DE10030827A1

DE10030827A1 - Verfahren zum Nachweis von Cathepsinen, Asparaginylendopeptidase und deren Isozyme, sowie von Leukocystatin

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Publication number: DE10030827A1
Application number: DE10030827A
Authority: DE
Inventors: Arthur Melms; Wolfgang Wienhold; Eva Tolosa
Original assignee: Eberhard Karls Universitaet Tuebingen; Universitaetsklinikum Tuebingen
Current assignee: Eberhard Karls Universitaet Tuebingen; Universitaetsklinikum Tuebingen
Priority date: 2000-06-23
Filing date: 2000-06-23
Publication date: 2002-01-10
Also published as: WO2001098475A3; WO2001098475A2

Abstract

Es wird ein Verfahren zum selektiven Nachweis von Nukleinsäuremolekülen in biologischem Material beschrieben, die spezifisch für Cathepsine, Asparaginylendopeptidase und deren Isozyme sowie für Leukocystatin sind, sowie die in dem Verfahren verwendeten Nukleinsäuremoleküle und deren Verwendung.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum selektiven Nachweis von Nukleinsäuremolekülen in biologischem Material, die spezifisch für Cathepsine, Asparaginylendopeptidase und de ren Isozyme sowie für Leukocystatin sind, sowie in dem Verfah ren verwendete Nukleotidsequenzen und deren Verwendung.

Verfahren der oben erwähnten Art für den Nachweis von Cathepsi nen sind aus verschiedenen Veröffentlichungen bekannt.

Cathepsine bilden eine Gruppe von lysosomalen Enzymen, die zu den Cystein- oder Aspartat-Proteinasen gehören. Sie kommen in tierischen und menschlichen Zellen vor.

Viele Proteinasen, einschließlich der Cathepsine, werden in verschiedenen Tumorgeweben und Zellen wesentlich stärker expri miert als in gesunden Geweben und Zellen. Dieser Expressions anstieg ist die Folge einer verstärkten Transkription, also mRNA-Neusynthese der entsprechenden Gene. So konnte z. B. eine verstärkte Expression von Cathepsin B, D und L durch Duffy, M. J., "Cancer metastasis: biological and clinical aspects", Ir J Med Sci 167: 4-8, 1998", durch Lah, T.T. and Kos, J., "Cysteine proteinases in cancer progression and their clinical relevance for prognosis", Biol Chem 379: 125-30, 1998, sowie von Cathepsin H durch Kos, J. et al., "Cathepsin B, H, L, and their inhibitors stefin A and cystatin C in sera of melanoma patients", Clin Cancer Res. 3: 1815-22, 1997, in transformier tem Gewebe nachgewiesen werden. Ebenso scheint die Expressions rate endogener Proteinaseinhibitoren in Tumorgewebe eine Rolle zu spielen, siehe Kos, J. and Lah, T.T., a.a.O. Aus diesem Grund wird angenommen, daß auch der Inhibitor Leukocystatin, der in hämatopoetischen Zellen eine Rolle spielt, verstärkt in Tumoren exprimiert wird.

Die Beobachtung, daß eine Tumorzelle über die verstärkte Ex pression von Cathepsinen identifiziert werden kann, führte be reits vor einigen Jahren zur Entwicklung von Nachweisverfahren für diese Proteine bzw. für deren kodierende Nukleinsäuremole küle, auch im Hinblick auf den möglichen Einsatz in der Progno se, Diagnose oder Therapie von Krebserkrankungen; Überblick in Kos, J. and Lah, T.T., "Cysteine proteinases and their endoge nous inhibitors: target proteins for prognosis, diagnosis and therapy in cancer", Oncol Rep 5: 1349-61, 1998.

Chauhan et al., "Expression of cathepsin L in human tumors", Cancer Res 51 : 1478-81, 1991, konnten über Northern-Blot- Analyse Cathepsin L in verschiedenen menschlichen Tumoren nach weisen. Saad et al., "Expression of genes that contribute to proliferative and metastatic ability in breast cancer resected during various menstrual phases", Lancet 351, 1170-1173, 1998, konnten ebenfalls über Northern-Blot-Analysen Cathepsin L und D in menschlichen Brusttumorzellen nachweisen. In keiner der bei den Schriften wurden die Sequenzen der Hybridisierungssonden offenbart.

Im Stand der Technik sind ebenfalls Nachweisverfahren bekannt, in denen Antikörper gegen Cathepsine verwendet werden. So be schreibt z. B. Herszènyi et al., "The role of cysteine and seri ne proteases in colorectal carcinoma", Cancer 86: 1135-42, 1999, den Nachweis von Cathepsin B und L in humanen colorekta len Karzinomen mittels enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Foekens et al., "Prognostic significance of cathepsins B and L in primary human breast cancer", J Clin Oncol 16: 1013- 21, 1998, zeigen Daten über den Nachweis von Cathepsin B und L in humanen Brusttumorzellen mittels ELISA.

In der EP 0 582 477 A1 wird ein Diagnoseverfahren zum Nachweis von Krebs und eine pharmazeutische Zusammensetzung beschrieben. Gegenstand der Anmeldung ist sowohl ein Anti-Cathepsin E-Anti körper als auch eine Hybridisierungssonde (DNA oder RNA), die mit der Cathepsin E-mRNA hybridisiert. In dieser Anmeldung ist keine Angabe einer Sequenz enthalten, die als Hybridisierungs sonde verwendet werden kann.

Die insoweit beschriebenen, bekannten Verfahren weisen ver schiedene Nachteile auf: Aufgrund ihrer niedrigen Sensitivität werden für die Northern-Blot-Analysen große Mengen an RNA benö tigt. Das bedeutet, daß für diese Analysen ein größerer invasi ver Eingriff in den Patienten erforderlich ist, um genügend Ausgangsmaterial für einen zuverlässigen Nachweis zu erhalten. Die damit verbundenen Belastungen für den erkrankten Patienten sind offensichtlich.

