auf aktivierten Lymphocyten (Trowbridge, I.S. and M.B. Omary, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:3039-3043 (1981)), bestimmten Tumorzellen (Greaves, M. et al., Int. J. Immunopharmac., 3:283-300 (1981)) und Trophoblastzellen (Galbraith, G.M.P. et al., Blood, 55:240-242 (1980)) vorhanden. Daher ist solch ein Antikörper spezifisch für oder erkennt (bindet an) kernhaltige fötale Zellen, aber nicht Leukocyten der Mutter. Wie in Beispiel 1 beschrieben, wurden kommerziell erhältliche fluoresceinkonjugierte monoklonale, gegen den Transferrinrezeptor (TIR) gerichtete Antikörper verwendet, um kernhaltige Erythrocyten von mütterlichen Zellen zu abtrennen. Obwohl der Antikörper nicht für kernhaltige fötale Erythrocyten spezifisch ist, erleichtert er ihre Anreicherung in den flußsortierten Proben. Andere monoklonale Antikörper, welche zwischen kernhaltigen fötalen Zellen und Zellen der Mutter unterscheiden können, die in einer Blutprobe vorhanden sind, können ebenfalls verwendet werden. Diese Antikörper umfassen kommerziell erhältliche monoklonale Antikörper und jene, welche unter Verwendung bekannter Techniken hergestellt werden können.
  • Die oben beschriebene Abtrennung kernhaltiger fötaler Zellen aus einer mütterlichen Blutprobe kann mit Vollblutproben oder einer Fraktion des Vollbluts durchgeführt werden (d.h., einer Fraktion, die durch eine Behandlung oder ein Bearbeiten des Vollbluts entsteht, um den Anteil vorhandener kernhaltiger fötaler Zellen zu erhöhen), hierin als angereicherte mütterliche Probe bezeichnet. Eine angereicherte mütterliche Probe wird z.B. in einem Zwei-Schritt-Verfahren hergestellt. Die mütterliche Probe wird einer ersten Trennung, die auf der Größe basiert, wie beispielsweise durch eine Ficoll-Hypaque-Dichtegradientenzentrifugation, unterzogen. Dies führt zur Herstellung einer überstehenden Schicht, welche Thrombocyten enthält, einer mononuklearen Zellschicht und eines zusammenklebenden Pellets, welches kernfreie Erythrocyten und Granulocyten enthält. Die mononukleare Schicht wird von den anderen Schichten getrennt, um eine mütterliche Probe herzustellen, die mit kernhaltigen fötalen Zellen angereichert ist.
  • Die mütterliche Probe, egal ob mütterliches Vollblut oder eine angereicherte mütterliche Probe, wird einer Trennung unterzogen, die auf Unterschiede der Oberflächenantigene zwischen kernhaltigen fötalen Zellen und Zellen der Mutter unter Verwendung der oben beschriebenen Antikörper basiert. Die mütterliche Probe wird mit zumindest einem monoklonalen Antikörper in Kontakt gebracht, der entweder für kernhaltige fötale Zellen oder Zellen der Mutter, aber nicht für beide spezifisch ist, wodurch eine Trennung der zwei Zelltypen ermöglicht wird. Die mütterliche Probe kann mit einem Satz von zwei oder mehr monoklonalen Antikörpern kombiniert werden, wobei jeder entweder für fötale oder mütterliche Zellen, aber nicht für beide spezifisch ist. Die Kombination von monoklonalen Antikörpern kann so angelegt sein, daß die Trennung der zwei Zellarten (d.h., die zuvor beschriebene Kombination von Anti-TfR-Antikörper und HLe-1-Antikörper) über das hinaus verstärkt wird, was mit einem einzelnen monoklonalen Antikörper möglich ist. Die Trennung der fötalen Zellen wird unter Verwendung bekannter Techniken, wie beispielsweise die Zellflußmessung, die Verwendung von immunomagnetischen Kugeln (immunomagnetic beads) und Zellpanning (cell panning) durchgeführt. Im allgemeinen haben die monoklonalen Antikörper eine detektierbare Markierung (beispielsweise radioaktive Stoffe, Fluorophore).
  • Männliche (Y-spezifische) DNA wurde in Zellen festgestellt, die von schwangeren Frauen in verschiedenen Stufen der Schwangerschaft isoliert wurden. Kurzgefaßt, es wurde die mononukleare Zellschicht aus venösen Blutproben isoliert, die von Frauen zwischen der 11. und 16. Schwangerschaftswoche erhalten wurde. Die Trennung wurde unter Verwendung der Ficoll/Hypaque Dichtezentrifugation durchgeführt, gefolgt von einer Inkubation mit monoklonalen Antikörpern (Anti-TfR, Anti-Leu4 und Anti-LeuM3), die an einen Fluoreszenzmarker oder eine Verbindung (Fluorescein, Phycoerythrin) konjugiert war und einer Zweifarbenanalyse sowie einer Flußsortierung mit Hilfe eines fluoreszenzaktivierten Zellsortierers. Die Zellen, die eine grüne Fluoreszenz, aber keine rote Fluoreszenz zeigten (TfR positiv, Leu4 negativ, LeuM3 negativ) waren kernhaltige lötale Zellen und wurden von dem Rest der Probe abgetrennt. Diese Zellen wurden lysiert, danach wurde die DNA amplifiziert und auf die Gegenwart einer 397 bp-Sequenz von Y-Chromosomen getestet.
  • Die in Beispiel 6 dargestellten Ergebnisse zeigen, daß das Verfahren die Detektion einer 397 bp-Sequenz erlaubt, die in so geringen Mengen wie 5 pg männlicher DNA vorhanden ist. Zusätzlich legt dies nahe, daß eine Beziehung zwischen dem Alter der Schwangerschaft und der Erkennung männlicher DNA besteht, wie dies in Fig. 4 dargestellt ist. Diese Daten legen nahe, daß ein biologisches "Fenster" für den Übergang von kernhaltigen fötalen Erythrocyten in den mütterlichen Blutkreislauf bestehen könnte.
  • Die DNA-Sequenzen des Vaters können in den autosomalen Chromosomen des Fötus identifiziert werden. Folglich kann das erfindungsgemäße Verfahren zur Trennung der weiblichen kernhaltigen fötalen Zellen genauso wie der männlichen kernhaltigen fötalen Zellen von dem Blut der Mutter verwendet werden. Daher kann das Verfahren für alle auf DANN basierenden Diagnostikverfahren verwendet werden, die augenblicklich in anderen Verfahren angewandt werden, wie beispielsweise der Amniozentese.
  • Eine weitere Unterstützung für die Fähigkeit des vorliegenden Verfahrens zur Identifizierung Y-spezifischer DNA in kernhaltigen Erythrocyten, die aus Blut peripheraler Körperbereiche schwangerer Frauen erhalten wurden, stammt von Rekonstruktionsexperimenten.
