NL193663C - Werkwijze en kit voor het detecteren van een specifiek nucleïnezuur in een monster. - Google Patents
Werkwijze en kit voor het detecteren van een specifiek nucleïnezuur in een monster. Download PDFInfo
- Publication number
- NL193663C NL193663C NL8500424A NL8500424A NL193663C NL 193663 C NL193663 C NL 193663C NL 8500424 A NL8500424 A NL 8500424A NL 8500424 A NL8500424 A NL 8500424A NL 193663 C NL193663 C NL 193663C
- Authority
- NL
- Netherlands
- Prior art keywords
- nucleic acid
- nucleic acids
- series
- detected
- dna
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
- C12Q1/705—Specific hybridization probes for herpetoviridae, e.g. herpes simplex, varicella zoster
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
- C12Q1/682—Signal amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
- C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
Description
1 193663
Werkwijze en kit voor het detecteren van een specifiek nucleïnezuur in een monster
De uitvinding betreft een werkwijze voor het detecteren van een specifiek nucleïnezuur in een monster door middel van sandwich hybridisatie van nucleïnezuren, waarbij aan een vaste drager gehechte nucieïnezuren 5 worden gebruikt voor het met de vaste drager verbinden van het te detecteren nucleïnezuur en gelabelde nucleïnezuren worden gebruikt voor het labelen van het te detecteren nucleïnezuur, waarbij de aan een vaste drager gebonden nucleïnezuren en de gelabelde nucleïnezuren complementair zijn aan van elkaar verschillende gebieden van het te detecteren nucleïnezuur.
Tevens betreft de uitvinding een kit voor het detecteren van een specifiek nucleïnezuur in een monster 10 door middel van sandwich hybridisatie van nucleïnezuren, waarbij de kit aan een vaste drager gehechte nucleïnezuren en gelabelde nucleïnezuren bevat, waarbij de aan een vaste drager gebonden nucleïnezuren en de gelabelde nucleïnezuren complementair zijn aan van elkaar verschillende gebieden van het te detecteren nucleïnezuur.
Een dergelijke werkwijze en kit zijn bekend uit de in 1983 gepubliceerde Europese octrooiaanvrage nr.
15 79139. Daarin wordt voor het detecteren van een nucleïnezuur in een monster een sandwich hybridisatie voorgesteld onder toepassing van een tweetal nucleïnezuren, te weten een aan een vaste drager gehecht oligonucleotide en een gelabeld oligonucleotide, die elk complementair zijn aan een ander gedeelte van het te detecteren nucleïnezuur. Deze nucleïnezuren worden in enkelstrengsvorm toegepast, zodat ze kunnen hybridiseren met het eveneens enkelstrengs te detecteren nucleïnezuur.
20 Een van de voorbeelden in deze Europese octrooiaanvrage betreft de detectie van adenovirus DNA.
Voor de bereiding van het voor immobilisatie dienende nucleïnezuur wordt een bepaald, met het restrictie-enzym BamHI uit het DNA van adenovirus verkregen fragment, opgenomen in het met BamHI geopende plasmide pBR322. Na selectie en klonen wordt het recombinant plasmide enkelstrengs gemaakt door het 5 min. te koken in 0,2N NaoH en daarna wordt het gehecht aan een nitrocellulosefilter. Bij het koken in 0,2N 25 NaoH treedt enige fragmentatie op van het recombinant plasmide. Als het voor labeling dienende nucleïnezuur wordt een met 12Sl-radioactief gelabeld, ander enkelstreng BamHI fragment van adenovirus DNA gebruikt, dat is opgenomen in de faag M13mp7 als vector.
De hybridisatie vond plaats in een 50% formamide oplossing met 4 x SSC (SSC = 0,15M NaCI en 0,015 M Nacitraat), 1% Na dodecylsulfaat (SDS) en 0,5 mg/ml zalmsperma DNA of kalf thymus DNA bij 37°C 30 gedurende 16-20 uur. De gevoeligheid, met name de detectiegrens, van deze bekende sandwich hybridisatie methode is voor verbetering vatbaar.
De onderhavige uitvinding verschaft een werkwijze en kit die een betere gevoeligheid, in de zin van een lagere detectiegrens, tot stand brengen.
Daartoe verschaft de uitvinding een werkwijze zoals in de aanhef vermeld, die gekenmerkt wordt doordat 35 de aan de vaste drager gehechte nucleïnezuren, die een lengte hebben van ten minste 15 nucleotiden, aanwezig zijn in een reeks (a, ... an) en complementair zijn met n verschillende gebieden in het te detecteren nucleïnezuur, waarbij n ten minste 2 is en de gelabelde nucleïnezuren, die een lengte hebben van ten minste 15 nucleotiden, aanwezig zijn in een reeks (b, ... bn.) en complementair zijn met n’ verschillende, andere gebieden in het te detecteren nucleïnezuur, waarbij n’ ten minste 2 is en waarbij de 40 gebieden van het te detecteren nucleïnezuur die complementair zijn met de reeks (a., ... an) alterneren met gebieden van het te detecteren nucleïnezuur die complementair zijn met de reeks (b1 ... b„.) en deze gebieden in hoofdzaak direct op elkaar aansluiten, terwijl verschillende nucleïnezuren uit de reeks (a,... an) met elkaar kunnen zijn verbonden en/of verschillende nucleïnezuren uit de reeks (b-, ... bn.) met elkaar kunnen zijn verbonden.