ELISA-Techniken oder Immunfärbungen für den Nachweis von Cathepsinen sind durch ihre niedrige Selektivität gekennzeich net. Die verwendeten Anti-Cathepsin-Antikörper sind häufig kreuzreaktiv. Beispielsweise haben Cathepsin L und V eine 85%-ige Sequenzhomologie, was zur Folge hat, daß sämtliche vor handenen Antikörper gegen diese Cathepsine miteinander kreuzreagieren, was z. B. von Santamaria et al., "Cathepsin L2 and novel human cystein proteinase produced by breast and colo rectal carcinomas", Cancer Res 58: 1624-30, 1998, beschrieben wurde. Des weiteren ist die Reproduzierbarkeit der so gewonne nen Ergebnisse durch die bisher verwendeten Verfahren stark vom Experimentator abhängig.

Asparaginylendopeptidase (AEP) ist eine erst vor kurzem gefun dene und von Chen et al., "Cloning, isolation and characteriza tion of mammalian legumain, an asparaginyl endopeptidase", J Biol Chem 272: 8090-8, 1997, beschriebene Asparagin- spezifische Cystein-Endopeptidase. Sie spielt im Rahmen der Immunantwort eine wichtige Rolle bei der Antigenprozessierung. Außerdem wird angenommen, daß AEP in Tumoren verstärkt expri miert wird.

Des weiteren konnte unter Verwendung spezifischer Inhibitoren und aufgereinigter Enzyme eine Beteiligung von Cathepsin B, L, S, D und E bei der Antigenprozessierung in verschiedenen Anti gen-präsentierenden Zellen (APC) nachgewiesen werden. Dies wird z. B. durch Bennett et al., "Antigen processing for presentation by class II major histocompatibility complex requires cleavage by cathepsin E", Eur J Immunol 22: 1519-24, 1992, Blum and Cresswell, "Role for intracellular proteases in the processing and the transport of class II HLA antigens", Proc Natl Acad Sci USA 85: 3975-9, 1988, und durch Hewitt et al., "Natural pro cessing sides for human cathepsin E and cathepsin D in tetanus toxin: Implications for T cells epitope generation", J Immunol 195: 4693-9, 1997 beschrieben. Es wird außerdem vermutet, daß Cathepsin V an der Entstehung bestimmter Selbst-MHC/Selbst- Peptid-Komplexe beteiligt ist, die für die Selektion von Thymo zyten, einer im Thymus vorkommenden, von pluripotenten Stamm zellen des Knochenmarks abstammenden lymphoiden Zellinie, not wendig sind. Wie von Chen et al., a.a.O. beschrieben, spielt außerdem die Asparaginylendopeptidase in APCs eine wichtige Rolle.

Trotz dieser Erkenntnisse ist der proteolytische Mechanismus bei der Antigenpräsentation, hauptsächlich der der MHC Klasse II, noch weitgehend ungeklärt. Um das Netzwerk der Antigen prozessierung und die unterschiedliche Präsentationseffizienz in verschiedenen APC besser verstehen zu können, muß die Ex pression der verschiedenen, daran beteiligten Moleküle durch ein geeignetes und effizientes Nachweisverfahren analysiert werden.

Vor diesem Hintergrund ist es Aufgabe der vorliegenden Erfin dung, ein Verfahren der eingangs genannten Art zu schaffen, das einen zuverlässigen und einfach, sowie reproduzierbar durchzu führenden Nachweis ermöglicht.

Bei dem eingangs genannten Verfahren wird diese Aufgabe erfin dungsgemäß dadurch gelöst, daß der Nachweis unter Verwendung von zumindest einer der Nukleotidsequenzen SEQ ID Nr. 1 bis 18 aus dem beiliegenden Sequenzprotokoll oder von Sequenzen, die an Sequenzen binden (hybridisieren), an die eine der Sequenzen SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 18 bindet, erfolgt.

Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe wird auf diese Wei se vollkommen gelöst. Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben nämlich erkannt, daß durch den Einsatz der hier erstmals beschriebenen Nukleinsäuremoleküle mit den Nukleotidsequenzen SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 18 aufgrund ihrer sehr hohen Spezi fität und Sensitivität der Nachweis verschiedener Cathepsine, bzw. Leukocystatin und Asparaginylendopeptidase in biologischem Material gelingt. Sämtliche vorstehenden Nukleinsäuremoleküle binden nämlich an hochkonservierte Bereiche der zugrunde lie genden Kodierungssequenzen der jeweiligen Proteine, d. h. bei spielsweise an Bereiche der mRNA-Transkripte, die für diese Proteine kodieren. Diese Bereiche werden im Rahmen dieser An meldung als für die jeweiligen Proteine spezifischen Nuklein säuremoleküle bezeichnet. Aufgrund dieser Eigenschaften eignen sich die neuen Nukleinsäuremoleküle z. B. besonders als Hybridi sierungssonden oder als Primer im Rahmen einer DNA-Amplifizie rungsmethode zum Nachweis der in Tumorgeweben oder APC ver stärkt exprimierten, oben erwähnten, spezifischen Nukleinsäure moleküle. Sie sind damit sowohl zur Diagnostik eines Krank heitsverlaufs bzw. zur Früherkennung einer bestimmten Krank heitsveranlagung als auch zur Bewertung eines Therapieerfolgs einsetzbar.