  • Wie in Beispiel 8 beschrieben, wurde männliches Nabelschnurblut zu Blut zugegeben, welches von nicht-schwangeren Frauen stammt, um die Gegenwart von fötalen Zellen in mütterlichem Blut zu simulieren. Kurzgefaßt, Proben von Venenblut wurden von gesunden, nicht schwangeren Frauen gesammelt und die mononuklearen Zellschichten wurden durch Ficoll/Hypaque Dichtezentrifugation isoliert. Mononukleare Zellen von der Nabelschnur männlicher Kinder (im Bereich von 102 bis 106 Zellen) wurden zu den mononuklearen Zellschichten des Bluts nicht schwangerer Frauen zugegeben. Das Nabenschnurblut enthielt einen großen Prozentsatz kernhaltiger Erythrocyten. Die erhaltenen Ergebnisse dieser Experimente waren im wesentlichen denen gleich, die von schwangeren Frauen zu verschiedenen Zeitpunkten der Schwangerschaften erhalten wurden. Amplifizierte Sequenzen der Y-Chromosomen, die der Gegenwart männlicher DNA entspricht, wurden nachgewiesen, wenn 102 männliche Zellen den weiblichen Zellen zugegeben wurden.
    • Verwendung des vorliegenden Verfahrens zur Isolierung keruhaltiger fötaler Zellen und Charakterisierung fötaler DNA
  • Da gezeigt wurde, daß fötale DNA aus kernhaltigen fötalen Zellen erhalten werden kann, die in einer Blutprobe der Mutter vorkommen, ist das Verfahren als Werkzeug der prenatalen Beurteilung zweckmäßig (beispielsweise als Mittel zur Feststellung von Chromosomenanomalien zur Bestimmung, ob DNA vorhanden ist, die mit einer Krankheit in Verbindung steht, oder zur Detektion Y-spezifischer DNA). Es ist besonders geeignet, weil es nicht invasiv ist und nur eine geringe Blutmenge benötigt.
  • Fötale DNA-Sequenzen in kernhaltigen fötalen Erythrocyten, die wie hierin beschrieben oder auf andere Arten isoliert werden, durch die kernhaltige fötale Zellen von einer mütterlichen Blutprobe getrennt werden können, lassen sich im Hinblick auf das Auftreten einer DNA-Sequenz oder DNA-Sequenzen (Gene oder Genteile) analysieren oder bewerten, welche für die Diagnose oder andere Zwecke von Interesse sind. Die DNA-Sequenzen oder Gene/Genteile, die in fötalen Zellen vorhanden sind, werden hierin als in Frage kommende fötale DNA bezeichnet. Zum Beispiel kann die ausgewählte DNA, deren Gegenwart oder Abwesenheit zu bestimmen ist, und deren Menge ebenfalls bestimmt werden kann, das Gen für eine Krankheit, wie beispielsweise Mukoviscidose sein, wobei das verursachende Gen oder Genteil geklont und sequenziert wurde; alternativ kann sie eine Sonde für eine X- oder Y-spezifische DNA sein. Das gleiche Verfahren kann ebenfalls mit geeigneten Modifikationen (beispielsweise eine geeignete DNA-Sonde, Zeit, Temperatur) verwendet werden, um andere Gene oder Genteile festzustellen.
  • Wenn es in einem diagnostischen Zusammenhang verwendet wird, beispielsweise zur Bestimmung bekannter Gene, die die Mukoviscidose verursachen, wird das vorliegende Verfahren wie folgt durchgeführt: Zunächst wird eine Blutprobe der Mutter (typisch 20 ml) gewonnen und in Komponentenschichten, die auf dem relativen Gewicht basieren (beispielsweise durch Ficoll-Hypaque-Dichtegradienten-Zentrifügation) getrennt, um Erythrocyten zu entfernen, die keinen Kern enthalten und um eine mononukleare Zellschicht herzustellen. Dies führt zur Herstellung einer Blutprobe der Mutter, die mit kernhaltigen fötalen Erythrocyten angereichert ist. Die mononukleare Zellschicht wird mit zumindest einem geeigneten monoklonalen Antikörper markiert (beispielsweise einem, der für die Art kernhaltiger fötaler Zellen spezifisch ist, die aus der Probe abgetrennt werden sollen). Z.B. kann ein monoklonaler Antikörper verwendet werden, der für kernhaltige fötale Zellen spezifisch ist, beispielsweise ein oben beschriebener Anti-TfR-Antikörper. Im allgemeinen enthalten die verwendeten monoklonalen Antikörper eine nachweisbare Markierung. Alternativ kann eine Kombination von ausgewählten markierten monoklonalen Antikörpern, beispielsweise monoklonale Antikörper, die für kernhaltige fötale Zellen (beispielsweise Anti-TfR-Anti-körper) spezifisch sind und monoklonalen Antikörpern, die für mütterliche Leukocyten (HLe-1 oder L4 und M3) spezifisch sind, jeweils gekennzeichnet mit verschiedenen Fluoreszenzverbindungen verwendet werden, um im wesentlichen alle mütterlichen Zellen zu entfernen. Gekennzeichnete Zellen werden nachfolgend von den anderen unter Verwendung bekannter Methoden, wie beispielsweise Zellflußmessung, getrennt. Die Bindung monoklonaler Antikörper an Zellen, für die sie spezifisch sind, führt zur Herstellung von markierten monoklonalen Antikörper-Zellkomplexen. In dem Fall, in dem beispielsweise Anti-TfR-Antikörper und HLe-1 Antikörper verwendet werden, werden kernhaltige fötale Erythrocyten an die Anti-TfR-Antikörper gebunden, wobei kernhaltige fötale Erythrocyt/Anti-TfR-Antikörper-Komplexe entstehen, und mütterliche Leukocyten werden von HLe- 1 Antikörpern gebunden, wobei mütterliche Leukocyt/HLe-1 Antikörperkomplexe entstehen. Die kernhaltigen fötalen Erythrocyt/Anti-TFR-Antikörper- Komplexe werden von den mütterlichen Zellihle- 1 -Antikörper-Komplexen unter Verwendung, beispielsweise der Zellflußmessung getrennt.
