DE60108337T2

DE60108337T2 - Methode und testsatz zur detektion von schistosomiasis mittels polymerasekettenreaktion

Info

Publication number: DE60108337T2
Application number: DE60108337T
Authority: DE
Inventors: Ana Lucia Teles Rabello; Emmanuel Dias Neto; Luis Andre Pontes
Original assignee: Fundacao Oswaldo Cruz
Current assignee: Fundacao Oswaldo Cruz
Priority date: 2000-04-04
Filing date: 2001-04-04
Publication date: 2005-12-22
Anticipated expiration: 2021-04-05
Also published as: ATE286984T1; BRPI0001536B1; EP1208241B1; WO2001075148A1; US6818402B2; DE60108337D1; EP1208241A1; BRPI0001536B8; AU4397101A; US20030096244A1; JP4974432B2; ES2237562T3; JP2003529373A; BRPI0001536A; CN1366553A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und einen Kit für die Diagnose von Schistosomiasis in menschlichem Probenmaterial durch Polymerasekettenreaktion (Polymerase Chain Reaction, PCR). Das Verfahren basiert auf dem Nachweis der Parasiten-DNA und ist besonders brauchbar in Fällen von geringer Infektionsintensität, für die parasitologische Stuhltests (Kato-Katz) wenig Empfindlichkeit zeigen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Schistosomiasis ist eine durch Infektion mit Parasiten der Gattung Schistosoma verursachte Krankheit, wobei Schistosoma mansoni, Schistosoma japanicum und Schistosoma haematobium die wichtigsten infizierenden Spezies sind. Die Krankheit ist seit 4000 Jahren dokumentiert und stellt immer noch ein wichtiges Problem für die öffentliche Gesundheit dar, wobei sie mehr als 200 Millionen Menschen in unentwickelten Ländern beeinträchtigt. Die Spezies S. mansoni ist in 54 Ländern und Gebieten von Südamerika, des karibischen Raums, von Afrika und des östlichen Mittelmeerraums endemisch.
Diese Darmwürmer, digenetische Saugwürmer, infizieren den Menschen durch Durchdringen der Haut mittels der Cercarien (Larvenstadium), die von verschiedenen Spezies von Weichtieren, ihren Zwischenwirten, ins Wasser ausgeschieden werden. Nachdem sie durch die Haut gewandert sind durchqueren die Larven von S. mansoni die Lungen und erreichen das Leberportalsystem, wobei sie dann in den Venen und im Nervengeflecht des gastrointestinalen Trakts weiterbestehen, wo sie erwachsen werden und sich paaren, wonach das Weibchen dann näherungsweise 300 Eier pro Tag in den venösen Gefäßen ablegt.
Die Immunreaktion des Wirts auf die Parasiteneier, die sich in den Geweben festsetzen, ist die Hauptursache, die für die Verbreitung der Krankheit verantwortlich ist. In manchen Fällen entwickelt sie sich zur akuten klinischen Form mit intensiven toxikämischen Manifestationen, und bei der Mehrheit der Opfer zu einer schwächenden chronischen Krankheit mit der Möglichkeit schwerwiegender und häufig verhängnisvoller Komplikationen.
Unter den Maßnahmen zur Kontrolle der Infektion haben sich die Behandlung der Infizierten, die Kontrolle der Weichtiere, die Verbesserung der Lebensbedingungen und die Identifizierung, gefolgt von der frühen Behandlung, von Risiko-Populationen als am nachhaltigsten erwiesen, sind aber keinesfalls völlig zufriedenstellend. Nach den 70er Jahren, mit dem Aufkommen von Arzneimitteln, die in größerem Maßstab verwendbar waren, begann die spezifische Therapie in allen Programmen zur Kontrolle der Krankheit eine wesentliche Rolle zu spielen.
Das Diagnoseverfahren stellt ein ur-anfängliches Instrument für die Programme zur Kontrolle der Endemie dar. Es ist hochgradig wünschenswert, Techniken zu entwickeln, die wirksamer sind als die zur Zeit verfügbaren.
Die Diagnose der Infektion kann durch Bestätigung der Anwesenheit von Parasiteneiern in den Fäkalien oder in Urin, abhängig von der Spezies, mittels Mikroskopie durchgeführt werden. Das Kato-Katz-Verfahren (Katz, N., A. Chaves, J. Pellegrino, 1972, A simple device for quantitative stool thick smear technique in Schistosomiasis mansoni. Rev. Inst. Med. Trop. Sao Paulo. 14: 337–340) ist die Technik, die die besten Bedingungen von Effizienz, Kosten und Handhabung bietet (WHO, 1994, The Control of schistosomiasis. Technical Re port Series, 830, Genf, 86 ff.). Wenn jedoch die Menge an Eiern in den Fäkalien klein ist, wie unter den Bedingungen einer geringen Verbreitung und einer geringen Infektionsintensität, und auch wenn es notwendig ist, die Behandlung zu überwachen, ist die Empfindlichkeit des Tests an einer einzigen Fäkalienprobe vermindert, was eine größere Anzahl an Untersuchungen von Fäkalienproben notwendig macht. Selbst dann können manche Opfer nicht diagnostiziert werden und erhalten folglich keine Behandlung.