Vor diesem Hintergrund betrifft die Erfindung ferner ein Nu kleinsäuremolekül mit einer Nukleotidsequenz, die aus einer der Sequenzen SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 18 aus dem beiliegenden Sequenzprotokoll besteht bzw. einer Nukleotidsequenz, die an Sequenzen bindet (hybridisiert), an die eine der Nukleotid sequenzen SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 18 bindet (hybridisiert), sowie die Verwendung der vorstehenden Nukleinsäuremoleküle in einem Nachweisverfahren, vorzugsweise einer Polymerase-Ketten reaktion (PCR), einer Real-Time-PCR oder Northern-Blot-Analyse.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind insbesondere solche der vorstehend genannten Nukleinsäuremoleküle bzw. deren Ver wendung oder Einsatz in einem der angegebenen Verfahren, die hochaffin an ihre Zielmoleküle, d. h. an cathepsin-, aspara ginyl- bzw. deren isozymspezifischen und leukocystatinspezifi schen Nukleinsäuremoleküle hybridisieren. Sie hybridisieren mit ihren Zielmolekülen selbst unter stringenten Bedingungen, d. h. auch bei hohen Salzkonzentrationen oder hohen Reaktionstempera turen.

Gegenstand der Erfindung ist nicht nur ein Nukleinsäuremolekül mit einer Nukleotidsequenz aus dem beiliegenden Sequenzproto koll bzw. dessen Verwendung oder Einsatz in einem der angegebe nen Verfahren, sondern auch ein Nukleinsäuremolekül, das an Se quenzen hybridisiert, an die eine der Nukleotidsequenzen SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 18 hybridisiert. Solch ein Nukleinsäuremo lekül kann sich von einem Nukleinsäuremolekül mit einer der Se quenzen SEQ ID Nr. 1 bis 18 in einzelnen Basen bzw. Sequenzab schnitten unterscheiden. Da die Nukleinsäuremoleküle mit einer der Sequenzen SEQ ID Nr. 1 bis 18 durch Verkürzung, Verlänge rung, Substitution, Insertion und/oder Deletion verändert wer den können, ohne dabei ihre erfindungsgemäße Funktion zu ver lieren bzw. ohne ihre Affinität zu ihrem Zielmolekül zu verlie ren, liegen solch modifizierte Nukleinsäuremoleküle bzw. deren Verwendung oder Einsatz in einem der angegebenen Verfahren ebenfalls im Rahmen der Erfindung.

Das beschriebene Verfahren sowie die Verwendung der angegebenen Nukleinsäuremoleküle führen zu besonders guten Ergebnissen, wenn die Nukleinsäuremoleküle z. B. als Primer in einer Polyme rase-Kettenreaktion (PCR) eingesetzt werden.

Insgesamt gelingt mit den Nukleinsäuremolekülen der spezifische Nachweis der nachstehend angegebenen Proteine:
SEQ ID Nr. 1 und 2: Asparaginylendopeptidase
SEQ ID Nr. 3 und 4: Cathepsin B
SEQ ID Nr. 5 und 6: Cathepsin D
SEQ ID Nr. 7 und 8: Cathepsin H
SEQ ID Nr. 9 und 10: Cathepsin L
SEQ ID Nr. 11 und 12: Cathepsin S
SEQ ID Nr. 13 und 14: Cathepsin V
SEQ ID Nr. 15 und 16: Cathepsin W
SEQ ID Nr. 17 und 18: Leukocystatin

Werden diese Nukleinsäuremoleküle im Rahmen einer PCR einge setzt, so entsteht ein Amplifikationsprodukt von ca. 100 bis 150 Basenpaaren (bp). Damit wird gewährleistet, daß die Ampli fizierungseffizienz nahezu 100% beträgt. Das Amplifikations produkt kann dann mittels einfacher Standardmethoden, z. B. durch Ethidiumbromidanfärbung nach gelelektrophoretischer Auf trennung, nachgewiesen werden.

Ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel der Verfahren bzw. der Ver wendung der beanspruchten Nukleinsäuremoleküle besteht darin, daß der Nachweis bzw. die Amplifikation der spezifischen Nu kleinsäuremoleküle mittels Real-Time-PCR (RT-PCR) erfolgt. Da bei handelt es sich um ein besonders sensitives Verfahren, bei dem die Zunahme an Amplifikat während des Verfahrens dadurch beobachtet werden kann, daß in den Ansatz ein unspezifisch an doppelsträngige DNA bindendes Fluorochrom, z. B. SYBR® Green, zugegeben wird. Ausgehend von ausschließlich einzelsträngiger cDNA als Template, die durch Umschreibung von mRNA hergestellt wird, steigt die Fluoreszenz mit zunehmender Zyklenzahl auf grund der sich aus dem Amplifikat gebildeten Menge an doppel strängiger DNA an. Typischerweise steigt die Fluoreszenz in einer RT-PCR nach einer gewissen Verzögerung nach ca. 20-25 Zyklen proportional zur Amplifikatmenge an und verläuft dann wiederum nach ca. 20-25 weiteren Zyklen in ein Plateau. Die Sensitivität dieses Verfahrens beruht im Vergleich zur tradi tionellen End-Punkt-PCR auf der Vielzahl der erhaltenen Meß punkte. Dies ermöglicht z. B. eine lineare Quantifizierung der nachzuweisenden spezifischen Nukleinsäuremoleküle über einen 3- 5 mal so großen Bereich im Vergleich zu einer End-Punkt-PCR.

Die Voraussetzung für den zuverlässigen Nachweis der genannten Nukleinsäuremoleküle durch die Real-Time-PCR ist eine extrem hohe Spezifität der verwendeten Primer-Sequenzen. Diese Anfor derung erfüllen die beanspruchten Nukleinsäuremoleküle nach Er kenntnis des Erfinders in hervorragender Weise. Durch die Ver wendung wird eine Amplifikation von unspezifischen Abschnitten und damit verbunden der Anstieg "falsch-positiver" Fluoreszenz vermieden.