  • Das Vorhandensein fötaler DNA, die mit anderen Krankheiten oder Zuständen als die Mukoviscidose in Verbindung steht, kann mit Hilfe des vorliegenden Verfahrens ebenfalls nachgewiesen und/oder quantifiziert werden. In jedem Fall wird eine geeignete Sonde verwendet, um die interessierende Sequenz zu detektieren. Zum Beispiel werden Sequenzen der Sonden St14 (Oberle, I., et al., New Engl. J. Med., 312:682-686 (1985)), 49a (Guerin, P., et al., Nucleic Acids Res., 16:7759 (1988)), KM-19 (Gasparini, P., et al., Prenat. Diagnosis, 9:349-355 (1989)) oder die deletionsanfälligen Exons der Gene für die Muskeldystrophie des Duchenne Typs (DMD) (Chamberlain, J.S., et al., Nucleic Acids Res., 16:11141-11156 (1988)) als Sonden verwendet. St14 ist eine hoch polymorphe Sequenz, die von dem langen Arm des X-Chromosoms isoliert wurde, welches die potentielle Möglichkeit zur Unterscheidung zwischen weiblicher DNA von mütterlicher DNA besitzt. Es befindet sich in der Nähe des Gens für den Faktor VIII:C und kann daher ebenfalls für die prenatale Diagnose auf Hämophilie A verwendet werden. Entsprechende Primer für die Sequenzen, die die sechs am häufigsten entfemten Exons in dem DMD-Gen flankieren, welche erfolgreich zur Diagnose von DMD durch PCR verwendet wurden, können ebenfalls eingesetzt werden (Chamberlain, J.S., et al., Nucleic Acids Res., 16:11141-11156 (1988)). Andere Zustände, welche durch das vorliegende Verfahren diagnostiziert werden können, umfassen β-Thalassämie (Cai, S-P., et al., Blood, 73:372-374 (1989); Cai, S-P., et al., Am. J. Hum. Genet., 45:112-114(1989); Saiki, R.K., et al., New Engl. J. Med., 319:537-541(1988)), Sichelzellenanämie (Saiki, R.K., et al., New Engl. J. Med., 319:537- 541(1988)), Phenylketonurie (DiLella, AG., et al., Lancet, 1:497-499 (1988)) und die Gaucher-Krankheit (Theophilus, B., et al., Am. J. Hum. Genet., 45:212-215 (1989)). Eine geeignete Sonde (oder Sonden) ist zur Verwendung in dem vorliegenden Verfahren zur Bestimmung des jeweiligen Zustands erhältlich.
  • Wie oben bereits erwähnt ist es auch möglich, fötale Zellen von den Zellen der Mutter mit anderen Methoden als der Blutzellflussmessung abzutrennen und die auf diesem Wege erhalene fötale kernhaltige Erythrocyten-DNA zu analysieren. Solche Trennmethoden können zusammen mit oder unabhängig von der Blutzellflussmessung eingesetzt werden. Dies ist von Vorteil, weil bei fehlender Verfügbarkeit eines Blutzellflussmessgeräts sowie aus Kostengründen mögliche Anwendungen dieser Technik nicht möglich sein können. Somit können andere Verfahren zur Abtrennung fötaler Zellen zum Einsatz kommen. Mit der Trennmethode kann die Entfernung unerwünschter Zellen ("Negativauswahl") oder die Isolierung seltener aber erwünschter Zellen ("Positivauswahl") erreicht werden.
  • Beispielsweise kann die Abtrennung mittels immunomagnetischer Kügelchen oder über Zellpanning erfolgen. Wie zuvor beschrieben wird bei dieser Ausführungsform die einkernige Zellschicht isoliert. Diese Schicht wird sodann mit antikörperbeschichteten Kunststoffteilchen vermischt, welche magnetische Kerne enthalten (z.B. "Dynabeads"). Diese immunomagnetischen Kügelchen stehen mit unterschiedlichen Antikörpern beschichtet zur Verfügung. Beispielsweise können immunomagnetische Kügelchen zum Einsatz kommen, die beschichtet sind mit Antikörpern gegen Leukocytenantigene und mit Antikörpern gegen Immunoglobuline der Maus, welche dann anschließend mit monoklonalen Antikörpern der Maus gegen den Transferrinrezeptor des Menschen konjugiert werden können. Nach dem Mischen werden die rosettenförmigen Zellen mit einem Konzentrator für magnetische Teilchen isoliert. In einer Ausführungsform werden zwei Chargen antikörperbeschichteter immunomagnetischer Kügelchen nacheinander eingesetzt. Zunächst werden die Leukocyten der Mutter entfernt und sodann die verbleibenden TfR-positiven Zellen gesammelt. Die folgenden Verfahrensschritte (Amplifikation, Separation, Kontakt mit einer geeigneten DNA- Sonde oder einem Sondensatz) sind die gleichen, wie sie für die Abtrennung von Zellen mittels mittels Zellflußmessung beschrieben sind.
  • Müller und Mitarbeiter (Lancet, 336:197-200 (1990)) beschrieben ein Isolationsverfahren für aus dem Blut der Placenta von schwangeren Frauen stammenden Trophoblasten unter Verwendung magnetischer Kügelchen. In diesem Verfahren wurden 1 ml einer Hybridoma- Kultur für monoklonale Antikörper vermischt mit einem ßjberstand von 2*10&sup7; magnetischen Kügelchen, welche mit Schaf-Antikörpern gegen IgG der Maus (Fc-Fragment) vorbeschichtet waren (Dynabeads M-450, Dynal AS, Oslo, Norwegen) und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Die beschichteten Kügelchen wurden bei 4ºC aufbewahrt und 3mal mit eiskaltem Li-Heparin (10 IE/ml) enthaltendem RPMI 1640-Medium gewaschen. Das Blut der schwangeren Frauen wurde in 10 IE Lithium pro ml Gesamtblut enthaltenden Röhrchen gesammelt, mit Li-haltigem RPMI-Medium im Verhältnis 1:10 verdünnt und mit den antikörperbeschichteten Kügelchen bei 4ºC über Nacht inkubiert. Die gewünschten Zellen wurden an die Antikörper auf den Kügelchen gebunden; die Kügelchen wurden mittels eines Kobalt-Samarium-Magneten gesammelt. Obwohl in diesem Falle die Antikörper gegen die Antigene der Trophoblasten gerichtet waren, läßt sich eine ännliche Technik mit z.B. gegen Zelloberflächenantigene gerichteten Antikörpern einsetzen, welche auf fötalen kernhaltigen Erythrocyten anzutreffen sind, nicht jedoch auf den Zellen der Mutter. Ein Vorteil dieser besonderen Technik besteht darin, daß Initiationsschritt, mit welchem die Isolierung einkerniger Zellen erreicht wird, nicht einbezogen ist. Zusätzlich lassen sich die magnetischen Kügelchen sowohl für eine positive Auswahl (Zellen des Fötus) als auch für eine negative Auswahl (Zellen der Mutter) einsetzen.
