BRPI0001536B1 - método para diagnosticar a infecção por parasitos do genero schistosoma e kit para uso no diagnóstico da infecção por schistosoma sp - Google Patents

Abstract

"método e kit para a detecção da esquistossomose pela reação em cadeia da polimerase". o objetivo da presente invenção é a detecção de schistosoma sp. em amostras biológicas através de pcr. uma primeira concretização da presente invenção diz respeito a um método para diagnóstico da esquistossomose através da amplificação por pcr da sequência do dna de schistosoma sp., seguido de separação dos produtos de amplificação por eletroforese e da detecção por técnica apropriada. numa segunda concretização, a invenção é dirigida a kit de diagnóstico a ser utilizado na detecção da esquistossomose. um kit básico compreende todos os reagentes necessários para a realização da técnica de pcr, a saber: iniciadores específicos, nucleotídeos e solução tampão apropriada para a amplificação por pcr. opcionalmente, o kit pode conter a enzima taq polimerase em quantidades suficientes para amplificação, dna padrão para ser usado como controle positivo da reação, solução tampão da amostra para preparar o material amplificado para eletroforese e protocolo e manual para instruir o usuário.

Description

MÉTODO mm DIAGNOSTICAR A INFECÇÃO POR FARASITOS DO GENEHO SCHISTOSOMA 8 EIT PARA USO NO DIAGNÓSTICO DA INFECÇÃO FOR SCHISTOSOMA SF. A presente invenção se relaciona a um método e kit para diagnosticar a esquistossomose em amostras humanas através da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). O método baseia-se na detecção do DMA do parasito e é especialmente útil em casos de baixa intensidade de infecção·, para os quais o exame parasitológico de fezes (Kato-Katz) mostra-se pouco sensível.

FUNDAMENTOS DA mVMIÇ&O A esquistossomose é uma doença causada pela infecção por parasitos do gênero Schistosoma, sendo as três principais espécies infectantes o Schistosoma mansoni, o Schistosoma japonicum e o Schistosoma haematobium. A doença foi relatada há 4000 anos e ainda constitui importante problema de saúde pública, atingindo mais de 200 milhões de pessoas em países não desenvolvidos. A espécie S. mansoni é endêmica em 54 países e territórios da América do Sul, do Caribe, da África e da região- oriental do Mediterrâneo.

Estes helmintos, trematódios digenétieos, infectam o homem através da penetração, pela pele, das cercárias |estágio larvário} que sâo eliminadas na água por diferentes espécies de moluscos, seus hospedeiros intermediários. Apôs migrarem pela pele, as larvas de S. mansoni atravessam os pulmões e alcançam o sistema portal hepático, indo viver em veias e plexos do trato gastrointestinal, onde se tornam adultos, se acasalam e a fêmea passa a depositar, nos vasos venosos, em torno de 300 ovos por dia. A reação imune do hospedeiro aos ovos do parasito, que irão se alojar nos tecidos, é a principal responsável pela doença que se instala. Em alguns casos, desenvolve-se a forma clinica aguda com manifestações toxêmicas intensas e, na maioria dos doentes, doença crônica debilitante, com possibilidade de complicações graves e freqüentemente fatais.