Die Erfinder haben nämlich erkannt, daß mit den entworfenen Primer-Paaren auch sehr homologe Sequenzen, wie z. B. von Ca thepsin V und L, differenziert erfaßt werden können. Mit den bisherigen Verfahren ist dies nicht möglich. Aufgrund dieser überraschenden Selektivität des Verfahrens bzw. der beanspruch ten Nukleinsäuremoleküle lassen sich wichtige neue Erkenntnisse gewinnen. Es kann jetzt z. B. untersucht werden, ob der in der Literatur von Herszènyi et al., 1999; Duffy et al., 1998; Lah et al., 1998, a.a.O., beschriebene Expressionsanstieg von Cathepsin L in humanen Tumoren nicht der verstärkten Expression von Cathepsin V zugeordnet werden muß.

Die beschriebenen Verfahren werden bevorzugt im Rahmen von Ver fahren zur Diagnose und/oder Früherkennung eingesetzt.

Da die vorliegenden Nachweisverfahren sehr sensitiv sind, eig nen sie sich sowohl zur Diagnostik eines Krankheitsverlaufs bzw. zur Früherkennung einer bestimmten Krankheitsveranlagung als auch zur Bewertung eines Therapieerfolgs. Die Menge des zu überprüfenden Probenmaterials, wie z. B. Blut, Biopsieproben, Abstriche, kann dabei stark reduziert werden. D. h., es sind le diglich minimale invasive Eingriffe in den Patienten notwendig.

Das neue Verfahren ist ebenfalls dazu geeignet, im Rahmen einer Früherkennungsuntersuchung und/oder eines Diagnoseverfahrens zum Nachweis von Tumoren und/oder Metastasen eingesetzt zu wer den.

Die Empfindlichkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens erlaubt es, Tumorzellen auch mit minimal-invasiven Methoden zu identi fizieren und schon während einer Therapie den Erfolg der Be handlung, z. B. durch Blutanalyse während einer Leukämiebehand lung, zu überprüfen. Durch die extrem hohe Sensitivität der be anspruchten Sequenzen als PCR-Primer in Verbindung mit der Real-Time-PCR lassen sich schon wenige metastatisierende Zellen nachweisen. Des weiteren kann der Behandlungserfolg von Patien ten nach einer Krebs-Therapie überwacht werden.

Durch die Auswahl der Zielmoleküle, d. h. der Cathepsin-, Aspa raginylendopeptidase- und Leukocystatin-spezifischen Nuklein säuremoleküle als nachzuweisende Moleküle, und durch das Design der Primer wird der zuverlässige, schnelle und kostengünstige Nachweis der häufigsten Tumorarten gewährleistet. Mit der Bereitstellung eines Kits, das die beanspruchten Nukleotid sequenzen beinhaltet, kann auch in der Klinik durch angelerntes Personal routinemäßig ein eingangs beschriebenes Verfahren durchgeführt werden. Deshalb ist auch ein Kit, der die bean spruchten Nukleotidsequenzen enthält, von der Erfindung umfaßt.

Es versteht sich, daß die vorstehend erwähnten Merkmale nicht nur in der angegebenen Kombination, sondern auch einzeln oder auch in anderer Kombination verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.

Die Erfindung wird nachstehend anhand von Beispielen erläutert, aus denen sich weitere Merkmale und Vorteile ergeben.

Drei beigefügte Abbildungen sollen der Beschreibung der Erfin dung dienen. Es zeigen:

Fig. 1 Agarosegel-Analyse der PCR-Amplifikate; beispielhaft für Cathepsin D-, Cathepsin L- und Cathepsin W-spe zifische Amplifikate dargestellt;

Fig. 2 eine schematische Darstellung einer Schmelzkurvenanalyse eines spezifischen PCR-Amplifikats;

Fig. 3 Standardkurven, beispielhaft für Cathepsin D- (a), Cathepsin V- (b) und Leukocystatin-spezifische Amplifikate (c) dargestellt.

Beispiel 1 Umschreibung der mRNA in cDNA

Die zu untersuchende biologische Probe wird in Form von Patien tenblut, Gewebe oder Abstrichmaterial zur Verfügung gestellt. Ausgangspunkt des Nachweisverfahrens ist die gesamte mRNA der biologischen Probe. Für die Anwendung des Verfahrens muß diese zuerst in eine entsprechende cDNA umgeschrieben werden. Dies erfolgt nach den Angaben des Herstellers. Mit Trizol® (GibcoBRL) oder StrataPrep Total RNA Miniprep Kit (Stratagene) wird die Total-RNA nach DNase-Behandlung der Probe isoliert und mit random Hexamers und M-MLV-Reverse Transkriptase (Promega) in cDNA umgeschrieben. Die resultierende cDNA wird mit Wasser 1 : 10 verdünnt und entsprechend den Angaben des Herstellers (Perkin Elmer) als Template zusammen mit den Primern und dem SYBR® Green PCR Core Reagent in eine Real-Time-PCR eingesetzt.

Beispiel 2 Primer-Design und Optimierung der Real-Time-PCR

Das Design der Primer für die PCR bestimmt die Selektivität und Empfindlichkeit des Nachweisverfahrens. Da sich bei der RT-PCR der zugegebene Farbstoff unspezifisch in doppelsträngige DNA einlagert, darf durch die PCR-Primer genomische DNA höchstens minimal amplifiziert werden.

Damit die PCR mit einer annähernd 100%-igen Effizienz verläuft, d. h. daß sich nach jedem Zyklus die Menge der Ziel-DNA verdop pelt, müssen die Primer erfahrungsgemäß so beschaffen sein, daß die Amplifikate eine Größe von 100-150 bp aufweisen.