Die serologische Diagnose stellt eine Alternative zu dem parasitologischen Test dar, wobei sie nach dem letzteren die am zweithäufigsten verwendete ist. Nach diesem Verfahren werden durch Infektion mit S. mansoni erzeugte Antikörper durch solche Techniken wie die indirekte Immunofluoreszenz-Reaktion und ELISA (Festphasen-Enzymimmunoassay, Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) nachgewiesen. Diese Technik hat jedoch den Nachteil, daß sie nicht zwischen aktiver Infektion und vergangener Infektion unterscheidet. Daher wird die geringe Spezifität von Antikörpern gegen S. mansoni in Abwesenheit einer aktiven Infektion durch Kreuzreaktivität mit anderen Parasiten (Correa-Oliveira R, Dusse LMS, Viana IRC, Colley DG, Carvalho OS, Gazzinelli G 1988. Human antibody response against schistosomal antigens. Am J Trop Med Hyg 38: 348–355), durch das Vorliegen unisexueller Infektionen, durch Kontakt mit anderen Cercarien, durch die Übertragung mütterlicher Antikörper und durch das Weiterbestehen von Antikörpern nach einer erfolgreichen vorhergehenden Behandlung erklärt.
Eine weitere Alternative für die Diagnose von Schistosoma mansoni besteht im Nachweisen antigener Substanzen, die von dem Parasiten freigesetzt werden, was es erlaubt, zwischen vergangener und aktiver Infektion zu unterscheiden, und das Problem der Unspezifität der Antikörper-Diagnose beseitigt. Die Suche nach zirkulierenden Antigenen bringt jedoch andere Nachteile mit sich, wie eine geringe Empfindlichkeit für leichte Infektionen, die hohen Kosten, die Schwierigkeit der Handhabung und eine Abhängigkeit von der Erzeugung monoklonaler Antikörper (DE Jonge, N., A. L. T. Rabello, F. W. Krijger, P. G. Kremsner, R. S. Rocha, N. Katz e A. M. Deelder. 1991. Levels of Schistosome circulating anodic and cathodic antigens in serum of Schistosomiasis patients from Brazil. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 85: 756–759).
Mit dem Aufkommen der Polymerasekettenreaktion (PCR) wurde es möglich, die DNA pathogener Organismen zu amplifizieren, was es ermöglicht, daß aus winzigen Ausgangsmengen ausreichend große Mengen bis zu dem Punkt, der ihren Nachweis erlaubt, erhalten werden. Daher ist PCR als ein effizientes Verfahren zur Diagnose für die unterschiedlichsten Infektionen in Gebrauch gekommen.
Die Schrift EP 550 883 beschreibt ein Experiment, das PCR verwendet, um in Fäkalienmaterial die Anwesenheit der DNA des Einzellers G. lamblia nachzuweisen. Das Verfahren wurde unter Verwendung der Sequenz des Gens RNA 18S von G. lamblia als Ziel ausgeführt. Außerdem konstruierte der Anmelder Oligonucleotid-Primer, die zu einem Bereich auf der Zielsequenz der Ribosomen-RNA 18S von G. lamblia ausreichend komplementär waren.
Die Schrift WO 94/04681 betrifft die Entwicklung spezifischer Oligonucleotide, die als Primer der PCR für den Nachweis der DNA-Sequenz, die das Protein der Wandung von Cryptosporidium sp. kodiert, und daher als ein Kit für die Diagnose von Parasiten dieser Gattungen zu verwenden sind. Abgesehen von den oben erwähnten Beispielen ist es möglich, die Schrift WO 93/03167 zu zitieren, die eine Anmeldung eines Verfahrens zur Isolierung, Aufbewahrung und Spaltung von DNA, das in der Lage ist, sie in einer passenden Form für die Amplifizierung durch ein spezifisches sequentielles Verfahren wie PCR zu liefern, ist. Das Verfahren wird insbesondere für den Nachweis parasitischer Krankheiten, die durch Mikroorganismen mit kettenartig verknüpfter, geschlos sen-kreisförmiger Kinetoplast-DNA, wie T. cruzi, Leishmania sp., P. falciparum, P. vivax und P. malariae, verursacht werden, verwendet.