Entre as medidas de controle da infecção, o tratamento dos infectados, o controle de moluscos, a melhoria de condições de habitação, a identificação e o tratamento precoces de populações em risco tem se mostrado as mais sustentáveis, embora de forma alguma, completamente satisfatórias. Após a década de 70, com o advento das drogas utilizáveis em larga escala, a terapêutica específica passou a apresentar papel crucial em todos os programas de controle da doença. 0 método de diagnóstico constitui instrumento primordial para os programas de controle da endemia. É altamente desejável o desenvolvimento de técnicas ainda mais eficientes do que as atualmente disponíveis. O diagnóstico da infecção pode se dar através da demonstração microscópica de ovos do parasito nas fezes ou urina, dependendo da espécie. 0 método de Kato-Katz (KATZ, N., A. Chaves, J. Pellegrino. 1972, A simple device for quantitative stoll thick smear technique in Schistosomiasis mansoni. Rev. Inst. Med. Trop., São Paulo. 14: 337-340) é a técnica que oferece as melhores condições de eficácia, custo e operacionalidade (WH0.1994, The Control of schistosomiais. Technical Report Series, 830, Geneva, 86pp.). Entretanto, quando o número de ovos nas fezes é pequeno, como em situações de baixa prevalência e baixa intensidade de infecção e no controle de cura, a sensibilidade do exame de uma única amostra fecal é baixa, sendo necessário maior número de amostras fecais. Ainda assim, alguns pacientes deixam de ser diagnosticados e, consequentemente, tratados. O diagnóstico sorológico constitui uma alternativa ao parasitológico sendo, após este, o mais largamente utilizado. Por esse método, anticorpos produzidos pela infecção com S. mansoni são detectados através de técnicas como a reação de imunofluorescência indireta e ELISA ("enzyme linked immunosorbent assay"). Porém, esta técnica apresenta a desvantagem de não distinguir entre infecção ativa e infecção passada. Assim, a baixa especificidade da presença de anticorpos contra S. mansoni na ausência de infecção ativa se explica por reatividade cruzada cora outros parasitos (Corrêa-Oliveira R, Dusse LMS, Viana IRC, Colley DG, Carvalho OS, Gazzinelli G 1988. Human antibody response against schistosomal antigens. Am J Trop Med Hyg 38: 348-355.), pela presença de infecções unissexuais, por contatos com outras cercárias, pela transferência de anticorpos maternos, e por tratamento prévio e persistência de anticorpos após a cura.

Outra alternativa para o diagnóstico da esquistossomose mansoni consiste em detectar substâncias antigênicas liberadas pelo parasito, possibilitando diferenciar infecção passada e ativa, eliminando o problema da inespecificidade do diagnóstico por anticorpos. No entanto, a pesquisa de antígenos circulantes apresenta outras desvantagens, como a baixa sensibilidade em infecções leves, o custo elevado, operacionalidade difícil e a dependência da produção de anticorpos monoclonais (DE Jonge,N., A.L.T.Rabello, F.W.Krijger, P.G.Kremsner, R.S.Rocha, N.Katz e A.M.Deelder.1991. Leveis of Schistosome circulating anodic and cathodic antigens in serum of Schistosomiasis patients from Brazil. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg.85:756-759).

Com o surgimento da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), tornou-se possível a amplificação do DNA de organismos patogênicos permitindo que, a partir de quantidades iniciais ínfimas, se obtivessem quantidades suficientemente grandes a ponto de possibilitar sua detecção. A PCR passou, então, a ser empregada como método eficiente de diagnóstico para as mais diversas infecções. 0 documento EP 550 883 descreve um ensaio utilizando a PCR para detectar, nas fezes, a presença de DNA do protozoário G. lambí ia. 0 procedimento foi realizado usando, como alvo, a sequência do gene RNA 18S de G. lambí ia. Adicionalmente, o depositante desenhou iniciadores oligonucleotídicos suficientemente complementares a uma região da sequência alvo do RNA ribossomal 18S de G. lamblia. 0 documento WO 94/04681 relaciona-se ao desenvolvimento de oligonucleotídeos específicos a serem empregados como iniciadores na PCR para detecção da sequência de DNA da proteína da parede de Cryptosporidium sp., assim, como kit para o diagnóstico de parasitos deste gênero. Além dos exemplos acima pode-se citar o documento WO 93/03167, no qual é requerido um processo para isolamento, armazenamento e divagem de DNA capaz de fornecê-lo de forma adequada para amplificação através de um processo sequencial específico, tal como a PCR. O processo é particularmente empregado para a detecção de doenças parasitárias causadas por microrganismos com DNA cinetoplástico circular fechado em cadeia, tal como T. cruzi, Leishmania sp., P. falciparum, P. vivax e P. malariae.

No estudo do DNA do Schistosoma sp. a PCR tem sido usada para determinação do sexo de cercárias (Gasser, R.B., G.Morahan e G.F.Mitchell. 1991. Sexing single larval stages of Schistosoma mansoni by polimerase chain reaction. Mol. Bioch. Parasitol. 47:255-258., na clonagem e sequenciamento de genes específicos (Francis, P. e Q. Bickl.1992. Cloning of a 21.7 kDa vaccine-dominant antigen gene of Schistosoma mansoni reveals an Elf Hand-like motif. Mol. Bioch. Parasitol. 50:215-224.; Kiang, D., A.M.Karim, P.T. LoVerde.1996. Cloning the gene encoding Schistosoma mansoni p50, an imraunophilin. Gene. 170:137-140.), para a determinação da variabilidade genética populacional de cepas de Schistosoma sp. (Dias Neto, E., C. P. Souza, D.