45 Tevens verschaft de uitvinding een kit zoals in de aanhef verwoord, die gekenmerkt wordt doordat de aan de vaste drager gehechte nucleïnezuren, die een lengte hebben van ten minste 15 nucleotiden, aanwezig zijn in een reeks (a, ... an) en complementair zijn met n’ verschillende gebieden in het te detecteren nucleïnezuur, waarbij n ten minste 2 is en de gelabelde nucleïnezuren, die een lengte hebben van ten minste 15 nucleotiden, aanwezig zijn in een reeks (b, ... b„.) van en complementair zijn met n’ 50 verschillende, andere gebieden in het te detecteren nucleïnezuur, waarbij n’ ten minste 2 is, en waarbij de gebieden van het te detecteren nucleïnezuur die complementair zijn met de reeks (a, ... an) alterneren met gebieden uit de reeks (b, ... bn.) en deze gebieden in hoofdzaak direct op elkaar aansluiten, terwijl verschillende nucleïnezuren uit de reeks (a1 ... an) met elkaar kunnen zijn verbonden en/of verschillende nucleïnezuren uit de reeks (b., ... bn.) met elkaar kunnen zijn verbonden.
55 De uitvinding leidt tot een hogere gevoeligheid doordat, dankzij het gebruik van meerdere aan de drager gehechte en aan het te detecteren nucleïnezuur door hybridisatie gebonden nucleïnezuren en meerdere op alternerende plaatsen aan het te detecteren nucleïnezuur door hybridisatie gebonden gelabelde nucleïnezu- 193663 2 ren een grotere hoeveelheid gelabelde nucleïnezuren aan de sandwich wordt gebonden.
De uitvinding en de stand der techniek zijn toegelicht in figuren 1 respectievelijk 2. In deze figuren stelt v het van de vector afgeleide DNA voor, x het te detecteren nucleïnezuur,b het gelabelde nucleïnezuur (de DNA- of RNA-probe), a het identificerende aan de drager gehechte nucleïnezuur, F het als drager 5 fungerende filter, en (1) de hybridisatie verbindingspunten. Aangezien de nucleïnezuren die in figuur 1 als a,, a2 en a3 en in de figuren 9 en 11 als a, en a2 zijn aangeduid, in werkelijkheid op willekeurige plaatsen en in willekeurige richtingen aan de drager zullen zijn gehecht, is de keurige plaatsing in overeenstemming met de plaatsen van het te detecteren nucleïnezuur waarbij hybridisatie kan optreden zoals aangegeven in deze figuren niet geheel reëel. Door de bijzonder flexibele vorm van het te detecteren nucleïnezuur zullen 10 echter na enige tijd vrijwel alle plaatsen die kunnen hybridiseren met nucleïnezuren via de reeks in contact hiermee zijn gekomen indien de dichtheid van de nucleïnezuren van de a-reeks op de drager ten minste voldoende groot is.
Wanneer verschillende DNA of RNA probe’s worden toegepast, neemt de hoeveelheid gelabelde nucleïnezuren die door hybridisatie aan het te detecteren nucleïnezuur worden gebonden toe. Op deze 15 wijze zijn de hybriden makkelijker te detecteren.
Wanneer de reeks van nucleïnezuur-fragmenten volgens de uitvinding gebruikt wordt in sandwich-hybridisatie-methoden, zijn minstens twee, of zoals figuur 1 laat zien, drie, identificerende nucleïnezuur-fragmenten gebonden aan de vaste drager. In dit geval kunnen de verschillende gebieden van de nucleïnezuur-streng x, die gedetecteerd moet worden, hybridiseren met de nucleïnezuur-fragmenten die 20 gebonden zijn aan de vaste drager, bijvoorbeeld a„ a2 en a3, op één of enkele plaatsen, afhankelijk van de graad van de reactie. Wanneer de reactie de laatste fase bereikt, kan een situatie zoals in figuur 1 verkregen worden, waarin de streng x een lus of lussen vormt, waarmee de DNA-probe of DNA-probe’s, bijvoorbeeld b., en b2 in figuur 1, hybridiseren. De aldus gevormde hybride is stabieler dan de hybride gevormd door één reagens-paar (stand van de techniek), zoals figuur 2 laat zien. De van de vector 25 afgeleide gedeelten van een hybride, gevormd uit één reagenspaar, worden gemakkelijk afgebroken door bijvoorbeeld mechanische belasting, zoals schudden. In een dergelijk geval ontsnapt het label dat al gebonden was aan de hybride.
Daar de werkwijze en kit volgens de uitvinding gevoeliger zijn dan die volgens de stand van de techniek zijn ze beter geschikt om chromosomale herrangschikkingen en erfelijke ziekten aan te tonen.
