ES2237562T3 - Procedimiento y kit para detectar la esquistosomiasis mediante la reaccion en cadena de la polimerasa. - Google Patents
Procedimiento y kit para detectar la esquistosomiasis mediante la reaccion en cadena de la polimerasa.Info
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Abstract
Procedimiento para la detección de parásitos del género Schistosoma en una muestra biológica, caracterizado porque se detecta una región específica del ADN del género Schistosoma como la descrita en la ID SEC Nº 1, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de: a) extracción del ADN de Schistosoma sp. a partir de una muestra biológica; b) amplificación por PCR de una región específica de dicho ADN de Schistosoma obtenido en la etapa a), con cebadores oligonucleotídicos que comprenden la ID SEC Nº 2 y la ID SEC Nº 3 adecuados para PCR, y son capaces de amplificar la ID SEC Nº 1 y secuencias homólogas comunes a S. mansoni, S. haematobium, S. japanicum, S. matthei, S. bovis y S. leipperi; c) separación de los productos de PCR obtenidos en la etapa b) mediante electroforesis, seguido de visualización.
Description
Procedimiento y kit para detectar la
esquistosomiasis mediante la reacción en cadena de la
polimerasa.
La presente invención se refiere a un
procedimiento y un kit para el diagnóstico de la esquistosomiasis
en materia de muestra humana mediante la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR). El procedimiento se basa en la detección del ADN
del parásito y es especialmente útil en los casos de baja intensidad
de infección, en los que las pruebas de cerote parasitógico
(Kato-Katz) demuestran una baja sensibilidad.
La esquistosomiasis es una enfermedad causada por
la infección por parásitos del género Schistosoma, siendo
Schistosoma mansoni, Schistosoma japonicum y
Schistosoma haematobiom las principales especies infecciosas.
La enfermedad se ha registrado durante 4000 años y aún constituye
un problema importante para la salud pública, que afecta a más de
200 millones de personas en los países subdesarrollados. La especie
S. mansoni es endémica en 54 países y territorios de
Sudamérica, el Caribe, África y la región oriental del
Mediterráneo.
Estos helmintos, trematodos digenéticos, infectan
al hombre por la penetración de la piel de las cercarias (fase
larvaria), que se liberan al agua por diferentes especies de
moluscos, sus huéspedes intermedios. Tras migrar a través de la
piel, las larvas de S. mansoni atraviesan los pulmones y
llegan al sistema portal hepático, subsistiendo luego en las venas
y el plexo del tubo digestivo, donde se hacen adultos y se aparean,
tras lo cual las hembras depositan después aproximadamente 300
huevos al día en las venas.
La reacción inmunitaria del huésped a los huevos
del parásito, que se alojarán en los tejidos, es la principal
responsable de la expansión de la enfermedad. En algunos casos,
progresa hacia una forma clínica aguda con intensas manifestaciones
toxémicas y, en la mayoría de las víctimas, hacia una enfermedad
crónica debilitante, con posibilidad de complicaciones graves y
frecuentemente fatales.
Entre las medidas para controlar la infección, el
tratamiento de los infectados, el control de los moluscos, la
mejora de las condiciones de vida y la identificación seguida por
el tratamiento temprano de las poblaciones en riesgo han resultado
ser las más sostenibles, pero no son medidas completamente
satisfactorias. Tras los años setenta, con la llegada de fármacos
utilizables a mayor escala, la terapia específica comenzó a
desempeñar un papel crucial en todos los programas de control de la
enfermedad.
El procedimiento de diagnóstico constituye un
instrumento primordial para los programas de control de la endemia.
Es muy deseable desarrollar técnicas que sean más eficaces que las
disponibles actualmente.
El diagnóstico de la infección se puede realizar
mediante confirmación por microscopia de la presencia de huevos de
parásito en las heces o la orina, dependiendo de las especies. El
método de Kato Katz (KATZ, N., A. Chaves, J. Pellegrino, 1972, A
simple device for quantitative stool thick smear technique in
Squistosomiasis mansoni. Rev. Inst. Med. Trop. S\tilde{a}o
Paulo. 14: 337-340) es la técnica que ofrece las
mejores condiciones de eficacia, coste y operación; (WHO, 1994, The
Control of Squistosomiasis. Technical Report Series, 830, Ginebra,
86 páginas). Sin embargo, cuando la cantidad de huevos en las heces
es pequeña, tal como en condiciones de baja incidencia y baja
intensidad de infección y también cuando es necesario controlar el
tratamiento, la sensibilidad de la prueba en una única muestra
fecal disminuye, haciendo necesario un mayor número de muestras
fecales. Aún así, algunas víctimas no pueden ser diagnosticadas, y
por lo tanto, no reciben tratamiento.