Rollinson, N. Katz, and A. J. G. Simpson. 1993. The random amplification of polymorphic DNA allows the Identification of strains and species of Schistosomes. Molecular and Biochemical Parasitology 57 (1): 83-88.; Simpson,A.J., E.Dias Neto, T.H.Vidigal, H.B.Pena, O.S.Carvalho e S.D.Pena.1995. DNA polymorphism of schistosomes and their snail hosts. Mem. Inst. Oswaldo Cruz.90(2):211-213.) e no desenvolvimento e aplicação de técnicas para a geração de etiquetas de sequências expressas (ESTs ou "expressed sequence tags") (Dias Neto, E., Harrop,R., Correia-Oliveira, R., Pena,S.D.J., Wilson,R.A. e Simpson,A.J.G.1996. The schistosome genome project: RNA arbitrarily primed PCR allows the accelerated generation of expressed sequence tags. Mem. Ist. Oswaldo Cruz. 91(5):655-657;Dias Neto,E., Harrop,R., Corrêa-Oliveira,R., Wilson,R.A., Pena, S.D.J. e Simpson, A.J.G. 1997. Minilibraries constructed from cDNA generated by arbitrarily primed RT-PCR: an alternative to normalized libraries for the efficient generation of ESTs from nanogram quantities of mRNA. Gene 186: 135-142). Recentemente, Hamburger et al (Hamburger, J., X.Yu-Xin,R.M.Ramzy, J.Jourdane e A.Ruppel.1998.Development and evaluation of a Polymerase Chain Reaction for monitoring Schistosoma mansoni infestation of water. Am. J. Trop. Med. Hyg.59(3):468-473) desenvolveram um teste baseado na PCR para monitorar infestação por $. mansoni em águas naturais.

Os iniciadores descritos na presente invenção foram desenhados com base na seqüência de S. mansoni originalmente relatada por Hamburger et al. descrita na figura 1,(Hambúrguer, J, Turetski, T, Kapeller, I & Deresiewicz, R. 1991. Highly repeated short DNA sequences in the genome of Schistosoma mansoni recognized by a species-specific probe. Molecular and Biochemical Parasitology 44: 73-80). O desenho dos iniciadores foi feito após a inspeção visual da seqüência original, de maneira a evitar a presença de regiões complementares dentro de cada iniciador ou entre os dois iniciadores. A fim de favorecer a amplificação de moléculas de DNA degradadas (como esperado para DNA livre presente nas fezes ou em fluidos corporais) os iniciadores foram escolhidos de maneira a amplificar uma seqüência curta. Adicionalmente, todas as etapas da presente invenção foram rigorosamente padronizadas de maneira a funcionarem satisfatoriamente com amostras biológicas quimicamente complexas como fezes e soro.

Até o presente momento, a utilização da PCR como um método de diagnóstico para esquistosomose humana nunca foi relatada.

Dessa forma, fica evidente que a busca de um método rápido e eficaz de detecção do parasito Schístosoma sp., especialmente útil em casos de baixa intensidade de infecção, ainda não foi viabilizado. Assim, visando atingir esse objetivo, foi utilizada a estratégia de PCR empregando iniciadores complementares a uma seqüência especifica e altamente repetitiva do genoma de S. mansoni.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO 0 objetivo da presente invenção é a detecção de Schístosoma sp. em amostras biológicas através de PCR.

Uma primeira concretização da presente invenção diz respeito a um método para diagnóstico da esquistossomose através da amplificação por PCR de uma sequência do DNA de Schístosoma sp.. 0 método da presente invenção se caracteriza pelas etapas de: (a) coletar a amostra a ser examinada; (b) extrair o DNA de Schístosoma sp. da amostra obtida em (a); (c) amplificar uma região do DNA de Schístosoma extraído na etapa (b) com iniciadores específicos construídos a partir da sequência original descrita em ID SEQ No.l. (d) separar os produtos de amplificação da etapa (c) por eletroforese, seguida de detecção por métodos de coloração apropriados.

