DE10143775A1

DE10143775A1 - Verfahren und Kit zur Diagnostik oder Behandlungskontrolle von Darmkrebs

Info

Publication number: DE10143775A1
Application number: DE10143775A
Authority: DE
Inventors: Monica Stefan; Alf-Andreas Krehan; Pia Steffens; Stefanie Waschuetza
Original assignee: Adnagen GmbH
Current assignee: Alere Diagnostics GmbH
Priority date: 2001-09-06
Filing date: 2001-09-06
Publication date: 2003-04-10
Also published as: US20060246430A1; ATE359377T1

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Diagnostik oder Behandlungskontrolle von Darmkrebs bei einem Menschen, wobei in einer Blutprobe des Menschen das Vorhandensein oder Fehlen von mRNS erfaßt wird und die für mindestens eines der Tumormarkerproteine CK20, EGF-R, CEA und/oder Stanniocalcin kodiert und daraus auf das Vorhandensein von Darmtumorzellen in der Blutprobe und damit auf mögliche Metastasierung geschlossen wird.

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren und ein Kit zur Diagnostik oder Behandlungskontrolle von Darmkrebs bei einem Menschen
Bei der Krebsnachsorge ist es von Relevanz, ein Rezidiv maligner Tumore anhand des Auftretens metastasierender Tumorzellen im Blut frühzeitig nachweisen zu können. Bei den derzeit angewandten Untersuchungsmethoden werden bei Krebspatienten sogenannte "Tumormarker" auf Proteinebene (immunologisch bzw. enzymatisch) quantitativ im Blut oder in anderen Körperflüssigkeiten ermittelt.
Diese Nachweisverfahren sind für die Tumordiagnostik bzw. Behandlungskontrolle/Nachsorge nur bedingt geeignet, da erhöhte Tumormarkerwerte auch durch nicht- Tumorerkrankungen (z. B. Entzündungen des Magen-Darm- Traktes, Leberzirrhose, Virusinfekte), starkes Rauchen oder durch eine Schwangerschaft hervorgerufen werden können.
Die Tumorprogression nach der Resektion eines kolorektalen Primärtumors ist in erster Linie auf residuale Tumorzellen zurückzuführen. Diese Zellen werden prä- oder intraoperativ aus dem primären Tumor abgelöst und erhalten die Möglichkeit zur Verstreuung im ganzen Organismus.
Neben der Ersterkennung eines kolorektalen Karzinoms ist daher insbesondere der frühest mögliche Nachweis metastasierender Zellen für eine erfolgreiche Behandlung von entscheidender Bedeutung. Ebenso kann im klinischen Stadium I ein definitiver Negativnachweis hilfreich sein, wenn zu entscheiden ist, ob der Patient mit einer Chemotherapie oder einer Operation belastet werden muß.
Die derzeit verwendeten diagnostischen Methoden sind ungenau, wenn es um die Beurteilung der malignen Potenz von Resttumoren nach durchgeführter Chemotherapie in den metastasierenden Stadien geht. Einige klinische Studien weisen auf eine prognostische Bedeutung von disseminierten Tumorzellen hin. Dennoch sind zahlreiche methodische Aspekte kritisch und bisher nicht hinreichend standardisiert. Somit müssen weiterhin Nachweise für eine okkulte oder restliche Metastasierung gefunden werden, die eine rechtzeitige Einordnung in die vielfältigen primär kurativen therapeutischen Optionen zulassen.
Dem Bestreben nach Verbesserung der Heilungschancen wird heute einerseits über Suche und Verwendung neuer Tumormarker, andererseits über Sensitivitätssteigerung bei den verwendeten Methoden nachgekommen.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren und ein Kit zur Verfügung zu stellen, mit dem auf einfache, sichere und wiederholbare Weise eine Diagnostik oder Behandlungskontrolle von Darmkrebs möglich ist.
Diese Aufgabe wird durch das Verfahren nach Patentanspruch 1 sowie das Kit nach Patentanspruch 26 und den Mikroarray nach Patentanspruch 43 gelöst. Vorteilhafte Weiterbildung des Verfahrens, des Kits und des Mikroarrays werden in den jeweiligen abhängigen Ansprüchen gegeben.
Erfindungsgemäß wird mittels des erfindungsgemäßen Kits bzw. des erfindungsgemäßen Verfahrens in einer Blutprobe eines Menschen das Vorhandensein oder Fehlen von mRNS der Tumormarkerproteine CK20, EGF-R, CEA und/oder Stanniocalcin erfaßt.
Da im Blut Gesunder die RNAs der beschriebenen Marker nicht exprimiert vorliegen, zeigt sich eine direkte Korrelation zwischen einem positiven RT-PCR-Nachweis dieser Tumormarker und zirkulierenden Tumorzellen im Blut, die zu einer Metastasierung führen können.
Da einzelne Marker in therapieabhängiger Weise unterschiedlich exprimiert werden, ist es vorteilhaft, eine Kombination von Tumormarkern zu untersuchen, um alle im Blut zirkulierende Tumorzellen zu erfassen. Hierdurch lassen sich Tumorzellen auch dann erkennnen, wenn die Expression eines bestimmten Markers bei einem Patienten bzw. in einem Krankheitsstadium relativ gering ist, was sonst zu einem vermeintlich negativen Ergebnis führen könnte. Die Verwendung weiterer Marker stößt jedoch meist deswegen auf Grenzen, weil mononukleäre Blutzellen eine Hintergrundexpression ("illegitime Transkription") aufweisen, die eine exakte Analyse behindern.
Für die Erkennung von Darmtumorzellen wird daher erfindungsgemäß die folgende Kombination aus Markern vorgeschlagen:

