DE60105411T2

DE60105411T2 - Verfahren zur diagnose von krebs

Info

Publication number: DE60105411T2
Application number: DE60105411T
Authority: DE
Inventors: Xu Qi Houston Chen; Maurice Stroun; Philippe Anker
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2000-05-26
Filing date: 2001-05-16
Publication date: 2005-09-22
Anticipated expiration: 2021-05-17
Also published as: WO2001090409A1; ATE275642T1; US7163789B2; EP1283907A1; US20040132019A1; AU5502101A; EP1158055A1; ES2227178T3; PT1283907E; EP1283907B1; DE60105411D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Diagnose und/oder Überwachung verschiedener Typen von Krebs, zum Beispiel nach einer chemotherapeutischen Behandlung oder nach einer Operation.
Bekanntermassen erfolgen Krebsdiagnose und -überwachung durch eine direkte Beobachtung und Prüfung der Tumoren, durch die Analyse von Biopsien oder im Falle von Blutkrebs die Analyse von Knochenmark, was entweder einen chirurgischen Eingriff oder einen invasiven Test wie Biopsie oder Knochenmarkaspiration bedeutet. Abgesehen von dem für die Patienten unangenehmen oder sogar gefährlichen Charakter solcher Verfahren ist nun des Weiteren festgestellt worden, dass diese auch ungenau sein können. Was den Brustkrebs betrifft, so werden grosse Anstrengungen gemacht, um die Erkennung durch Mammographie weiterzuentwickeln. Obwohl mehrere Studien gezeigt haben, dass mammographische Reihenuntersuchungen eine nützliche Strategie sein können, um die Sterblichkeit bei Brustkrebs zu verringern, so hat dieses Verfahren doch eine gewisse Anzahl von Nachteilen. Unter diesen muss man einen hohen Anteil von falschen Positiven, häufige falsche Negative und die enormen staatlichen Ausgaben hervorheben. So ist es, wenn Vor- und Nachteile verglichen werden, keine Überraschung, dass diese Art der Untersuchung seit zwanzig Jahren angeregte, widersprüchliche Diskussionen verursacht.
Das Ziel dieser Erfindung besteht daher darin, ein Verfahren zur Diagnose und/oder der Überwachung der Entwicklung verschiedener Krebsarten zu liefern, das einerseits genauer und zuverlässiger, andererseits leichter auszuführen ist und keinen invasiven Test an den Patienten bedingt.
Das Verfahren zur Diagnose und/oder Überwachung der Entwicklung von Krebs, das den Gegenstand der Erfindung darstellt und danach strebt, das vorgenannte Ziel zu erreichen, umfasst die Analyse der Ribonucleinkomponente (RNA) im Blutplasma oder – serum.
Die Telomerase ist ein Ribonucleoprotein-Enzym, das wiederholte telomere Sequenzen an den Chromosomenenden synthetisiert. Die Telomere schützen die Enden der Chromosomen und verkürzen sich bei jeder Zellteilung. Die Telomerase verwendet ein oder zwei Segmente ihres RNA-Bestandteils als Matrix für die Synthese dieser Telomere.
Die Aktivität dieses Enzyms ist zu einem anerkannten Anzeiger für die Diagnose und Prognose der meisten krebsartigen Tumoren geworden. Die Expression der RNA von humaner Telomerase (hTR) oder des Enzyms Invers-Transkriptase der RNA-Telomerase (hTERT) bzw. des zugehörigen Proteins (TEP 1) ist beim Fortschreiten mehrerer Tumorarten bestimmt worden, wodurch es möglich wurde, eine Korrelation zwischen dieser Expression (der Menge an RNA) und der Aktivität der Telomerase aufzustellen. Die meisten Krebsgeschwüre und immortalisierten Zelllinien besitzen eine starke Telomerase-Aktivität, was einen Mechanismus widerspiegelt, der nicht der normalen Regulierung der Prozesse des Alterns unterliegt.
Obwohl die RNA-Komponenten der Telomerase Zellbestandteile sind, ist nun überraschend festgestellt worden, dass sich diese Bestandteile auch extrazellulär im Plasma oder Serum finden.