30
De uitvinding wordt meer in detail beschreven in de volgende beschrijving en in de tekeningen, waarin Figuur 1 een reeks sandwich-hybriden laat zien,
Figuur 2 aan sandwich-hybride volgens de stand van de techniek afbeeldt,
Figuur 3 de plaatsen van twee alternerende series van nucleïnezuur-fragmenten laat zien in een 35 nucleïnezuur dat gekozen is voor de bereiding van een reeks nucleïnezuren volgens de uitvinding,
Figuur 4 een reeks nucleïnezuur-fragmenten volgens figuur 3 laat zien, gescheiden (a), met elkaar verbonden (b) en zowel gescheiden als met elkaar verbonden (c),
Figuur 5 een reeks sandwich-hybriden laat zien,
Figuur 5a een reeks sandwich-hybriden laat zien, die gevormd wordt wanneer gescheiden fragmenten 40 worden gebruikt,
Figuur 5b een reeks sandwich-hybriden laat zien, die gevormd wordt wanneer verbonden b-fragmenten worden gebruikt,
Figuur 5c een reeks sandwich-hybriden laat zien, die gevormd wordt wanneer zowel gescheiden als verbonden fragmenten worden gebruikt, 45 Figuur 6 een reeks nucleïnezuren laat zien, die verschillende nucleïnezuren identificeren,
Figuur 7 een reeks sandwich-hybriden laat zien, die gevormd worden wanneer de reeks nucleïnezuren volgens figuur 6, die de verschillende nucleïnezuren identificeert, gebruikt wordt,
Figuur 8 het recombinant-plasmide pKTH 1220 laat zien,
Figuur 9 een reeks sandwich-hybriden laat zien, die gevormd wordt wanneer een reeks van 50 nucleïnezuur-fragmenten bereid uit het recombinant-plasmide pKTH 1220 wordt gebruikt,
Figuur 10 het recombinant-plasmide pKTH 1271 laat zien,
Figuur 11 een reeks sandwich-hybriden laat zien, wanneer reeksen van nucleïnezuur-fragmenten, bereid uit het recombinant plasmide pKTH 1271, worden gebruikt.
55 De onderhavige uitvinding maakt gebruik van nucleïnezuren die in een reeks nucleïnezuur-fragmenten worden gesplitst. Zo’n reeks bestaat uit ten minste 4 maar zelfs tot 20 fragmenten, die voldoende complementair zijn met gedeelten van het te detecteren nucleïnezuur in enkelstrengsvorm om daarmee te kunnen 3 193663 hybridiseren. Deze fragmenten worden alternerend gehecht aan een vaste drager en gelabeld. Hierdoor worden twee series van alternerende reeksen van nucleïnezuur-fragmenten verkregen, die niet homoloog met elkaar mogen zijn.
De reeksen van nucleïnezuurfragmenten kunnen synthetisch bereid worden door volledig geautomati-5 seerde apparaten na vaststelling van de nucleïnezuur-sequentie van het te detecteren nucleïnezuur.
De reeksen nucleïnezuur-fragmenten kunnen verbonden zijn met een vector, gedeelten van vectoren bevatten, of geheel zonder vector-gedeelten zijn.
De gebruikte nucleïnezuur-fragmenten hebben een minimum-lengte van 15 nucleotiden. Er is geen feitelijke bovengrens wat betreft lengte, maar het is gunstig fragmenten te gebruiken die een lengte van 10 20-5000 nucleotiden hebben. De nucleïnezuur-fragmenten volgens de uitvinding worden afgeleid hetzij van het te detecteren nucleïnezuur hetzij van een gedeelte van dit nucleïnezuur. Zij kunnen bijvoorbeeld worden verkregen uit een kloon van een nucleïnezuur dat uit een relatief groot gedeelte van een genoom bestaat en verbonden is met een vector. De reeksen nucleïnezuur-fragmenten volgens de uitvinding kunnen fragmenten bevatten die afgeleid zijn van twee of meer onafhankelijke genomen die niet direct aangrenzend zijn. De 15 zo bereide reeksen nucleïnezuurfragmenten kunnen worden gecombineerd en gebruikt voor het detecteren van meer dan één genoom. De reeksen van nucleïnezuur-fragmenten kunnen ook geïsoleerd worden uit een DNA dat niet geheel identiek is met het te identificeren nucleïnezuur, maar voldoende homoloog is om een stabiele hybride te vormen met het te detecteren nucleïnezuur. De bereiding van geschikte reeksen van nucleïnezuur-fragmenten is niet beperkt tot de isolatie van geschikte nucleïnezuurfragmenten uit het 20 genoom. De deskundige kan reeksen nucleïnezuur-fragmenten bereiden door synthetische of semisynthe-tische methoden.