El diagnóstico serológico constituye una
alternativa a la prueba parasitológica, siendo, tras el anterior,
el segundo más ampliamente empleado. Mediante este procedimiento,
se detectan los anticuerpos producidos por la infección por S.
mansoni mediante técnicas tales como la reacción de
inmunofluorescencia indirecta y ELISA (ensayo inmunoenzimático).
Sin embargo, esta técnica tiene la desventaja de no distinguir
entre la infección activa y la infección pasada. Así, la baja
especificidad de los anticuerpos frente a S. mansoni en
ausencia de infección activa se explica mediante la reactividad
cruzada con otros parásitos (Correa-Oliveira, R.,
Dusse, L. M. S., Viana, I. R. C., Colley, D. G., Carvalho, O. S.,
Gazzinelli, G. 1988. Human antibody response against Schistosomal
antigens. Am. J. Trop. Med. Hyg. 38: 348-355) por la
presencia de infecciones unisexuales, por el contacto con otras
cercarias, por la transferencia de anticuerpos maternos y por la
persistencia de anticuerpos tras un tratamiento exitoso
previo.
previo.
Otra alternativa para el diagnóstico de
Schistosoma mansoni consiste en detectar sustancias
antigénicas liberadas por el parásito, permitiendo diferenciar
entre infección activa y pasada y eliminando el problema de la
inespecificidad del diagnóstico por anticuerpos. Sin embargo, la
búsqueda de antígenos circulantes presenta otras desventajas, tales
como una baja sensibilidad a infecciones leves, el elevado coste,
la dificultad de operación y una dependencia respecto a la
producción de anticuerpos monoclonales (De Jonge, N., A. L. T.
Rabello, F. W. Krijger, P. G. Kremsner, R. S. Rocha, N. Katz y A.
M. Deelder. 1991. Levels of Schistosome circulating anodic and
cathodic antigens in serum of Squistosomiasis patients from Brazil.
Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 85: 756759).
Con la aparición de la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR, siglas en inglés), se ha hecho posible amplificar
el ADN de organismos patógenos, permitiendo que, a partir de
ínfimas cantidades iniciales, se obtengan cantidades
suficientemente grandes hasta el punto de permitir su detección. Por
tanto, la PCR ha llegado a usarse como un procedimiento eficaz de
diagnóstico para la más diversas infecciones.
El documento EP 550883 describe un experimento
usando PCR para detectar en las heces la presencia del ADN del
protozoo G. lamblia. El procedimiento se llevó a cabo
usando, como objetivo, la secuencia del gen ARN 18S de G.
lamblia. Por lo tanto, el solicitante diseñó cebadores
oligonucleotídicos suficientemente complementarios a una región de
la secuencia objetivo del ARN ribosómico 18S de G.
lamblia.
El documento WO94/04681 se refiere al desarrollo
de oligonucleótidos específicos para ser usados como cebadores de
la PCR para la detección de la secuencia de ADN que codifica la
proteína de la pared de Cryptosporidium sp., y de ese modo,
como kit para el diagnóstico de parásitos de este género. Con la
excepción de los ejemplos mencionados anteriormente, es posible
citar el documento WO 93/03167, que es una solicitud de un
procedimiento para el aislamiento, almacenamiento y escisión de ADN
capaz de proporcionarlo en una forma adecuada para la amplificación
mediante un procedimiento secuencial específico, tal como la PCR.
El procedimiento se emplea particularmente para la detección de
enfermedades parasitarias causadas por microorganismos que tienen
ADN cinetoplásmico circular cerrado concatenado tales como T.
cruzi, Leishmania sp., P. falciparum, P.
vivax y P. malariae.
En el estudio de Schistosoma sp. se ha
usado la PCR para determinar el sexo de las cercarias (Gasser, R.
B., G. Morahan y G. F. Mitchell. 1991. Sexing single larval stages
of Schistosoma mansoni by polimerase chain reaction. Mol.
Bioch. Parasitol. 47: 255-258.), en la clonación y
secuenciación de genes específicos (Francis, P. y Q. Bickl. 1992.
