JP4974432B2 - Ｐｃｒ法によって住血吸虫症を検出するための方法及びそのキット - Google Patents
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Description
【０００１】
（発明の技術分野）
本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法によって、ヒトの試料において住血吸虫症の診断を行う方法及びそのキットに関連する。この方法は、寄生虫DNAの検出に基づいており、感染の程度が弱く寄生虫学的な検便（Kato-Katz）によって殆ど感度を示さないような場合に特に有用である。
【０００２】
（発明の背景）
住血吸虫症は、住血吸虫属の寄生虫の感染によって起こる。その主な住血吸虫の種類は、マンソン住血吸虫、日本住血吸虫、ビルハルツ住血吸虫である。この疾患は、４０００年前から存在していたという記録があり、未だに未開発国では２億人以上もの人々が感染し、公衆衛生にとって重要な問題である。マンソン住血吸虫種は、南アメリカ及びカリブ海域、アフリカ、東部地中海地域の５４カ国に存在し、風土病を起こしている。
【０００３】
このような二生類吸虫である蠕虫は、その幼虫期のセルカリアがヒトの皮膚から侵入してヒトに感染する。セルカリアは、それらの中間宿主である様々な軟体動物種によって水中で取り除くことができる。マンソン住血吸虫の幼虫は、皮膚から侵入した後、肺に移行してから肝門脈系に達し、更に胃腸管の血管及び神経叢に至ってそこで生存し、成虫になって交尾し、メスが１日に約３００個の卵を静脈内に産み付ける。
【０００４】
後に組織に寄生する、寄生虫の卵に対する宿主の免疫反応が、疾患が拡散する主な原因である。或る場合には、激しい毒血症による急性症状に発展し、感染者の大多数が、致命的となる可能性の高い合併症を伴う慢性疾患に罹る。
【０００５】
感染を制御する方法の中で、感染者の治療、軟体動物の抑制、生活条件の改善、及びその後に感染リスクのある集団の初期治療を行う疾患の同定は最も支持できる手段であるが、完全に満足できるというものではない。１９７０年代以降、大量に使用可能な薬剤が出現し、特定の治療法が、疾患を制御するためのすべてのプログラムにおいて極めて重要な役割を果たすようになってきた。
【０００６】
診断方法には、この風土病を抑制するために始原的な機器を用いている。現在用いられている技術より効率的な技術の開発が待ち望まれている。
【０００７】
この感染症は、種類によるが大便または尿に含まれている寄生虫の卵を顕微鏡で検査して診断することができる。Kato-Katz 法 (KATZ, N., A. Chaves, J. Pellegrino, 1972, A simple device for quantitative stool thick smear technique in Schistosomiasis mansoni. Rev. Inst. Med. Trop. Sao Paulo. 14: 337-340)は、効率及びコスト、操作性の点において最も優れた方法である(WHO, 1994, The Control of schistosomiasis. Technical Report Series, 830, Geneva, 86pp.)。しかしながら、浸透及び感染の程度が低く大便に含まれている寄生虫の卵の量が少量の場合、または治療をモニタリングする必要性がある場合、１つの大便試料における検査の感度が低いと、大便のサンプルの検査回数を相当増やさなければならなくなる。たとえ検査回数を増やしても、発見できない可能性があり、そのような場合は感染の治療を受けないことになる。
【０００８】
血清学的な診断は、寄生虫学的検査に替わるものであり、近年では二番目に広く利用されている。この方法では、マンソン住血吸虫の感染によって産生される抗体を、間接的な蛍光抗体法やELISA (酵素結合免疫吸着検定法：Enzyme Linked IminunoSorbent Assay)などの技術を用いて検出する。しかしながら、この技術は、過去の感染と現在進行中の感染とを見分けることができないと言う欠点がある。従って、現在感染していない場合にマンソン住血吸虫に対する特異性が低いということは、他の寄生虫との交差反応性(Correa-Oliveira R, Dusse LMS, Viana IRC, Colley DG, Carvalho OS, Gazzinelli G 1988. Human antibody response against schistosomal antigens. Am J Trop Med Hyg 38: 348-355)、単性との感染、他のセルカリアとの接触、移行抗体の移行、及び前回の成功した治療の後の残存抗体によって説明がつく。
【０００９】
マンソン住血吸虫の他の診断方法は、寄生虫が放出する抗原性の物質を検出することで、過去と現在の感染の違いを識別することができ、抗体診断の過去と現在の感染を識別できないという問題を解決できる。しかしながら、循環する抗原の探索は、軽度の感染に対して感度が低い、コストが嵩む、操作性、モノクローナル抗体の生産へ依存するなどの問題点がある（DE Jonge,N., A.L.T.Rabello, F.W.Krijger, P.G.Kremsner, R.S.Rocha, N.Katz e A.M.Deelder.1991. Levels of Schistosome circulating anodic and cathodic antigens in serum of Schistosomiasis patients from Brazil. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg.85:756-759）。
【００１０】
PCR法が開発され、病原微生物のDNAを増幅することが可能となり、開始時の微量のDNAから検出が十分に可能な量のDNAを得ることができるようになった。従って、PCR法は、極めて多様な感染に対する効果的な診断方法として用いられるようになった。
【００１１】
EP 550 883には、PCR法を用いて大便に含まれているランブル鞭毛虫という原虫のDNAの存在を検出する実験が記載されている。この実験は、標的としてランブル鞭毛虫の遺伝子RNA 18Sの配列を用いて実施した。更に、出願人は、ランブル鞭毛虫のリボソームRNA 18Sの標的配列の或る領域に十分に相同なオリゴヌクレオチドプライマーの設計を行った。
【００１２】
国際出願WO 94/04681には、クリプトスポリジウム(Cryptosporidium sp)の壁の一部をコードするDNA配列を検出するためのPCR法のプライマー、即ち同属の寄生虫の診断キットのプライマーとして用いるべく、特殊なオリゴヌクレオチドの作製方法が開示されている。上記の例とは別に、PCR法などの特定の連続的なプロセスによる増幅に用いることができるように、DNAを単離、切断、及び貯蔵する方法を開示した国際出願WO 93/03167を引用することができる。この方法は、特に、クルーズトリパノソーマ及びLeishmania sp、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、P. malariaeなどの連鎖状の閉環状キネトプラストDNAを有する微生物による寄生虫疾患を検出するために用いられる。
【００１３】