Numa segunda concretização, a invenção é dirigida a kit de diagnóstico a ser utilizado na detecção da esquistosomose. Um kit básico compreende todos os reagentes necessários para a realização da técnica de PCR, a saber: iniciadores específicos, nucleotídeos e solução tampão apropriada para a amplificação por PCR. Opcionalmente, o kit pode conter a enzima Taq polimerase em quantidades suficientes para amplificação, DNA padrão para ser usado como controle positivo da reação, solução tampão da amostra para preparar o material amplificado para eletroforese e protocolo e manual para instruir o usuário.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS FIGURA 1: Mostra a Sequência de DNA da unidade repetitiva de S. mansoni. Indicando, em negrito, a localização dos iniciadores específicos descritos nesta invenção; FIGURA 2: Apresenta a sensibilidade da PCR na detecção do DNA de S. mansoni. FIGURA 3: Mostra a capacidade da técnica de PCR da presente invenção de amplificar o DNA de diversas espécies de Schistosoma sp., incluindo as três espécies de maior importância clínico-epidemiológica no mundo: S. mansonir S. japonicum e S. heamatobium FIGURA 4: Mostra a especificidade da PCR da presente invenção. DNA de outros helmintos não foi amplificado pela PCR. FIGURA 5: Ilustra a comparação em termos de sensibilidade entre a PCR da invenção e o exame parasitológico no diagnóstico da S. mansoní, em fezes humanas. FIGURA 6: Mostra a detecção, através da PCR, de S. mansoni em amostras de fezes de pacientes infectados. FIGURA 7: Mostra a detecção, através da PCR, de S. mansoni em amostras de soro humano.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Para facilitar a compreensão, são dadas a seguir as definições já consagradas de alguns dos termos usados na descrição da invenção: (1) Iniciadores (primers) : oligonucleotideos sintéticos de fita única, normalmente utilizados em pares na hibridização com fitas complementares de um segmento de DNA . As extremidades internas do complexo iniciador/DNA molde é usada pela DNA polimerase como ponto de inicio da síntese em uma PCR. (2) Reação em cadeia de polimerase (PCR): técnica na qual são aplicados ciclos de desnaturaçâo, anelamento com o iniciador e extensão com uma polimerase de DNA termoestável, por exemplo a Taq DNA polímerase, para amplificar uma seqüência alvo de DNA. 0 processo PCR de amplificação de ácido nucleico está descrito nos documentos US 4 683 195 e US 4 683 202.

Uma seleção inadequada dos iniciadores pode produzir diversos efeitos indesejáveis, tais como: incapacidade de amplificação, amplificação em múltiplos sítios, formação de dímeros dos iniciadores, entre outros, tornando a reação de amplificação não informativa. O objetivo da presente invenção é alcançado pela amplificação, por PCR, de uma região específica do genoma de Schístosoma sp. e posterior separação dos produtos de amplificação por eletroforese, seguida de técnicas apropriadas de coloração que permitam a visualização adequada do DNA no gel compreendendo, mas não limitados a: coloração por sais de prata, radioisótopos e enzimas em combinação com substratos que permitam sua detecção, sem os efeitos indesejáveis acima mencionados. O método da presente invenção pode ser empregado para a detecção do DNA de espécies do gênero Schístosoma em qualquer amostra biológica que contenha células ou DNA livre do parasito, suficientemente íntegro para ser amplificado pela PCR. Algumas amostras, como fezes e urina, precisam ser submetidas a algum tipo de tratamento para que as membranas ou envoltórios que eventualmente possam encerrar o DNA na célula do parasito, sejam rompidos, liberando o DNA era solução. Outras amostras como, por exemplo, o soro de pessoas infectadas, já contém as moléculas livres e não necessitam de tal tratamento. De maneira geral, as membranas podem ser rompidas com o uso de substâncias químicas especiais, como detergentes e sais chaotrópicos, ou com o uso de processos físicos e mecânicos, como pressão osmótica induzida e sonicaçâo. Após o rompimento das membranas celulares, o DNA deve ser isolado das demais moléculas celulares, o que pode ser feito também por processos físico-químicos, como a precipitação pelo etanol ou com o uso de matrizes de sílica.

Uma vez livre na solução, o DNA pode ser detectado na amostra, após ser amplificado pela PCR. 0 DNA deve ser, preferencialmente, purificado através de técnicas já consagradas para remoção de eventuais substâncias que inibam a reação de amplificação.