- CK20
- EGF-R
- CEA
- Stanniocalcin

Bei der Anwendung von RT-PCR-Systemen zum Nachweis von Tumorzellen ist aufgrund der sehr hohen Amplifikationsrate die Spezifität ein kritischer Punkt. Geringste Kontaminationen, etwa durch Fremd-RNA oder untypische Transkription, können hierbei das Ergebnis verfälschen.
Durch die Verwendung der Immunzytochemie mit monoklonalen Antikörpern gegen Tumorzellantigene kann eine Steigerung der Spezifität des Tumorzell-Nachweises erzielt werden (Nachweisquote von 1 Tumorzelle auf 10⁷ mononukleären Blutzellen). Die Tumorzellen werden dabei mittels spezifischer Antikörper bzw. einer Antikörpermischung von mononukleären Blutzellen getrennt. Die Trennung kann mittels Magnetpartikel (Dynal), an die die Antikörper gebunden werden, erfolgen. Dies wird im folgenden detaillierter beschrieben.
Eukaryontische Zellen tragen eine Vielzahl unterschiedlicher Moleküle an ihrer Zelloberfläche. Entsprechend des Ursprungs und der Funktion der einzelnen Zelle unterscheidet sich die Kombination der exprimierten Oberflächenmoleküle, so daß zelltyp- spezifische Muster entstehen. Zur Erkennung dieser zelltyp-spezifischen Muster werden Antikörper genutzt. Antikörper binden mit hoher Spezifität an ihr Antigen, hier an ausgewählte Oberflächenmoleküle. Diese Eigenschaft wird genutzt, um Zellen mittels spezifischer Antikörperbindung anhand ihrer Zelltyp- spezifischen Muster zu erkennen und voneinander zu unterscheiden.
Die Expression spezieller Oberflächenproteine unterscheidet Tumorzellen von nichttransformierten Zellen dieses Zelltyps. Da sich dieses spezielle Muster der Oberflächen-Antigene bei Tumorzellen auch von den Blutzell-typischen Mustern unterscheidet, können Tumorzellen im Blut unterschieden werden. Um Tumorzellen zu identifizieren, werden Antikörper, die diese speziellen Oberflächenproteine spezifisch erkennen, als Werkzeuge genutzt. Die spezifische Antikörperbindung wird für verschiedene Analyse- und Separations- Methoden nutzbar gemacht.
Aufgrund der intensiven Bindung von speziell dafür selektionierten Immunglobulinen ist neben der Erkennung von Zellen über deren Oberflächenepitope auch eine Separierung der erkannten Zellen von nicht erkannten möglich.

1. Trennprinzip beruhend auf Flüssigphase; z. B. Durchflußzytometrie:
Für die durchflußzytometrische Analyse werden Antikörper mit Fluoreszenzfarbstoffen gekoppelt. Vereinzelte Zellen werden in einem konstanten Flüssigkeitsstrom einzeln an einer Lichtquelle (Laser) vorbeigeleitet. Bei Beleuchtung der Zellen werden die an den Antikörpern gebundenen Fluoreszenzfarbstoffe angeregt und strahlen Licht bestimmter Wellenlängen ab. Das abgestrahlte Licht wird detektiert und das gemessene Signal digitalisiert gespeichert. Das Lichtsignal kann einzelnen Zellen zugeordnet werden. Die Antikörper-markierte Zelle wird so erkannt und kann nun von anderen Zellen getrennt werden. Zur Trennung werden die Zellen in kleinsten Tropfen vereinzelt. Nach Erkennung der antikörper-markierten Zelle wird der entsprechende Tropfen in ein Auffangbehältnis gelenkt.
2. Trennprinzip beruhend auf Festphase; z. B. magnetische Separation:
Für die magnetische Separation werden Antikörper mit pseudomagnetischen Partikeln gekoppelt. Nach Einbringen der pseudomagnetischen Partikel in ein Magnetfeld wandern die Partikel im magnetischen Feld. Bei der Bewegung in diesem magnetischen Feld werden Zellen, an die diese gekoppelten Antikörper gebunden sind, mitgerissen und von anderen Zellen getrennt.
Zur Tumorzellenerkennung mittels Magnetpartikel werden folglich an pseudomagnetische Partikel, die eine definierte Anzahl an chemisch aktivierten Stellen auf ihrer Oberfläche besitzen, Antikörper kovalent gekoppelt. Über die Spezifität der Antikörper wird die Spezifität der Trennung bestimmt. Eine Tumorzellen enthaltende Blutprobe wird mit Antikörper gekoppelte Magnetpartikel versetzt; dann werden Partikel und Blut relativ zueinander bewegt. Jene (Tumor-)Zellen, die von den festphase-gebundenen Antikörpern erkannt und damit fest gebunden werden, folgen der Bewegung der Partikel. Hierdurch ist es möglich, bei Anlegen eines magnetischen Feldes, die Partikel mit den daran gebundenen Zellen aus dem Blut herauszuziehen (z. B. an die Wand des Trenngefäßes). Das auf diese Weise Tumorzellen-depletierte Blut kann gegen andere Lösungen ausgetauscht werden, wobei die über Magnetpartikel separierten Zellen bis zum Abschalten/Entfernen des Magnetfeldes vor Ort verbleiben und für weitere Anwendungen zur Verfügung stehen.
Vorteilhafterweise können für die Erkennung der Tumorzellen spezifische Antikörper-Mischungen verwendet werden, die entweder allgemein auf Tumorzellen oder auch spezifisch für Darmtumorzellen- Erkennung optimiert sind. Beispielsweise eignet sich zur Erkennung von Tumorzellen im Blut eine Kombination der Antikörper MOC-31 und Ber-EP4.
Derartige Antikörpermischungen zeigen im Vergleich zu den jeweils separat eingesetzten Antikörpern bei der Zellerkennung und Zelltrennung unabhängig von der angewandten Methode eine erhöhte Sensitivität.