Cloning of a 21.7 kDa vaccine-dominant antigen gene
of Schistosoma mansoni reveals an Elf
Hand-like motif. Mol. Bioch. Parasitol. 50:
215-224; Kiang, D., A. M. Karim, P. T. LoVerde.
1996. Cloning the gene encoding Schistosoma mansoni p50, an
immunophilin. Gene. 170: 137-140.), para averiguar
la variabilidad genética poblacional de las cepas de Schistosoma
sp. (Dias Neto, E., C. P. Souza, D. Rollinson, N. Katz, y A. J.
G. Simpson. 1993. The random amplificación of polymorphic DNA
allows the identification of strains and species of Schistosomes.
Molecular and Biochemical Parasitology 57(1):
83-88; Simpson, A. J., E. Dias Neto, T. H. Vidigal,
H. B. Pena, O. S. Carvalho y S. D. Pena. 1995. DNA polymorphism of
schistosomes and their snail hosts. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 90
(2): 211-213.) y en el desarrollo y aplicación de
técnicas para la generación de identificadores de secuencias
expresadas (orEST) (Dias Neto, E., Harrop, R.,
Correia-Oliveira, R., Pena, S. D. J., Wilson, R. A.
y Simpson, A. J. G. 1996. The schistosome genome project: RNA
arbitrarily primed PCR allows the accelerated generation of
expressed secuencia tags. Mem. Ist. Oswaldo Cruz. 91 (5):
655-657; Dias Neto, E., Harrop, R., Correa Olivera,
R., Wilson, R. A., Pena, S. D. J. y Simpson, A. J. G. 1997.
Minilibraries constructed from cDNA generated by arbitrarily primed
RT-PCR: an alternative to normalized libraries for
the efficient generation of ESTs from nanogram quantities of mRNA.
Gene 186: 135-142). Recientemente, Hamburger y col.
(Hamburger, J., X. Yu-Xin, R. M. Ramzy, J. Jourdane
y A. Ruppel. 1998. Development and evaluation of a polymerase chain
reaction for monitoring Schistosoma mansoni infestation of
water. Am. J. Trop. Med. Hyg. 59 (3): 468-473)
desarrollaron una prueba basada en PCR para monitorizar la
infestación de agua natural por S. mansoni.
Los cebadores descritos en la presente invención
se diseñaron según la secuencia de S. mansoni descrita
originalmente por Hamburger y col. mostrada en la figura 1,
(Hamburger, J, Turetski, T, Kapeller, I y Deresiewicz, R. 1991.
Highly repeated short DNA sequences in the genome of Schistosoma
mansoni recognized by a species-specific probe.
Molecular and Biochemical Parasitology 44: 73-80).
El diseño de los cebadores se realizó tras la inspección visual de
la secuencia original, para evitar la presencia de regiones
complementarias dentro de cada iniciador o entre ambos cebadores.
Con el fin de facilitar la amplificación de las moléculas de ADN
degradadas (como se espera para el ADN libre presente en heces o
fluidos corporales) se eligieron los cebadores de tal modo que se
amplificara una secuencia corta. Asimismo, todas las etapas de la
presente invención se estandarizaron de forma estricta de tal modo
que funcionaran satisfactoriamente con las muestras biológicas
químicamente complejas tales como heces y suero.
Hasta el presente instante, no se había descrito
nunca el uso de la PCR como método para diagnosticar la
esquistosomiasis humana.
Como tal, se hace evidente que la búsqueda de un
procedimiento rápido y eficiente para la detección del parásito
Schistosoma sp., útil especialmente en los casos de baja
intensidad de infección, aún no ha sido realizable. Por tanto, con
la intención de conseguir este objetivo, se usa una estrategia que
emplea cebadores para PCR complementarios con una secuencia
específica y altamente repetitiva del genoma de S.
mansoni.
El objeto de la presente invención es la
detección mediante PCR de Schistosoma sp. en muestras
biológicas.