Es ist notwendig, für jedes Primer-Paar die Spezifität der Pro duktbildung zu überprüfen und gegebenenfalls die Reaktions bedingungen der PCR zu optimieren. Eventuell stattfindende un spezifische Amplifikationen, unspezifische Bildungen von Pri mer-Dimeren bzw. Kontaminationen der Amplifikationsprodukte wurden durch Produktanalysen von NTC-(engl.: no template con trol)Proben, d. h. Proben ohne Template, mit Hilfe der Agarose- Gelelektrophorese (Fig. 1, Beispiel 3) oder durch Schmelz kurvenanalyse der Amplikate (Fig. 2, Beispiel 4) ausgeschlos sen.

Die RT-PCR führt zu besonders guten Ergebnissen bei folgenden Reaktionsbedingungen:
Pro Reaktionsansatz wird ein Gesamtvolumen von 25 µl gewählt. Dieses enthält (Endkonzentration) 1 × SYBR® PCR-Puffer (zu be ziehen über Perkin-Elmer), 3 mM MgCl₂, jeweils 0,05 mM dATP, dCTP, dGTP und 0,1 mM dUTP, 0,025 u/25 µl AmpliTaq Gold, 0,01 u/25 µl AmpErase UNG und jeweils 300 nM des Vorwärts- und Rückwärtsprimers. Die Menge des pro 25 µl-Ansatz eingesetzten (cDNA-)Templates entspricht einem Total-RNA-Äquivalent von ca. 5 ng.

Die PCR-Reaktion wird vorzugsweise mit folgendem Temperaturpro fil durchgeführt: AmpErase UNG-Inkubation für 2 Minuten bei 50°C, AmpliTaq Gold Aktivierung für 10 Minuten bei 95°C; an schließend folgen 40 Zyklen von jeweils 15 Sekunden Hitzedena turierung bei 95°C und Primerhybridisierung/Polymerisierung für 1 Minute bei 60°C.

Um die Spezifität des Verfahrens zu charakterisieren, wurden sämtliche Amplifikate sequenziert. In allen Fällen wurde nur das gewünschte Produkt amplifiziert.

Die Ergebnisse verschiedener PCR-Ansätze, bei denen als Templa te eine cDNA-Bibliothek aus Mononuklearen Zellen peripheren Blutes (PBMC) gesunder Patienten eingesetzt wurde, sind in Ta belle 1 dargestellt.

Um den Einfluß von Kontaminationen durch genomische DNA auf die spezifische Amplifikation zu überprüfen, wurden zusätzlich die der Bibliothek zugrunde liegenden mRNA-Präparationen ohne vor herige DNase-Behandlung einer Erst-Strang-cDNA-Synthesereaktion einmal mit und einmal ohne Reverse Transkriptase unterzogen und anschließend in die PCR eingesetzt. In dem Ansatz ohne Reverse Transkriptase sollte nur dann ein PCR-Produkt entstehen, wenn die entsprechende Zielsequenz innerhalb von DNA-Kontaminationen mit den Primern amplifiziert werden kann. In der Tabelle 1 ist für jedes Primer-Paar der prozentuale Anteil der Amplifikation von genomischer DNA angegeben.

TABELLE 1

In allen Fällen wird die gewünschte Größenlimitierung für das Amplifikat von 150 bp erreicht. Wie der Tabelle zu entnehmen ist, kommt es nur in den Fällen von Cathepsin B, L und V und bei der Kontrolle zu einer wenn auch schwachen Amplifikation genomischer DNA. Da jedoch bei der RNA-Isolierung (siehe Bsp. 1) die genomische DNA vor der Reversen Transkription durch DNase-Abbau nahezu vollständig zerstört wird, spielt die hier beobachtete Amplifikation von genomischer DNA bei der eigentli chen Analyse keine Rolle mehr. Bei den übrigen Primerpaaren kommt es zu keinerlei Amplifikation genomischer DNA.

Die Effizienz der einzelnen Amplifikationsansätze läßt sich über den sogenannten Schwellenwertzyklus (c_t, englisch: thres hold cycle) bestimmen. Ein c_t-Wert repräsentiert jene Zyklen zahl, bei der in der RT-PCR zum ersten Mal ein Anstieg der Re porter-Fluoreszenz signifikant über dem Hintergrundsignal de tektiert wird. Demnach ist eine effiziente PCR-Reaktion durch einen möglichst niedrigen c_t-Wert charakterisiert. Bei spezifi schen c_t-Werten < 35 kann von hocheffizienter Amplifikation ge sprochen werden. In sämtlichen Ansätzen gelingt folglich eine hocheffiziente Amplifizierung des Zielmoleküls.

Primer-Dimerbildungen, die zur Akkumulierung unspezifischer Amplifikate führen können, spielten in keinem der überprüften Ansätze eine Rolle.

Beispiel 3 Agarose-Gelanalyse der PCR-Produkte

Nach der RT-PCR-Reaktion wurden die Amplifikate mittels Agaro se-Gelelektrophorese aufgetrennt und durch Ethidiumbromid ange färbt. Unter UV-Anregung wurden die aufgetrennten Produkte sichtbar gemacht, und die Größen der Amplifikate konnten über den Vergleich mit einer 100-bp-Leiter bestimmt werden. Dabei konnten auch eventuelle Kontaminationen durch unspezifische Produkte beurteilt werden. Dies ist in Fig. 1 beispielhaft für Cathepsin D, L und W dargestellt. In den Spuren 1 und 12 wurde als Referenz die 100-bp-Leiter aufgetrennt. Die Spuren 2 und 3 zeigen den Cathepsin D-PCR-Ansatz ohne Template (NTC); die Spu ren 7 und 8 den Cathepsin L-PCR-Ansatz ohne Template (NTC); die Spuren 13 und 14 den Cathepsin W-PCR-Ansatz ohne Template (NTC). Die Spuren 4 bis 6 zeigen das aufgetrennte Amplifikat des Cathepsin D-PCR-Ansatzes (mit cDNA als Template); in den Spuren 9 bis 11 den Cathepsin L-PCR-Ansatz (mit cDNA) und in den Spuren 15 bis 17 den Cathepsin W-PCR-Ansatz (mit cDNA). Die Markergrößen sind im relevanten Bereich angegeben.