Im folgenden sollen einige Beispiele erfindungsgemäßer Nachweise für Darmtumorzellen in Blutproben beschrieben werden.
Es zeigen:
Fig. 1 einen Nachweis von PCR-Produkten mit Elektrophorese;
Fig. 2 einen weiteren Nachweis von PCR-Produkten mit Elektrophorese;
Fig. 3a bis 3d einem Tumormarkernachweis mittels Light Cycler; und
Fig. 4 den Nachweis einer Zelltrennung mittels Antikörper-markierter Magnetpartikel.
In einem ersten Beispiel erfolgte eine RNA- Aufarbeitung aus 1 ml EDTA-Vollblut mit dem QIAamp RNA Blood Mini Kit (Fa. Qiagen, Hilden). Kontaminationen mit genomischer DNA wurden durch einen zusätzlichen DNA-Verdau auf der Säule mittels RNase-free DNase Set, Fa. Quiagen, Hilden) vermieden.
Die RNA-Aufarbeitung aus 1 ml EDTA-Vollblut wurde fotometrisch über den Quotienten 260 : 280 nm verifiziert. Zur Qualitäts- und Quantitätsbestimmung kann dabei 1 µl des Ansatzes durch elektrophoretische Trennung auf einem RNA 6000 Chip über den Agilent Bioanalyzer 2100 analysiert werden.
Die isolierte RNA wurde in einem entsprechenden Volumen zusammen mit Oligo(dT)15-Primern (Fa. Promega, Mannheim) für 5 Minuten bei 65°C denaturiert und anschließend direkt auf Eis inkubiert. Die cDNA- Synthese erfolgte mittels des Sensiscript™ Reverse Transkriptase Kit, (Fa. Qiagen, Hilden) in einem 20 µl Reaktionsansatz gemäß Tabelle 1 bei 37°C für 1 Stunde mit nachfolgender Inaktivierung der reversen Transkriptase für 5 Minuten bei 95°C und anschließender Abkühlung auf Eis. Tabelle 1 Komponenten der cDNA-Synthese
Mit der so erzeugten cDNA wurde für jeden der gewählten Tumormarker Stanniocalcin, EGF-R, CK20, CEA sowie als interne Kontrolle für β-Aktin eine Multiplex- PCR durchgeführt. Der PCR-Ansatz ist in der folgenden Tabelle 2 dargestellt. Tabelle 2 PCR-Ansatz
Für jeden Tumormarker wurde dabei ein Primerpaar eingesetzt, das aus der nachfolgenden Tabelle 3 hervorgeht. Tabelle 3 Liste der PCR-Primer
Die für die Tumormarkereinzelnachweise eingesetzten Primerkombinationen und -mengen sind in der folgenden Tabelle 4 aufgeführt. Tabelle 4 Auflistung der Primermengen und Primerkombinationen
Die PCR wurde unter den in Tabelle 5 angegebenen PCR- Bedingungen und mit den in Tabelle 6 angegebenen Marker-spezifischen Schmelz-Temperaturen und Zyklenzahlen durchgeführt. Tabelle 5 PCR-Bedingungen