  • Ein alternatives Verfahren für die Isolierung kann in einer Abänderung des von R.J. Berenson und Mitarbeitern (J. of Immunol. Methods, 91: 11-19 (1986)) beschriebenen Verfahrens bestehen, in welchem die große Affinität zwischen dem Protein Avidin und dem Vitamin Biotin ausgenutzt wird, um ein indirektes Immunoadsorbens-Verfahren zur Verfügung zu stellen. In diesem Verfahren wurde Avidin an mit Bromcyan aktivierte Sepharose 6MB- Kügelchen gebunden und abwechselnd mit einem Kopplungspuffer (0,1 M NaHCO&sub3; in 0,5 M - NaCl bei einem pH von 8,3) und einem Waschpuffer (0,1 M Natriumacetat in 0,5 M NaCl bei einem pH von 4,5) gewaschen und bei 4ºC aufbewahrt. Die Blutzellen wurden mit 1) monoklonalen Antikörpern der Maus und mit 2) biotinyliertem Anti-Maus-Immunglobulin aus Ziegen inkubiert. Eine Pharmacia K19/15-Säule wurde mit 3 ml eines Säulengels beschickt. Die behandelten Zellen wurden in 2% Rinderserumalbumin enthaltender phosphatgepufferter Kochsalzlösung auf die Säule gegeben. Durch mechanisches Rühren wurden aneinanderhaftende Zellen voneinander getrennt. Diese Technik läßt sich zur Abtrennung fötaler Zellen verwenden, falls die eingesetzten Antikörper Antigene auf Oberflächen von fötalen Zellen erkennen oder Antigene auf Zelloberflächen der Mutter, jedoch nicht beide zusammen. Es gibt verschiedene Verfahren zur Konjugation von Antikörpern an Kügelchen; Beispiele wurden von Thomas und Mitarbeitern (Thomas, T.E., et al. (J. of Immunol. Methods, 120: 221-231(1989)) und von dekretser und Mitarbeitern (deKretser, T.A., et al. (Tissue Antigens, 16: 317-325 (1980)) beschrieben. Bei Verwendung einer antikörperbeschichteten Säule ist zu Beginn die Isolierung der einkernigen Zellfraktion aus Gesamtblut nicht erforderlich.
  • Sind die fötalen Zellen erst einmal aus dem Blut der Mutter isoliert, dann lassen sie sich falls erwünscht, zur Erhöhung der Zellzahl für Diagnosezwecke in Kultur vermehren. E. Fibach und Mitarbeiter (Blood, 73: 100-103 (1989)) haben ein Verfahren beschrieben, welches das Wachstum menschlicher Vorläuferzellen für die Blutbildung begünstigt. Dieses mehrstufige Verfahren besteht aus 1) einer Anfangskultur in Gegenwart eines konditionierten Mediums aus menschlichen Blasenkrebszellen, 2) Entfernung von Leukocyten durch Sammeln nicht anhaftender Zellen und Lyse mit monoklonalen Antikörpern und 3) erneute Kultur der Zellen in einem durch rekombinantes Erythropoetin ergänten Medium.
  • Andere Verfahren zur Abtrennung von fötalen kernhaltigen Zellen aus Zellen der Mutter können ebenfalls eingesetzt werden, unter der Voraussetzung, daß sie eine Unterscheidung zwischen fötalen Zellen und Zellen der Mutter sowie deren Trennung voneinander ermöglichen.
  • Ein Kit zur Verwendung bei der Durchführung des vorliegenden Verfahrens zur Isolierung und zum Nachweis von erwünschter DNA, wie z.B. eine mit einer Krankheit oder einer anderen Körperzustand einhergehende Chromosomenanomalie, in einer Blutprobe der Mutter läßt sich zusammenstellen. Er kann beispielsweise einen Behälter zur Aulbewahrung der benötigten Reagentien, die Reagentien selbst und wahlweise einen festen Träger zur Verwendung bei der Abtrennung von fötalen kernhaltigen Zellen und/oder spezifischen Antikörperkomplexen von anderen Bestandteilen der Probe oder zur Abtrennung von mit spezifischen Antikörpern komplexierten Zellen der Mutter enthalten. Der Kit kann, wie beschrieben, auch einen festen Träger zum Einsatz bei der Abtrennung von Komplexen enthalten, welche von anderen Bestandteilen der Probe gebildet werden. Solche festen Träger können beispielsweise aus einem Objektträger aus Glas, einem Nitrocellulosefilter oder immunomagnetischen Kügelchen bestehen und können einen daran angehefteten Antikörper aufweisen, welcher selektiv ist für die in den fötalen kernhaltigen Zellen vorkommenden Antikörper und/oder spezifischen Antikörperkomplexe.
  • Die vorliegende Erfindung wird nun anhand der folgenden Beispiele näher beschrieben, ohne daß sie nur darauf beschränkt ist.
    • Beispiel 1: Abtrennung von Antikörpern für die Isolierung und Auslesvon fötalen kernhaltigen Erythrocyten (NRBCs) Entfernung von Leukocyten der Mutter aus Mutterblut unter Verwendung von menschlichem Leukocytenantigen (HLe- 1)
  • Die Technik zur Isolierung von fötalem NRBC erfolgte anfangs über eine Ficoll-Hypaque- Dichtegradientenzentrifugation zur Entfernung der außerordentlich hohen Zahl kernfreier Erythrocyten aus dem Blut der Mutter. Peripheres Blut wurde zentrifugiert und in eine überstehende Schicht mit Thrombocyten (platelets), eine Schicht aus einkernigen Zellen und ein aus kernfreien Erythrocyten und Granulocyten bestehendes agglutiniertes Pellet aufgetrennt. Die Schicht aus einkernigen Zellen bestand aus Lymphocyten, Monocyten, möglichen Trophoblasten und, infolge größerer Dimension und Dichte, aus NRBCs und einigen Retikulocyten. Während die Ficoll-Hypaque-Zentrifugation eine anfängliche Anreicherung an in der Probe der Mutter enthaltenen fötalen NRBCs erbrachte, wurde zur Verbesserung der Reinheit der isolierten Zellpopulation eine Zellflussmessung und Zellauslese eingesetzt.
  • Die Schicht aus einkernigen Zellen aus Proben peripheren Blutes von 63 schwangeren Frauen, 15 nicht schwangeren Erwachsenen und 39 Nabelschnüren wurde mit FITC-HLe-1 zur Analyse mittels Zellflussmessung versetzt. Proben aus Nabelschnur wurden als Ersatz für fötales Vollblut verwendet. Für jede der drei Gruppen wurden repräsentative Histogramme gwonnen, in denen die Fluoreszenz gegen die Flachwinkel-Lichtstreuung (ergibt Näherungswerte für die Zellgröße) aufgetragen ist. In den Histogrammen wurden die Peaks, die den Leukocyten, Erythrocyten und Thrombocyten entsprechen identifiziert. Von Proben von 9 schwangeren Frauen, 7 nicht schwangeren Erwachsenen und 12 Nabelschnüren wurden zur genauen mikroskopischen Untersuchung mittels der Wright-Giemsa-Färbung fluoreszierende (HLe-1-positiv) und nicht fluoreszierende (HLe-1-negativ) Zellpopulationen ausgesucht. Während die HLe-1-positiven Populationen unabhängig von der Herkunft der Proben immer aus Leukocyten bestanden, unterschieden sich die HLe-1-negativen Populationen.