Die Amplifikate haben die erwartete Größe (~ 100-125 bp) und weisen keine Kontaminationen mit unspezifischer DNA auf. Die NTC-Ansätze zeigen keine Amplifikate. D. h. es kommt zu keiner unspezifischen Bildung von Primer-Dimeren. Diese Ergebnisse be legen die hohe Spezifität der Primer in Verbindung mit einer optimierten RT-PCR.

Beispiel 4 Schmelzkurven der spezifischen Amplifikate

Um zusätzlich die Spezifität der beschriebenen Nukleinsäure moleküle als PCR-Primer zu charakterisieren, wurden einige der spezifischen Amplifikate einer Schmelzkurven- bzw. Dissoziati onskurvenanalyse unterzogen. Dazu wurden diese Amplifikate mit <SYBR® Green versetzt, der sich, wie oben erwähnt, unspezifisch in doppelsträngige DNA einlagert. Eine graduelle Temperatur erhöhung führt zu einer zunehmenden Denaturierung bzw. Auf schmelzung der doppelsträngigen Bereiche. Bei einer bestimmten kritischen Temperatur kommt es dann zum Freisetzen der eingela gerten Fluoreszenz. Spezifische Amplifikate sind durch eine re lativ hohe Schmelztemperatur von ca. 80°C gekennzeichnet, wo hingegen nicht-spezifisch amplifizierte Abschnitte bei niedri geren Temperaturen von ca. 75°C aufschmelzen. In Fig. 2 ist ein derartiges Analysenergebnis schematisch dargestellt. Dabei ist auf der x-Achse die Temperatur in °C aufgetragen, auf der y- Achse die erste Ableitung der Fluoreszenz. Dem Schmelzprofil läßt sich demnach entnehmen, daß in dem Ansatz eine spezifische Amplifikation stattgefunden hat. Sämtliche Amplifikate geben, wie hier exemplarisch dargestellt, bei ∼80°C den eingelagerten Fluoreszenzfarbstoff frei, einen Nebenpeak bei niedrigeren Tem peraturen findet man nicht.

Beide Analyseverfahren, sowohl die Agarose-Gelelektrophorese als auch die Schmelzkurvenanalyse belegen eindeutig die Spezi fität des beschriebenen Nachweisverfahrens bzw. der Nuklein säuremoleküle.

Beispiel 5 Sensitivität des Nachweisverfahrens

Um die Sensitivität des beanspruchten Verfahrens zu testen, wurden die spezifischen Amplikons isoliert, z. T. in Plasmide (pTNOT, pKS+) kloniert, sequenziert und als Template in ver schiedenen Verdünnungen eingesetzt. Die Menge der Template-DNA wurde durch eine Absorptionsmessung bei 260 nm Wellenlänge be stimmt. Die Sensitivität läßt sich nun testen, indem die c_t- Werte der einzelnen Amplifikations-Ansätze bei jeweils vorge gebener Menge an Template bestimmt werden und gegenüber dem Logarithmus der vorgegebenen cDNA-Moleküle/Ansatz aufgetragen werden (Standardkurve). Durch die so erhaltenen Punkte wird eine Gerade gelegt. Eine akkurate Quantifizierung ist bis zu der Konzentration möglich, bei der die entsprechenden c_t-Werte noch auf der ermittelten Geraden liegen.

In Fig. 3 sind beispielhaft die Standardkurven für Cathepsin D (a), Cathepsin V (b) und Leukocystatin (c) gezeigt. Hier wurde eine Verdünnungsreihe von Cathepsin D-cDNA und eines Cathepsin V- bzw. Leukocystatin-Plasmids angelegt und in die quantitative RT-PCR eingesetzt. Im Falle von Cathepsin D gelingt demnach noch der Nachweis von 10 spezifischen cDNA Molekülen pro 4 An satzvolumen. Für Cathepsin V und Leukocystatin ist noch der Nachweis von 100 spezifischen Plasmidmolekülen pro µl Ansatzvo lumen möglich.

Die beiden dargestellten Beispiele belegen die extrem hohe Sen sitivität des beschriebenen Verfahrens bzw. der erstmals offen barten Nukleinsäuremoleküle.

Beispiel 6 Verwendete Nukleinsäuremoleküle

Die folgenden Nukleinsäuremoleküle sind Bestandteil der be schriebenen Verfahren, z. B. als PCR-Primer.