Beim Studium von Schistostoma sp. wurde PCR verwendet zur Bestimmung des Geschlechts der Cercarien (Gasser, R. B., G. Morahan e G. F. Mitchell. 1991. Sexing single larval stages of Schistosoma mansoni by polymerase chain reaction. Mol. Bioch. Parasitol. 47: 255–258), zum Klonen und Sequenzieren spezifischer Gene (Francis, P. e Q. Bickl. 1992. Cloning of a 21.7 kDa vaccine-dominant antigen gene of Schistosoma mansoni reveals an Elf Hand-like motif. Mol. Bioch. Parasitol. 50: 215–224.; Kiang, D., A. M. Karim, P. T. LoVerde. 1996. Cloning the gene encoding Schistosoma mansoni p50, an immunophilin. Gene. 170: 137–140), zur Feststellung der genetischen Populations-Variabilität von Stämmen von Schistosoma sp. (Dias Neto. E., C. P. Souza, D. Rollinson, N. Katz, and A. J. G. Simpson. 1993. The random amplification of polymorphic DNA allows the identification of strains and species of Schistosomes. Molecular and Biochemical Parasitology 57 (1): 83–88.; Simpson, A. J., E. Dias Neto, T. H. Vidigal, H. B. Pena, O. S. Carvalho e S. D. Pena. 1995. DNA polymorphism of schistosomes and their snail hosts. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 90 (2): 211–213) und bei der Entwicklung und Anwendung von Techniken zur Erzeugung von exprimierten Sequenzteilen (Expressed Sequence Tags, EST's) (Dias Neto, E., Harrop, R., Correia-Oliveira, R., Pena, S. D. J., Wilson, R. A. e Simpson, A. J. G. 1996. The schistosome genome project: RNA arbitrarily primed PCR allows the accelerated generation of expressed sequence tags. Mem. Ist. Oswaldo Cruz. 91(5): 655–657; Dias Neto, E., Harrop, R., Correa-Oliveira, R., Wilson, R. A., Pena, S. D. J. e Simpson, A. J. G. 1997. Minilibraries constructed from cDNA generated by arbitrarily primed RT-PCR: an alternative to normalized libraries for the efficient generation of ESTs from nanogram quantities of mRNA. Gene 186: 135–142). Kürzlich haben Hamburger et al. (Hamburger, J., X. Yu-Xin, R. M. Ramzy, J. Jourdane e A. Ruppel. 1998. Development and evaluation of a Polymerase Chain Reaction for monitoring Schistosoma mansoni infestation of water. Am. J. Trop. Med. Hyg. 59(3): 468–473) einen Test auf der Basis von PCR entwikkelt, um die Verseuchung von natürlichem Wasser mit S. mansoni zu überwachen.
Die in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Primer wurden auf der Basis der ursprünglich von Hamburger et al. beschriebenen Sequenz von S. mansoni, die in 1 gezeigt ist, konstruiert (Hamburger, J, Turetski, T, Kapeller, I. & Deresiewicz, R. 1991. Highly repeated short DNA sequences in the genome of Schistosoma mansoni recognized by a species-specific probe. Molecular and Biochemical Parasitology 44: 73–80). Die Konstruktion der Primer wurde nach der visuellen Inspektion der Ausgangssequenz durchgeführt, um das Vorliegen komplementärer Bereiche innerhalb jedes Starters oder zwischen beiden Primern zu vermeiden. Um die Amplifikation der abgebauten DNA-Moleküle (wie sie für freie DNA, die in Fäkalien oder Körperflüssigkeiten vorliegt, erwartet werden) zu erleichtern, wurden die Primer in einer Weise gewählt, daß sie eine kurze Sequenz amplifizierten. Auch wurden alle Stufen der vorliegenden Erfindung streng in einer Weise standardisiert, daß sie mit chemisch komplexen biologischen Proben wie Fäkalien und Serum zufriedenstellend funktionierten.
Bis zum gegenwärtigen Augenblick wurde die Verwendung von PCR als ein Verfahren zur Diagnose menschlicher Schistosomiasis niemals berichtet.
Als solches wird es offenkundig, daß die Suche nach einem schnellen und effizienten Verfahren zum Nachweis des Parasiten Schistosoma sp., das speziell brauchbar ist in Fällen niedriger Infektionsintensität, bis jetzt nicht durchführbar war. Daher wird mit dem Ziel, diese Aufgabe zu erfüllen, eine Strategie für PCR, die Primer verwendet, die komplementär zu einer spezifischen und hochgradig repetitiven Sequenz des Genoms von S. mansoni sind, angewendet.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist der Nachweis von Schistosoma sp. in biologischen Proben mittels PCR.