Tatsächlich haben die gegenwärtigen Erfinder zeigen können, dass hTR, hTERT und TEP 1 im Plasma oder Serum von Personen vorkommen, die insbesondere an Krebs des Blutes, des Eierstocks, des Magens oder des Dickdarms leiden, während diese Produkte im Blut gesunder Personen fehlen. Im Gegensatz zu den verschiedenen Markern der Desoxyribonucleinsäure (DNA) wie Mutationen des Gens ras oder p53 oder den zahlreichen Mikrosatelliten der Literatur, die bereits im Plasma oder Serum aufgefunden worden sind, scheint es, dass die RNA-Komponenten der Telomerase für alle Tumorarten verwendet werden können. Es handelt sich um einen allgemeinen Plasma- oder Serummarker für Krebs. So ist für die meisten Krebsarten der Anteil von Seren, die Telomerase-RNA aufweisen, höher als bei anderen, bisher verwendeten Nucleinsäuremarkern.
Genauer besteht das erfindungsgemässe Diagnoseverfahren darin, aus dem Plasma oder Serum die RNA zu extrahieren, diese RNA zu reinigen und zu amplifizieren, sodann das Vorhandensein und wahlweise die Menge von Produkt der Reverse-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) zu bestimmen, das die Bestandteile hTR, hTERT oder TEP 1 darstellt, und zwar im Vergleich zwischen dem Plasma oder Serum einer als krank angenommenen Person und dem einer Person bei guter Gesundheit.
Die PCR-Amplifizierungsprodukte der RNA-Bestandteile, die durch die RT-PCR zu DNA transkribiert worden sind, werden nachgewiesen und gegebenenfalls quantifiziert, indem zum Beispiel Gelfärbungsverfahren eingesetzt werden. Diese Analyse kann auch anders auf anderen Gelen oder gelfrei durch Radioimmunoassay (RIA), ELISA (Enzyme linked-Inununosorbent-Assay) oder einen Mikrochip-Test (Gen-Array) durchgeführt werden. Eine quantitative Amplifizierung auf TaqMan (Perkin-Elmer Biosystems) oder Light-Cycler-Kapillaren (Hoffmann-La Roche) verbessert den Nachweis von hRT, hTERT und TEP 1.
Jedes Extraktions-, Reinigungs- und Amplifizierungsverfahren für RNA im Plasma und Serum kann ebenfalls eingesetzt werden.
Die vorliegende Erfindung wird nunmehr nicht einschränkend durch das folgende Beispiel veranschaulicht, das sich auf die Diagnose von Brustkrebs bezieht. Dennoch sei festgestellt, dass die Tragweite der vorliegenden Erfindung keineswegs auf die Diagnose dieses Krebstyps beschränkt ist. Vorläufige Prüfungen haben in der Tat ebenfalls das Vorhandensein von hTR, hTERT und TEP 1 im Serum von Patienten gezeigt, die insbesondere von Eierstock- oder gastrointenstinalem Krebs betroffen sind. Man kann schon jetzt schlussfolgern, dass die hTR, hTERT und TEP 1 des Plasmas oder Blutes als allgemeine Marker zahlreicher Krebstypen dienen können.
Beispiel
Diagnose von Brustkrebs durch den Nachweis von hTR, hTERT oder TEP 1 im Plasma oder Serum.
Blutproben (2 – 3 ml) wurden präoperativ von 18 Patienten gezogen, die kleine Brustkrebstumoren (T1 oder T2) aufwiesen, die noch differenziert (G1 oder G2) waren, und im Prinzip weder Krebsknötchen noch Metastasen hatten. Die Muster wurden dann während 15 min bei 900 g und Zimmertemperatur zentrifugiert und das Serum gesammelt. Eine zweite Zentrifugierung während 15 min bei 900 g wurde ausgeführt, um alle Reste zu beseitigen. Die Serummuster wurden bei –70 °C aufbewahrt.
Die Extraktion der RNA erfolgte unter Benutzung eines üblichen Verfahrens mit einer handelsüblichen Ausrüstung (SV Total RNA Isolation System der Firma Promega, Wisconsin, USA) und den Anweisungen des Lieferanten folgend. Bezüglich dieser Anweisungen wurde eine Abwandlung eingeführt, die genauer darin bestand, 175 μl SVRNA Lysis-Puffer direkt zu 100 μl des frischen (oder zumindest nicht mehr als einmal aufgetauten) Serums oder Plasmas hinzuzugeben.
Nachweis von hTR, hTERT, TEP 1 und rRNA (Bezugs-RNA) durch Reverse-Transkriptase-PCR (RT-PCR):