PCR-Primer-Paar 1 (spezifisch für: Asparaginylendopeptidase)

SEQ ID Nr. 1: 5'-GAAGCCTGTGAGTCTGGGTC-3'
SEQ ID Nr. 2: 5'-CAGTCCCCCAGGTACGTG-3'

PCR-Primer-Paar 2 (spezifisch für: Cathepsin B)

SEQ ID Nr. 3: 5'-CTGTGTATTCGGACTTCCTGC-3'
SEQ ID Nr. 4: 5'-CCAGGAGTTGGCAACCAG-3'

PCR-Primer-Paar 3 (spezifisch für: Cathepsin D)

SEQ ID Nr. 5: 5'-AACTGCTGGACATCGCTTG-3'
SEQ ID Nr. 6: 5'-AGGTACCCGGAGAGGCTG-3'

PCR-Primer-Paar 4 (spezifisch für: Cathepsin H)

SEQ ID Nr. 7: 5'-ACTGGCTGTTGGGTATGGAG-3'
SEQ ID Nr. 8: 5'-AGGCCACACATGTTCTTTCC-3'

PCR-Primer-Paar 5 (spezifisch für: Cathepsin L)

SEQ ID Nr. 9: 5'-ACCAAGTGGAAGGCGATG-3'
SEQ ID Nr. 10: 5'-TTCCCTTCCCTGTATTCCTG-3'

PCR-Primer-Paar 6 (spezifisch für: Cathepsin S)

SEQ ID Nr. 11: 5'-ACTCAGAATGTGAATCATGGTG-3'
SEQ ID Nr. 12: 5'-TTCTTGCCATCCGAATATATCC-3'

PCR-Primer-Paar 7 (spezifisch für: Cathepsin V)

SEQ ID Nr. 13: 5'-TGGAAGGCAACACACAGAAG-3'
SEQ ID Nr. 14: 5'-GAAGCCATGTTTCCCTTGG-3'

PCR-Primer-Paar 8 (spezifisch für: Cathepsin W)

SEQ ID Nr. 15: 5'-GACCAGAAAAACTGCAACTGC-3'
SEQ ID Nr. 16: 5'-CCACAGTCCAGCAGTTCATG-3'

PCR-Primer-Paar 9 (spezifisch für: Leukocystatin)

SEQ ID Nr. 17: 5'-ACTGCACGAACGACATGTTC-3'
SEQ ID Nr. 18: 5'-AGTCATCCAGACGCAGGTG-3'

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Verfahren zum selektiven Nachweis von Nukleinsäuremolekü len in biologischem Material, die spezifisch für Cathepsi ne, Asparaginylendopeptidase und deren Isozyme, sowie für Leukocystatin sind, dadurch gekennzeichnet, daß der Nach weis unter Verwendung von zumindest einem Nukleinsäure molekül erfolgt, das eine der folgenden Nukleotidsequenzen aufweist:
SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 18 aus dem beiliegenden Se quenzprotokoll oder Sequenzen, die an Sequenzen binden (hybridisieren), an die eine der Sequenzen SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 18 bindet.

2. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Nachweis über Amplifikation mittels Polymerase-Ketten reaktion (PCR), vorzugsweise einer Real-Time-PCR, erfolgt.

3. Verfahren nach Anspruch 2 zum Nachweis von Asparaginyl endopeptidase, dadurch gekennzeichnet, daß als Primer-Paar für die PCR Nukleinsäuremoleküle mit Nukleotidsequenzen SEQ ID Nr. 1 und SEQ ID Nr. 2 aus beiliegendem Sequenz protokoll oder mit Sequenzen, die an Sequenzen binden (hy bridisieren), an die eine der vorstehenden Sequenzen bin det, verwendet werden.

4. Verfahren nach Anspruch 2 zum Nachweis von Cathepsin B, dadurch gekennzeichnet, daß als Primer-Paar für die PCR Nukleinsäuremoleküle mit Nukleotidsequenzen SEQ ID Nr. 3 und SEQ ID Nr. 4 aus beiliegendem Sequenzprotokoll oder mit Sequenzen, die an Sequenzen binden (hybridisieren), an die eine der vorstehenden Sequenzen bindet, verwendet wer den.

5. Verfahren nach Anspruch 2 zum Nachweis von Cathepsin D, dadurch gekennzeichnet, daß als Primer-Paar für die PCR Nukleinsäuremoleküle mit Nukleotidsequenzen SEQ ID Nr. 5 und SEQ ID Nr. 6 aus beiliegendem Sequenzprotokoll oder mit Sequenzen, die an Sequenzen binden (hybridisieren), an die eine der vorstehenden Sequenzen bindet, verwendet wer den.

6. Verfahren nach Anspruch 2 zum Nachweis von Cathepsin H, dadurch gekennzeichnet, daß als Primer-Paar für die PCR Nukleinsäuremoleküle mit Nukleotidsequenzen SEQ ID Nr. 7 und SEQ ID Nr. 8 aus beiliegendem Sequenzprotokoll oder mit Sequenzen, die an Sequenzen binden (hybridisieren), an die eine der vorstehenden Sequenzen bindet, verwendet wer den.

7. Verfahren nach Anspruch 2 zum Nachweis von Cathepsin L, dadurch gekennzeichnet, daß als Primer-Paar für die PCR Nukleinsäuremoleküle mit Nukleotidsequenzen SEQ ID Nr. 9 und SEQ ID Nr. 10 aus beiliegendem Sequenzprotokoll oder mit Sequenzen, die an Sequenzen binden (hybridisieren), an die eine der vorstehenden Sequenzen bindet, verwendet wer den.

8. Verfahren nach Anspruch 2 zum Nachweis von Cathepsin S, dadurch gekennzeichnet, daß als Primer-Paar für die PCR Nukleinsäuremoleküle mit Nukleotidsequenzen SEQ ID Nr. 11 und SEQ ID Nr. 12 aus beiliegendem Sequenzprotokoll oder mit Sequenzen, die an Sequenzen binden (hybridisieren), an die eine der vorstehenden Sequenzen bindet, verwendet wer den.

9. Verfahren nach Anspruch 2 zum Nachweis von Cathepsin V, dadurch gekennzeichnet, daß als Primer-Paar für die PCR Nukleinsäuremoleküle mit Nukleotidsequenzen SEQ ID Nr. 13 und SEQ ID Nr. 14 aus beiliegendem Sequenzprotokoll oder mit Sequenzen, die an Sequenzen binden (hybridisieren), an die eine der vorstehenden Sequenzen bindet, verwendet wer den.