スピンダレ住血吸虫の研究では、スピンダレ住血吸虫株における集団的な遺伝子変異の可能性を確かめるべく(Dias Neto, E.., C. P. Souza, D. Rollinson, N. Katz, and A. J. G. Simpson. 1993. The random amplification of polymorphic DNA allows the identification of strains and species of Schistosomes. Molecular and Biochemical Parasitology 57 (1): 83-88.; Simpson,.A.J., E.Dias Neto, T.H.Vicligal, H.E.Pena, O.S.Carvalho e S.D.Pena.1995. DNA polymorphism of schistosomes and their snail hosts. Mern. Inst. Oswaldo Cruz.90(2):211-2l3.)、特定の遺伝子のクローニング及びシークエンシングにおいて(Francis, P. e Q. Bickl.1992. Cloning of a 21.7 kDa vaccine-dominant antigen gene of Schistosoma mansoni reveals an Elf Hand-like motif. Mol. Bioch. Parasitol. 50:215-224.; Kiang, D., A.M.Karim, P.T. LoVerde.1996. Cloning the gene encoding Schistosoma mansoni p50, an immunophilin. Gene. 170:137-140)、及び発現遺伝子断片（ESTとも呼ぶ）を作製する技術の開発及び適用において(Dias Neto, E., Harrop,R., Correia-Oliveira,R., Pena,S.D.J., Wilson,R.A. e Simpson,A.J.G.1996. The schistosome genome project: RNA arbitrarily primed PCR allows the accelerated generation of expressed sequence tags. Mem. Ist. Oswaldo Cruz. 91(5) :655-657;Dias Neto,E., Harrop,.R., Correa- Oliveira,R., Wilson,R.A., Pena, S.D.J. e Simpson, A.J.G. 1997. Minilibraries constructed from cDNA generated by arbitrarily primed RT-PCR: an alternative to normalized libraries for the efficient generation of ESTs from nanogram quantities of mRNA. Gene 186: 135-142)、PCR法を用いてカルカリアの雌雄を決定した(Gasser, R.B., G.Morahan e G.F.Mitchell.1991. Sexing single larval stages of Schistosoma mansoni by polirnerase chain reaction. Mol. Bioch. Parasitol. 47:255-258)。近年、Hamburger他 (Hamburger,J., X.Yu-Xin,R.M.Ramzy, J.Jourdane e A.Ruppel.1998.Deve.lopment and evaluation of a Polymerase Chain Reaction for monitoring Schistosoma mansoni infestation of water. Am. J. Trap. Med. Hyg.59(3):468-473)が、天然水へのマンソン住血吸虫のインフェステーションをモニタリングするPCR系の検査を開発した。
【００１４】
図１に示す本発明のプライマーは、Hamburger他(Hamburguer, J, Turetski, T, Kapeller, I & Deresiewicz, R. 1991. Highly repeated short DNA sequences in the genome of Schistosoma mansoni recognized by a species-specific probe. Molecular and Biochemical Parasitology 44: 73-80)によって開示されたマンソン住血吸虫の配列に基づいて設計した。各イニシエーター内の相補的な領域或いは両プライマー間に相補的な領域が含まれないようにするために、元となる配列を目視検査した後このプライマーの設計を行った。変性したDNA分子の増幅を容易にするべく（大便若しくは体液に遊離DNAが存在すると予想されるため）、短い配列を増幅できるようにプライマーを選択した。また、大便や血清などの化学的に複雑な生体試料と十分に作用するように、本発明の全てのステップは厳密に標準化した。
【００１５】
現在に至るまで、PCR法を用いたヒト住血吸虫の診断方法は存在しない。
【００１６】
従って、特に感染の程度が弱い場合に有用な、スピンダレ住血吸虫という寄生虫を迅速かつ効率的に検出する方法が、未だに実施されていないことは明らかである。従って、この目的を達成するために、マンソン住血吸虫遺伝子の或る特定の高度反復配列に相補的なプライマーを用いるPCR法を利用する。
【００１７】
（発明の要約）
本発明の目的は、生体試料において、PCR法によってスピンダレ住血吸虫を検出することである。
【００１８】
本発明の第一実施例は、PCR法でスピンダレ住血吸虫のDNA配列を増幅して住血吸虫症を診断する方法に関する。本発明のこの方法は、
（ａ）検査する試料を準備するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で得た試料からスピンダレ住血吸虫のDNAを抽出するステップと、
（ｃ）SEQ ID NO:1に示されている配列から作製した特異的プライマーでステップ（ｂ）で抽出したスピンダレ住血吸虫のDNAの或る領域を増幅するステップと、
（ｄ）電気泳動法によって、ステップ（ｃ）で増幅した生成物を分離してから、好適な染色法によって検出するステップとを含むことを特徴とする。
【００１９】
本発明の第二実施例は、住血吸虫の検出に用いられる診断キットに関連する。基本キットには、PCR法を実行するために必要な全ての試薬、即ち、PCR増幅用の特異的プライマー及びヌクレオチド、好適な緩衝液が含まれる。増幅に十分な量のTaqポリメラーゼ、反応の陽性のコントロールとして用いられる標準DNA、電気泳動法に用いるPCR産物を用意するための試料の緩衝液、ユーザー用のプロトコル及び取扱説明書を自由選択としてキットに含めることができる。
【００２０】
（本発明の詳細な説明）
本発明を容易に理解できるように、本明細書に用いる用語の容易な定義を以下に記載する。
【００２１】
「プライマー」とは、或るDNA部分と相補的な鎖を有する、通常はハイブリダイゼーションにおい一対で用いられる、一本鎖合成オリゴヌクレオチドである。プライマー／DNA鋳型複合体の内側端部が、PCR法の合成開始点となり、DNAポリメラーゼによって合成される。
【００２２】
「ポリメラーゼ連鎖反応法（PCR法）」とは、変性ステップTと、プライマーとのアニーリングステップと、耐熱性DNAポリメラーセ（例えば、Taq DNAポリメラーゼ）による伸長ステップのサイクルを繰り返して、DNAの標的配列を増幅する技術である。ヌクレオチドを増幅するPCR法は、米国特許第4,683,195号及び第4,683,202号に記載されている。