Após a extração, o DNA é seletivamente amplificado pela Reação em Cadeia da Polimerase. Através da PCR, uma sequência específica do genoma de Schistosoma sp. é seletivamente copiada milhões de vezes, permitindo a detecção do DNA do parasito. A reação é um processo sequencial que requer pelo menos dois inicíadores, pequenas sequências de DNA complementares ao DNA do parasito, que serão estendidos enzimaticamente, formando uma cópia fiel ao deste DNA. Adicionando-se grandes quantidades de inicíadores, juntamente com outros reagentes necessários, obtém-se milhares de cópias do DNA do parasito, chamado DNA molde. Os iniciadores da PCR aqui utilizados foram especialmente desenhados para esta invenção, com base na sequência original altamente repetitiva do genoma de S. mansoni conforme descrita em ID SEQ No. 1 e visualizada também na figura 1. É importante que fique claro que podem ser construídos outros iniciadores cujas sequências de nucleotídeos sejam funcionalmente equivalentes em relação a ID SEQ No:2 e ID SEQ No:3. Tais sequências são denominadas equivalentes se funcíonalmente os biopolímeros correspondentes podem desempenhar o mesmo papel, sem serem idênticos, frente à utilização ou aplicação considerada. As sequências equivalentes podem ser resultado da variabilidade, ou seja, qualquer modificação, espontânea ou induzida em uma sequência, seja ela substituição e/ou deleção e/ou inserção de nucleotídeos, e/ou extensão e/ou encurtamento da sequência em uma de suas extremidades. Uma variabilidade não natural pode resultar de técnicas de engenharia genética.

Cada iniciador do par é, preferencialmente, construído de forma a ser substancialmente complementar a uma fita diferente da seqüência que flanqueia a sequência específica do genoma de Schistosoma sp. a ser amplificada. Sendo assim, um iniciador de cada par é suficientemente complementar para ser capaz de hibridizar com uma parte da seqüência no sentido senso e o outro iniciador de cada par é também suficientemente complementar para hibridizar com uma parte diferente da mesma seqüência no sentido antisenso. Apesar da seqüência do iniciador não precisar, necessariamente, refletir a seqüência exata do molde, quanto mais próximo a seqüência 3' terminal estiver da seqüência exata melhor será a ligação durante a etapa de eraparelhamento da reação da polimerase em cadeia.

Os iniciadores podem ser preparados por qualquer método apropriado de conhecimento daqueles versados na matéria e incluem, por exemplo, clonagem e digestão de sequências adequadas e síntese química direta. 0 produto da amplificação promovida pela PCR é um fragmento, ou uma série de fragmentos de DNA de diferentes tamanhos que podem ser separados por eletroforese, seguida de técnicas apropriadas de coloração que permitam a visualização adequada do DNA no gel. Devido a grande especificidade da PCR, o DNA amplificado do parasito pode ser diferenciado de outros produtos de amplificação com base em seu tamanho específico. Dessa maneira, a presença ou ausência da infecção pode ser determinada, na maioria das vezes, apenas pela análise dos produtos amplificados, ou seja, pela presença ou não do fragmento de peso correspondente ao do parasito. Na presente invenção, a PCR é utilizada para amplificar e visualizar um fragmento específico de DNA originalmente descrito em S. mansoni, bem como amplificar região especifica de outras espécies de Schístosoma, levando a conclusão de que a região repetitiva e específica de DNA originalmente verificada em S. mansoni e descrita em ID SEQ No.l seja comum a todas as demais espécies de Schístosoma. A amplificação da região específica do genoma de Schístosoma sp. é feita por PCR, com os iniciadores especialmente construídos para uso no método da presente invenção e definidos na tabela 1 ou sequências funcionalmente equivalentes, ou seja, que sejam capazes de amplificar a sequência de S. mansoni ou sequências homólogas de outras espécies de Schístosoma.