Eine erste Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Schistosoma, wie es in Anspruch 1 definiert ist, durch die Amplifikation einer DNA-Sequenz von Schistosoma sp. durch PCR. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist durch die folgenden Stufen gekennzeichnet:

(a) Extraktion der Schistosoma sp.-DNA aus einer biologischen Probe;
(b) Amplifizieren eines Bereichs der in Stufe (a) extrahierten Schistosoma-DNA mit spezifischen, aus der in ID SEQ Nr. 1 beschriebenen Ausgangssequenz aufgebauten Primern, wobei die Primer SEQ ID Nr.: 2 und SEQ ID Nr.: 3 aufweisen und in der Lage sind, SEQ ID Nr.: 1 und homologe Sequenzen, die S. mansoni, S. haematobium, S. japanicum, S. matthei, S. bovis und S. leipperi gemeinsam sind, zu amplifizieren;
(c) Trennen der Produkte der Amplifikationen von Stufe (b) durch Elektrophorese, gefolgt von Nachweisen unter Verwendung geeigneter Färbeverfahren.

In einer zweiten Ausführungsform betrifft die Erfindung einen beim Nachweis von Schistosoma zu verwendenden, diagnostischen Kit, wie er in Anspruch 5 definiert ist. Ein Basiskit enthält alle die Reagenzien, die zur Ausführung der PCR-Technik erforderlich sind, nämlich: spezifische Primer, Nucleotide und eine geeignete Pufferlösung für die Amplifikation durch PCR. Gewünschtenfalls kann der Kit das Enzym Taq-Polymerase in zur Amplifikation ausreichenden Mengen, als positive Kontrolle der Reaktion zu verwendende Standard-DNA, Pufferlösung der Probe, um das amplifizierte Material zur Elektrophorese herzurichten, und ein Protokoll und Anweisungshandbuch für den Benutzer enthalten.
KURZE BESCHREIBUNG DER DIAGRAMME
1: zeigt die DNA-Sequenz der repetitiven Einheit von S. mansoni. Sie zeigt, fettgedruckt, die örtliche Lage der in der vorliegenden Erfindung beschriebenen spezifischen Primer.
2: demonstriert die Empfindlichkeit der PCR beim Nachweis der S. mansoni-DNA.
3: zeigt die Kapazität der PCR-Technik der vorliegenden Erfindung zur Amplifizierung der DNA verschiedener Spezies von Schistosoma sp., einschließlich der drei Spezies von größerer klinisch-epidemiologischer Wichtigkeit in der Welt: S. mansoni, S. japanicum und S. haematobium.
4: zeigt die Spezifität der PCR der vorliegenden Erfindung.
5: veranschaulicht den Vergleich hinsichtlich Empfindlichkeit zwischen der PCR der vorliegenden Erfindung und dem parasitologischen Test für die Diagnose von S. mansoni in menschlichen Fäkalien.
6: zeigt den Nachweis von S. mansoni-DNA in Fäkalienproben infizierter Patienten mittels PCR.
7: zeigt den Nachweis von S. mansoni-DNA in Proben von menschlichem Serum mittels PCR.
GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Zur Erleichterung des Verständnisses der Erfindung sind die folgenden die ohne weiteres akzeptierten Definitionen einiger Begriffe, die in dieser Beschreibung verwendet werden:

1. Primer: einzelsträngige synthetische Oligonucleotide, die normalerweise in Paaren bei der Hybridisierung mit Strängen, die zu einem DNA-Abschnitt komplementär sind, verwendet werden. Die inneren Enden des Primer/DNA-Matrize-Komplexes werden von der DNA-Polymerase in einer PCR als Startpunkte der Synthese verwendet.
2. Polymerasekettenreaktion (PCR): Technik, die die Anwendung von Zyklen der Denaturierung, des Annealing mit dem Primer und der Extension mit einer thermisch stabilen DNA-Polymerase, z. B. der Taq-DNA-Polymerase, um eine DNA-Zielsequenz zu amplifizieren, beinhaltet. Das PCR-Verfahren zum Amplifizieren von Nucleinsäuren ist in den Schriften US 4 683 195 und US 4 683 202 beschrieben.