  • Im Nabelschnurblut bestanden die HLe-1-negativen Zellen aus kernfreien und kernhaltigen Erythrocyten, zuweilen mit Thrombocyten. Im Blut schwangerer Frauen traten Thrombocyten, kernfreie Erythrocyten und sehr selten NRBCs auf. Im Blut von nicht schwangeren Erwachsenen konnten nur Thrombocyten und Zelltrümmer nachgewiesen werden. Somit wurde Nabelschnurblut mit seinem hohen Prozentgehalt an NRBCs als Bezugsgröße für die Erstellung von Parametern zur Zellauslese herangezogen. Mit dem Mikroskop wurde die Spezifität der Antikörper-Antigen-Bindung bestätigt, sowie die Tatsache, daß die ausgelesenen HLe-1-negativen Zellen relativ frei von Kontamination mit Leukocyten waren. Diese Auswahlparameter wurden für die Isolierung potentieller fötaler NRBCs von 40 Schwangeren eingesetzt.
    • Anreicherung von fötalen NRBCs im Blut der Mutter unter Einsatz von Transferrinrezeptor-Antigenen (TfR)
  • Der Transferrinrezeptor (Newman, R., et al., Trends Biochem. Sci. 1: 397-399 (1982)) ist ein Oberflächen-Glykoprotein mit Bedeutung für den Eisentransport in Zellen. TfR kommt auf aktivierten Lymphocyten (Trowbridge, I.S.-, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 3039- 3043 (1981)), einigen Tumorzellen (Greaves, M., et al., Int. J. Immunopharmac., 3: 283-300 (1981)) sowie auf Trophoblaten vor (Galbraith, G.M.P., et al., Blood, 55: 240-242 (1980)). Erythroblasten tragen TfR auf ihren Zelloberflächen vom BFU-E-Stadium bis zur Abstoßung des Kerns (Loken, M.R., et al., Blood 69 255-263 (1987)). Somit ist TfR ein ausgezeichneter "Antigen-Kandidat" zur Anreicherung von im Blut der Mutter gefundenen fötalen NRBCs. Monoklonale Antikörper gegen TfR stehen sowohl als Fluoresceinkonjugat (Becton-Dickinson Katalog #7513) als auch als Konjugat mit Phycoerythrin (PR) zur Verfügung (Geschenk von Dr. Michael Loken, Becton-Dickinson). Zur TfR-Analyse und zur mikroskopischen Untersuchung wurde die Schicht aus einkernigen Zellen aus Proben peripheren Blutes von 6 schwangeren Frauen, 4 nicht schwangeren Erwachsenen und 3 Nabelschnüren von Neugeborenen isoliert. Von diesen drei Gruppen wurden representative Histogramme mit einem Auftrag der Fluoreszenz gegen die Lichtstreuung erstellt.
  • Während Proben aus Nabelschnur eine große Population fluoreszierender Zellen (TfR- positiv) von heterogener Größe aulwiesen, zeigte sich bei nicht schwangeren und schwangeren Erwachsenen ein kleinerer Prozentsatz an fluoreszierenden Zellen, die Ansammlungen diskreter Gruppen bildeten. Darüber hinaus zeigten sich geringfügige Unterschiede in den Prozentsätzen für TfR-positive bei Schwangeren (Mittelwert 0,83) im Vergleich mit Proben von nicht schwangeren Erwachsenen (Mittelwert 0,32).
  • Mikroskopische Untersuchungen der TfR-positiven Zellen erfolgten unter Einsatz der Wright-Giesma-Färbung für die Morphologie und der Kleinhauer-Betge-Technik für den Nachweis von fötalem Hämoglobin (Kleinhauer, E., et al., Klin. Wochenschr., 35: 637-638 (1957)). In den Nabelschhurproben wurden eine große Anzahl von kernhaltigen und kernfreien Erythrocyten mit fötalem Hämoglobin sowie zufällig vorliegende Leukocyten visuell identifiziert. Bei schwangeren Frauen waren die vorherrschenden Zelltypen kernhaltige und kernfreie Erythrocyten mit fötalem Hämoglobin, obwohl gelegentlich auch Leukocyten beobachtet wurden. Im Gegensatz dazu bestanden die Proben von nicht schwangeren Kontrollen fast ausschließlich aus Lymphocyten und Monocyten. Weil Trophoblasten TfR exprimieren, wurde postuliert, daß sie auch in der von schwangeren Frauen ausgewählten Population enthalten sein könnten; nichts dergleichen konnte nachgewiesen werden.
    • Doppelantikörper-Analyse
  • Weil beide Antikörper den Gehalt an vorliegenden NRBCs anreicherten jedoch andere Zelltypen nicht vollständig aus den ausgewählten Proben aussonderten, wurden für die Isolierung von reinen Populationen an fötaler NRBCs Kombinationen von Antikörpern eingesetzt. Unter Verwendung von PE-konjugiertem TfR und FITC-konjugierten HLe-1 wurden vorläufige Doppelantikörper-Untersuchungen durchgeführt. NRBCs sind TfR-positiv und HLe-1-negativ, während Leukocyten der Mutter HLe-1-positiv sind. Diese Untersuchungen erwiesen sich als erfolgreich und resultierten in einer Abtrennung von Leukocyten der Mutter.
  • So wurden mit der oben beschriebenen Arbeit die Parameter für die Zellflussmessung zur Anreicherung und Auslese von NRBCs im peripheren Blut schwangerer Frauen bestimmt. Darüber hinaus zeigten mikroskopische Untersuchungen, daß morphologische Unterschiede in einkernigen Zellpopulationen aus Proben venösen Blutes von Schwangeren im Vergleich mit den von nicht schwangeren Erwachsenen auftreten.
    • Beispiel 2: Untersuchungen zur DNA-Hybridisierung in aus dem Blut der Mutter ausgewählten HLe-1-negativen Zellen
  • Zur Bestätigung des fötalen Ursprungs der nach Beispiel 1 ausgesonderten Zellen wurden Sonden aus Y-Chromosomen eingestzt, da gerade Y-Chromosomen unbestreitbar fötalen Ursprungs sind. Die Auswertung zielte darauf ab, zu untersuchen, ob der vor der Geburt erfolgte autoradiographische Nachweis des Vorkommens von DNA aus Y-Chromosomen im Blut der Mutter im Zusammenhang mit der späteren Geburt eines Knaben steht.