【００２３】
不適切なプライマーを用いると、様々な部位での増幅やプライマーダイマーの生成されたり、または増幅が不可能になったり、さらには情報価値のない増幅反応を起こすなどの種々の好ましくない結果を招く恐れがある。
【００２４】
本発明の目的は、スピンダレ住血吸虫のゲノムの或る特定の領域のPCR法による増幅、それに続く電気泳動による増幅された生成物（PCR産物）の分離、更に、以下に限定するものではないが、上述した不都合を生じさせない、銀塩や放射性同位元素による染色、またはそれらの検出を可能にする基質と結合した酵素による染色を含む、ゲル中のDNAを十分に可視化することができる好適な染色技術によって達成することができる。
【００２５】
本発明の方法を用いて、PCR法によって増幅が十分に可能である完全な、寄生虫から遊離した細胞若しくはDNAを含む任意の生物試料において、住血吸虫属のDNAを検出することが可能である。大便や尿などの試料は、寄生虫の細胞のDNAを最終的には囲んでしまう膜やエンベロープを破裂させて、溶液中にDNAを放出させるある種の処理を施す必要がある。ところが、感染した患者の血清などの試料は、すでに遊離分子を含んでいるためそのような処理は必要ない。一般に膜は、特殊な化学物質、例えば界面活性剤やカオトロピック塩などを用いるか、或いは人工の浸透圧や音波破砕などの物理的及び機械的な方法によって破壊することができる。細胞膜を破裂させた後、DNAを別の細胞分子から単離しなければならない。これは、エタノールによる沈殿やシリカマトリックス使用などの物理化学的な方法によって行うことができる。
【００２６】
DNAを溶液に遊離させPCR法で増幅した後、試料におけるそのDNAを検出することができる。そのDNAは、増幅反応を阻害する可能性のある物質を除去するべく、標準的な技術を用いて選択的に精製しなければならない。
【００２７】
抽出後、そのDNAを選択的にPCR法で増幅する。スピンダレ住血吸虫のゲノムのある特定の配列をPCR法で選択的に数百万回複製して、その寄生虫のDNAを検出できるようにする。この反応は連続的なプロセスであり、少なくとも２種類のプライマーと、その寄生虫のDNAと相補的なDNAの短い配列とが必要である。この短い配列は、酵素的に伸長されてこのDNAの完全な複製となる。大量のプライマーを他の必要な試薬と共に加え、この寄生虫DNAの数百万の複製を作製する。本発明に用いるPCR用のプライマーは、SEQ ID NO:1及び図１に示されているマンソン住血吸虫のゲノムの高度反復配列に基づいて特別に設計する。SEQ ID NO:2及びSEQ ID NO:3に対して機能的に等価なヌクレオチド配列を有する別のプライマーも作製できることを理解されたい。配列が同一でないにもかかわらず、対応する生体高分子が使用や目的の点で機能的に同一の役割を果たす場合に、その配列を「等価」と呼ぶ。この等価配列は、ヌクレオチドの置換及び／または欠失及び／または挿入、及び／または配列の一端における配列の伸長及び／または短縮などの偶発或いは誘導による配列の任意の改変などから生じ得る。自然によっては生じない配列の改変は、遺伝子組み換え技術で行うことができる。ある一対の各プライマーは、スピンダレ住血吸虫のゲノムの増幅されるある特定の領域に隣接する配列の他方の一本鎖に実質的に相補的となるように選択的に作製される。従って、各対の一方のプライマーは、配列のセンス鎖の一部と十分に相補的でハイブリダイズ可能であり、他方のプライマーは、同一配列のアンチセンス鎖の別の一部と十分に相補的でハイブリダイズ可能である。プライマーの配列は、鋳型配列と鏡像である必要はないが、プライマー配列が鋳型配列の３'末端の配列に近づけば近づくほど、PCR法におけるプライマー付加時の結合が容易になる。
【００２８】
プライマーの作製は、当分野で周知の任意の好適な方法、例えば、好適な配列のクローニング及び消化、または化学合成によって行うことができる。
【００２９】
PCR法によって増幅される生成物は、様々な大きさの単独、または一連のDNA断片である。これらのDNA断片を電気泳動法によって分離し、ゲル内のDNAを十分に視認できるように好適な染色技術によって染色する。PCR法は特異性が高いため、増幅された寄生虫のDNAは、その特定の大きさに基づいて、増幅された別の生成物と分離することができる。この方法では、感染の有無は、大抵の場合単純に増幅された生成物の視覚的な検査、即ち、その寄生虫のDNA断片に相当する分子量の断片の有無によって検査することができる。本発明では、PCR法を用いて、マンソン住血吸虫の同定されたDNAの或る特定の断片と、別の種の住血吸虫のある特定の領域とを増幅して可視化し、SEQ ID NO:1に示され、同定されたマンソン住血吸虫のDNAの反復及び特定の領域が他の種類の住血吸虫のある特定の領域と共通であることがわかった。
【００３０】
スピンダレ住血吸虫のゲノムのその特定領域の増幅は、本発明で使用するために特別に作製した表１に示すプライマー、若しくはそれと等価のプライマーを用いるPCR法を利用するため、マンソン住血吸虫の配列やその他の住血吸虫種の相同な配列の増幅を行うことができる。
【００３１】
スピンダレ住血吸虫のゲノムの高度反復領域のPCR法による増幅に用いたプライマーの配列を以下の表１に示す。
【００３２】
【表１】
【００３３】
本発明のキットには、住血吸虫属の蠕虫の感染を検出するのに必要なすべての試薬が含まれている。このキットには、表１に示されているスピンダレ住血吸虫のゲノムのある特定の領域に対して特異的なプライマー、或いはその等価配列と、PCR技術に通常用いられる試薬や添加剤、例えば４種のデオキシヌクレオチド三リン酸（dGTP及びdATP、dCTP、dTTP)や好適な緩衝液(例えば、10〜20 mM Tris-HCl、50〜60 mM KCl、1.5〜2.0 mM MgCl2、pH 8.0〜8.5)、及びTaq DNAポリメラーゼが含まれるのが好ましい。また、反応液の陽性のコントロールとして用いられる一定量のDNAや検査に用いられるプロトコル、並びに予想される結果を例示する表が含まれる。
【００３４】
以下に記載する実施例を用いて本発明の詳細を説明する。本発明は、以下の実施例に限定されるものではなく、本発明の範囲内で様々な改変が可能であることを理解されたい。
【００３５】
実施例１
マンソン住血吸虫の卵を破裂させる
１００匹のセルカリアで予め感染させたマウスの肝から、マンソン住血吸虫の卵を抽出し、使用するまで０.９％の食塩水に−２０℃で保存した(Pellegrino e Siqueira, 1956, Rev. Bras. Malar. 8: 589)。卵を破裂させるために、１ｍｌ当たり１００.０００個の卵を含む１０μｌの食塩水を９０μｌの蒸留水で混合し、その混合液をメカニカルミキサーで５分間撹拌した。破裂した卵を含む混合液を直接用いてDNAを抽出した。
【００３６】
実施例２
一部変更したSteiner法(Steiner, J. J., C. J. Poklemba, R. G. Fjellstrom and L. F. Elliott. 1995. A rapid one-tube genomic DNA extraction process for PCR and RAPD analyses. Nucleic Acids res. 23 (13) 2569-2570)によるDNAの抽出