Una primera realización de la presente invención
se refiere a un procedimiento para la detección de
Schistosoma como se define en la reivindicación 1, mediante
la amplificación por PCR de una secuencia de ADN de Schistosoma
sp. El procedimiento de la presente invención se caracteriza
por las etapas de:
(a) extracción del ADN de Schistosoma sp.
a partir de una muestra biológica;
(b) amplificación de una región del ADN de
Schistosoma extraído en la etapa (a) con cebadores
específicos construidos a partir de la secuencia original descrita
en la ID SEC nº 1, en la que dichos cebadores comprenden la ID SEC
nº 2 y la ID SEC nº 3, y son capaces de amplificar la ID SEC nº 1 y
las secuencias homólogas comunes a S. mansoni, S.
haematobium, S. japonicum, S. matthei, S.
bovis y S. leipperi;
(c) separación de los productos de las
amplificaciones de la etapa (b) mediante electroforesis, seguido de
la detección usando procedimientos adecuados de tinción.
En una segunda realización, la invención está
orientada hacia un kit de diagnóstico para usarse en la detección
de Schistosoma, como se define en la reivindicación 5. Un
kit básico incluye todos los reactivos necesarios para llevar a
cabo la técnica de la PCR, a saber: cebadores específicos,
nucleótidos y disolución tampón apropiada para la amplificación por
PCR. Opcionalmente, el kit puede contener la enzima Taq polimerasa
en cantidades suficientes para amplificación, ADN estándar para
usarse como control positivo de la reacción, disolución tampón de
la muestra para preparar el material amplificado para la
electroforesis y el protocolo y manual de instrucciones para el
usuario.
Figura 1: Muestra la secuencia de ADN de la
unidad repetitiva de S. mansoni. Indica, en negrita, la
localización de los cebadores específicos descritos en la presente
invención.
Figura 2: Demuestra la sensibilidad de la PCR en
la detección del ADN de S. mansoni.
Figura 3: Muestra la capacidad de la técnica de
PCR de la presente invención para amplificar el ADN de diversas
especies de Schistosoma sp., incluyendo las tres especies de
mayor importancia clínica y epidemiológica en el mundo: S.
mansoni, S. japonicum y S. heamatobium.
Figura 4: Muestra la especificidad de la PCR de
la presente invención.
Figura 5: Ilustra la comparación en términos de
sensibilidad entre la PCR de la presente invención y la prueba
parasitológica para el diagnóstico de S. mansoni en heces
humanas.
Figura 6: Muestra la detección, mediante PCR, del
ADN de S. mansoni en muestras fecales de pacientes
infectados.
Figura 7: Muestra la detección, mediante PCR, del
ADN de S. mansoni en muestras de suero humano.
Para facilitar la comprensión de la invención,
las siguientes son las definiciones fácilmente aceptables de
algunos términos usados en esta descripción:
1. Cebadores: oligonucleótido sintético
monocatenario, usado normalmente por parejas, en hibridación con
hebras complementarias a una sección de ADN. Los extremos
interiores del complejo cebador/molde de ADN se usan por la ADN
polimerasa como puntos de inicio de la síntesis en la PCR.
2. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR):
técnica que implica la aplicación de ciclos de desnaturalización,
hibridación con el cebador y extensión con una ADN polimerasa
termoestable, por ejemplo la Taq ADN polimerasa, para amplificar
una secuencia objetivo de ADN. El proceso de PCR para amplificar
ácidos nucleicos se describe en los documentos US 4683195 y US
4683202.
Una elección inadecuada de cebadores puede
producir diversos efectos indeseables, tales como: imposibilidad de
amplificación, amplificación en diversos sitios, formación de
dímeros de cebadores, entre otros, haciendo no informativa la
reacción de amplificación.
El objeto de la presente invención se realiza por
la amplificación, mediante PCR, de una región específica del genoma
de Schistosoma sp. y posterior separación por electroforesis
de los productos de esta amplificación, seguido de técnicas
apropiadas de tinción que permitan una visualización adecuada del
ADN en el gel, incluyendo, pero sin limitarse a: tinción con sales
de plata, radioisotópos y enzimas combinadas con sustratos que
permitan su detección, sin los efectos indeseables mencionados
antes.
El procedimiento de la presente invención se
puede emplear para la detección del ADN del género
Schistosoma en cualquier muestra biológica que contenga
células o ADN libre del parásito con suficiente integridad para ser
amplificado por PCR. Algunas muestras, tales como las heces y la
orina, necesitan someterse a algún tipo de tratamiento de modo que
se puedan romper las membranas o cubiertas que eventualmente puedan
encerrar el ADN en la célula del parásito, liberando el ADN en
disolución. Otras muestras, por ejemplo el suero de personas
infectadas, ya contiene las moléculas libres y no necesitan tal
tratamiento. Por lo general, las membranas se pueden romper
mediante el uso de sustancias químicas especiales, tales como
detergentes y sales caotrópicas, o usando procedimientos físicos y
mecánicos, tales como presión osmótica inducida y sonicación. Tras
la ruptura de las membranas celulares, el ADN se debe aislar de
otras moléculas celulares, lo que se puede realizar también mediante
procesos fisicoquímicos, tales como precipitación por etanol o con
el uso de matrices de sílice.