Tabela 1: Iniciadores utilizados na reação de PCR para amplificação da região altamente repetitiva do genoma de Schístosoma sp. 0 kit da presente invenção inclui todos os reagentes necessários para permitir a detecção de qualquer infecção causada por helmintos do gênero Schístosoma. 0 kit consiste de iniciadores específicos para a região específica do genoma de Schístosoma sp. como mostrado na Tabela 1 ou sequências funcionalmente equivalentes e, adicionalmente, são fornecidos reagentes e aditivos normalmente utilizados na técnica de PCR, como por exemplo, nucleotídeos apropriados, tais como dGTP (desoxiguanidina-trifosfato), dATP (desoxiadenosina-trifosfato), dCTP (desoxicitidina-trifosfato),e dTTP (desoxitimidina-trifosfato); solução tampão apropriada (por exemplo, 10 a 20 mM de Tris-HCl, 50 a 60 mM de KC1, 1,5 a 2,0 mM de MgCl2, pH 8,0 a 8,5); Taq DNA polimerase, preferencialmente. Será fornecida uma certa quantidade de DNA a ser utilizado como controle positivo da reação, além de um manual de instruções contendo protocolo a ser utilizado no teste, com uma figura ilustrativa dos resultados esperados. A presente invenção é descrita detalhadamente através dos exemplos apresentados abaixo. É necessário frisar que a invenção não está limitada a esses exemplos mas que também inclui variações e modificações dentro dos limites nos quais ela funciona. EXEMPLO 1 Rompimento dos Ovos de S. mansoni Os ovos de 5. mansoni foram extraídos de fígado de camundongos previamente infectados com 100 cercárias, e armazenados em 0.9% de solução salina a -20 °C até serem usados (Pellegrino e Siqueira, 1956, Rev. Bras. Malar. 8: 589). Para rompimento dos ovos, 10 μΐ da solução salina contendo 100.000 ovos/inl foram misturados a 90 μΐ de água destilada e a solução final submetida a 5 minutos de agitação em um agitador mecânico. Esta mistura, contendo ovos rompidos, foi utilizada diretamente na extração do DNA. EXEMPLO 2 Extração do DNA, através do Método Modificado de Steiner e outros (Steiner, J. J., C. J. Poklemba, R. G. Fjellstrom and L. F. Elliott. 1995. A rapid one-tube genomic DNA extraction process for PCR and RAPD analyses. Nucleic Acids res. 23 (13): 2569-2570): 100 μΐ da solução de ovos rompidos foram diluídos em 200 μΐ de tampão contendo 10 mM de Tris-base, pH 8.0; 270 mM de EDTA, pH 8.0; 1% de Dodecil Sulfato de Sódio (SDS); 1% de polivinilpolipirrolidona (PVPP). Esta mistura foi incubada a 95°C por 20 minutos, com uma rápida agitação manual após os 10 primeiros minutos de incubação e, então, centrifugada por 10 minutos a 8000 x g, em temperatura ambiente. O DNA contido no sobrenadante foi precipitado com etanol, o sobrenadante foi retirado e o precipitado foi incubado por 15 min a 37°C para evaporação do restante do álcool e posteriormente, ressuspendido em tampão T.E (10 mM de Tris, pH 8.0; 1 mM de EDTA, pH 8.0). O DNA foi, então, quantificado por leitura de densidade óptica a 260 nm, e armazenado a -20°C até ser utilizado na PCR. EXEMPLO 3 Amplificação pela Reação em Cadeia da Polimerase utilizando os iniciadores específicos mostrados na Tabela 1: A figura 2 mostra o padrão eletroforétíco obtido da amplificação do DNA de S. mansoni e, também, a sensibilidade máxima obtida para a detecção deste DNA. Na canaleta M, está o marcador de peso molecular; nas canaletas de 1 a 5: 20, 10, 5, 1 e 0.5 fg de DNA, respectivamente. A reação de PCR foi capaz de detectar até 1 fg de DNA de S. mansoni. A figura 3 mostra o padrão eletroforétíco obtido após a amplificação do DNA de cinco outras espécies do gênero Schistosoma, amplificadas com os mesmos iniciadores e sob as mesmas condições de PCR usadas para S. mansoni. Canaleta M: marcador de peso molecular; canaleta 1: DNA de S. mansoni; canaleta 2: S. haematobium; canaleta 3: S. japonicum (cepa proveniente das Filipinas); canaleta 4: S. japonicum (cepa do Japão); canaleta 5: S, matthei; canaleta 6: S. bovís; canaleta 7: S. leípperi; canaleta 8: controle negativo. A reação de PCR foi capaz de amplificar o DNA de todas as espécies de Schistosoma sp. testadas. A figura 4 mostra a tentativa de amplificação do DNA de vermes de outros gêneros, também sob as mesmas condições usadas para S. mansoni. Canaleta M: marcador de peso molecular; canaleta 1: controle positivo (DNA de S. mansoni); canaleta 2: Ascaris lumbricoides; canaleta 3: Ancilostoma duodenales; canaleta 4: Taenía solium; canaleta 5: Tríchiuris trichiuria. Nenhum produto de amplificação pode ser visualizado ao se utilizar o DNA de vermes de outros gêneros. A PCR descrita nesta invenção é, portanto, específica para o gênero Schistosoma. EXEMPLO 4 Detecção de DNA de S. mansoní em amostras de fezes de pacientes: Nestes experimentos, os ovos contidos nas fezes infectadas (natural ou artificialmente) foram rompidos da maneira descrita no exemplo 1. 0 DNA foi, então, extraído das fezes pela mesma técnica usada para extração em ovos puros (exemplo 2).