破裂させた卵を含む溶液１００μｌを、２００μｌの緩衝液（10 mM Tris-base（pH 8.0）、270 mM EDTA（pH 8.0）、1％のドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、1％のpolyvinylpolypyrrolidone (PVPP)を含む）で希釈した。この混合液を９５℃で２０分間インキュベート（１０分経過後に手動で高速撹拌）し、次に室温で１０分間遠心分離（8000×g）にかけた。層に含まれているDNAをエタノールで沈殿させ、この層を取り除き、残っているアルコールを蒸発させるべく、この沈殿物を３７℃で１５分間インキュベートしてから、緩衝液T.E. (10 mM Tris(pH 8.0); 1 mM EDTA(pH 8.0))に懸濁させた。次にDNAを２６０ｎｍで吸光度を測定して定量し、PCR法に用いるまで−２０℃で保管した。
【００３７】
実施例３
表１に示す特異的プライマーを用いるPCR法による増幅
簡単に言えば、増幅するために１μｌの抽出したDNAを、PCR緩衝液（20 mM Tris-HCl(pH 8.0)、50 mM KCl、1.5 mM MgCl2）及び２００μM dNTP (deoxinucleotides)、０.５μMの各プライマー、０.７５単位のTaq DNAポリメラーゼを総計１０μｌ含む反応チューブに加える。増幅反応には、寄生虫の二本鎖DNAを変性させるステップ（９５℃で４５秒間）と、プライマーをアニーリングさせるステップ（６３℃で３０秒間）とが含まれる。これらの２ステップを連続３５サイクル繰り返す。１回目のサイクルは、完全に変性させるために変性ステップが５分間と長く、最後のサイクルは、アニールした残っているプライマーを完全に伸長させるべく追加ステップ（７２℃で２分間）が含まれる。
【００３８】
図２は、マンソン住血吸虫のDNAを増幅した後の電気泳動による電気泳動パターンであり、得られた最高検出感度を示す。列Mは分子量マーカーであり、列１〜５はそれぞれ、２０ｆｇ及び１０ｆｇ、５ｆｇ、１ｆｇ、０.５ｆｇのDNAである。PCR法による反応は、１ｆｇのマンソン住血吸虫のDNAまで検出可能である。図３は、マンソン住血吸虫のDNA増幅に用いた同じプライマー、同じPCR条件で、住血吸虫属の別の５種類のDNAを増幅した後の電気泳動による電気泳動パターンである。列Mは分子量マーカー、列１はマンソン住血吸虫のDNA、列２はビルハルツ住血吸虫、列３は日本住血吸虫のDNA（フィリピンからの株）、列４は日本住血吸虫のDNA（日本からの株）、列５はマッチーイ住血吸虫、列６はボビス住血吸虫、列７はS. leipperi、列８は陰性のコントロールである。PCR反応で、検査した全種のスピンダレ住血吸虫のDNAを増幅することが可能である。図４は、マンソン住血吸虫のDNA増幅に用いた条件と同じ条件で行った、別の属に属する蠕虫のDNAの増幅を示す。列Mは分子量マーカー、列１は陽性のコントロール（マンソン住血吸虫のDNA）、列２は回虫、列３はAncilostoma duodenales、列４有鉤条虫、列５はTrichiuris trichiuriaである。別の属の蠕虫のDNAを用いた場合は、増幅による生成物を可視化することができなかった。従って、本発明のPCR法は、住血吸虫属に特異的である。
【００３９】
実施例４
患者の大便試料におけるマンソン住血吸虫のDNAの検出
この実験では、実施例１で示した方法と同じ方法で大便中に自然に或いは人工的に含まれている卵を破裂させた。次に、実施例２で示した純粋なマンソン住血吸虫の卵からDNAを抽出する方法と同じ方法で、大便からDNAを抽出した。
【００４０】
DNAを抽出した後、実施例３で示した条件及びプライマーと同じ条件及びプライマーで、１μｌのマンソン住血吸虫のDNA（１００倍に希釈）を増幅した。図５は、寄生虫の卵で人工的に感染させた大便のマンソン住血吸虫DNAの増幅による生成物を示す。簡単に言えば、１ｇｍ当たり２１６個の卵を含む患者の大便試料１００ｍｇを陰性の大便試料９００ｍｇと混合し、１ｇｍ当たり約２０個の卵を含む目的の濃度の試料を作製した。この方法を後２回繰り返して、１ｇｍ当たり約２個及び約０.２個の大便試料を作製した。次に、２つの方法の感度を比較するために、各試料のアリコットを用いて、Kato-Katz法及び本発明のPCR法によってそれぞれ寄生虫のDNAの検出を行った。図５の列Mは分子量マーカー、列１は陽性のコントロール（１ｎｇのマンソン住血吸虫卵のDNA）、列２〜列５はそれぞれ、１ｇｍ当たり２００個及び４８個、４.８個、０.４８個の卵を含む大便試料である。PCR法では、１ｇｍ当たり約４.８個の卵を含む試料までマンソン住血吸虫のDNAを検出できたが、一方のKato-Katz法では、１ｇｍ当たり４８個の卵においてまでしか検出できなかった。従って、Kato-Katz法の検出感度は本PCR法の１／１０の検出感度である。
【００４１】
図６は、Kato-Katz法によって予め決定された患者の様々な寄生虫濃度の大便試料におけるマンソン住血吸虫のDNAの増幅結果を示す。列Mは分子量マーカー、列１は陽性のコントロール、列２〜列９はそれぞれ、１ｇｍ当たり０.９６個及び０.１６８個、４３２個、６００個、９６.９１２個、７２個の卵を含むヒト大便の試料である。PCR法による結果は、寄生虫学的検査によって得られた値と全ての試料において一致した。
【００４２】
実施例５
患者の血清におけるマンソン住血吸虫の検出
Glass-max（商標）DNA単離スピン・カートリッジ・システム(Life Technologies)で、取扱説明書に従って４つの血清試料のDNAを各１００μｌ精製した。次に、上記した条件と同じ条件で２μｌのそのDNAをPCR法で増幅した。用いた患者からの血清は、既にKato-Katz法によって検査されており、２つの試料が陽性であり、２つの試料が陰性であった。
【００４３】
図７は、この増幅の結果を示す。列Mは分子量マーカー、列１は陽性のコントロール、列２〜列５はそれぞれ、１ｍｇの大便に０個及び９６個、０個、２１６個の卵を含む患者の血清である。
【図面の簡単な説明】
【図１】 マンソン住血吸虫の反復単位のDNA配列を示し、太字部分は本発明の特異的プライマーを示す。
【図２】 マンソン住血吸虫のDNAの検出におけるPCR法の感度を示す。
【図３】 世界的に臨床疫学に重要なマンソン住血吸虫及び日本住血吸虫、ビルハルツ住血吸虫の３種を含むスピンダレ住血吸虫の様々な種のDNAを増幅する本発明のPCR技術の能力を示す。
【図４】 本発明のPCR法の特異性を示す。
【図５】 ヒト大便中のマンソン住血吸虫を検査するための本発明のPCR法と寄生虫学的検査との感度の比較を例示する。
【図６】 PCR法による、感染した患者の大便試料におけるマンソン住血吸虫の検出を示す。
【図７】 PCR法による、ヒト血清試料におけるマンソン住血吸虫の検出を示す。
（発明の技術分野）
本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法によって、ヒトの試料において住血吸虫症の診断を行う方法及びそのキットに関連する。この方法は、寄生虫DNAの検出に基づいており、感染の程度が弱く寄生虫学的な検便（Kato-Katz）によって殆ど感度を示さないような場合に特に有用である。
【０００２】
（発明の背景）
住血吸虫症は、住血吸虫属の寄生虫の感染によって起こる。その主な住血吸虫の種類は、マンソン住血吸虫、日本住血吸虫、ビルハルツ住血吸虫である。この疾患は、４０００年前から存在していたという記録があり、未だに未開発国では２億人以上もの人々が感染し、公衆衛生にとって重要な問題である。マンソン住血吸虫種は、南アメリカ及びカリブ海域、アフリカ、東部地中海地域の５４カ国に存在し、風土病を起こしている。
【０００３】
このような二生類吸虫である蠕虫は、その幼虫期のセルカリアがヒトの皮膚から侵入してヒトに感染する。セルカリアは、それらの中間宿主である様々な軟体動物種によって水中で取り除くことができる。マンソン住血吸虫の幼虫は、皮膚から侵入した後、肺に移行してから肝門脈系に達し、更に胃腸管の血管及び神経叢に至ってそこで生存し、成虫になって交尾し、メスが１日に約３００個の卵を静脈内に産み付ける。