Una vez libre en disolución, el ADN se puede
detectar en la muestra tras amplificación por PCR. Preferiblemente,
el ADN se debe purificar empleando técnicas estándar para la
eliminación de posibles sustancias que inhiban la reacción de
amplificación.
Tras la extracción, el ADN se amplifica de forma
selectiva por la reacción en cadena de la polimerasa. Mediante la
PCR, una secuencia específica del genoma de Schistosoma sp.
se copia selectivamente millones de veces, permitiendo la detección
del ADN del parásito. La reacción es un proceso secuencial que
precisa de al menos dos cebadores, pequeñas secuencias de ADN
complementarias con el ADN del parásito, que se extenderá de manera
enzimática, exhibiendo una copia fiel de este ADN. Al añadir
grandes cantidades de cebadores, junto con otros reactivos
necesarios, se obtienen millones de copias del ADN del parásito. Los
cebadores de PCR empleados en el presente documento se diseñaron
especialmente para esta invención, según la secuencia altamente
repetitiva original del genoma de S. mansoni, como se
describe en la ID SEC Nº 1 y se ilustra también en la figura 1. Se
comprenderá que se pueden construir otros cebadores con secuencias
de nucleótidos que comprendan la ID SEC Nº 2 y la ID SEC Nº 3.
Preferiblemente, cada cebador del par se
construye de tal modo que sea sustancialmente complementario a una
hebra diferente de la secuencia que flanquea la secuencia
específica del genoma de Schistosoma sp. que se va a
amplificar. Por tanto, un cebador de cada par es suficientemente
complementario por ser capaz de hibridar con una parte de la
secuencia en sentido y el otro cebador de cada par es también
suficientemente complementario por hibridar con una parte diferente
de la misma secuencia en antisentido. A pesar de que la secuencia
del cebador no requiere necesariamente reflejar la secuencia exacta
del molde, cuanto más se corresponda la secuencia 3' terminal a la
secuencia exacta, mejor será la unión durante la etapa de
apareamiento de la reacción en cadena de la polimerasa.
Los cebadores se pueden preparar por cualquier
procedimiento apropiado conocido para aquellos expertos en la
técnica, e incluye, por ejemplo, la clonación y digestión de las
secuencias adecuadas y la síntesis química directa.
El producto de la amplificación promovida por la
PCR es un fragmento, o una serie de fragmentos de ADN de diferentes
tamaños que se pueden separar por electroforesis, seguido de
técnicas apropiadas de tinción que permitan una visualización
adecuada del ADN en el gel. Debido a la gran especificidad de la
PCR, el ADN amplificado del parásito se puede diferenciar del resto
de productos de amplificación según su tamaño específico. De este
modo, la mayoría de las veces se puede determinar la presencia o
ausencia de la infección, simplemente por análisis visual de los
productos amplificados, en consecuencia, por la presencia o no del
fragmento con un peso correspondiente al del parásito. En la
presente invención, la PCR se emplea para amplificar y visualizar un
fragmento específico de ADN descrito originalmente en S.
mansoni, y amplificar también regiones específicas de otras
especies de Schistosoma, llegando a la conclusión de que la
región repetitiva y específica del ADN verificado originalmente en
S. mansoni y descrito en la ID SEC Nº 1 es común a todas las
otras especies de Schistosoma.
La amplificación de la región específica del
genoma de Schistosoma sp. se realiza mediante PCR, con los
cebadores especialmente construidos para usarse en la presente
invención y definidos en la tabla 1, que son capaces de amplificar
la secuencia de S. mansoni o secuencias homólogas de otras
especies de Schistosoma.