Eine unpassende Wahl von Primern kann verschiedene unerwünschte Wirkungen hervorrufen, wie unter anderem: die Unmöglichkeit der Amplifikation, die Amplifikation an verschiedenen Stellen, die Bildung von Primer-Dimeren, die die Amplifikationsreaktion uninformativ machen.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird erfüllt durch die Amplifikation, durch PCR, eines spezifischen Bereichs der Genome von Schistosoma sp., und spätere Trennung der Produkte dieser Amplifikation durch Elektrophorese, ge folgt von passenden Färbetechniken, die eine adäquate Sichtbarmachung der DNA in dem Gel erlauben, wozu gehören, aber ohne darauf beschränkt zu sein: Färben mit Silbersalzen, Radioisotopen und Enzymen in Kombination mit Substraten, die ihren Nachweis erlauben, ohne die oben erwähnten unerwünschten Wirkungen.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann für den Nachweis der DNA der Gattungen Schistosoma in irgendeiner biologischen Probe, die von dem Parasiten freie Zellen oder DNA mit ausreichender Unversehrtheit, um durch PCR amplifiziert zu werden, enthält, verwendet werden. Manche Proben, wie Fäkalien und Urin, müssen irgendeiner Art von Behandlung unterzogen werden, so daß die Membranen oder Hüllen, die möglicherweise die DNA in der Zelle des Parasiten einschließen können, zerrissen werden können, wobei sie die DNA in die Lösung freisetzen. Andere Proben, z. B. das Serum infizierter Menschen, enthalten bereits die freien Moleküle und brauchen keine derartige Behandlung. Im allgemeinen können die Membranen durch die Verwendung spezieller chemischer Substanzen wie Detergentien und chaotroper Salze, oder durch Anwendung physikalischer und mechanischer Verfahren, wie induziertem osmotischem Druck und Beschallung, zerrissen werden. Nach dem Zerreißen der Zellmembranen muß die DNA von den anderen Zellmolekülen isoliert werden, was ebenfalls durch physikalisch-chemische Verfahren, wie durch Ausfällung mit Ethanol oder unter Verwendung von Silica-Matrizes, durchgeführt werden kann.
Sobald sie sich frei in der Lösung befindet, kann die DNA nach Amplifikation durch PCR in der Probe nachgewiesen werden. Die DNA muß bevorzugt unter Verwendung von Standardtechniken zur Entfernung eventueller Substanzen, die die Amplifikationsreaktion hemmen, gereinigt werden.
Nach der Extraktion wird die DNA mittels Polymerasekettenreaktion selektiv amplifiziert. Durch die PCR wird eine spezifische Sequenz des Schistosoma sp.-Genoms millionenfach selektiv kopiert, was den Nachweis der Parasiten-DNA erlaubt. Die Reaktion ist ein sequentielles Verfahren, das mindestens zwei Primer erfordert, kleine zu der Parasiten-DNA komplementäre DNA-Sequenzen, die enzymatisch verlängert werden, wobei sie eine getreue Kopie dieser DNA ergeben. Bei Zugabe großer Mengen an Primern, zusammen mit anderen notwendigen Reagenzien, werden Millionen von Kopien der Parasiten-DNA erhalten. Die hier verwendeten PCR-Primer wurden auf der Basis der hochgradig repetitiven Ausgangssequenz des S. mansoni-Genoms, wie sie in ID SEQ Nr. 1 beschrieben ist und auch in 1 veranschaulicht ist, speziell für diese Erfindung konstruiert. Es versteht sich, daß andere Primer aufgebaut werden können, die Nucleotidsequenzen haben, die ID SEQ Nr. 2 und ID SEQ Nr. 3 enthalten.
Jeder Primer des Paares ist bevorzugt in einer Weise aufgebaut, daß er im wesentlichen komplementär zu einem unterschiedlichen Strang der Sequenz, die die spezifische Sequenz des Schistosoma sp.-Genoms, die amplifiziert werden soll, flankiert, ist. Daher ist ein Primer jedes Paares ausreichend komplementär, um in der Lage zu sein, mit einem Teil der Sequenz sinnig (in the sense) zu hybridisieren, und der andere Primer jedes Paares ist auch ausreichend komplementär, um mit einem unterschiedlichen Teil derselben Sequenz gegensinnig (in the antisense) zu hybridisieren. Obwohl die Sequenz des Primers nicht notwendigerweise die genaue Sequenz der Matrize wiederzuspiegeln braucht, ist die Verknüpfung während des Paarungsstadiums der Polymerasekettenreaktion um so besser, je näher die 3'-terminale Sequenz der genauen Sequenz kommt.
Die Primer können durch irgendein geeignetes Verfahren, das Fachleuten auf dem Gebiet bekannt ist, hergestellt werden, und es umfaßt beispielsweise Klonen und Verdau geeigneter Sequenzen und direkte chemische Synthese.
Das Produkt der durch PCR geförderten Amplifikation ist ein Fragment oder eine Reihe von DNA-Fragmenten unterschiedlicher Größen, die durch Elektrophorese getrennt werden können, gefolgt von geeigneten Färbetechniken, die eine geeignete Sichtbarmachung der DNA in dem Gel erlauben. Wegen der großen Spezifität der PCR kann die amplifizierte DNA des Parasiten von den anderen Produkten der Amplifikation auf der Basis ihrer spezifischen Größe unterschieden werden. Auf diese Weise kann das Vorliegen oder Fehlen der Infektion in den meisten Fällen einfach durch visuelle Analyse der amplifizierten Produkte, deshalb dadurch, ob das Fragment mit einem dem Fragment des Parasiten entsprechenden Gewicht vorhanden ist oder nicht, bestimmt werden. Bei der vorliegenden Erfindung wird die PCR verwendet, um ein spezifisches DNA-Fragment, das ursprünglich in S. mansoni beschrieben wurde, zu amplifizieren und sichtbar zu machen, und auch um spezifische Bereiche anderer Schistosoma-Spezies zu amplifizieren, was zu dem Schluß führt, daß der repetitive und spezifische Bereich der DNA, der ursprünglich in S. mansoni verifiziert wurde und in ID SEQ Nr. 1 beschrieben ist, allen anderen Spezies von Schistosoma gemeinsam ist.