【０００４】
後に組織に寄生する、寄生虫の卵に対する宿主の免疫反応が、疾患が拡散する主な原因である。或る場合には、激しい毒血症による急性症状に発展し、感染者の大多数が、致命的となる可能性の高い合併症を伴う慢性疾患に罹る。
【０００５】
感染を制御する方法の中で、感染者の治療、軟体動物の抑制、生活条件の改善、及びその後に感染リスクのある集団の初期治療を行う疾患の同定は最も支持できる手段であるが、完全に満足できるというものではない。１９７０年代以降、大量に使用可能な薬剤が出現し、特定の治療法が、疾患を制御するためのすべてのプログラムにおいて極めて重要な役割を果たすようになってきた。
【０００６】
診断方法には、この風土病を抑制するために始原的な機器を用いている。現在用いられている技術より効率的な技術の開発が待ち望まれている。
【０００７】
この感染症は、種類によるが大便または尿に含まれている寄生虫の卵を顕微鏡で検査して診断することができる。Kato-Katz 法 (KATZ, N., A. Chaves, J. Pellegrino, 1972, A simple device for quantitative stool thick smear technique in Schistosomiasis mansoni. Rev. Inst. Med. Trop. Sao Paulo. 14: 337-340)は、効率及びコスト、操作性の点において最も優れた方法である(WHO, 1994, The Control of schistosomiasis. Technical Report Series, 830, Geneva, 86pp.)。しかしながら、浸透及び感染の程度が低く大便に含まれている寄生虫の卵の量が少量の場合、または治療をモニタリングする必要性がある場合、１つの大便試料における検査の感度が低いと、大便のサンプルの検査回数を相当増やさなければならなくなる。たとえ検査回数を増やしても、発見できない可能性があり、そのような場合は感染の治療を受けないことになる。
【０００８】
血清学的な診断は、寄生虫学的検査に替わるものであり、近年では二番目に広く利用されている。この方法では、マンソン住血吸虫の感染によって産生される抗体を、間接的な蛍光抗体法やELISA (酵素結合免疫吸着検定法：Enzyme Linked IminunoSorbent Assay)などの技術を用いて検出する。しかしながら、この技術は、過去の感染と現在進行中の感染とを見分けることができないと言う欠点がある。従って、現在感染していない場合にマンソン住血吸虫に対する特異性が低いということは、他の寄生虫との交差反応性(Correa-Oliveira R, Dusse LMS, Viana IRC, Colley DG, Carvalho OS, Gazzinelli G 1988. Human antibody response against schistosomal antigens. Am J Trop Med Hyg 38: 348-355)、単性との感染、他のセルカリアとの接触、移行抗体の移行、及び前回の成功した治療の後の残存抗体によって説明がつく。
【０００９】
マンソン住血吸虫の他の診断方法は、寄生虫が放出する抗原性の物質を検出することで、過去と現在の感染の違いを識別することができ、抗体診断の過去と現在の感染を識別できないという問題を解決できる。しかしながら、循環する抗原の探索は、軽度の感染に対して感度が低い、コストが嵩む、操作性、モノクローナル抗体の生産へ依存するなどの問題点がある（DE Jonge,N., A.L.T.Rabello, F.W.Krijger, P.G.Kremsner, R.S.Rocha, N.Katz e A.M.Deelder.1991. Levels of Schistosome circulating anodic and cathodic antigens in serum of Schistosomiasis patients from Brazil. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg.85:756-759）。
【００１０】
PCR法が開発され、病原微生物のDNAを増幅することが可能となり、開始時の微量のDNAから検出が十分に可能な量のDNAを得ることができるようになった。従って、PCR法は、極めて多様な感染に対する効果的な診断方法として用いられるようになった。
【００１１】
EP 550 883には、PCR法を用いて大便に含まれているランブル鞭毛虫という原虫のDNAの存在を検出する実験が記載されている。この実験は、標的としてランブル鞭毛虫の遺伝子RNA 18Sの配列を用いて実施した。更に、出願人は、ランブル鞭毛虫のリボソームRNA 18Sの標的配列の或る領域に十分に相同なオリゴヌクレオチドプライマーの設計を行った。
【００１２】
国際出願WO 94/04681には、クリプトスポリジウム(Cryptosporidium sp)の壁の一部をコードするDNA配列を検出するためのPCR法のプライマー、即ち同属の寄生虫の診断キットのプライマーとして用いるべく、特殊なオリゴヌクレオチドの作製方法が開示されている。上記の例とは別に、PCR法などの特定の連続的なプロセスによる増幅に用いることができるように、DNAを単離、切断、及び貯蔵する方法を開示した国際出願WO 93/03167を引用することができる。この方法は、特に、クルーズトリパノソーマ及びLeishmania sp、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、P. malariaeなどの連鎖状の閉環状キネトプラストDNAを有する微生物による寄生虫疾患を検出するために用いられる。
【００１３】
スピンダレ住血吸虫の研究では、スピンダレ住血吸虫株における集団的な遺伝子変異の可能性を確かめるべく(Dias Neto, E.., C. P. Souza, D. Rollinson, N. Katz, and A. J. G. Simpson. 1993. The random amplification of polymorphic DNA allows the identification of strains and species of Schistosomes. Molecular and Biochemical Parasitology 57 (1): 83-88.; Simpson,.A.J., E.Dias Neto, T.H.Vicligal, H.E.Pena, O.S.Carvalho e S.D.Pena.1995. DNA polymorphism of schistosomes and their snail hosts. Mern. Inst. Oswaldo Cruz.90(2):211-2l3.)、特定の遺伝子のクローニング及びシークエンシングにおいて(Francis, P. e Q. Bickl.1992. Cloning of a 21.7 kDa vaccine-dominant antigen gene of Schistosoma mansoni reveals an Elf Hand-like motif. Mol. Bioch. Parasitol. 