El kit de la presente invención incluye todos los
reactivos necesarios para permitir la detección de cualquier
infección causada por helmintos del género Schistosoma. El
kit como se define en la reivindicación 5 comprende cebadores
específicos para una región específica del genoma de Schistosoma
sp. como se muestra en la tabla 1 y, por lo tanto, también se
suministran los reactivos y aditivos usados normalmente en la
técnica de PCR, por ejemplo los nucleótidos apropiados, tales como
dGTP (desoxiguanidina trifosfato), dATP (desoxiadenosina
trifosfato), dCTP (desoxicitidina trifosfato) y dTTP
(desoxitimidina trisfosfato); disolución tampón apropiada (por
ejemplo Tris-HCl de 10 a 20 mM, KCl de 50 a 60 mM,
MgCl_{2}de 1,5 a 2,0 mM, pH 8,0 a 8,5); Taq ADN polimerasa,
preferiblemente. También se suministrará una cantidad determinada
de ADN para usarse como control positivo de la reacción, junto con
un manual de instrucciones que contiene el protocolo que se va a
usar en la prueba, con un diagrama ilustrativo de los resultados
que se esperan.
La presente invención se describe detalladamente
en relación a los siguientes ejemplos. Se debe comprender que la
presente invención no se limita a estos ejemplos, ya que también
incluye variaciones y modificaciones dentro del alcance de las
reivindicaciones.
Se extrajeron los huevos de S. mansoni de
los hígados de ratones infectados previamente con 100 cercarias, y
se almacenaron en solución salina al 0,9% a - 20ºC hasta que se
usaron (Pellegrino y Siqueira, 1956, Rev. Bras. Malar. 8: 589).
Para la ruptura de los huevos, se mezclaron 10 \mul de la solución
salina que contenía 100.000 huevos/ml con 90 \mul de agua
destilada y se sometió a la disolución final a 5 minutos de
agitación en una mezcladora mecánica. Esta mezcla, que contenía los
huevos fracturados, se usó directamente en la extracción del
ADN.
Se diluyeron 100 \mul de la disolución con los
huevos fracturados en 200 \mul de tampón que contenía
Tris-base 10 mM, pH 8,0; EDTA 270 mM, pH 8,0;1% de
dodecilsulfato sódico (SDS); 1% de polivinilpirrolidona (PVP). Esta
mezcla se incubó a 95ºC durante 20 minutos, con una rápida
agitación manual tras los primeros 10 minutos de incubación y,
después se centrifugó durante 10 minutos a 8000 g a temperatura
ambiente. El ADN contenido en la espuma se precipitó con etanol, se
retiró la espuma y se incubó el precipitado durante 15 minutos a
37ºC para la evaporación del alcohol residual y después se
resuspendió en tampón T.E. (Tris 10 mM, pH 8,0; EDTA 1 mM, pH 8,0).
Luego se cuantificó el ADN mediante densidad óptica midiendo a 260
nm, y se almacenó a -20ºC hasta que se usó en la PCR.
Brevemente, se sometió 1 \mul de ADN extraído a
amplificación en un tubo de reacción que contenía tampón de PCR
(Tris-HC1 20 mM pH 8,0, KCl 50 mM, MgCl_{2} 1,5
mM), dNTP 200 \muM (desoxinucleótidos), cada cebador a 0,5 M y
0,75 unidades de la enzima Taq polimerasa, en un volumen total de 10
\mul. La reacción de amplificación suponía la desnaturalización
del ADN bicatenario del parásito ADN a 95ºC durante 45 segundos y
la hibridación con el cebador a 63ºC durante 30 segundos. Estas dos
etapas se repitieron de forma secuencial en 35 ciclos consecutivos.
En el primer ciclo, la etapa de desnaturalización se prolongó
durante cinco minutos, para asegurar una completa desnaturalización,
y en el último ciclo se incluyó una etapa adicional, a 72ºC durante
2 minutos, para finalizar la extensión de los restantes cebadores
de hibridación.
La figura 2 muestra el patrón electroforético
obtenido a partir de la amplificación del ADN de S. mansoni
y, también, la sensibilidad máxima obtenida para la detección de
este ADN. En el carril M está es marcador de peso molecular; en los
carriles 1 a 5: 20, 10, 5, 1 y 0,5 \mug de ADN, respectivamente.
La reacción por PCR fue capaz de detectar por debajo de 1 \mug de
ADN de S. mansoni. La figura 3 muestra el patrón
electroforético obtenido tras la amplificación del ADN de otras
cinco especies del género Schistosoma, amplificadas con los
mismos cebadores y a las mismas condiciones de PCR que se usaron
para S. mansoni. Carril M: marcador de peso molecular;
carril 1: ADN de S. mansoni; carril 2: S. haematobium;
carril 3: S. japonicum (cepa de Filipinas); carril 4: S.
japonicum (cepa de Japón); carril 5: S. matthei; carril
6: S. bovis; carril 7: S. leipperi; carril 8: control
negativo. La reacción de PCR fue capaz de amplificar el ADN de
todas las especies de Schistosoma sp. probadas. La figura 4
muestra el intento de amplificar el ADN de gusanos de otros géneros,
también en las mismas condiciones usadas para S. mansoni.