De nucleïnezuren worden zodanig bereid, dat twee series van alternerende nucleïnezuur-fragmenten an, a2, a3, etc. en b1, b2, b3, etc., verkregen worden. De nucleïnezuur-fragmenten behorende tot de serie a,, a2, a3, etc., bestaan uit fragmenten die dicht bij elkaar liggen, maar niet alle aan elkaar grenzen. De 25 nucleïnezuur-fragmenten behorende tot de serie b.,, b2, b3, etc., bestaan eveneens uit nucleïnezuurfragmenten die dicht bij elkaar liggen, maar niet alle aan elkaar grenzen. De nucleïnezuur-fragmenten behorende tot de serie av a2, a3, etc., en die behorende tot de serie b.,, b2, b3, etc., mogen niet homoloog met elkaar zijn. Het verdient de voorkeur dat de nucleïnezuren behorende tot de serie a„ a2, a3, etc., en die behorende tot de serie b1t b2, b3, etc., geïsoleerd worden op een zodanige wijze, dat ieder eerste fragment van een 30 opvolgend paar tot de a-serie behoort en ieder tweede tot de b-serie, zoals figuur 3 laat zien. In figuur 3 zijn a1f a2, a3, en bn, b2, b3, reeksen nucleïnezuurfragmenten die voldoende homoloog zijn met het te detecteren nucleïnezuur. Het verdient de voorkeur dat de alternerende twee nucleïnezuren elkaar direct volgen, maar dit is geen absoluut vereiste voor de uitvinding.
De hierboven beschreven nucleïnezuur-fragment-series kunnen gebruikt worden hetzij als gescheiden 35 fragmenten a1( a2, a3, etc., en b1f b2, b3, etc. (figuur 4a) hetzij met elkaar verbonden tot langere ketens ara2-a3, etc., en b^ba-bg, etc. (figuur 4b). Het is natuurlijk mogelijk om allerlei soorten van intermediaire vormen te bereiden, zoals bijvoorbeeld een a-serie waarin a, een gescheiden fragment is en a2-a3 met elkaar verbonden zijn, en in de b-serie zijn bijvoorbeeld brb2 met elkaar verbonden en is b3 gescheiden, etc., zoals figuur 4c laat zien.
40 Figuur 5 beeldt verschillende reeksen sandwich-hybriden uit. Figuur 5a laat een reeks sandwich-hybriden zien waarin de reeksen nucleïnezuurfragmenten gescheiden zijn. Figuur 5b laat een reeks hybriden zien, waarin de gelabelde reeks nucleïnezuur-fragmenten met elkaar verbonden zijn. Figuur 5c beeldt een geval uit waarin een reeks sandwich-hybriden gevormd is uit zowel gebonden als gescheiden gelabelde reeksen nucleïnezuur-fragmenten. In figuur 5 stelt x het te detecteren nucleïnezuur voor, stellen b,, b2 en b3, de 45 gelabelde probe’s voor, en stellen a1( a2, en a3 de nucleïnezuur-fragmenten voor die aan een vaste drager gehecht zijn. Gelabelde nucleïnezuur-fragmenten behorende tot de b-serie kunnen zodanig met elkaar verbonden zijn dat één gelabeld nucleïnezuur wordt verkregen, d.i. de probe B. Aan een vaste drager gehechte nucleïnezuren behorende tot de a-serie kunnen zodanig met elkaar verbonden zijn dat één nucleïnezuur A, gehecht aan een vaste drager, verkregen wordt.
50 Dergelijke nucleïnezuur-paren B en A, respectievelijk gelabeld en gebonden aan een vaste drager, kunnen afzonderlijk bereid worden voor enkele verschillende te detecteren nucleïnezuren. Ze kunnen gecombineerd worden tot geschikte nucleïnezuur-combinaties, die bestaan uit verschillende nucleïnezuur-paren B, en A1( B2 en A2, B3 en A3, etc. Reagentia die reeksen gelabelde nucleïnezuur-fragmenten bevatten die verschillende nucleïnezuren kunnen detecteren kunnen bijvoorbeeld zodanig gecombineerd 55 worden, dat een probe Bx-By-Bz verkregen wordt, die bijvoorbeeld een reeks nucleïnezuurfragmenten (b^ba-b^-fb’-ba -b3)y- (brb2-b3)z omvat, als weergegeven in figuur 6, waarin b1x, b2x en b3x verbonden gelabelde nucleïnezuur-fragmenten Bx zijn die nucleïnezuur x detecteren; b1y, b2y en b3y verbonden 193663 4 gelabelde nucleïnezuurfragmenten By zijn die nucleïnezuur y detecteren; b1z, en b3z verbonden gelabelde nucleïnezuur-fragmenten zijn die nucleïnezuur z detecteren, en v een van een vector afgeleid nucleïnezuur-gedeelte is. In plaats van gebonden reeksen nucleïnezuur-fragmenten kunnen natuurlijk ook gescheiden fragmenten, in de vorm van geschikte mengsels, gebruikt worden.