Tabelle 6 Marker-spezifische Annealingtemperatur und Zyklenzahl
1 µl des so erzeugten PCR-Produktes wurde in einem Agilent Bioanalyzer 2100 auf einem DNA-Chip (500) aufgetrennt und das Trennergebnis elektronisch dokumentiert. Die Ergebnisse zeigen die Fig. 1 und 2. In diesen Figuren zeigt jeweils Spur 1 eine 100 kb- Leiter sowie die Spuren 2-9 die Ergebnisse der entsprechenden Proben. Wie zu erkennen ist, zeigt Spur 5 ein PCR-Produkt für den Tumormarker CK20 und Spur 9 ein PCR-Produkt für den Tumormarker CEA, während sämtliche Proben mit biologischem Material (Spuren 4, 5, 8, 9) PCR-Produkte für die interne Kontrolle β-Aktin enthalten.
In Fig. 2 zeigen die Spuren 5 und 9 PCR-Produkte der Marker Stanniocalcin bzw. EGF-R, während wiederum die biologisches Material enthaltenden Proben gemäß Spuren 4, 5, 8, 9 PCR-Produkte von β-Aktin als internem Marker enthalten.
Die Spuren 2, 3, 6, 7 enthalten kein biologisches Material, so dass dort auch keine entsprechenden PCR- Produkte auftreten. Die sogenannte cDNA-Kontrolle ist ein Ansatz ganz ohne RNA, die sogenannte PCR- Kontrolle ist ein Ansatz ohne cDNA und die Negativ- Kontrolle ist ein Ansatz mit RNA einer gesunden Kontrollperson in Fig. 1 und in Fig. 2. CEA steht für Carcinoembryonic Antigen, CK20 für Cytokeratin 20, STC für Stanniocalcin und EGF-R für Epidermal Growth Factor Receptor in den Fig. 1 und 2.
Fig. 3 zeigt die alternative Analyse mittels Fluoreszens-basierender Echtzeit-PCR mittels interkallierender Fluoreszenzfarbstoffe.
Dieser Tumormarkernachweis kann alternativ zur Block- PCR auch mittels Light Cycler (Fa. Roche, Basel) erfolgen.
Die reverse Transkription der mRNA erfolgt wie oben beschrieben. Anschliessend wurde die PCR mit dem Light Cycler-DNA Master Sybr Green I Kit (Fa. Roche, Basel) nach Herstellerangaben unter den für jeden Tumormarker optimierten Bedingungen durchgeführt. Als Primer wurden dabei die in Tabelle 3 angegebenen Oligonukleotide verwendet. Tabelle 7 und Tabelle 8 zeigen den Ansatz für die PCR bzw. die PCR-Bedingungen im Light Cycler. Tabelle 7 PCR-Ansatz LightCycler

Tabelle 8 PCR-Bedingungen LightCycler
Das Ergebnis dieser PCR und Auswertung durch Light Cycler-Technologie ist in den Fig. 3A bis 3D dargestellt.
In sämtlichen Fig. 3A bis 3D ist die Kontrollkurve mit 2 bezeichnet, während die Kurve, die für die Probe aufgenommen wurde, mit 1 bezeichnet ist.
Bei dieser Analyse wird die Schmelzkurve der PCR- Produkte durch Sybr Green I Detektion analysiert. Die jeweilige Graphik der Fig. 3A bis 3D stellt dabei die gemessene Fluoreszenz in Abhängigkeit von der Temperatur dar. Die in den Kontrollansätzen auftretenden Fluoreszenzpeaks sind auf Primerdimere zurückzuführen.
Fig. 3A stellt dabei die Schmelzkurvenanalyse des Stanniocalcin-PCR-Produktes dar. Der Schmelzpunkt des Hauptproduktes liegt bei 88,7°C und der Schmelzpunkt des Nebenproduktes bei 84,6°C. Derartige Fluoreszenzpeaks sind bei der Kontrollprobe nicht zu erkennen.
Fig. 3B zeigt die Schmelzkurvenanalyse des EGFR-PCR- Produktes mit einem Schmelzpunkt bei 84,3°C.
Fig. 3C zeigt eine Schmelzkurvenanalyse des CK20-PCR- Produktes mit einem Schmelzpunkt bei 87, 6°C.
Fig. 3D zeigt die Schmelzkurvenanalyse des CEA-PCR- Produktes mit einem Schmelzpunkt bei 89,7°C.
Alternativ zu den hier dargestellten Methoden können selbstverständlich auch herkömmliche Analysemethoden wie Agarose-Gelelektrophorese angewandt werden, bei denen beispielsweise 25 µl des oben dargestellten PCR-Produktes über ein 2,5%iges Agarosegel aufgetrennt werden und die DNS-Banden anschließend mit Ethidiumbromid angefärbt und sichtbar gemacht werden. Die Dokumentation kann beispielsweise mit Hilfe des DUO Store Systems der Fa. Intas durchgeführt werden.
Auch eine Fragmentanalyse mittels ABI Prism 310 Genetic Analyser (Fa. PE Applied Biosystems, Weiterstadt) kann zur Auswertung verwendet werden. Hierzu wird eine PCR mit fluoreszenzmarkierten Primern durchgeführt und anschließend beispielsweise jeweils 1 µl des jeweiligen PCR-Produktes in einer Verdünnung von 1 : 50 eingesetzt.
Als weiterer Nachweis ist ein Nachweis mittels sequenzspezifischer fluoreszenzmarkierter Hybridisierungsproben möglich, die nach jedem Zyklus der PCR die Produktentwicklung verfolgen lassen. Anhand spezieller Standards kann dann auch ein Rückschluß auf die Menge an Ausgangs-RNS gezogen werden.
Zentral für die Qualität der als Nachweisbasis isolierten RNS und der daraus synthesisierten cDNS ist die Anreicherung der hierfür verwendeten Zellfraktion aus der verwendeten Blutprobe. Hierfür stehen drei verschiedene Methoden zur Verfügung:

