CN110760588A - 一种用于日本血吸虫检测的核酸诊断试剂盒及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种用于日本血吸虫检测的核酸诊断试剂盒，所述的试剂盒提供了一组敏感性高和特异性强的日本血吸虫检测用引物，其引物核苷酸序列为SEQ ID NO.1‑2所示，本发明构建了敏感性高和特异性强的日本血吸虫游离核酸的实时荧光定量的PCR检测技术，可准确快速的检测日本血吸虫的感染，判断水体是否含有毛蚴、尾蚴以及进行血吸虫的虫种鉴定。

Description

一种用于日本血吸虫检测的核酸诊断试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，具体涉及日本血吸虫核酸特异性基因G01的Real-time PCR的检测方法的建立，及其在检测日本血吸虫游离核酸中的应用。

背景技术

日本血吸虫属于吸虫纲，复殖亚纲，复殖目，裂体科，裂体属(我国兽医系统称为分体属)。日本血吸虫的终末宿主包括人、水牛、黄牛、山羊、绵羊、猪、马、骡和狗等40余种哺乳动物。其中水牛、黄牛、山羊和绵羊等患病家畜是日本血吸虫的主要传染源。目前，在全球74个国家和地区中，约有2亿血吸虫病感染者，其中1.2亿人表现出血吸虫病的临床症状，2千万人患病严重，有6亿人口受血吸虫病感染威胁。血吸虫病仍是一个需要重视的公共卫生问题，被世界银行(World Bank)、世界卫生组织(WHO)和联合国热带病研究发展特别规划署(TDR)列为重点研究、检测、防控的六大热带病之一。日本血吸虫能够逃避宿主的免疫攻击，在宿主的血管中存活长达十几年甚至更长时间，血吸虫感染能引起人和家畜的消瘦，重度感染可以造成人和家畜极高的发病率和死亡率，因此对日本血吸虫检测的研究具有十分重要的临床意义，并能提高疫区畜牧业的经济效益。

日本血吸虫的生活史包括虫卵(eggs)、毛蚴(miracidia)、母胞蚴(primarysporocysts)、子胞蚴(daughter sporocysts)、尾蚴(cercariae)、童虫(schistosomulae)、成虫(adult)7个发育阶段。血吸虫的感染始于人及多种哺乳动物的皮肤接触有尾蚴的疫水，尾蚴侵入皮肤后，尾部脱落转变成童虫，随后侵入末稍血管或淋巴管内，随血流最终汇集于肝门静脉，在肝内合抱并发育，然后下行寄居于肠系膜静脉为成虫，成虫的寿命可达几十年。自尾蚴感染4到6周，雌虫开始产卵，直至虫体死亡。

近年来，药物治疗已经在血吸虫病流行的国家大规模使用。这导致血吸虫感染强度降低，因此血清学和Kato-Katz粪便涂片等常用诊断方法的漏检率上升，诊断价值有所降低。日本血吸虫病在中国的感染率和感染强度显着下降，因此迫切需要更敏感和准确的检测方法进一步防控血吸虫病。目前，日本血吸虫的诊断主要分为病原学诊断和免疫学诊断。病原学诊断是该疾病诊断的金标准，但它需要很长时间并且检出率较低。病原学逐渐被免疫学诊断所取代，但免疫学诊断本身也存在一些缺点，例如难以区分现症感染或既往感染，并且易于发生交叉反应。核酸诊断具有灵敏度高，特异性强的特点，具有血吸虫病早期诊断、鉴别诊断及疗效考核的潜力。目前，核酸诊断方法已广泛用于胎儿诊断，肿瘤诊断等，其敏感性和特异性已得到认可。因此，日本血吸虫病的核酸诊断方法具有广阔的应用前景和潜力。

游离核酸最早于1977年被发现，Leon等学者在对肿瘤患者的研究中发现，它是存在于宿主体内的一种无细胞状态的胞外DNA，主要存在于宿主血液、唾沫、尿液等地方。游离核酸的存在形式主要有：游离DNA(单链DNA、双链DNA或两者的混合物)和DNA-蛋白质复合物。游离核酸的产生机制尚不明确，目前主要有两种观点：一种观点认为游离核酸是机体细胞凋亡或坏死后，释放出的DNA片段。另一种观点认为循环DNA是由细胞本身主动释放的。由于日本血吸虫侵入宿主后，进入宿主的血液循环系统，最终寄生在宿主肝门静脉处，虫体正常细胞凋亡、或虫体死亡后所释放的核酸片段最终会进入宿主血液循环内，这就为日本血吸虫病的核酸诊断提供了理论依据。

日本血吸虫的核酸诊断关键在于寻找到一个稳定存在于宿主体内的核酸片段，但用于扩增靶基因序列数量有限，目前研究较多用的增靶基因序列主要有18SrRNA基因、逆转录转座子SjR2、Sjrh1.0、线粒体DNA等，这些靶序列的特异性和敏感性在用于现场核酸检测时仍不够理想。核酸诊断在技术上相对比较成熟的方法有普通PCR和Real-time PGR，目前研究比较多的是灵敏度高的LAMP法和重组酶扩增技术，但是其在现场诊断时容易出现假阳性，另外，重组酶扩增技术相对而言成本较高。