    • DNA-Isolierung
  • HLe-1-negative Zellen aus Nabelschnur und dem Blut schwangerer Frauen wurden in Teströhrchen gegeben. Sowohl herkömmliche Verfahren zur DNA-Isolierung als auch die Abänderung gröberer Verfahren (Lau, Y-F., et al., Lancet 1 14-16 (1984); Mccabe, E.R.B., et al., Hum. Genet., 75: 213-216 (1987)) wurden ohne Erfolg beim Nachweis von Southern- Blot-Bändern eingestzt, die von Y-Chromosomen stammen. Alle wurden durch die kleine Zahl vorhandener Zellen beschränkt.
    • Beispiel 3: Direkte Hybridisierung an auf Filtern abgeschiedenen Zellen
  • Um die mit der DNA-Isolierung einhergehenden technischen Probleme zu umgehen, wurde ein Verfahren zur direkten DNA-Hybridisierung an Zellen entwickelt, die auf Nitrocellulosefiltern abgeschieden wurden (Bianchi, B.W., et al., Cytometry, 8: 197-202 (1987)). In Kontrollversuchen wurde das Geschlecht eines Neugeborenen aus lediglich 50 ausgesuchten Leukocyten aus der Nabelschnur oder aus 5000 HLe-1-negativen Zellen (Mischung aus kernhaltigen und kernlosen Zellen) bestimmt.
  • Die Vorgehensweise wurde dann zum Nachweis von Y-Chromosomensequenzen in HLe-1negativen Zellen eingestzt, welche aus Proben peripheren Blutes von 40 Frauen mit einer Schwangerschaftsdauer zwischen 8½ und 38 Wochen gewonnen wurden. Die Ergebnisse sind nachstehend wiedergegeben:
  • Es wurde der Schluß gezogen, daß bei Verwendung dieser Sonde keine Voraussage für die Geburt eines Knaben abgegeben werden konnte. Die Möglichkeit besteht, daß sich fötale DNA auf den Filtern befand, wo eine DNA-Hybridisierung stattfand, diese an die Y-Sonde gebundene DNA jedoch nicht spezifisch war. Somit könnten die als "positiv" für männliche DNA interpretierten Filter tatsächlich "positiv" für fetomaternales Blut sein.
    • Beispiel 4: Bestimmung des Volumens, der Morphologie und der Vielseitigkeit von fetomaternalem Blut a. Allgemeine Strategie
  • Wegen der Anwendbarkeit des vorliegenden Verfahrens auf die Isolierung von aus dem Blut einer schwangeren Frau erhaltenen fötalen kernhaltigen Zellen ist es auch möglich, zu bestimmen, ob sich lötale Zellen im Blut der Mutter in allen Schwangerschaftsstadien nachweisen lassen. Es kann eine Datei erstellt werden, welche Informationen über die Anzahl und den Typ der bei fortschreitender Schwangerschaft im Blut der Mutter zirkulierenden fötalen Zellen liefert. Aus früheren Arbeiten kann erwartet werden, daß es für die Werte jeweils einen Normalbereich gibt, der vom Alter der Schwangerschaft abhängt; eine Abweichung von diesen Werten könnte als potentielles Anzeichen für eine risikobehaftete Schwangerschafr gedeutet werden. Insbesondere kann ein hoher Gehalt an fötalem Blut im Kreislauf der Mutter mit Anomalitäten der Placenta, einer drohenden Fehlgeburt und einer Wachstumsverzögerung im Innern der Gebärmutter in Zusammenhang gebracht werden.
  • Von schwangeren Frauen werden Proben venösen Mutterbluts gesammelt, allgemein vor jedem invasiven Eingriff. Gewöhnlich wird eine einzelne Probe von 20 ml venösen Blutes erhalten. Von einer Patientenuntergruppe wird die Erlaubnis eingeholt, alle 4 Wochen Blutproben entnehmen zu dürfen, um die Veränderung in der Anzahl der vorhandenen fötalen Zellen zu verfolgen. Das Blut wird in EDTA gesammelt, im Verhältnis 1:1 mit Hanks gepufferter Salzlösung (HBSS) verdünnt, auf eine Ficoll-Hypaque-Säule (Pharmacia) aufgetragen und bei 1400 upm 40 Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert. Die Schicht mit einkernigen Zellen wird isoliert, zweimal mit HBSS gewaschen und mit fluoreszierenden monoklonalen Antikörpern gefärbt. Dies kann beispielsweise eine Kombination aus Fluorescein-Isothiocyanat-konjugiertem Antitransferrinrezeptor (TfR) und Phycoerythrin-konjugierten Antikörpern gegen Monocyten (M3, Becton-Dickinson Katalog #7347) sein. Die Färbung erfolgt auf Eis in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit 2% fötalem Kälberserum und 0,1% Natriumazid. Die Zellen werden vor der Zellflussbestimmung in PBS gewaschen. Die Analyse und das Aussondern erfolgt auf einem an ein Consort 40-Programm angeschlossenen Becton-Dickinson FACS-IV. Es werden Daten über die relative Größe und Fluoreszenz (bei zwei Farben) der analysierten Zellen erhalten. Im grünen Wellenlängenbereich fluoreszierende Zellen (TfR-positiv) und im roten Wellenlängenbereich nicht fluoreszierende Zellen (L4- und M3-negativ) enthalten die vermuteten fötalen NRBCs. Der Prozentsatz dieser Zellen in der Schicht mit einkernigen Zellen wird aufgezeichnet und in Abhängigkeit vom Alter der Schwangerschaft analysiert. Diese Zellen werden für die Mikroskopie und die PCR-Amplifikation ausgesondert. Darüber hinaus werden die im grünen Wellenlängenbereich nicht fluoreszierenden (TfR-negativ) aber im roten Wällenlängenbereich fluorezierenden Zellen (L4- und/oder M3-positiv) als vermutliche Leukocytenpopulation der Mutter und Quelle für DNA-Polymorphismus der Mutter ausgesondert.
  • Ein zusätzlicher Vorteil bei der Untersuchung kernhaltiger fötaler Zellen im Mutterblut besteht darin, daß der Gehalt an vorliegender fötaler DNA extrapoliert werden kann, um das Ausmaß an fetomaternaler Transfusion in normalen und gewöhnlichen Schwangerschaften zu bestimmen. In den untersuchten Schwangerschaften lag ein durchschnittlicher Gehalt von 1 ng fötaler DNA (entsprechend 150 NBBCs) vor. Unter Verwendung veröffentlichter Werte über die Zahl an NRBCs pro Liter fötalen Blutes für die 16. Schwangerschaftswoche (3,6*10&sup9;) (Millar, D.S., et al., Prenat. Diagnosis, 5: 367-373 (1985); (Forestier, F., et al., Pediatr. Res., 20: 342-346 (1986)) und mittels einfacher Algebra wurde berechnet, daß diese Werte einen Blutaustausch an fötalem Blut von 2-20 ml in den Kreislauf der Mutter ergeben. Dies ist ein verschwindend kleiner Betrag im Vergleich mit dem fötoplazentalen Blutvolumen in der 16. Woche von ca. 20 ml. Es ist wichtig, diese Ergebnisse auszuwerten und zu erweitem, um Sollwerte bezüglich einer fetomaternalen Transfusion im Frühstadium von Schwangerschaften zu erhalten. Ebenso wichtig wird es sein, Abweichungen von den erwarteten Ergebnissen mit Kompikationen bei der Schwangerschaft zu korrelieren.