Die Amplifikation des spezifischen Bereichs der Genome von Schistosoma sp. wird durch PCR durchgeführt, mit den Primern, die speziell aufgebaut wurden, um in der vorliegenden Erfindung verwendet zu werden und die in Tabelle 1 definiert sind, die in der Lage sind, die Sequenz von S. mansoni oder homologe Sequenzen anderer Spezies von Schistosoma zu amplifizieren.
Tabelle 1: In der Reaktion durch PCR für die Amplifikation des hochgradig repetitiven Bereichs des Genoms von Schistosoma sp. verwendete Primer
Der Kit der vorliegenden Erfindung enthält alle Reagenzien, die notwendig sind, um den Nachweis irgendeiner durch Darmwürmer der Gattungen Schistosoma verursachten Infektion zu erlauben. Der Kit, wie er durch Anspruch 5 definiert wird, weist spezifische Primer für einen spezifischen Bereich des Genoms von Schistosoma sp. auf, wie sie in Tabelle 1 gezeigt sind, und außerdem werden bevorzugt auch Reagenzien und Zusatzstoffe, die normalerweise in der PCR-Technik verwendet werden, geliefert, z. B. geeignete Nucleotide wie dGTP (Desoxyguanidin-triphosphat), dATP (Desoxyadenosin-triphosphat), dCTP (Desoxycytidin-triphosphat) und dTTP (Desoxytymidin-triphosphat); eine geeignete Pufferlösung (z. B. 10 bis 20 mM Tris-HCl, 50 bis 60 mM KCl, 1,5 bis 2,0 mM MgCl₂, pH 8,0 bis 8,5); Taq-DNA-Polymerase. Eine bestimmte Menge an DNA, die als eine positive Kontrolle der Reaktion zu verwenden ist, wird ebenfalls geliefert, zusammen mit einem Anweisungshandbuch, das das in dem Test zu verwendende Protokoll mit einem veranschaulichenden Diagramm der zu erwartenden Ergebnisse enthält.
Die vorliegende Erfindung wird durch Bezugnahme auf die folgenden Beispiele detailliert beschrieben. Es versteht sich, daß die vorliegende Erfindung nicht auf diese Beispiele beschränkt ist, sondern auch Variationen und Modifikationen innerhalb des Umfangs der Ansprüche umfaßt.
BEISPIEL 1
Zerreißen der Eier von S. mansoni
Die Eier von S. mansoni wurden aus den Lebern von Mäusen, die vorher mit 100 Cercarien infiziert worden waren, extrahiert und in 0,9%-iger Kochsalzlösung bei –20°C bis zur Verwendung aufbewahrt (Pellegrino e Siqueira, 1956, Rev. Bras. Malar. 8: 589). Zum Zerreißen der Eier wurden 10 μl der Kochsalzlösung, die 100.000 Eier/ml enthielt, mit 90 μl destilliertem Wasser gemischt, und die endgültige Lösung wurde in einem mechanischen Mischer einer 5-minütigen Bewegung unterzogen. Dieses zerrissene Eier enthaltende Gemisch wurde direkt bei der Extraktion der DNA verwendet.
BEISPIEL 2
Extraktion von DNA durch eine Abwandlung des Steiner-Verfahrens (Steiner, J. J., C. J. Poklemba, R. G. Fjellstrom and L. F. Elliott. 1995. A rapid one-tube genomic DNA extraction process for PCR and RAPD analyses. Nucleic Acids res. 23 (13): 2569–2570)
100 μl der Lösung mit zerrissenen Eiern wurden in 200 μl Puffer, der 10 mM Tris-Base, pH 8,0; 270 mM EDTA, pH 8,0; 1% Natrium-dodecylsulfat (SDS); 1% Polyvinylpolypyrrolidon (PVPP) enthielt, verdünnt. Dieses Gemisch wurde bei 95°C 20 Minuten lang inkubiert, mit einer schnellen manuellen Bewegung nach den ersten 10 Minuten Inkubation, und dann 10 Minuten lang bei 8.000 g bei Raumtemperatur zentrifugiert. Die in dem Schaum enthaltene DNA wurde mit Ethanol ausgefällt, der Schaum wurde entfernt, und der Niederschlag wurde zur Verdampfung des verbleibenden Alkohols 15 Minuten lang bei 37°C inkubiert und später in Puffer T. E. (10 mM Tris, pH 8,0; 1 mM EDTA, pH 8,0) wieder in Suspension gebracht. Die DNA wurde dann durch Ablesung der optischen Dichte bei 260 nm quantitativ bestimmt und bis zur Verwendung in der PCR bei –20°C aufbewahrt.