Carril M: marcador de peso molecular; carril 1: control positivo
(ADN de S. mansoni); carril 2: Ascaris lumbricoides;
carril 3: Ancilostoma duodenalis; carril 4: Taenia
solium; carril 5: Trichiuris trichiuria. No se puede
visualizar producto de amplificación cuando se usa el ADN de
gusanos de otros géneros. La PCR descrita en esta invención es, por
tanto, específica para el Schistosoma.
En estos experimentos, los huevos contenidos en
las heces infectadas (de forma natural o artificial) se rompieron
del modo descrito en el ejemplo 1. El ADN se extrajo después de las
heces por la misma técnica usada para la extracción de ADN a partir
de huevos puros de S. mansoni (Ejemplo 2).
Tras la extracción, 1 \mul de S. mansoni
(diluido 100 veces) se amplificó con los mismos cebadores y en las
mismas condiciones descritas en el ejemplo 3. La figura 5 muestra
los productos de la amplificación del ADN de S. mansoni en
heces infectadas de forma artificial con los huevos del parásito.
Brevemente, 100 mg de una muestra fecal de un paciente, conteniendo
216 huevos/g, se mezcló con 900 mg de heces negativas, formando una
muestra con una concentración esperada de aproximadamente 20
huevos/g. Se repitió este procedimiento dos veces más con 2 y 0,20
huevos/g, aproximadamente. Después se sometió a una alícuota de
cada muestra al análisis por el método Kato-Katz y a
la detección del ADN del parásito mediante la PCR de la invención,
con la finalidad de comparar la sensibilidad de los dos
procedimientos. En el carril M está el marcador de peso molecular;
carril 1: control positivo (0,1 ng de ADN de huevo de
S.mansoni); carriles 2 a 5: ADN amplificado de muestras que
contenían 200, 48, 4,8 y 0,48 huevos/g de heces, respectivamente.
La PCR fue capaz de detectar el ADN de S. mansoni por debajo
de la muestra que contenía aproximadamente 4,8 huevos/g, mientras
que la sensibilidad del método Kato-Katz fue de 48
huevos/g, por lo tanto, 10 veces menor.
La figura 6 muestra el resultado de la
amplificación del ADN de S. mansoni en heces de pacientes
con diversas concentraciones de parásitos, determinadas previamente
por el método Kato-Katz. Carril M: marcador de peso
molecular; carril 1: control positivo; carriles 2 a 9: muestras de
heces humanas conteniendo 0,96; 0,168; 432; 600; 96; 912 y 72
huevos/g, respectivamente. El resultado de la PCR fue consistente
con el obtenido por la prueba parasitológica en todas las
muestras.
Se purificó el ADN de 4 muestras de suero usando
100 \mul/muestra empleando el sistema Glass-max®
de aislamiento de ADN con cartucho rotacional (Life Technologies),
de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después se usaron
2 \mul de este ADN en la amplificación por PCR, en las mismas
condiciones descritas anteriormente. Se usó el suero de personas
examinado previamente por el método Kato-Katz, con
2 muestras positivas y 2 muestras negativas.
La figura 7 muestra el resultado de esta
amplificación. En la banda M está el marcador de peso molecular;
carril 1: control positivo; carriles 2 a 5: suero de personas que
contenía 0, 96, 0 y 216 huevos/g de heces, respectivamente.
1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- I.a)
- Solicitante: Fundaçao Oswaldo Cruz
\vskip0.500000\baselineskip
- I.b)
- Dirección: Av. Brasil, 4365, Castelo Mourisco,
\hskip4,4cmsala 05, Manguinhos - 21045-900 -
\hskip4,4cmRío de Janeiro - RJ
\vskip0.800000\baselineskip
- II)
- Título de la invención: "PROCEDIMIENTO Y KIT PARA LA DETECCIÓN DE ESQUISTOSOMIASIS MEDIANTE LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA "
\vskip0.800000\baselineskip
- III)
- Número de secuencias: 3 (tres).