发明内容

本发明构建了敏感性高和特异性强的日本血吸虫游离核酸的实时荧光定量的PCR检测技术，可准确快速的检测日本血吸虫G01基因。

本发明提供了一种用于日本血吸虫检测的核酸诊断试剂盒，所述的试剂盒包含一组敏感性高和特异性强的日本血吸虫检测用引物，其引物核苷酸序列为

P1：5′-CCGAACACTTCAAGG-3′；(SEQ ID NO.1)

P2：5′-CTTCCTCGTTTCAGGTT-3′(SEQ ID NO.2)，扩增片段大小为145bp。

本发明的另一目的是提供了用于检测的PCR反应体系：Master Mix 10μl，上下游引物各0.4μL，模板1μL，加适量去离子水，使体系达到20μL。引物用双蒸水稀释到10pmol/μL的浓度。PCR扩增条件如下：95℃ 30s预变性，95℃ 15s，58℃ 34s，72℃ 10s，40个循环。经实验样本验证，可用于日本血吸虫的检测。

对PCR扩增产物进行分析，可选择以下任一步骤：

常规PCR结合琼脂糖凝胶电泳分析；或者Real-time PCR的扩增曲线判断。

上述检测方法，用核酸提取试剂盒从待测样本中提取DNA。

上述检测方法，PCR反应体系如下：Master Mix 10μl，上下游引物各0.4μL，模板1μL，加适量去离子水，使体系达到20μL。

上述检测方法，PCR扩增反应条件如下：95℃ 30s预变性，95℃ 15s，58℃ 34s，72℃ 10s，40个循环。

上述检测方法，产物的熔解曲线在82℃形成特征峰，即显示阳性。

本发明检测既可以用Real-time PCR仪熔解曲线法来检测，也可以用常规PCR仪+电泳法进行检测。前者可用于装配了Real-time PCR仪(30万/台以上)的单位，由于扩增+结果读取一步到位，操作较为方便；后者适用于处于分子诊断起步阶段以及有意开展分子诊断项目的单位。

本发明提供了一种检测日本血吸虫的试剂盒以及检测方法；可用于监测水体中是否含有日本血吸虫毛蚴和尾蚴，鉴别钉螺是否感染了日本血吸虫毛蚴，对血吸虫进行虫种鉴定；本发明的试剂盒价格低廉，检测方法操作简单、不需要复杂的操作过程。

附图说明

图1 Real-time PCR结果 1：阳性样本 2：阴性样本 3：虫体DNA

图2常规PCR结果 1：阳性样本 2：阴性样本 3：虫体DNA 4：无模板体系。

图3交叉反应性试验结果

Real-time PCR结果：产物的熔解曲线在82℃形成特征峰的样本为日本血吸虫虫体DNA，以弓形虫、大片形吸虫、前后盘吸虫、住肉孢子虫、旋毛虫、棘球绦虫的基因组为模板的产物均未形成特征峰。

常规PCR结果：1：弓形虫虫体DNA 2：大片形吸虫虫体DNA 3：前后盘吸虫虫体DNA4：住肉孢子虫虫体DNA 5：旋毛虫虫体DNA 6：棘球绦虫虫体DNA 7：日本血吸虫虫体DNA

图4灵敏度比较试验结果，起始浓度为100pg，10倍稀释9个梯度(100pg，10pg，1pg，100fg，10fg，1fg，0.1fg，0.01fg和0.001fg)，Real-time PCR检测下限为0.01fg，普通PCR检测下限为1fg。

图5标准曲线

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例：

(1)日本血吸虫虫株及基因组核酸样本制备：实验用日本血吸虫虫株由本实验室保存。将虫体研磨2min，然后12000rpm离心2min，弃去上清。然后用核酸提取试剂盒提取虫体基因组，测定浓度和纯度，用于方法建立的检测模板。

(2)引物设计：根据实验室前期核酸诊断研究的基础上，发现了具有诊断潜力的G01基因，根据该基因利用Oligo6.0软件设计引物。引物：P1：5′-CCGAACACTTCAAGG-3′；(SEQID NO.1)P2：5′-CTTCCTCGTTTCAGGTTC-3′(SEQ ID NO.2)，扩增片段大小为145bp。

(3)靶标基因克隆和重组阳性质粒构建：以P1和P2为上下游引物，扩增出目片段。纯化PCR产物，连接到pMD19-T载体上，获得重组阳性质粒，用于灵敏度试验。

(4)反应体系：

扩增条件：95℃ 30s预变性，95℃ 15s，58℃ 34s，72℃ 10s，40个循环。

(5)结果判定：

Real-time PCR仪熔解曲线法检测：产物的熔解曲线在82℃形成特征峰，显示扩增出目的片段，即该样本为阳性。如图1所示。

普通PCR仪+电泳法检测：PCR产物大小为145bp，显示扩增出目的片段，即为该样本为阳性，如图2所示。

(6)交叉反应性试验：弓形虫、大片形吸虫、前后盘吸虫、住肉孢子虫、旋毛虫、棘球绦虫虫体的基因组均由本所农业部动物寄生虫重点实验室提供。以其为模板，Real-timePCR扩增观察其交叉反应性。