BEISPIEL 3
Amplifikation durch Polymerasekettenreaktion unter Verwendung der in Tabelle 1 gezeigten, spezifischen Primer
In Kürze, es wurde 1 μl extrahierter DNA der Amplifikation in einem Reaktionsrohr unterzogen, das PCR-Puffer (20 mM Tris HCl, pH 8,0, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂), 200 μM dNTPs (Deoxynucleotide), 0,5 μM jedes Primers und 0,75 Einheiten Taq-Polymerase-Enzym in einem Gesamtvolumen von 10 μl enthielt. Die Amplifikationsreaktion beinhaltete die Denaturierung der doppelsträngigen Parasiten-DNA bei 95°C für 45 Sekunden und das Primer-Annealing bei 63°C für 30 Sekunden. Diese zwei Schritte wurden sequentiell in 35 aufeinanderfolgenden Zyklen wiederholt. In dem ersten Zyklus wurde der Denaturierungsschritt 5 Minuten verlängert, um eine vollständige Denaturierung sicherzustellen, und in dem letzten Zyklus wurde ein zusätzlicher Schritt, bei 72°C für 2 Minuten, miteinbegriffen, um die Verlängerung der verbleibenden hybridisierten Primer abzuschließen.
2 zeigt das von der Amplifikation der DNA von S. mansoni erhaltene Elektrophoresemuster und auch die für den Nachweis dieser DNA erhaltene maximale Empfindlichkeit. In Bahn M ist der Molekulargewichts-Marker; in den Bahnen 1 bis 5: 20, 10, 5, 1 bzw. 0,5 fg DNA. Die Reaktion mittels PCR war in der Lage, bis hinunter zu 1 fg S. mansoni-DNA nachzuweisen. 3 zeigt das Elektrophoresemuster, das nach der Amplifikation der DNA von 5 anderen Spezies der Gattung Schistosoma, amplifiziert mit denselben Primern und unter denselben PCR-Bedingungen, wie sie für S. mansoni verwendet wurden, erhalten wurde. Bahn M: Molekulargewichts-Marker; Bahn 1: DNA von S. man soni; Bahn 2: S. haematobium; Bahn 3: S. japanicum (Stamm von den Philippinen); Bahn 4: S. japanicum (Stamm aus Japan); Bahn 5: S. matthei; Bahn 6: S. bovis; Bahn 7: S. leipperi; Bahn 8: negative Kontrolle. Die PCR-Reaktion war in der Lage, die DNA aller getesteten Spezies von Schistosoma sp. zu amplifizieren. 4 zeigt den Versuch, die DNA von Würmern anderer Gattungen zu amplifizieren, ebenfalls unter denselben Bedingungen, die für S. mansoni verwendet wurden. Bahn M: Molekulargewichts-Marker; Bahn 1: positive Kontrolle (DNA von S. mansoni); Bahn 2: Ascaris lumbricoides; Bahn 3: Ancilostoma duodenales; Bahn 4: Taenia solium; Bahn 5: Trichiuris trichiuria. Kein Amplifikationsprodukt kann sichtbar gemacht werden bei Verwendung der DNA von Würmern anderer Gattungen. Die in dieser Erfindung beschriebene PCR ist daher spezifisch für die Schistosoma-Gattungen.
BEISPIEL 4
Nachweis der S. mansoni-DNA in Fäkalienproben von Patienten
Bei diesen Experimenten wurden die in den infizierten Fäkalien (natürlich oder künstlich) enthaltenen Eier auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise zerrissen. Die DNA wurde dann mittels derselben Technik, die für die Extraktion von DNA von reinen S. mansoni-Eiern verwendet wurde (Beispiel 2), aus den Fäkalien extrahiert.
Nach der Extraktion wurde 1 μl der S. mansoni (100-fach verdünnt) mit denselben Primern und unter denselben Bedingungen, die in Beispiel 3 beschrieben sind, amplifiziert. 5 zeigt die Produkte der Amplifikation der S. mansoni-DNA in Fäkalien, die künstlich mit den Eiern des Parasiten infiziert worden waren. In Kürze, es wurden 100 mg einer Fäkalienprobe eines Patienten, die 216 Eier/g enthielt, 900 mg negativen Fäkalien zugemischt, wobei eine Probe mit einer erwarteten Konzentration von näherungsweise 20 Eiern/g gebildet wurde.