    • Beispiel 5: Nachbildungsversuche unter Verwendung von Blut nichtschwangerer Frauen und Zusatz von Nabelschnurblut von Knaben, um das Vorliegen fötaler Zellen in Mutterblut zu simulieren
  • Proben von venösem Blut (20 ml) gesunder, nicht-schwangerer Frauen wurden in EDTA gesammelt. Proben von Nabelschnurblut (10 ml) normaler Neugeborener wurden in EDTA gesammelt. Die Schicht mit einkernigen Zellen wurde mittels Ficoll/Hypaque- Dichtegradientenzentrifugation isoliert. Mit einem Blutzählgerät wurden die Zellen ausgezählt. Es wurden getrennte Aliquots von Zellen hergestellt mit: 1) weiblichen Zellen allein; 2) weibliche Zellen und Zugabe von 10² männlichen Blutzellen aus Nabelschnur; 3) weibliche Zellen und Zugabe von 10³ männlichen Blutzellen aus Nabelschnur; 4) weibliche Zellen und Zugabe von 10&sup4; männlichen Blutzellen aus Nabelschnur; 5) weibliche Zellen und Zugabe von 10&sup5; männlichen Blutzellen aus Nabelschnur; 6) weibliche Zellen und Zugabe von 10&sup6; männlichen Blutzellen aus Nabelschnur; 7) männliche Blutzellen aus Nabelschnur allein. Die getrenten Aliquots wurden sodann mit den individuellen Antikörpern zum Test inkubiert. Die Analyse und die Aussonderung erfolgten unter Verwendung eines Blutflussmessers. Für jedes Aliquot wurde ein Histogramm mit zwei Merkmalsvariablen erhalten und Auswertungsparameter für antikörperpositive und antikörpemegative Zellen wurden erstellt. Die ausgesonderten Zellen wurden in sterilen Mikroteströhrchen gesammelt und bei -20ºC eingefroren. Eine PCR-Amplifikation erfolgte mit Primem, die eine nur auf dem Y- Chromosom enthaltene Sequenz von 397 Basenpaaren nachweisen. Das Auftreten einer Bande bei 397 bp im Autoradiographen wurde verwendet, um das Vorliegen männlicher Zellen aus Nabelschnurblut in ausgewählten Proben zu bestätigen.
  • Figur 5 zeigt die erhaltenen Histogramme, wenn ein FITC-Antitransferrin-Rezeptor verwendet wird. Bei nicht-schwangeren Frauen reagieren 0,1% der einkernigen Zellen mit dem Antikörper. Bei männlichem Nabelschnurblut reagieren 24,9% der einkernigen Zellen mit dem Antikörper. Bei Zusatz von immer mehr Nabelschnurzellen zu den Zellen von nichtschwangeren Frauen kann man einen erhöhten Prozentsatz von Zellen, die mit dem Antikörper reagieren, erkennen.
  • Figur 6 zeigt, daß männliche DNA in TfR+-Zellen nachgewiesen werden können, wenn 102 bis 106 männliche Zellen zugesetzt werden. Männliche DNA kann bei Zusatz von 10&sup5; bis 10&sup6; männlichen Zellen in TfR&supmin;-Zellen nachgewiesen werden. Dies ergibt sich aus der Gegenwart von männlichen weißen Blutzellen in der TfR&supmin;-Population.
  • Figur 7 zeigt die erhaltenen Histogramme, wenn Anti-HPCA-1-Antikörper eingesetzt werden. Bei nicht-schwangeren Frauen reagieren 0,9% der einkernigen Zellen mit dem Antikörper. Bei Nabelschnurblut läßt sich eine ganz bestimmte Zellpopulation erkennen, der Prozentsatz beträgt aber nur 1,1%. Somit kann der Zusatz von Nabelschnurblut zu den Zellen nicht-schwangerer Frauen auf den Histogrammen nicht so klar erkannt werden, wie mit dem Transferrinrezeptorantikörper. Mit zunehmender Menge an zugesetzten Nabelschnurzellen konnte eine erhöhte Zahl an HPCA+-Zellen erhalten werden.
  • Das 397 bp-Band für DNA ließ sich in HPCA&spplus;-Zellen auf Agarosegelen nachweisen, wenn 10³ bis 10&sup5; männliche Zellen zu den weiblichen Zellen zugesetzt wurden. Männliche DNA wurde in HPCA-Zellen auf Agarosegelen nachgewiesen, wenn 106 männliche Zellen zu den weiblichen Zellen zugestzt wurden.
    • Beispiel 6: In-situ-Hybridisierung unter Verwendung molekularer Sonden, welche einzelne Chromosomen in nach dem Zellfluß ausgesonderten kernhaltigen Erythrocyten erkennen können
  • Um die diagnostische Einsatzmöglichkeit der vorliegenden Erfindung aufruzeigen, wurde ein Satz von DNA-Sonden aus chromosomenspeziflschen Sonden zusammengestellt, welche sowohl gute Signale für den Störabstand als auch ein gute räumliche Auflösung der Fluoreszenzsignale anzeigten. Entsprechend wurden spezifische Sonden für fünf Chromosomen entwickelt, die häufig bei Lebendgeburten als aneuploid erkannt wurden; die Chromosomen 13, 18, 21, X und Y. Eine Sonde für Chromosom 1 wurde als Kontrolle eingesetzt. Bei der Zusammenstellung der Sonden bestand die allgemeine Strategie darin, einen Starterklon zu identifizieren, welcher über eine Vielzahl genetischer und physikalischer Methoden den gewünschten Chromosomenabschnit kartiert und diesen Klon sodann dazu zu verwenden, ein passendes Cosmid "contig" zu identifizieren, welches dann als Hybridisierungssonde eingesetzt wurde.