50:215-224.; Kiang, D., A.M.Karim, P.T. LoVerde.1996. Cloning the gene encoding Schistosoma mansoni p50, an immunophilin. Gene. 170:137-140)、及び発現遺伝子断片（ESTとも呼ぶ）を作製する技術の開発及び適用において(Dias Neto, E., Harrop,R., Correia-Oliveira,R., Pena,S.D.J., Wilson,R.A. e Simpson,A.J.G.1996. The schistosome genome project: RNA arbitrarily primed PCR allows the accelerated generation of expressed sequence tags. Mem. Ist. Oswaldo Cruz. 91(5) :655-657;Dias Neto,E., Harrop,.R., Correa- Oliveira,R., Wilson,R.A., Pena, S.D.J. e Simpson, A.J.G. 1997. Minilibraries constructed from cDNA generated by arbitrarily primed RT-PCR: an alternative to normalized libraries for the efficient generation of ESTs from nanogram quantities of mRNA. Gene 186: 135-142)、PCR法を用いてカルカリアの雌雄を決定した(Gasser, R.B., G.Morahan e G.F.Mitchell.1991. Sexing single larval stages of Schistosoma mansoni by polirnerase chain reaction. Mol. Bioch. Parasitol. 47:255-258)。近年、Hamburger他 (Hamburger,J., X.Yu-Xin,R.M.Ramzy, J.Jourdane e A.Ruppel.1998.Deve.lopment and evaluation of a Polymerase Chain Reaction for monitoring Schistosoma mansoni infestation of water. Am. J. Trap. Med. Hyg.59(3):468-473)が、天然水へのマンソン住血吸虫のインフェステーションをモニタリングするPCR系の検査を開発した。
【００１４】
図１に示す本発明のプライマーは、Hamburger他(Hamburguer, J, Turetski, T, Kapeller, I & Deresiewicz, R. 1991. Highly repeated short DNA sequences in the genome of Schistosoma mansoni recognized by a species-specific probe. Molecular and Biochemical Parasitology 44: 73-80)によって開示されたマンソン住血吸虫の配列に基づいて設計した。各イニシエーター内の相補的な領域或いは両プライマー間に相補的な領域が含まれないようにするために、元となる配列を目視検査した後このプライマーの設計を行った。変性したDNA分子の増幅を容易にするべく（大便若しくは体液に遊離DNAが存在すると予想されるため）、短い配列を増幅できるようにプライマーを選択した。また、大便や血清などの化学的に複雑な生体試料と十分に作用するように、本発明の全てのステップは厳密に標準化した。
【００１５】
現在に至るまで、PCR法を用いたヒト住血吸虫の診断方法は存在しない。
【００１６】
従って、特に感染の程度が弱い場合に有用な、スピンダレ住血吸虫という寄生虫を迅速かつ効率的に検出する方法が、未だに実施されていないことは明らかである。従って、この目的を達成するために、マンソン住血吸虫遺伝子の或る特定の高度反復配列に相補的なプライマーを用いるPCR法を利用する。
【００１７】
（発明の要約）
本発明の目的は、生体試料において、PCR法によってスピンダレ住血吸虫を検出することである。
【００１８】
本発明の第一実施例は、PCR法でスピンダレ住血吸虫のDNA配列を増幅して住血吸虫症を診断する方法に関する。本発明のこの方法は、
（ａ）検査する試料を準備するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で得た試料からスピンダレ住血吸虫のDNAを抽出するステップと、
（ｃ）SEQ ID NO:1に示されている配列から作製した特異的プライマーでステップ（ｂ）で抽出したスピンダレ住血吸虫のDNAの或る領域を増幅するステップと、
（ｄ）電気泳動法によって、ステップ（ｃ）で増幅した生成物を分離してから、好適な染色法によって検出するステップとを含むことを特徴とする。
【００１９】
本発明の第二実施例は、住血吸虫の検出に用いられる診断キットに関連する。基本キットには、PCR法を実行するために必要な全ての試薬、即ち、PCR増幅用の特異的プライマー及びヌクレオチド、好適な緩衝液が含まれる。増幅に十分な量のTaqポリメラーゼ、反応の陽性のコントロールとして用いられる標準DNA、電気泳動法に用いるPCR産物を用意するための試料の緩衝液、ユーザー用のプロトコル及び取扱説明書を自由選択としてキットに含めることができる。
【００２０】
（本発明の詳細な説明）
本発明を容易に理解できるように、本明細書に用いる用語の容易な定義を以下に記載する。
【００２１】
「プライマー」とは、或るDNA部分と相補的な鎖を有する、通常はハイブリダイゼーションにおい一対で用いられる、一本鎖合成オリゴヌクレオチドである。プライマー／DNA鋳型複合体の内側端部が、PCR法の合成開始点となり、DNAポリメラーゼによって合成される。
【００２２】
「ポリメラーゼ連鎖反応法（PCR法）」とは、変性ステップTと、プライマーとのアニーリングステップと、耐熱性DNAポリメラーセ（例えば、Taq DNAポリメラーゼ）による伸長ステップのサイクルを繰り返して、DNAの標的配列を増幅する技術である。ヌクレオチドを増幅するPCR法は、米国特許第4,683,195号及び第4,683,202号に記載されている。
【００２３】
不適切なプライマーを用いると、様々な部位での増幅やプライマーダイマーの生成されたり、または増幅が不可能になったり、さらには情報価値のない増幅反応を起こすなどの種々の好ましくない結果を招く恐れがある。
【００２４】
本発明の目的は、スピンダレ住血吸虫のゲノムの或る特定の領域のPCR法による増幅、それに続く電気泳動による増幅された生成物（PCR産物）の分離、更に、以下に限定するものではないが、上述した不都合を生じさせない、銀塩や放射性同位元素による染色、またはそれらの検出を可能にする基質と結合した酵素による染色を含む、ゲル中のDNAを十分に可視化することができる好適な染色技術によって達成することができる。
【００２５】
本発明の方法を用いて、PCR法によって増幅が十分に可能である完全な、寄生虫から遊離した細胞若しくはDNAを含む任意の生物試料において、住血吸虫属のDNAを検出することが可能である。大便や尿などの試料は、寄生虫の細胞のDNAを最終的には囲んでしまう膜やエンベロープを破裂させて、溶液中にDNAを放出させるある種の処理を施す必要がある。ところが、感染した患者の血清などの試料は、すでに遊離分子を含んでいるためそのような処理は必要ない。一般に膜は、特殊な化学物質、例えば界面活性剤やカオトロピック塩などを用いるか、或いは人工の浸透圧や音波破砕などの物理的及び機械的な方法によって破壊することができる。細胞膜を破裂させた後、DNAを別の細胞分子から単離しなければならない。これは、エタノールによる沈殿やシリカマトリックス使用などの物理化学的な方法によって行うことができる。