5 De reeksen sandwich-hybriden volgens figuur 7 worden verkregen door gebruik van de reagentia die in figuur 6 zijn weergegeven. Wanneer gelijktijdige detectie van enkele verschillende nucleïnezuren verlangd wordt, is het natuurlijk noodzakelijk gescheiden vaste dragers te gebruiken, waaraan nucleïnezuren van een a-reeks zijn gehecht die kunnen hybridiseren met het te detecteren nucleïnezuur zoals weergegeven in figuur 7. Figuur 7a laat een vaste drager zien die nucleïnezuur x detecteert, figuur 7b een vaste drager die 10 nucleïnezuur y detecteert, en figuur 7c een vaste drager die nucleïnezuur z detecteert. In figuur 7a, zijn btx, b2x en b3x nucleïnezuurfragmenten die gehecht zijn aan de vaste drager Fx en die het nucleïnezuur x binden. In de figuur 7b zijn b,y, b2y en b3y nucleïnezuur-fragmenten die gehecht zijn aan de vaste drager Fy en die het nucleïnezuur y binden. In de figuur 7c zijn b,z, b2z en b3z nucleïnezuur-fragmenten die gehecht zijn aan de vaste drager Fz en die nucleïnezuur z binden. In de figuur 7 zijn de gedeelten uit de b-reeks die 15 niet betrokken zijn bij de detectie van het nucleïnezuur aangeduid met de hoofdletter V. Dit zijn By en Bz in figuur 7a, Bx en Bz in figuur 7b, en Bx en By in figuur 7c. Ook in de figuur 7 worden nucleïnezuurstukken die afkomstig zijn van vectoren aangeduid als v.
De hierboven beschreven nucleïnezuurfragment-series kunnen bereid worden door op zichzelf bekende recombinant-DNA-technieken. Een aantal nucleïnezuur-fragmenten van verschillende lengten worden 20 verkregen door gebruik van restrictie-enzymen, uit het te detecteren nucleïnezuur of uit een typerend gedeelte hiervan. Indien de restrictie-kaart van het te detecteren genoom bekend is, is het mogelijk om door een juiste keuze van restrictie-enzymen het genoom in geschikte aan elkaar grenzende fragmenten te splitsen, de fragmenten van elkaar te scheiden en door klonen hun hoeveelheid te vergroten.
Wanneer het een genoom van onbekende structuur betreft, kan van een relatief groot restrictie-fragment, 25 nadat door klonen de hoeveelheid hiervan is vergroot, de restrictiekaart worden vastgesteld, waarna uit dit relatief groot fragment op bovenbeschreven wijze geschikte aan elkaar grenzende fragmenten kunnen worden verkregen.
Het is natuurlijk mogelijk combinaties van de hierboven vermelde methoden te gebruiken en enkele grote gescheiden gekloonde restrictïefragmenten als uitgangsmateriaal te gebruiken, en enkele gescheiden series 30 te bereiden, die gecombineerd worden tot geschikte combinaties.
Om te voorkomen dat bij de werkwijze volgens de uitvinding een hybridisatie optreedt tussen het vectorgedeelte van een fragment van de a serie met het vectorgedeelte van een fragment uit de b serie, waardoor de bepaling van het te detecteren nucleïnezuur wordt gestoord, dienen vectoren van fragmenten van de a serie geen sequenties gemeen te hebben met die van de b serie. Fragmenten van de serie a 35 kunnen bijvoorbeeld worden gekloond in de plasmide pBR322, terwijl fragmenten van de serie b bijvoorbeeld worden gekloond in de bacteriofaag M13. Fragmenten behorende tot de serie a kunnen met elkaar verbonden worden, en de verbonden fragmenten kunnen gekloond worden in één vector. Bijvoorbeeld an-a2, met elkaar verbonden, kunnen gekloond worden als een continue insertie in dezelfde pBR322 vector. Op een overeenkomstige wijze is het mogelijk een nucleïnezuurfragment bn-b2 te bereiden. Bij het klonen 40 verdient het de voorkeur vectoren toe te passen waarin zeer grote inserties van vreemd DNA gebonden kunnen worden. Lambdafaag en cosmide-vectoren zijn bijvoorbeeld geschikt voor dit doel.
Er zijn twee reeksen nucleïnezuur-fragmenten nodig in de sandwich-hybridisatie-methode volgens de uitvinding, een reeks nucleïnezuren gelabeld met de te identificeren labelsubstantie, d.i. een probe, en een reeks nucleïnezuren, gebonden aan een vaste drager.
45 Meestal worden radioactieve isotopen gebruikt voor het labelen van de probes. Bijvoorbeeld wordt volgens de Britse octrooipublicatie 2.034.323 en de Amerikaanse octrooischriften 4.358.535 en 4.302.204 het isotoop 32P gebruikt. Het Amerikaanse octrooischrift 4.358.535 noemt verder nog 3H en 14C. In de Europese octrooipublicatie 79.139 wordt de isotoop 125l gebruikt. Nucleïnezuur-probes zijn ook op verschillende andere manieren gemodificeerd en gelabeld. Zo worden enzymatische of enzymatisch meetbare 50 labels gebruikt (Britse octrooipublicatie 2.019.408). De Europese octrooipublicaties 70.685 en 70.687 beschrijven lichtgevende labels en label-methodes, en de Franse octrooipublicatie 2.518.755 beschrijft een immunologisch aantoonbare label. De fluorescerende chelaten van europium en van terbium beschreven in het Amerikaanse octrooischrift 4.374.120, kunnen gebruikt worden voor het labelen van nucleïnezuren. Ook de biotine-avidine-labelsubstantie beschreven door J.J. Leary e.a. (PNAS 80, 4045-4049, 1983) en in Britse 55 octrooipublicatie 2019408 is geschikt als label. Misschien zullen nieuwe labelsubstanties ontwikkeld worden, die ook geschikt zijn voor het labelen van reeksen nucleïnezuurfragmenten volgens de uitvinding.