a) Anreicherung durch wiederholte Zentrifugation nach Erythrozytenlyse:
1 ml EDTA-Blut werden nach Zugabe von 5 Volumina Erythrozyten-Lysepuffer ("QIAmp Blood Kit", Qiagen; Hilden) für 20 Minuten auf Eis lysiert. Nach Abnehmen des Plasmas/Lysates von den pelletierten Zellen und Resuspension erfolgt eine erneute Zentrifugation bei 3000 × g für 20 Minuten. Nach Abnehmen des Überstandes steht die pelletierte Leukozytenfraktion für die RNA-Präparation zur Verfügung.
b) Anreicherung durch Dichtegradienten- Zentrifugation:
Mittels eines über Zentrifugation erzeugten Dichtegradienten lassen sich Zellen unterschiedlicher mittlerer Volumendichte voneinander trennen. Mononukleare Blutzellen werden mittels eines Ficoll- Hypaque-Gradienten (Pharmacia, Uppsala, Schweden) separiert und anschließend zweifach mit PBS/1% FCS gewaschen.
c) Anreicherung von Tumorzellen durch FACS- Durchflußzytometrie:
Die mononukleären Zellen aus der unter b) angereicherten Fraktion werden mit fluoreszenzmarkierten mononuklearen Antikörpern gegen tumorspezifische Oberflächenproteine inkubiert. Die markierten Zellen werden zweifach mit PBS gewaschen und im Anschluß werden 10⁷ Zellen in 1 ml PBS resuspendiert. Für die Isolierung der Tumorzellen wird ein FACS Vantage SE-Durchflußzytometer (Becton Dickinson) verwendet. Über das CellQuest Programm erfolgen Datenaufnahme, Instrumentenkontrolle und Datenauswertung. Die sortierten Zellen werden in ein 1,5 ml-Reaktionsgefäß (gefüllt mit 1 ml PBS) überführt. Die RNS kann dann wie oben beschrieben isoliert werden.
Alternativ kann auch die isolierte Fraktion der mononukleären Blutkörperchen, die nach einem der obigen Verfahren isoliert wurden, in Trizol- Reagenz (Gibco BRL, NY, USA) lysiert und mittels Pipette homogenisiert werden. Nach Chloroformextraktion wird die RNA-haltige wäßrige Phase in Isopropanol bei -80°C gefällt. Nach zweimaligem Waschen in 80%igem Ethanol wird das Pellet an der Luft getrocknet und anschließend in Rnase-freiem Wasser resuspendiert.
An diese Isolation der RNS schließt sich dann die reverse Transkription sowie der mRNA-Nachweis wie oben beschrieben an.