10. Verfahren nach Anspruch 2 zum Nachweis von Cathepsin W, dadurch gekennzeichnet, daß als Primer-Paar für die PCR Nukleinsäuremoleküle mit Nukleotidsequenzen SEQ ID Nr. 15 und SEQ ID Nr. 16 aus beiliegendem Sequenzprotokoll oder mit Sequenzen, die an Sequenzen binden (hybridisieren), an die eine der vorstehenden Sequenzen bindet, verwendet wer den.

11. Verfahren nach Anspruch 2 zum Nachweis von Leukocystatin, dadurch gekennzeichnet, daß als Primer-Paar für die PCR Nukleinsäuremoleküle mit Nukleotidsequenzen SEQ ID Nr. 17 und SEQ ID Nr. 18 aus beiliegendem Sequenzprotokoll oder mit Sequenzen, die an Sequenzen binden (hybridisieren), an die eine der vorstehenden Sequenzen bindet, verwendet wer den.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch ge kennzeichnet, daß es im Rahmen eines Diagnose- und/oder Früherkennungsverfahrens durchgeführt wird.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß es im Rahmen einer Diagnose und/oder Früherkennung von Tumo ren und/oder Metastasen durchgeführt wird.

14. Nukleinsäuremolekül mit einer der Nukleotidsequenzen SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 18 aus dem beiliegenden Sequenz protokoll.

15. Nukleinsäuremolekül mit einer Nukleotidsequenz, die an eine Sequenz bindet (hybridisiert), an die eine der Nu kleotidsequenzen SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 18 aus dem beiliegenden Sequenzprotokoll bindet (hybridisiert).

16. Verwendung von Nukleinsäuremolekülen mit Nukleotidsequen zen SEQ ID Nr. 1 und SEQ ID Nr. 2 aus beiliegendem Se quenzprotokoll oder mit Sequenzen, die an Sequenzen binden (hybridisieren), an die eine der vorstehenden Sequenzen bindet, zum Nachweis von Asparaginylendopeptidase.

17. Verwendung von Nukleinsäuremolekülen mit Nukleotidsequen zen SEQ ID Nr. 3 und SEQ ID Nr. 4 aus beiliegendem Se quenzprotokoll oder mit Sequenzen, die an Sequenzen binden (hybridisieren), an die eine der vorstehenden Sequenzen bindet, zum Nachweis von Cathepsin B.

18. Verwendung von Nukleinsäuremolekülen mit Nukleotidsequen zen SEQ ID Nr. 5 und SEQ ID Nr. 6 aus beiliegendem Se quenzprotokoll oder mit Sequenzen, die an Sequenzen binden (hybridisieren), an die eine der vorstehenden Sequenzen bindet, zum Nachweis von Cathepsin D.

19. Verwendung von Nukleinsäuremolekülen mit Nukleotidsequen zen SEQ ID Nr. 7 und SEQ ID Nr. 8 aus beiliegendem Se quenzprotokoll oder mit Sequenzen, die an Sequenzen binden (hybridisieren), an die eine der vorstehenden Sequenzen bindet, zum Nachweis von Cathepsin H.

20. Verwendung von Nukleinsäuremolekülen mit Nukleotidsequen zen SEQ ID Nr. 9 und SEQ ID Nr. 10 aus beiliegendem Se quenzprotokoll oder mit Sequenzen, die an Sequenzen binden (hybridisieren), an die eine der vorstehenden Sequenzen bindet, zum Nachweis von Cathepsin L.

21. Verwendung von Nukleinsäuremolekülen mit Nukleotidsequen zen SEQ ID Nr. 11 und SEQ ID Nr. 12 aus beiliegendem Se quenzprotokoll oder mit Sequenzen, die an Sequenzen binden (hybridisieren), an die eine der vorstehenden Sequenzen bindet, zum Nachweis von Cathepsin S.

22. Verwendung von Nukleinsäuremolekülen mit Nukleotidsequen zen SEQ ID Nr. 13 und SEQ ID Nr. 14 aus beiliegendem Se quenzprotokoll oder mit Sequenzen, die an Sequenzen binden (hybridisieren), an die eine der vorstehenden Sequenzen bindet, zum Nachweis von Cathepsin V.

23. Verwendung von Nukleinsäuremolekülen mit Nukleotidsequen zen SEQ ID Nr. 15 und SEQ ID Nr. 16 aus beiliegendem Se quenzprotokoll oder mit Sequenzen, die an Sequenzen binden (hybridisieren), an die eine der vorstehenden Sequenzen bindet, zum Nachweis von Cathepsin W.

24. Verwendung von Nukleinsäuremolekülen mit Nukleotidsequen zen SEQ ID Nr. 17 und SEQ ID Nr. 18 aus beiliegendem Se quenzprotokoll oder mit Sequenzen, die an Sequenzen binden (hybridisieren), an die eine der vorstehenden Sequenzen bindet, zum Nachweis von Leukocystatin.

25. Verwendung nach einem der Ansprüche 16 bis 24, dadurch ge kennzeichnet, daß der Nachweis mittels einer Polymerase- Kettenreaktion (PCR) erfolgt.

26. Verwendung nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß die PCR eine Real-Time-PCR umfaßt.

27. Verwendung nach einem der Ansprüche 16 bis 24, dadurch ge kennzeichnet, daß der Nachweis mittels einer Northern- Blot-Analyse erfolgt.

28. Kit, das zumindest eines der Nukleinsäuremoleküle nach An spruch 14 oder 15 enthält.