结论：对各种寄生虫虫体的DNA进行Real-time PCR的特异性分析，结果显示Real-time PCR无特异性扩增，只对日本血吸虫G01基因具有很强的敏感性(图3)。

(7)灵敏度比较试验：将构建的重组质粒倍比稀释9个梯度，分别用常规PCR和Real-time PCR两种方法在模板量一致的情况下进行对比检测，观察其检测下限。

结论：检测结果表明，Real-time PCR检测下限为0.01fg，常规PCR检测下限为1fg，由此可见Real-time PCR灵敏度是常规PCR的100倍(图4)。

(8)标准曲线制作：将构建好的质粒标准品，用去离子水10倍倍比稀释9个梯度作为模板，按照以上提到的体系和反应条件进行操作。多次摸索，选择最优的质粒浓度作为标准曲线建立的模板梯度，并作为后续实验标准品稀释梯度。反应体系：

扩增条件：95℃ 30s预变性，95℃ 15s，58℃ 34s，72℃ 10s，40个循环。

以构建的质粒的不同浓度稀释作为模板得出Real-time PCR标准曲线(图5)。相应参数分析发现，标准曲线的相关性参数R²＝0.996和扩增效率E＝1.91均较好。

上述研究表明，该核酸诊断试剂盒具有较好的敏感性和特异性，同时与常见的寄生虫病几乎没有交叉反应。吕超等利用重组表位抗原rBSjPGM-BSjRAD23-1-BSj23作为诊断抗原对血吸虫病进行ELISA检测，结果显示该方法对诊断日本血吸虫的敏感性为(95.61％，109/114)，其特异性和交叉反应率分别为97.83％(90/92)和7.14％(2/14)。而以SEA作为诊断抗原，获得的敏感性为100％，特异性和交叉反应率分别为82.61％(76/92)和50％(7/14)。张旻等(2014)以rSjPGM和SjSEA作为诊断抗原对血吸虫病进行检测，其敏感性分别为91.35％和100.00％，特异性分别为100.00％和91.67％。而在检测14份前后盘吸虫、9份大片吸虫感染水牛血清时，rSjPGM的交叉反应率为7.14％和11.11％，SjSEA为50.00％和44.44％。目前，本专利中提供的研究方法敏感性为100％(162/162)，特异性为100％(0/23)，且本专利中所提供的引物P1和P2具有很好的敏感性和特异性。

Zhang等利用巢氏PCR技术对SjR2序列进行了血吸虫病诊断研究，结果显示该方法检测出日本血吸虫的DNA，敏感度达0.9fg。目前日本血吸虫核酸诊断检测的最低的检测下限为0.1fg，而本专利中提供的研究方法的检测下限可达0.01fg。

Claims (9)

1.一种用于日本血吸虫检测的核酸诊断试剂盒，所述的试剂盒包括一对特异性引物，引物序列如下：

P1：5′-CCGAACACTTCAAGG-3′(SEQ ID NO.1)；

P2：5′-CTTCCTCGTTTCAGGTT-3′(SEQ ID NO.2)。

2.根据权利要求1所述的用于日本血吸虫检测的核酸诊断试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括：

DNA模板1μl，上下游引物各0.4μl，Master Mix 10μl，超纯水补充至20μl。

3.根据权利要求1或2所述的用于日本血吸虫检测的核酸诊断试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒的Real-time PCR扩增反应条件如下：

95℃ 30s预变性，95℃ 15s，58℃ 34s，72℃ 10s，40个循环。

4.如权利要求1-3任一项所述的试剂盒在非诊断目的的检测日本血吸虫中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的应用具体是：用试剂盒中的一对特异性引物，对待测样本中提取的DNA进行Real-time PCR扩增，通过熔解曲线对PCR扩增产物进行分析，当特征峰出现在82℃时，认为扩出目的片段，该样本判为阳性。

6.一种非诊断目的的日本血吸虫的PCR检测方法，检测方法包括如下步骤：

A)从待测样本中提取DNA，进一步以DNA为模版，将P1和P2同时加入PCR反应体系，进行PCR扩增；

B)对PCR扩增产物进行分析，若扩增出目的片段，则待测样本为阳性。

7.根据权利要求6所述的日本血吸虫的PCR检测方法，其特征在于，步骤中对PCR扩增产物进行分析，可选择1)普通PCR结合琼脂糖凝胶电泳分析；或者2)Real-time PCR的扩增曲线判断。

8.根据权利要求7所述的日本血吸虫的PCR检测方法，其特征在于，步骤1)普通PCR结合琼脂糖凝胶电泳分析过程中，若发现PCR扩增的产物大小分别为145bp，即显示扩增出目的片段，待测样本为阳性。

9.根据权利要求7所述的日本血吸虫的PCR检测方法，其特征在于，步骤2)Real-timePCR的扩增曲线判断过程中，若发现PCR扩增的两个产物的熔解曲线分别在82℃形成特征峰，即显扩增出目的片段，待测样本为阳性。

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