Als vaste drager waaraan nucleïnezuren kunnen worden gehecht zijn nitrocellulose-filters bruikbaar 5 193663 (Amerikaans octrooischrift 4.358.535 en Britse octrooipublicatie 2.095.833). De DDR-octrooipublicatie 148.955 beschrijft een methode om nucleïnezuren met behulp van cyanuurchloride chemisch te binden aan cellulose of papier. Het Amerikaanse octrooischrift 4.302.204 beschrijft chemisch gemodificeerde papieren die als vaste dragers gebruikt kunnen worden. Ook nylonmembranen en gemodificeerde nitrocellucose-5 filters kunnen worden toegepast. In principe zijn er geen andere beperkingen met betrekking tot de keuze van de vaste drager dan die welke hieronder worden genoemd. Het moet mogelijk zijn nucleïnezuur in enkelstrengs vorm te hechten aan de vaste drager, op zodanige wijze dat deze enkelstrengs nucleïnezuren kunnen hybridiseren met het complementaire deel van het nucleïnezuur. De vaste drager en de hybridisatie-oplossing moeten ook gemakkelijk van elkaar te verwijderen zijn. Tevens mag de probe niet hechten aan 10 het dragermateriaal, omdat dan ten onrechte de indruk zou kunnen worden gewekt dat het te detecteren nucleïnezuur aanwezig is.
Het monster wordt op zodanige wijze behandeld dat de nucleïnezuren vrijgemaakt worden in de hybridisatieoplossing, en dat ze enkelstrengs gemaakt worden. Het enkelstrengs maken kan bijvoorbeeld worden uitgevoerd door 5 minuten te koken in ongeveer 0,17 M NaoH. Hierbij treedt ook enige fragmentatie 15 op. Opgemerkt wordt dat enkelstrengs maken van cyclische nucleïnezuur zoals recombinant-plasmiden zonder enige fragmentatie niet goed mogelijk is. De hybridisatie wordt uitgevoerd in een hybridisatieoplossing, waaraan zowel de nucleïnezuren die gebonden zijn aan de vaste drager, alsook de gelabelde nucleïnezuren zijn toegevoegd. Wanneer hybridisatie heeft plaatsgevonden, worden de vaste drager met aangehechte nucleïnezuren en de hybridisatie-oplossing van elkaar gescheiden. De vaste dragers worden 20 met een geschikte wasoplossing gespoeld. De in de gevormde sandwich-hybriden aanwezige gelabelde nucleïnezuren worden gedetecteerd door op zichzelf bekende methoden. Een radioactieve label wordt bijvoorbeeld gemeten door autoradiografie, met een scintillatie-teller of met een gamma-teller.
Verschillende mengsels kunnen gebruikt worden als hybridisatie-oplossing; voorbeelden hiervan zijn vermeld in de Europese octrooipublicatie 79.139 en het Amerikaanse octrooischrift 4.302.204. Het is 25 natuurlijk ook mogelijk andere hybridisatiemengsels te gebruiken. De hybridisatie vindt plaats bij een temperatuur van 0-80°C, maar het is gunstig een temperatuur van bijvoorbeeld 65°C te gebruiken. Voldoende hybridisatie kan optreden in een zeer korte periode, maar het is gunstig hybridisatie-perioden van bijvoorbeeld 12-20 uren te gebruiken.
De sandwich-hybridisatie-methode kan ook in 2 trappen worden uitgevoerd, in principe op dezelfde 30 manier, maar in dit geval wordt het nucleïnezuur, gebonden aan een vaste drager, eerst toegevoegd aan de hybridisatie-oplossing. Nadat hybridisatie heeft plaatsgevonden, wordt de vaste drager gewassen en wordt een tweede hybridisatie uitgevoerd waarbij het gelabelde nucleïnezuur aanwezig is.
Zoals reeds hierboven beschreven en afgebeeld in figuur 7 kan het gelabelde nucleïnezuur bestaan uit al dan niet met elkaar verbonden reeksen nucleïnezuurfragmenten homoloog met verschillende nucleïnezuren. 35 Het is mogelijk door gebruik van deze combinaties deze verschillende nucleïnezuren gelijktijdig te detecteren. De verschillende nucleïnezuren die gebonden zijn aan een vaste drager, moeten natuurlijk gescheiden gehouden worden om de detectie succesvol te laten zijn.
Hybridisatie onder toepassing van reeksen nucleïnezuurfragmenten kan worden toegepast voor het identificeren van diverse menselijke, dierlijke en plantaardige pathogene microörganismen. Door de methode 40 is het mogelijk microörganismen te identificeren die als zij aanwezig zijn in etenswaren, voedselvergiftingen veroorzaken. De methode is geschikt voor de detectie van ongewenste micro-organismen in water, zoals enterobacteria en enterovirussen.