Dieses Verfahren wurde zwei weitere Male wiederholt, was Fäkalienproben mit, näherungsweise, 2 und 0,20 Eiern/g hervorbrachte. Eine Teilmenge jeder Probe wurde dann der Analyse nach dem Kato-Katz-Verfahren und dem Nachweis der Parasiten-DNA mittels der PCR der Erfindung unterzogen mit dem Ziel, die Empfindlichkeit der beiden Verfahren zu vergleichen. In Bahn M ist der Molekulargewichts-Marker; Bahn 1: positive Kontrolle (0,1 ng DNA von S. mansoni-Eiern); Bahnen 2 bis 5: amplifizierte DNA von Proben, die 200, 48, 4,8 bzw. 0,48 Eier/Gramm Fäkalien enthielten. Die PCR war in der Lage, die DNA von S. mansoni bis hinunter zu der Probe, die näherungsweise 4,8 Eier/Gramm enthielt, nachzuweisen, während die Empfindlichkeit des Kato-Katz-Verfahrens 48 Eier/Gramm, daher 10-mal niedriger, war.
6 zeigt das Ergebnis der Amplifikation der S. mansoni-DNA in Fäkalien von Patienten mit verschiedenen Konzentrationen an Parasiten, die vorab durch das Kato-Katz-Verfahren bestimmt worden waren. Bahn M: Molekulargewichts-Marker; Bahn 1: positive Kontrolle; Bahnen 2 bis 9: Proben menschlicher Fäkalien, die 0,96; 0,168; 432; 600; 96,912 bzw. 72 Eier/Gramm enthielten. Das Ergebnis der PCR stimmte für alle Proben mit dem durch den parasitologischen Test erhaltenen überein.
BEISPIEL 5
Nachweis von S. mansoni im Serum von Patienten
Die DNA von vier Serum-Proben wurde unter Verwendung von 100 μl/Probe gereinigt, wobei das Glass-max^® DNA isolation spin cartridge system (Life Technologies) nach den Anweisungen des Herstellers benutzt wurde. 2 μl dieser DNA wurden dann unter denselben Bedingungen, wie oben beschrieben, bei der Amplifikation durch PCR verwendet. Es wurde das Serum von Perso nen, das vorher durch das Kato-Katz-Verfahren untersucht worden war, verwendet, wobei es zwei positive und zwei negative Proben gab.
7 zeigt das Ergebnis dieser Amplifikation. In Bahn M ist der Molekulargewichts-Marker; Bahn 1: positive Kontrolle; Bahnen 2 bis 5: Serum von Personen, das 0; 96; 0 bzw. 216 Eier/Gramm Fäkalien enthielt.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zum Nachweis von Parasiten der Gattung Schistosoma in einer biologischen Probe, dadurch gekennzeichnet, dass ein spezifischer Bereich der DNA der Gattung Schistosoma, wie er in SEQ ID NO. 1 beschrieben ist, nachgewiesen wird, wobei das Verfahren folgende Schritte aufweist: a) Extraktion von Schistosoma sp.-DNA aus einer biologischen Probe; b) Amplifikation durch PCR eines in Schritt (a) erhaltenen spezifischen Bereichs der Schistosoma sp.-DNA mit SEQ ID NO. 2 und SEQ ID NO. 3 aufweisenden Oligonucleotid-Primern, die geeignet sind für PCR und in der Lage sind, SEQ ID NO. 1 und homologe Sequenzen, die S. mansoni, S. haematobium, S. japanicum, S. matthei, S. bovis und S. leipperi gemeinsam sind, zu amplifizieren; c) Trennung der in Schritt (b) erhaltenen PCR-Produkte durch Elektrophorese, gefolgt von Sichtbarmachung.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die amplifizierten Produkte aus Schritt b) durch Elektrophorese in einem Polyacrylamidgel getrennt werden und durch Färben mit Silbersalzen oder anderen Visualisierungssystemen sichtbar gemacht werden.
Oligonucleotid-Primer, der geeignet ist für PCR, für die Amplifikation von Schistosoma sp.-DNA, der SEQ ID NO. 2 oder SEQ ID NO. 3 aufweist und in der Lage ist, SEQ ID NO. 1 und homologe Sequenzen, die S. mansoni, S. hae matobium, S. japanicum, S. matthei, S. bovis und S. leipperi gemeinsam sind, zu amplifizieren.
Oligonucleotid-Primer nach Anspruch 3, bestehend aus SEQ ID NO. 2 oder SEQ ID NO. 3.
Kit zur Verwendung für die Diagnose einer Infektion mit Schistosoma sp. in einer biologischen Probe, wobei der Kit SEQ ID NO. 2 und SEQ ID NO. 3 aufweisende Oligonucleotid-Primer, die geeignet sind für PCR und in der Lage sind, SEQ ID NO. 1 und homologe Sequenzen, die S. mansoni, S. haematobium, S. japanicum, S. matthei, S. bovis und S. leipperi gemeinsam sind, zu amplifizieren, und alle notwendigen Reagenzien zur Durchführung von PCR aufweist.