Após a extração, Ιμΐ do DNA de S. mansoní (diluído 100 vezes) foi amplificado com os mesmos iniciadores e nas mesmas condições descritas no exemplo 3. A figura 5 mostra os produtos da amplificação do DNA de S. mansoní em fezes artificialmente infectados com ovos do parasito. Resumidamente, 100 mg de uma amostra de fezes de um paciente, contendo 216 ovos/grama, foram misturados a 900 mg de fezes negativas, formando uma amostra com uma carga esperada de aproximadamente 20 ovos/grama. Este procedimento foi repetido mais 2 vezes, originando amostras de fezes com 2 e 0,20 ovos/grama, aproximadamente. Uma alíquota de cada amostra foi então, submetida a análise pelo método de Kato-Katz e à detecção do DNA do parasito pela PCR da invenção, com o intuito de comparar a sensibilidade dos dois métodos. Na canaleta M está o marcador de peso molecular; canaleta 1: controle positivo {0,lng de DNA de ovos de 5. mansoni): canaletas de 2 a 5; DNA amplificado de amostras contendo 200, 48, 4,8 e 0,48 ovos/grama de fezes, respectivamente. A PCR foi capaz de detectar o DNA de S. mansoni até a amostra contendo, aproximadamente 4,8 ovos/grama, enquanto que a sensibilidade do método Kato-Katz foi de 48 ovos/grama, ou seja, 10 vezes menor. A figura 6 mostra o resultado da amplificação do DNA de S. mansoni em fezes de pacientes com diversas cargas parasitárias, previamente determinadas pelo Kato-Katz. Canaleta M: marcador de peso molecular; canaleta 1: controle positivo; canaletas de 2 a 9: amostras de fezes humanas contendo 0 (amostra negativa}, 168, 0 (amostra negativa}, 432, 600, 96, 912 e 72 ovos/grama, respectivamente. O resultado da PCR foi concordante com os obtidos pelo exame parasitológico em todas as amostras. EXEMPLO 5 Detecção de S. mansoni em soros de pacientes 0 DNA de 4 amostras de soro foi purificado a partir de um. volume de 100 μΐ/amostra utilizando-se o Kit de purificação Glass-max® DNA isolation spin cartridge system (Life Technologies), de acordo com as instruções do fabricante. 2 μΐ deste DNA foram, então, usados na amplificação pela PCR, nas mesmas condições descritas anteriormente. Foram utilizados soros de pessoas previamente examinadas pelo Kato-Katz, sendo duas amostras positivas e duas negativas. A figura 7 mostra o resultado desta amplificação. Na canaleta M está o marcador de peso molecular; canaleta 1: Controle positivo; canaletas de 2 a 5: soros de pessoas contendo 0; 96; 0 e 216 ovos/grama de fezes, respectivamente.

Claims (3)

1. Método para diagnosticar a infecção por parasites do gênero Schistosoma através da detecção, em amostras biológicas, da região especifica de DNA do gênero Schistosoma descrita em SEQ ID N0.1, caracterizado por compreender as etapas de: (a) Coletar a amostra a ser examinada; {b} Extrair o DNA de Schistosoma sp. da amostra obtida em (a); (c) Amplificar por PCR uma região específica do DNA de Schistosoma sp. extraído na etapa (b) com iniciadores específicos que compreendem as sequencías SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:3, construídos a partir da sequencia original de S. mansoni descrita em SEQ ID NO:1. (d) Separar produtos de amplificação da etapa (c) por eletroforese, seguida de detecção por técnica apropriada.

2. Método de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo fato dos produtos de amplificação da etapa (d) serem separados por eletroforese em gel de poliacrilamida e detectados com coloração por sais de prata ou outro sistema de detecção.

3. Kit para uso no diagnóstico da infecção por Schistosoma sp. caracterizado por compreender iniciadores específicos compreendendo as sequências SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:3, construídos a partir da sequencia original de S. mansoni descrita em SEQ ID NO: 1 e todos os reagentes necessários para realizar a PCR de acordo com a reivindicação 1.