Aangezien de sandwich-hybridisatie-test, die gebruik maakt van reeksen nucleïnezuur-fragmenten, een kwantitatieve methode is, is deze bijvoorbeeld toepasbaar voor de detectie en meting van gen-amplificatie. 45 Dit gegeven is bijvoorbeeld belangrijk bij de detectie en behandeling van kanker. De vorming van een stabiele reeks hybriden vereist dat de homologe sequenties van de probe en het aan de drager gehechte nucleïnezuur niet te ver van elkaar liggen, bij voorkeur minder dan 5 kb van elkaar verwijderd zijn bij het te detecteren nucleïnezuur. Wanneer veranderingen optreden in de afstand tussen deze twee gebieden, dan is de verandering duidelijk met deze methode waarneembaar (grotere afstanden leiden tot een zwakker 50 signaal). Derhalve is de methode ook geschikt voor de detectie van veranderd mRNA, chromosomale herrangschikking, de herrangschikking van immunoglobulinegenen voor expressie, en erfelijke ziekten. Het is mogelijk voor de identificatie van de verwekkers van geslachtsziekten kits te construeren, die een probe bevatten, die reeksen nucleïnezuurfragmenten bevat die gonorrhoe, syphilis, herpes en chlamydiae identificeren. De identificatie is in dit geval mogelijk door toepassing van gescheiden vaste dragers, waarbij 55 aan iedere vaste drager nucleïnezuurfragmenten zijn gehecht die homoloog zijn met het nucleïnezuur van één van de verwekkers van gonnorrhoe, syphilis, herpes en chlamydiaeinfecties. In de voorbeelden wordt voor de detectie van chlamidiae en van cytomegalovirus gebruik gemaakt van reeksen nucleïnezuur- 193663 6 fragmenten die verkregen zijn uit de recombinant-plasmiden pKTH 1220 en pKTH 1271. Recombinant-plasmide pKTH 1220 bevat, opgenomen in de plasmide-vector pBR322, een BamHI-fragment van het DNA van Chlamydia trachomatis L2, dat specifiek is voor de chlamydiae. Dit recombinant-plasmide wordt gekloond in de gastheer Escherichia coli K12 HB 101. Recombinant-plasmide 1271 bevat, opgenomen in de 5 plasmide-vector pBR325, een EcORI fragment van het DNA van het cytomegalovirus AD 169. Dit recombinantplasmide wordt eveneens gekloond in de gastheer Escherichia coli K12 HB101. De gastheren die de recombinant-plasmiden pKTH 1220 en pKTH 1271 bevatten zijn gedeponeerd bij de cultuurcollectie Deutsche Sammlung von Mikro-organismen (DSM), Griessebachstrasse 8, D-3400 Gottingen, West-Duitsland. Het nummer van het depot dat recombinant-plasmide pKTH 1220 bevat is DSM 2825 en het 10 nummer van het depot dat recombinant-plasmide pKTH 1271 bevat is DSM 2826. De depots zijn vrij beschikbaar voor het publiek na de publicatie van de octrooiaanvrage.
De uitvinding wordt meer in detail in de volgende voorbeelden beschreven. Deze voorbeelden dienen niet te worden opgevat als beperkend voor de beschermingsomvang van de onderhavige uitvinding.
15 Voorbeeld I
a) Reeksen nucleïnezuur-fragmenten uit Chlamydia trachomatis en de bereiding daarvan DNA-f rag menten geschikt voor de diagnose van de Chlamydia trachomatis groep werden bereid uit het DNA van Chlamydia trachomatis serotype L2. Het DNA werd geïsoleerd en gefragmenteerd met het restrictie-20 enzym BamHI, en de verkregen DNA-f rag menten werden gekloond door deze op te nemen in plasmide pBR322, dit plasmide over te brengen in het gastheer-organisme Escherichia coli K12 HB 101, en dit gastheer-organisme vervolgens te kweken. Als resultaat van het klonen werd een gen-bank van Chlamydia trachomatis L2 verkregen, die bestond uit een groot aantal recombinantplasmiden, die ieder een afzonderlijk BamHI-restrictiefragment hebben, afgeleid van DNA uit de Chlamydia-stam. Voor de productie van 25 nucleïnezuren werden recombinant-plasmiden die bijzonder grote DNA-inserties hebben, afgeleid van het Chlamydia DNA, gekozen uit de gen-bank. Eén zo’n plasmide is pKTH 1220, dat bij de cultuurcollectie Deutsche Sammlung von Mikroorganismen is gedeponeerd onder nummer DSM 2825 en waarvan de geschiktheid voor gebruik als reagens bleek uit een directe-hybridisatie-test. De test liet zien dat pKTH 1220 alle nucleïnezuren, afgeleid van verschillende Chlamydia trachomatis serotypen, identificeert, maar geen 30 andere nucleïnezuren.
Uit het pKTH 1220-plasmide werden onder toepassing van verschillende restrictie-enzymen fragmenten verkregen, en van deze fragmenten werden enkele die toegepast konden worden voor het aantonen van Chlamydia DNA, voor verder klonen overgebracht in het pAT 153-plasmide (Nature 283, 1980, 216-218) en enkele in de M13 faag. Figuur 8 laat recombinantplasmide pKTH 1220 zien, dat een moleculaire lengte van 35 14 kb heeft. In figuur 8 stellen BamHI, Sal I en Cla I de gebruikte restrictie-enzymen voor, en illustreren a1p a2, b,, b2 en b3 de grootte en onderlinge locaties van de met behulp van deze restrictie-enzymen geproduceerde fragmenten. Tabel A geeft de grootte van de fragmenten en vectoren gebruikt voor verder klonen, de namen van de recombinant-plasmiden en de toepassing ervan.