  • Eine Hybridiesierung der großen Kopienzahl an repetitiven Sequenzen wurde durch Einbeziehung der gesamten genomischen Human-DNA unterdrückt und die chromosomale Spezifität wurde durch Hybridisierung an Metaphase-Ausstrichen nachgewiesen. Die Sonden egaben scharfe, punktförmige Fluoreszenzsignale in Interphasezellen, welche leicht zu unterscheiden und auszuzählen waren. Die bei dieser Untersuchung eingesetzte Y-Sonde war pDP97, ein repetitiver Klon (ein 5,3 kb EcoRI-Y-Fragment aus dem in die EcoRI-Stelle von pUC-13 subklonierten Cosmid Y97). Alle Sonden wurden mit Biotin markiert, unter Suppressionsbedingungen hybridisiert und die spezifische Hybridisierung über konjugiertes Streptavidin-FITC nachgewiesen, was sich als einzelner "Dot" im FITC-Bild bemerkbar machte. Wie in Figur 8 wiedergegeben, wurde das Y-Chromosom über in situ-Hybridisierung der pDP97-Sonde für das Y-Chromosom in einer fötalen, kernhaltigen Blutzelle nachgewiesen. Somit konnte eine pränatale Diagnose für Chromosomenanomalien an aus dem Blut der Mutter isolierten fötalen Zellen durchgeführt werden.

Claims (25)

1. Nichtinvasives Verfahren zur pränatalen Diagnose einer Chromosomenanomalie in einem Fötus in den Schritten:
(a) Beschaffung einer Blutprobe der Mutter;
(b) Behandlung der Blutprobe der Mutter zur Herstellung einer mit kernhaltigen fötalen Erythrocyten angereicherten Blutprobe;
(c) Durchführung einer in situ-Hybridisierung an der angereicherten Probe mit einer chromosomenspezifischen Sonde oder einer für anomale chromosomale DNA spezifischen Sonde zur Erzeugung von Signalen mit räumlicher Auflösung in einzelnen Chromosomen von Interphasezellen; und
(d) Verwendung der in Schritt (c) erzeugten Signale als Grundlage für die Diagnose einer Chromosomenanomalie im Fötus.
2. Verfahren nach Anspruch 1, in welchem die Blutprobe der Mutter eine Blutprobe aus dem peripheren Körperbereich der Mutter ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, in welchem die Chromosomenanomalie eine Aneuploidie ist.
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, in welchem die in situ-Hybridisierung eine in situ- Hybridisierung mit Fluoreszenzmarkierung ist.
5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, in welchem die Sonde an betreffende fötale DNA hybridisierbar ist, welche in einem aus den Chromosomen 13, 18, 21, X und Y ausgewählten Chromosom enthalten ist.
6. Verfahren nach jedem der Ansprüche 1 bis 5, in welchem der Behandlungsschritt (b) eine Anreicherung in zwei Schritten umfaßt.
7. Verfahren nach Anspruch 6, in welchem die Anreicherung in zwei Schritten aus der Abtrennung kernfreier Zellen von kernhaltigen Zellen im Blut der Mutter unter Gewinnung einer mit kernhaltigen Zellen angereicherten Probe besteht, sowie aus der Behandlung der mit kernhaltigen Zellen angereicherten Probe derart, daß der Anteil an fötalen Zellen in der Probe in Bezug auf den Anteil der Zellen der Mutter, die eine an fötalen kernhaltigen Erythrocyten angereicherte Probe bilden, erhöht ist.
8. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, in welchem die Probe der Mutter unter Einsatz einer Dichtegradientenzentrifugation mit fötalen, kernhaltigen Zellen angereichert wird.
9. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, in welchem die Probe zur Anreicherung mit fötalen kernhaltigen Erythrocyten unter Verwendung nur eines einzigen fötusspezifischen monoklonalen Antikörpers behandelt wird.
10. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, in welchem die Probe zur Anreicherung mit fötalen kernhaltigen Erythrocyten unter Verwendung von mindestens einem fötusspezifischen monoklonalen Antikörpers behandelt wird.
11. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, in welchem in Schritt (c) die Probe auf einen festen Träger, beispielsweise einen Objektträger aufgetragen wird.
12. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, in welchem die Probe mit dem Blut der Mutter behandelt wird, indem man sie mit einem ersten monoklonalen Antikörper in Kontakt bringt, der fötale kernhaltige Erythrocyten, jedoch keine vom Blut der Mutter stammenden Zellen erkennt und/oder mit einem zweiten monoklonalen Antikörper, der von dem Blut der Mutter stammende Zellen erkennt, jedoch keine fötalen kernhaltigen Erythrocyten, wobei die Behandlung unter für die Antikörperbindung geeigneten Bedingungen erfolgt, wobei Komplexe des ersten monoklonalen Antikörpers mit fötalen kernhaltigen Erythrocyten und/oder entsprechend Komplexe des zweiten monoklonalen Antikörpers mit Zellen der Mutter gebildet werden und wobei die Komplexe des ersten monoklonalen Antikörpers mit den fötalen kernhaltigen Erythrocyten von Zellen der Mutter abgetrennt und/oder Komplexe des zweiten monoklonalen Antikörpers mit Zellen der Mutter von fötalen kernhaltigen Erythrocyten abgetrennt werden, wodurch eine Trennung von fötalen kernhaltigen Erythrocyten von vom Blut der Mutter stammenden Zellen erfolgt.
13. Verfahren nach Anspruch 12, in welchem der erste und/oder zweite monoklonale Antikörper an einen festen Träger angeheftet wird.
14. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, in welchem die Probe der Mutter gewonnen wird, wenn das Schwangerschaftsalter des Fötus ca. 15 bis 17 Wochen beträgt.
15. Verfahren nach Anspruch 14, in welchem die Probe der Mutter gewonnen wird, wenn das Schwangerschaftsalter des Fötus ca. 16 Wochen beträgt.
16. Verfahren nach Anspruch 13, in welchem der feste Träger ein immunomagnetisches Kügelchen ist.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 4 oder 6 bis 16, in welchem die Sonde an in einem Y-Chromosom enthaltene betreffende fötale DNA hybridisierbar ist.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 4 oder 6 bis 16, in welchem die Sonde an betreffende fötale DNA hybridisierbar ist, die in Verbindung mit einer Krankheit steht.
19. Verfahren nach Anspruch 18, in welchem die Krankheit Mukoviszidose ist.
20. Verfahren nach Anspruch 18, in welchem die Krankheit eine Muskeldystrophie des Duchenne-Typs ist.
21. Verfahren nach Anspruch 18, in welchem die Krankheit eine Hämophilie A ist.
22. Verfahren nach Anspruch 18, in welchem die Krankheit die Gaucher-Krankheit ist.
23. Verfahren nach Anspruch 18, in welchem die Krankheit eine Sichelzellenanämie ist.
24. Verfahren nach Anspruch 18, in welchem die Krankheit eine β-Thalassämie ist.
25. Verfahren nach Anspruch 18, in welchem die Krankheit eine Phenylketonurie ist.
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