Zum Nachweis des Vorhandenseins und der Menge an hTR und rRNA wurde ein Qiagen-Kit verwendet (Ein-Schritt-RT-PCR). Die Serum-RNA (1 mg) wurde zu einem Reaktionsgemisch von 25 μl RT-PCR hinzugefügt, das je 400 μM an dNTP, Omniscript^TM-Reverse-Transkriptase, Sensiscript^TM-Reverse-Transkriptase und HotStart Taq^TM-Polymerase sowie 0,15 μM Primer enthielt, und zwar GAAGGGCGTAGGCGCCGTGCTTTTGC für Sense-hTR und GTTTGCTCTAGAATGAACGGTGGAAGG für Antisense-hTR. Das Gemisch wurde für die Reverse-Transkription mindestens 30 min lang bei 50 °C inkubiert, dann während 15 min bei 95 °C, um die HotStart Taq^TM-DNA-Polymerase zu aktivieren, ferner mit 50 Zyklen von 30 s bei 94 °C, 1 min bei 65 °C und 1 min bei 72 °C und einer abschliessenden Verlängerung von 10 min bei 72 °C.
Die gleichen RT-PCR-Bedingungen wurden für den Nachweis von hTERT eingesetzt, aber mit einer Primer-Konzentration von 0,3 μM, wobei die Primer TGACACCTCACCTCACCCAC für Sense und CACTGTCTTCCGCAAGTTCAC für Antisense waren. Die gleichen Bedingungen wurden auch für den Nachweis von TEP 1 eingesetzt, wobei die Primer die folgenden waren:
(Primerkonzentrationen 0,3 μM).
Was die Kontroll-RNA betrifft, so wurden GAPDH und die gleichen Bedingungen eingesetzt wie bei hTR, und zwar mit einer Primerkonzentration von 0,3 μM; die Sequenzen des Primers GAPDH waren: CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT (Sense) und AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC (Antisense).
Alle oben als Primerbeispiele genannten Aminosäuresequenzen sind als solche bekannt und können zum Beispiel auf der Internetseite der Genom-Datenbank (http://www.gdb.org/) nachgelesen werden.
Die PCR lieferte ein Amplifizierungsprodukt von 111 bp für hTR, 95 bp für hTERT, 150 bp für TEP 1 und 306 bp für GAPDH der Kontroll-RNA. Diese Produkte wurden bei 55 °C auf Elchrom Scientific S-50-Gelen (Elchrom Scientific, Cham, Schweiz) analysiert, auf SYBR-Gold (Molecular Probe, Eugene, Oregon, USA während 45 min gefärbt und zweimal während 30 min in entionisiertem Wasser bei Zimmertemperatur im Dunklen entfärbt.
Ergebnisse
Durch Einsatz des oben beschriebenen Verfahrens ergibt sich, dass es effektiv möglich ist, ein von der Bezugs-RNA abgeleitetes PCR-Produkt in allen analysierten Mustern nachzuweisen. Quantitativ sind alle Muster ähnlich, gleichviel ob sie vom Serum einer gesunden Person oder dem einer kranken Person stammen.
Was das mit den für hTR spezifischen Primern erhaltene Amplifizierungsprodukt betrifft, so hat sich nur die von an Brustkrebs leidenden Patienten stammende RNA in 25 % der Fälle als positiv erwiesen. Was die RNA von hTERT betrifft, so ist sie in 22 % der Seren von kranken Patienten nachgewiesen worden. Was das TEP 1 betrifft, so ist es in 20 % der Fälle nachweisbar. Mit der Kombination der drei Marker war es demnach möglich, einen Brustkrebs in 55 % der Fälle nachzuweisen; dieser Prozentsatz ist deutlich höher als der, den man mit den derzeit bekannten Verfahren erhalten kann und der selten 30 % übersteigt. Hingegen fehlen die Telomerase-RNA in den Kontrollseren (gesunde Personen).

Claims

Verfahren zur Diagnose und/oder Überwachung der Entwicklung von Krebs, die Analyse von im Blutplasma oder -serum vorliegenden RNA des Enzyms Telomerase umfassend, dadurch gekennzeichnet, dass man RNA aus dem Plasma oder Serum extrahiert, diese RNA reinigt und amplifiziert, dann die für den katalytischen Abschnitt des Enzyms kodierende hTERT-RNA oder die für das assoziierte Protein kodierende TEP1-RNA analysiert.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die RNA mit der Technik der Reverse-Transkriptase-Kettenreaktion (RT-PCR) amplifiziert wird.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die benannten RNA durch Gelfärbung, durch die Technik des Radioimmunoassays (RIA), durch den Enzymelinked-Immunosorbent-Assay (ELISA) oder durch Microchip-Tests (Gene-Arrays) analysiert werden.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die RNA einer Quantifizierung unterworfen werden.
Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Quantifizierung mit „TagMan" oder mit „LightCycler"-Kapillaren ausgeführt wird.