Fig. 4 zeigt die Ergebnisse eines derartigen Isolationsverfahrens. In diesem Beispiel werden metastasierende Tumorzellen in peripherem Blut von Krebs- Patienten isoliert und mittels RT-PCR nachgewiesen.
Die Expression spezieller Oberflächenproteine unterscheidet Tumorzellen von nichttransformierten Zellen dieses Zelltyps. Da sich dieses spezielle Muster der Oberflächen-Antigene bei Tumorzellen auch von den Blutzell-typischen Mustern unterscheidet, können Tumorzellen im Blut unterschieden werden. Um Tumorzellen zu identifizieren, werden Antikörper, die diese speziellen Oberflächenproteine spezifisch erkennen, als Werkzeuge genutzt. Die spezifische Antikörperbindung wird für das erfindungsgemäße Verfahren nutzbar gemacht. An pseudomagnetische Partikel, die eine definierte Anzahl an chemisch aktivierten Stellen auf ihrer Oberfläche besitzen, werden Antikörper kovalent gekoppelt. Über die Spezifität der Antikörper wird die Spezifität der Trennung bestimmt. Eine Tumorzellen enthaltende Blutprobe wird mit Antikörper gekoppelte Magnetpartikel versetzt; als Antikörper werden in verschiedenen Beispielen zwei verschiedene Mischungen von Antikörpern wie in den Tabellen 1 und 2 beschrieben verwendet; dann werden Partikel und Blut relativ zueinander bewegt, beispielsweise durch "Über-Kopf-Rotierer" in einem geschlossenen Behälter befindlicher Proben oder durch Bewegung der Partikel aufgrund von wechselnden Magnetfeldern. Jene (Tumor-)Zellen, die von den Festphase-gebundenen Antikörpern erkannt und damit fest gebunden werden, folgen der Bewegung der Partikel. Hierdurch ist es möglich, bei Anlegen eines magnetischen Feldes, die Partikel mit den daran gebundenen Zellen aus dem Blut herauszuziehen(z. B. an die Wand des Trenngefäßes). Das auf diese Weise Tumorzellen-depletierte Blut kann gegen andere Lösungen ausgetauscht werden, wobei die über Magnetpartikel separierten Zellen bis zum Abschalten/Entfernen des Magnetfeldes vor Ort verbleiben und für weitere Anwendungen zur Verfügung stehen. Tabelle 9 Antikörper-Mischung 1
Mittels der Antikörpermischung in Tabelle 9 werden ganz allgemein Tumorzellen jedoch mit hoher Spezifität erfaßt. Dies beruht auf der selektiven Expression bestimmter Oberflächenproteine, die Krebszellen von anderen Zellen unterscheidet.
Durch den Einsatz der Antikörpermischung wird ganz grundsätzlich im Vergleich zu separat eingesetzten Antikörpern bei der Zelltrennung unabhängig von der angewendeten Methode eine erhöhte Sensivität nachgewiesen. Dies zeigt sich in Fig. 4, bei der im Teilbild A mit dem Antikörper BER-EP4 belegte magnetische Partikel, in dem Teilbild B mit dem Antikörper MOC-31 belegte magnetische Partikel und in dem Teilbild C ein Mix aus Partikeln die jeweils separat mit einem Antikörper belegt wird, eingesetzt wurden.
Für jeden der Antikörper bzw. der Antikörpermischungen wurden insgesamt vier Messungen durchgeführt, bei denen 0, 10, 100 bzw. 1000 Karzinom-Zellen in 10 ml Blut inokuliert wurden. Die Spuren 1a bis 4a, 1b bis 4b bzw. 1c bis 4c zeigen dann den Nachweis von RNA nach RNA-Präparation und RT-PCR mit Tumormarkerspezifischen Primern wie oben beschrieben für Proben von jeweils 1 µl Volumen. Die Fig. 4 wurde dabei mittels elektrophoretischer Trennung in einem Agilent™ Bioanalyser 2100 gemäß Herstellerangaben ermittelt.
Bei Verwendung von lediglich mit einem Antikörper markierten magnetischen Partikeln wie in den Fig. 4A und 4B wurde lediglich bei einem Gehalt von 1000 Zellen ein Nachweis positiv möglich. Bei Verwendung einer Antikörpermischung wie in Fig. 4C wurde bereits ein Nachweis bei nur 100 Zellen und damit um den Faktor 10 sensitiver erbracht.
Bei diesem Beispiel wurden experimentelle Ergebnisse gezeigt, die nicht die maximal mögliche Sensitivität darstellen, sondern beispielhaft die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erreichbare Sensitivitätserhöhung demonstrieren sollen.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung und das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht es weiterhin, die sortierten und separierten Zellen anschließend beliebig weiter zu verwenden. Beispielsweise können diese in ein geeignetes Zellkulturmedium eingesetzt und in situ kultiviert werden.
Da die Zellen nach der Trennung intakt sind, bleiben auch die Eigenschaften der Zellmembran und des Zellkerns erhalten. Dies eröffnet die Möglichkeit, mikroskopisch die Expression weiterer Oberflächenmarker untersuchen oder auch Chromosomen-Analysen durchzuführen. Die sortierten Zellen werden dazu auf Objektträger aufgebracht. Der Nachweis weiterer Oberflächenmarker kann cytochemisch oder über Fluoreszenzmikroskopie erfolgen. Ebenso können genetische Analysen durchgeführt werden, wie beispielsweise Chromosomenanalysen mittels FISH (Flurorescence in situ hybridisation) oder Karyogramm-Erstellung.

Claims

1. Verfahren zur Diagnostik oder Behandlungskontrolle von Darmkrebs bei einem Menschen, dadurch gekennzeichnet, daß in einer Blutprobe des Menschen das Vorhandensein oder Fehlen von mRNS erfaßt wird, die für mindestens eines der Tumormarkerproteine CK20, EGF-R, CEA und/oder Stanniocalcin kodiert und daraus auf das Vorhandensein von Darmtumorzellen in der Blutprobe und damit auf mögliche Metastasierung geschlossen wird.

2. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß aus der Blutprobe Tumorzellen abgetrennt bzw. angereichert werden und der Nachweis an diesen Tumorzellen erfolgt.

3. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß die Darmtumorzellen mittels für Tumorzellen allgemein spezifischer Antikörper und/oder mittels für Darmtumorzellen spezifischer Antikörper oder Mischungen derartiger Antikörper abgetrennt bzw. angereichert werden.

4. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß als Antikörper MOC-31 und/oder Ber-EP4 verwendet werden.

5. Verfahren nach einem der beiden vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Darmtumorzellen mittels an Magnetpartikel gebundener Antikörper abgetrennt bzw. angereichert werden.

6. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Darmtumorzellen mittels fluoreszenzassoziierter Durchflußzytometrie, Dichtegradientenzentrifugation und/oder Zentrifugation nach Erythrozytenlyse abgetrennt bzw. angereichert werden.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß eine Zentrifugation der Blutprobe zur Pelletierung der in ihr enthaltenen Leukozyten durchgeführt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die RNS-haltigen Bestandteile der Probe mittels Lyse der darin enthaltener Erythrozyten und anschließender Pelletierung der nichtlysierten Leukozyten aufkonzentriert werden.

9. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die RNS-haltigen Bestandteile durch mindestens eine Dichtegradienten-Zentrifugation der Blutprobe zur Abseparierung und Gewinnung der in ihr enthaltenen mononuklearen Blutzellen aufkonzentriert werden.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die gewonnenen mononuklären Blutzellen mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern markiert und mittels fluoreszenzassoziierter Zellsortierung (FACS) von der Probe abgetrennt und gewonnen werden.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die mononuklearen Zellen der gewonnenen Fraktion lysiert und die mRNS abgetrennt wird.

12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die mRNS in herkömmlicher Weise unmittelbar aus der Vollblutprobe isoliert wird.

13. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß anschließend an die Isolation der mRNS ein DNS-Verdau durchgeführt wird.

14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die gewonnene mRNS in cDNS revers transkribiert wird und anschließend das Vorhandensein oder Fehlen der cDNS erfaßt wird, die dem Tumormarkerprotein zugeordnet ist.

15. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß zumindest ein vorbestimmter Abschnitte der cDNS durch Polymerase- Kettenreaktion ("PCR") vervielfältigt wird.

16. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß zur Vervielfältigung der cDNS eines oder mehrere Oligonukleotid-Paare verwendet werden, die die folgenden Sequenzen aufweisen:
AACCCATGAGGCGGAGCAGAATGA und CGTTGGCGATGCATTTTAAGCTCT
und/oder
AGTCGGGCTCTGGAGGAAAAGAAA und GATCATAATTCCTCTGCACATAGG
und/oder
ATCTCCAAGGCCTGAATAAGGTCT und
CCTCAGTTCCTTTTAATTCTTCAGT
und/oder
AGAAATGACGCAAGAGCCTATGTA und
AACTTGTGTGTGTTGCTGCGGTAT.

17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als interne Kontrolle die mRNS des Proteins β-Aktin bestimmt wird.

18. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß die mRNS für β-Aktin in cDNS revers transkribiert und ein Abschnitt der cDNS mittels Polymerasekettenreaktion vervielfältigt wird.

19. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß zur Vervielfältigung der cDNS des β-Aktin ein Oligonukleotid-Paar verwendet wird, wobei die Oligonukleotide des Paares die folgenden Sequenzen aufweisen:
CTCTTCCAGCCTTCCTTCCT und AGCACTGTGTTGGCGTACAG.

20. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß der vervielfältigte cDNS-Abschnitt durch geeignete Restriktionsenzyme verdaut und anhand der erzeugten cDNS-Bruchstücke das Vorhandensein oder Fehlen der mRNS eines Tumormarkerproteins bestimmt wird.

21. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß zum Nachweis der amplifizierten cDNS-Abschnitte eine Gelelektrophorese der PCR-Produkte durchgeführt wird.

22. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß zum Nachweis der amplifizierten cDNS-Abschnitte eine Fragmentanalyse durchgeführt wird.

23. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß während des Verlaufs der Polymerasekettenreaktion die von den Produkten erzeugte Fluoreszenz erfaßt und die Produktentwicklung erfaßt wird (fluoreszenzbasierte Echtzeit-PCR).

24. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß zum Nachweis der mRNS oder cDNS ein Nukleotid-Mikroarray nach einem der Ansprüche 21 oder 22 verwendet wird.

25. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß zum Nachweis der amplifizierten cDNS das PCR-Produkt auf ein Nukleotid- Mikroarray nach einem der Ansprüche 43 oder 44 aufgetragen wird.

26. Diagnose-Kit zur Diagnostik oder Behandlungskontrolle von Darmkrebs mit mindestens einem Paar Oligonukleotide (Reverseprimer, Forwardprimer), wobei die beiden Oligonukleotide des Paares als Primer zur Amplifikation mittels Polymerasekettenreaktion jeweils eines der beiden komplementären Stränge eines gesuchten DNS-Abschnittes geeignet sind, und wobei der gesuchte DNS-Abschnitt Teil der cDNS zu einem der CK20, EGF-R, CEA und/oder Stanniocalcin ist.

27. Diagnose-Kit nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens vier Paare Oligonukleotide (Reverseprimer, Forwardprimer) enthält, wobei die beiden Oligonukleotide der jeweiligen Paare als Primer zur Amplifikation mittels Polymerasekettenreaktion jeweils eines der beiden komplementären Stränge verschiedener gesuchter DNS-Abschnitte geeignet sind, und wobei die gesuchten DNS-Abschnitt jeweils Teil der c-DNS zu verschiedenen Tumormarkerproteinen ausgewählt aus den Tumormarkerproteinen CK20, EGF-R, CEA und Stanniocalcin sind.

28. Diagnose-Kit nach einem der beiden vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es ein weiteres Paar Oligonukleotide enthält, die jeweils als Primer zur Amplifikation zumindest eines Abschnitts eines der beiden komplementären Stränge der cDNS zu dem Protein β-Aktin als interne Kontrolle geeignet sind.