【００２６】
DNAを溶液に遊離させPCR法で増幅した後、試料におけるそのDNAを検出することができる。そのDNAは、増幅反応を阻害する可能性のある物質を除去するべく、標準的な技術を用いて選択的に精製しなければならない。
【００２７】
抽出後、そのDNAを選択的にPCR法で増幅する。スピンダレ住血吸虫のゲノムのある特定の配列をPCR法で選択的に数百万回複製して、その寄生虫のDNAを検出できるようにする。この反応は連続的なプロセスであり、少なくとも２種類のプライマーと、その寄生虫のDNAと相補的なDNAの短い配列とが必要である。この短い配列は、酵素的に伸長されてこのDNAの完全な複製となる。大量のプライマーを他の必要な試薬と共に加え、この寄生虫DNAの数百万の複製を作製する。本発明に用いるPCR用のプライマーは、SEQ ID NO:1及び図１に示されているマンソン住血吸虫のゲノムの高度反復配列に基づいて特別に設計する。SEQ ID NO:2及びSEQ ID NO:3に対して機能的に等価なヌクレオチド配列を有する別のプライマーも作製できることを理解されたい。配列が同一でないにもかかわらず、対応する生体高分子が使用や目的の点で機能的に同一の役割を果たす場合に、その配列を「等価」と呼ぶ。この等価配列は、ヌクレオチドの置換及び／または欠失及び／または挿入、及び／または配列の一端における配列の伸長及び／または短縮などの偶発或いは誘導による配列の任意の改変などから生じ得る。自然によっては生じない配列の改変は、遺伝子組み換え技術で行うことができる。ある一対の各プライマーは、スピンダレ住血吸虫のゲノムの増幅されるある特定の領域に隣接する配列の他方の一本鎖に実質的に相補的となるように選択的に作製される。従って、各対の一方のプライマーは、配列のセンス鎖の一部と十分に相補的でハイブリダイズ可能であり、他方のプライマーは、同一配列のアンチセンス鎖の別の一部と十分に相補的でハイブリダイズ可能である。プライマーの配列は、鋳型配列と鏡像である必要はないが、プライマー配列が鋳型配列の３'末端の配列に近づけば近づくほど、PCR法におけるプライマー付加時の結合が容易になる。
【００２８】
プライマーの作製は、当分野で周知の任意の好適な方法、例えば、好適な配列のクローニング及び消化、または化学合成によって行うことができる。
【００２９】
PCR法によって増幅される生成物は、様々な大きさの単独、または一連のDNA断片である。これらのDNA断片を電気泳動法によって分離し、ゲル内のDNAを十分に視認できるように好適な染色技術によって染色する。PCR法は特異性が高いため、増幅された寄生虫のDNAは、その特定の大きさに基づいて、増幅された別の生成物と分離することができる。この方法では、感染の有無は、大抵の場合単純に増幅された生成物の視覚的な検査、即ち、その寄生虫のDNA断片に相当する分子量の断片の有無によって検査することができる。本発明では、PCR法を用いて、マンソン住血吸虫の同定されたDNAの或る特定の断片と、別の種の住血吸虫のある特定の領域とを増幅して可視化し、SEQ ID NO:1に示され、同定されたマンソン住血吸虫のDNAの反復及び特定の領域が他の種類の住血吸虫のある特定の領域と共通であることがわかった。
【００３０】
スピンダレ住血吸虫のゲノムのその特定領域の増幅は、本発明で使用するために特別に作製した表１に示すプライマー、若しくはそれと等価のプライマーを用いるPCR法を利用するため、マンソン住血吸虫の配列やその他の住血吸虫種の相同な配列の増幅を行うことができる。
【００３１】
スピンダレ住血吸虫のゲノムの高度反復領域のPCR法による増幅に用いたプライマーの配列を以下の表１に示す。
【００３２】
【表１】
本発明のキットには、住血吸虫属の蠕虫の感染を検出するのに必要なすべての試薬が含まれている。このキットには、表１に示されているスピンダレ住血吸虫のゲノムのある特定の領域に対して特異的なプライマー、或いはその等価配列と、PCR技術に通常用いられる試薬や添加剤、例えば４種のデオキシヌクレオチド三リン酸（dGTP及びdATP、dCTP、dTTP)や好適な緩衝液(例えば、10〜20 mM Tris-HCl、50〜60 mM KCl、1.5〜2.0 mM MgCl2、pH 8.0〜8.5)、及びTaq DNAポリメラーゼが含まれるのが好ましい。また、反応液の陽性のコントロールとして用いられる一定量のDNAや検査に用いられるプロトコル、並びに予想される結果を例示する表が含まれる。
【００３４】
以下に記載する実施例を用いて本発明の詳細を説明する。本発明は、以下の実施例に限定されるものではなく、本発明の範囲内で様々な改変が可能であることを理解されたい。
【００３５】
実施例１
マンソン住血吸虫の卵を破裂させる
１００匹のセルカリアで予め感染させたマウスの肝から、マンソン住血吸虫の卵を抽出し、使用するまで０.９％の食塩水に−２０℃で保存した(Pellegrino e Siqueira, 1956, Rev. Bras. Malar. 8: 589)。卵を破裂させるために、１ｍｌ当たり１００.０００個の卵を含む１０μｌの食塩水を９０μｌの蒸留水で混合し、その混合液をメカニカルミキサーで５分間撹拌した。破裂した卵を含む混合液を直接用いてDNAを抽出した。
【００３６】
実施例２
一部変更したSteiner法(Steiner, J. J., C. J. Poklemba, R. G. Fjellstrom and L. F. Elliott. 1995. A rapid one-tube genomic DNA extraction process for PCR and RAPD analyses. Nucleic Acids res. 23 (13) 2569-2570)によるDNAの抽出
破裂させた卵を含む溶液１００μｌを、２００μｌの緩衝液（10 mM Tris-base（pH 8.0）、270 mM EDTA（pH 8.0）、1％のドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、1％のpolyvinylpolypyrrolidone (PVPP)を含む）で希釈した。この混合液を９５℃で２０分間インキュベート（１０分経過後に手動で高速撹拌）し、次に室温で１０分間遠心分離（8000×g）にかけた。層に含まれているDNAをエタノールで沈殿させ、この層を取り除き、残っているアルコールを蒸発させるべく、この沈殿物を３７℃で１５分間インキュベートしてから、緩衝液T.E. (10 mM Tris(pH 8.0); 1 mM EDTA(pH 8.0))に懸濁させた。次にDNAを２６０ｎｍで吸光度を測定して定量し、PCR法に用いるまで−２０℃で保管した。
【００３７】
実施例３
表１に示す特異的プライマーを用いるPCR法による増幅
簡単に言えば、増幅するために１μｌの抽出したDNAを、PCR緩衝液（20 mM Tris-HCl(pH 8.0)、50 mM KCl、1.5 mM MgCl2）及び２００μM dNTP (deoxinucleotides)、０.５μMの各プライマー、０.７５単位のTaq DNAポリメラーゼを総計１０μｌ含む反応チューブに加える。増幅反応には、寄生虫の二本鎖DNAを変性させるステップ（９５℃で４５秒間）と、プライマーをアニーリングさせるステップ（６３℃で３０秒間）とが含まれる。これらの２ステップを連続３５サイクル繰り返す。１回目のサイクルは、完全に変性させるために変性ステップが５分間と長く、最後のサイクルは、アニールした残っているプライマーを完全に伸長させるべく追加ステップ（７２℃で２分間）が含まれる。