\vskip0.800000\baselineskip
- IV)
- Forma legible por ordenador:
\vskip0.500000\baselineskip
- IV.a)
- Tipo de medio: disquete - 3,5 pulgadas.
\vskip0.500000\baselineskip
- IV.b)
- Ordenador: IBM compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- IV.c)
- Sistema operativo: PC-DOS/MS-DOS.
\vskip1.000000\baselineskip
2) INFORMACIÓN GENERAL DE LAS SECUENCIAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- I.a)
- Número ID de la secuencia: ID SEC 1
\vskip0.800000\baselineskip
- II)
- Características de la secuencia:
\vskip0.500000\baselineskip
- II.a)
- Longitud: 120
\vskip0.500000\baselineskip
- II.b)
- Tipo: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- II.c)
- tipo de hebra: doble hebra
\vskip0.500000\baselineskip
- II.d)
- topología: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- III)
- Posición en el genoma:
\vskip0.500000\baselineskip
- III.a)
- posición en el mapa:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- I.a)
- Número ID de la secuencia: ID SEC 2
\vskip0.800000\baselineskip
- II)
- Características de la secuencia:
\vskip0.500000\baselineskip
- II.a)
- longitud: 20
\vskip0.500000\baselineskip
- II.b)
- tipo: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- II.c)
- tipo de hebra: hebra única
\vskip0.500000\baselineskip
- II.d)
- topología: lineal F (sentido)
\vskip0.800000\baselineskip
- III)
- Posición en el genoma:
\vskip0.500000\baselineskip
- III.a)
- posición en el mapa:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGATCTGMTCCGACCAACCG
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- I.a)
- Número ID de la secuencia: ID SEC 3
\vskip0.800000\baselineskip
- II)
- Características de la secuencia:
\vskip0.500000\baselineskip
- II.a)
- longitud: 20
\vskip0.500000\baselineskip
- II.b)
- tipo: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- II.c)
- tipo de hebra: hebra única
\vskip0.500000\baselineskip
- II.d)
- topología: lineal R (antisentido)
\vskip0.800000\baselineskip
- III)
- Posición en el genoma:
\vskip0.500000\baselineskip
- III.a)
- posición en el mapa:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATATTAACGCCCACGCTCTC
\hfill
Claims (5)
1. Procedimiento para la detección de parásitos
del género Schistosoma en una muestra biológica,
caracterizado porque se detecta una región específica del
ADN del género Schistosoma como la descrita en la ID SEC Nº
1, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:
- a)
- extracción del ADN de Schistosoma sp. a partir de una muestra biológica;
- b)
- amplificación por PCR de una región específica de dicho ADN de Schistosoma obtenido en la etapa a), con cebadores oligonucleotídicos que comprenden la ID SEC Nº 2 y la ID SEC Nº 3 adecuados para PCR, y son capaces de amplificar la ID SEC Nº 1 y secuencias homólogas comunes a S. mansoni, S. haematobium, S. japanicum, S. matthei, S. bovis y S. leipperi;
- c)
- separación de los productos de PCR obtenidos en la etapa b) mediante electroforesis, seguido de visualización.
2. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que los productos amplificados de la etapa
b) se separan mediante electroforesis en un gel de poliacrilamida y
se visualizan mediante tinción con sales de plata u otros sistemas
de visualización.
3. Un cebador oligonucleotídico adecuado para
PCR, para la amplificación del ADN de Schistosoma sp. que
comprende la ID SEC Nº 2 o la ID SEC Nº 3, y que es capaz de
amplificar la ID SEC Nº 1 y secuencias homólogas comunes a S.
mansoni, S. haematobium, S. japanicum, S. matthei, S. bovis y
S. leipperi.
4. El cebador oligonucleotídico de acuerdo con la
reivindicación 3 constituido por la ID SEC Nº 2 o la ID SEC Nº
3.
5. Un kit para su uso en el diagnóstico de la
infección por Schistosoma sp. en una muestra biológica,
comprendiendo dicho kit cebadores oligonucleotídicos que comprenden
la ID SEC Nº 2 y la ID SEC Nº 3, adecuados para PCR, y que son
capaces de amplificar la ID SEC Nº 1 y secuencias homólogas comunes
a S. mansoni, S. haematobium, S. japanicum, S. matthei, S.
bovis y S. leipperi, y todos los reactivos necesarios
para realizar la PCR.
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