29. Diagnose-Kit nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß die beiden Oligonukleotide eines Paares paarweise die folgenden Sequenzen aufweisen:
AACCCATGAGGCGGAGCAGAATGA und CGTTGGCGATGCATTTTAAGCTCT
und/oder
AGTCGGGCTCTGGAGGAAAAGAAA und GATCATAATTCCTCTGCACATAGG
und/oder
ATCTCCAAGGCCTGAATAAGGTCT und
CCTCAGTTCCTTTTAATTCTTCAGT
und/oder
AGAAATGACGCAAGAGCCTATGTA und
AACTTGTGTGTGTTGCTGCGGTAT.

30. Diagnose-Kit nach einem der beiden vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zumindest jeweils eines der beiden Oligonukleotide eines Paares von Oligonukleotiden mit Fluorophoren markiert ist.

31. Diagnose-Kit nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß die Oligonukleotide verschiedener Paare mit verschiedenen Fluorophoren markiert sind.

32. Diagnose-Kit nach einem der Ansprüche 26 bis 31, dadurch gekennzeichnet, daß es zur Amplifikation der cDNS zu β-Aktin ein Paar Oligonukleotide mit den folgenden Sequenzen enthält:
CTCTTCCAGCCTTCCTTCCT und AGCACTGTGTTGGCGTACAG.

33. Diagnose-Kit nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß zumindest jeweils eines der beiden Oligonukleotide des Paares zur Amplifikation der cDNS zu β-Aktin mit Fluorophoren markiert ist.

34. Diagnose-Kit nach einem der Ansprüche 26 bis 33, dadurch gekennzeichnet, daß es die zur Durchführung einer Polymerasekettenreaktion erforderlichen Substanzen enthält.

35. Diagnose-Kit nach einem der Ansprüche 26 bis 34, dadurch gekennzeichnet, daß es als zur Durchführung einer Polymerasekettenreaktion erforderliche Substanzen eine Pufferlösung, Magnesiumchlorid, Desoxynukleotid-Triphosphate sowie eine hitzestabile Polymerase enthält.

36. Diagnose-Kit nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß es als hitzestabile Polymerase eine Polymerase aus Thermus aquaticus (Taq-Polymerase) enthält.

37. Diagnose-Kit nach einem der Ansprüche 26 bis 36, dadurch gekennzeichnet, daß es als Positivkontrolle eine DNS-Probe mit dem jeweils gesuchten DNS-Abschnitt enthält.

38. Diagnose-Kit nach einem der Ansprüche 26 bis 37, dadurch gekennzeichnet, daß es
eine Anleitung zur Durchführung der Polymerasekettenreaktion und/oder
eine Anleitung zur Durchführung einer Fragmentanalyse enthält.

39. Diagnose-Kit nach einem der Ansprüche 26 bis 38, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Schema zur Auswertung der erhaltenen Meßergebnisse enthält.

40. Diagnose-Kit nach einem der Ansprüche 26 bis 39, dadurch gekennzeichnet, daß es einen Mikroarray (DNS-Chip) enthält, wobei der Array eine Anzahl voneinander getrennter Zellen (Felder) aufweist und in mindestens einer Zelle des Mikroarrays ein Oligonukleotid angeordnet ist, das mit dem gesuchten DNS-Abschnitt hybridisiert.

41. Diagnosekit nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß in mindestens einer weiteren Zelle des Mikroarrays ein weiteres Oligonukleotid angeordnet ist und die Sequenz des Oligonukleotids, das in der mindestens einen Zelle angeordnet ist, sich von der Sequenz des weiteren Oligonukleotides unterscheidet.

42. Diagnose-Kit nach einem der beiden vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß in mindestens zwei Zellen jeweils ein Oligonukleotid angeordnet ist, wobei die in verschiedenen Zellen angeordneten Oligonukleotide jeweils mit verschiedenen gesuchten DNS-Abschnitten hybridisieren.

43. Mikroarray zur Diagnostik oder Behandlungskontrolle von Darmkrebs, beispielsweise DNS-Chip, mit einer Anordnung von mehreren, voneinander getrennten Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß in mindestens einer Zelle ein Oligonukleotid angeordnet ist, das mit einem DNS-Abschnitt hybridisiert, der Teil der cDNS zu einem der Tumormarkerproteine CK20, EGF-R, CEA oder Stanniocalcin ist.

44. Mikroarray nach Anspruch 43, dadurch gekennzeichnet, daß in zwei bis vier Zellen jeweils verschiedene Oligonukleotide angeordnet sind, die mit jeweils zwei bis vier verschiedenen DNS- Abschnitten, die Teil der cDNS von jeweils verschiedenen Tumormarkerproteinen ausgewählt aus den Tumormarkerproteinen Tumormarkerproteine CK20, EGF-R, CEA oder Stanniocalcin sind, hybridisieren.

45. Verwendung eines Diagnose-Kits, eines Mikroarrays und/oder eines Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Diagnose von Erkrankungen oder Metastasierung oder zur Behandlungskontrolle bei Darmkrebs.