【００３８】
図２は、マンソン住血吸虫のDNAを増幅した後の電気泳動による電気泳動パターンであり、得られた最高検出感度を示す。列Mは分子量マーカーであり、列１〜５はそれぞれ、２０ｆｇ及び１０ｆｇ、５ｆｇ、１ｆｇ、０.５ｆｇのDNAである。PCR法による反応は、１ｆｇのマンソン住血吸虫のDNAまで検出可能である。図３は、マンソン住血吸虫のDNA増幅に用いた同じプライマー、同じPCR条件で、住血吸虫属の別の５種類のDNAを増幅した後の電気泳動による電気泳動パターンである。列Mは分子量マーカー、列１はマンソン住血吸虫のDNA、列２はビルハルツ住血吸虫、列３は日本住血吸虫のDNA（フィリピンからの株）、列４は日本住血吸虫のDNA（日本からの株）、列５はマッチーイ住血吸虫、列６はボビス住血吸虫、列７はS. leipperi、列８は陰性のコントロールである。PCR反応で、検査した全種のスピンダレ住血吸虫のDNAを増幅することが可能である。図４は、マンソン住血吸虫のDNA増幅に用いた条件と同じ条件で行った、別の属に属する蠕虫のDNAの増幅を示す。列Mは分子量マーカー、列１は陽性のコントロール（マンソン住血吸虫のDNA）、列２は回虫、列３はAncilostoma duodenales、列４有鉤条虫、列５はTrichiuris trichiuriaである。別の属の蠕虫のDNAを用いた場合は、増幅による生成物を可視化することができなかった。従って、本発明のPCR法は、住血吸虫属に特異的である。
【００３９】
実施例４
患者の大便試料におけるマンソン住血吸虫のDNAの検出
この実験では、実施例１で示した方法と同じ方法で大便中に自然に或いは人工的に含まれている卵を破裂させた。次に、実施例２で示した純粋なマンソン住血吸虫の卵からDNAを抽出する方法と同じ方法で、大便からDNAを抽出した。
【００４０】
DNAを抽出した後、実施例３で示した条件及びプライマーと同じ条件及びプライマーで、１μｌのマンソン住血吸虫のDNA（１００倍に希釈）を増幅した。図５は、寄生虫の卵で人工的に感染させた大便のマンソン住血吸虫DNAの増幅による生成物を示す。簡単に言えば、１ｇｍ当たり２１６個の卵を含む患者の大便試料１００ｍｇを陰性の大便試料９００ｍｇと混合し、１ｇｍ当たり約２０個の卵を含む目的の濃度の試料を作製した。この方法を後２回繰り返して、１ｇｍ当たり約２個及び約０.２個の大便試料を作製した。次に、２つの方法の感度を比較するために、各試料のアリコットを用いて、Kato-Katz法及び本発明のPCR法によってそれぞれ寄生虫のDNAの検出を行った。図５の列Mは分子量マーカー、列１は陽性のコントロール（１ｎｇのマンソン住血吸虫卵のDNA）、列２〜列５はそれぞれ、１ｇｍ当たり２００個及び４８個、４.８個、０.４８個の卵を含む大便試料である。PCR法では、１ｇｍ当たり約４.８個の卵を含む試料までマンソン住血吸虫のDNAを検出できたが、一方のKato-Katz法では、１ｇｍ当たり４８個の卵においてまでしか検出できなかった。従って、Kato-Katz法の検出感度は本PCR法の１／１０の検出感度である。
【００４１】
図６は、Kato-Katz法によって予め決定された患者の様々な寄生虫濃度の大便試料におけるマンソン住血吸虫のDNAの増幅結果を示す。列Mは分子量マーカー、列１は陽性のコントロール、列２〜列９はそれぞれ、１ｇｍ当たり０.９６個及び０.１６８個、４３２個、６００個、９６.９１２個、７２個の卵を含むヒト大便の試料である。PCR法による結果は、寄生虫学的検査によって得られた値と全ての試料において一致した。
【００４２】
実施例５
患者の血清におけるマンソン住血吸虫の検出
Glass-max（商標）DNA単離スピン・カートリッジ・システム(Life Technologies)で、取扱説明書に従って４つの血清試料のDNAを各１００μｌ精製した。次に、上記した条件と同じ条件で２μｌのそのDNAをPCR法で増幅した。用いた患者からの血清は、既にKato-Katz法によって検査されており、２つの試料が陽性であり、２つの試料が陰性であった。
【００４３】
図７は、この増幅の結果を示す。列Mは分子量マーカー、列１は陽性のコントロール、列２〜列５はそれぞれ、１ｍｇの大便に０個及び９６個、０個、２１６個の卵を含む患者の血清である。
【図面の簡単な説明】
【図１】 マンソン住血吸虫の反復単位のDNA配列を示し、太字部分は本発明の特異的プライマーを示す。
【図２】 マンソン住血吸虫のDNAの検出におけるPCR法の感度を示す。
【図３】 世界的に臨床疫学に重要なマンソン住血吸虫及び日本住血吸虫、ビルハルツ住血吸虫の３種を含むスピンダレ住血吸虫の様々な種のDNAを増幅する本発明のPCR技術の能力を示す。
【図４】 本発明のPCR法の特異性を示す。
【図５】 ヒト大便中のマンソン住血吸虫を検査するための本発明のPCR法と寄生虫学的検査との感度の比較を例示する。
【図６】 PCR法による、感染した患者の大便試料におけるマンソン住血吸虫の検出を示す。
【図７】 PCR法による、ヒト血清試料におけるマンソン住血吸虫の検出を示す。
Claims (4)
- 生物試料において、SEQ ID NO:1に示されている住血吸虫属のDNAを検出して、前記住血吸虫属の寄生虫の感染を検出する方法であって、
（ａ）前記生物試料からスピンダレ住血吸虫のDNAを抽出するステップと、
（ｂ）SEQ ID NO:2及びSEQ ID NO:3の配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーセットであって、PCRに適しており、かつSEQ ID NO:1の配列並びにマンソン住血吸虫、ビルハルツ住血吸虫、日本住血吸虫、マッチーイ住血吸虫、ボビス住血吸虫、及びS. leipperiに共通の相同配列を増幅可能な、該オリゴヌクレオチドプライマーセットで、前記ステップ（ａ）で抽出したスピンダレ住血吸虫のDNAをPCR法によって増幅するステップと、
（ｃ）電気泳動法によって、前記ステップ（ｂ）で増幅された生成物を分離してから、可視化するステップとを含むことを特徴とする検出方法。 - 前記ステップ（ｂ）の増幅された生成物が、ポリアクリルアミドゲルにおいて電気泳動法によって分離され、銀塩で染色して可視化されるか、或いは他の可視化手段によって可視化されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
- スピンダレ住血吸虫のDNAを増幅するためのPCR用オリゴヌクレオチドプライマーセットであって、
SEQ ID NO:2及びSEQ ID NO:3の配列からなり、PCRに適しており、かつSEQ ID NO:1の配列並びにマンソン住血吸虫、ビルハルツ住血吸虫、日本住血吸虫、マッチーイ住血吸虫、ボビス住血吸虫、及びS. leipperiに共通の相同配列を増幅可能なことを特徴とするオリゴヌクレオチドプライマーセット。 - 生物試料において、スピンダレ住血吸虫の感染を検出するために用いられるキットであって、
SEQ ID NO:2及びSEQ ID NO:3の配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーセットであって、PCRに適しており、かつSEQ ID NO:1の配列並びにマンソン住血吸虫、ビルハルツ住血吸虫、日本住血吸虫、マッチーイ住血吸虫、ボビス住血吸虫、及びS. leipperiに共通の相同配列を増幅可能な、該オリゴヌクレオチドプライマーセットと、PCR法を実施するために必要な全ての試薬とを含むことを特徴とするスピンダレ住血吸虫の感染を検出するために用いられるキット。
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