40 TABEL A
Fragment Grootte Vector Recombinant Toepassing plasmide 45 at Clal-Sal! 3,0 kb pAT153 pKTH1252 Aan filter a2 Sall-Clal 2,9 kb pAT153 pKTH1250 Aan filter b, Sall-BamHI 0,7 kb M13mp8 mKTH1242 Gelabelde DNA-probe b2 BamHI-Sall 1,4 kb M13mp8 mKTH1239 Gelabelde DNA-probe b3 Clal-Clal 1,7 kb M13mp8 mKTH1248 Gelabelde DNA-probe 50 b,-b2 BamHI-BamHI 2,1 kb M13mp8 mKTH1245 Gelabelde DNA-probe
De fragmenten gegeven in Tabel A werden geïsoleerd uit een agarosegel door elektroëlutie en werden overgebracht in de passende restrictie-enzym-identificatie-plaatsen van de in Tabel A genoemde vectoren, 55 om te worden gekloond onder toepassing van bekende methoden.
Het fragment BamHI-BamHI 2,1 kb werd als volgt verkregen: de fragmenten BamHI-Sall 1,4 kb en Sall-BamHI 0,7 kb van plasmide pKTH1220 werden gescheiden door gel-elektroforese in agarose-gel, 7 193663 waarna ze uit deze gel geïsoleerd werden. De gezuiverde fragmenten werden aan elkaar gebonden met behulp van T4 ligase-enzym, en van de in de reactie geproduceerde 2,1 kb DNA-fragmenten werden die welke vrije uiteinden hadden die beide overeenkwamen met de splitsïngsplaats van het BamHI-enzym, verder verbonden aan de BamHI-restrictie-plaats van de dubbele-strengs-vorm van het M13mp8-faag-DNA.
5 Zo werd een recombinant-faag-DNA (mKTH1245) gemaakt, dat twee verbonden DNA-fragmenten van Chlamydia trachomatis DNA bevat, die niet aan elkaar grenzen in het genoom. Echter, in het genoom grenzen zij aan de DN A's a2 uit pKTH1250 en al uit pKTH 1252, die aan het filter gebonden moeten worden (figuur 9). Figuur 9 laat een reeks sandwich-hybriden zien, die gevormd wordt wanneer de recombinant-plasmiden en recombinantplasmiden en recombinant-fagen gegeven in Tabel A worden 10 toegepast als reeksen nucleïnezuren.
b) Demonstratie van de gevoeligheid van een reeks nucleïnezuren van Chlamydia trachomatis onder toepassing van de sandwich-hybridisatie-methode
De gevoeligheid van een reeks nucleïnezuren vergeleken met een enkel continu nucleïnezuurpaar werd 15 bestudeerd met de sandwich-hybridisatie-methode. De test werd uitgevoerd met gebruik van filters die ieder 1011 moleculen van zowel pKTH1250 (a2) als pKTH1252 (a,) enkelstrengs gemaakt DNA bevatten. Het te bestuderen monster was plasmide pKTH1220, dat voor de test door koken gedurende 5 minuten in 0,17 M NaoH enkelstrengs gemaakt werd, waarna het werd afgekoeld tot 0°C en geneutraliseerd met een equimolaire hoeveelheid azijnzuur. De volgende DNA-probes, gelabeld met 125J, gegeven in Tabel B, 20 werden gebruikt in de testen; mKTH1242 (b,), mKTH1239 (b2), mKTH1248 (b3) en mKTH1245 (b1-b2).
De hybridisatie werd uitgevoerd bij +65°C gedurende 17 uren in een hybridisatie-oplossing met de volgende samenstelling: 4 x SSC, 0,02% Ficoll, 0,02% polyvinylpyrrolidon, 0,2% SDS en 200 pg/ml haringsperma DNA. De filters werden gedurende 2 uren gewassen bij 50°C met een wasoplossing met de volgende samenstelling; 0,1 x SSC, 0,2% SDS, en de gebonden 125J werd bepaald onder toepassing van 25 een gamma-teller. De resultaten worden vermeld in Tabel B en zijn de gemiddelden van vijf parallelle testen.
TABEL B
30 Aan te tonen DNA Radioactiviteit van het hybride met (b) als de DNA probe moleculen/test - b1 b2 b3 b1s b2 (b1 b2) (b1—b2), b3 0 37 37 33 ___49______39______52____ 35 106 48 44 48 | 93 _68 140 107 226 236 232 396 416 686 108 1475 1415 1456 2912 2637 3580
b, 380.000 cpm/test; 5x107 cpm/pg DNA
40 b2 340.000 cpm/test; 4x107 cpm/pg DNA
b3 350.000 cpm/test; 5xlo7 cpm/pg DNA
b.,-b2 310.000 cpm/test; 7x107 cpm/pg DNA
b„ b2 700.000 cpm/test; (b,-b2), b3 700.000 cpm/test; 45 -
Statistisch berekend, werd de 95% zekerheidslimiet van de tests uitgevoerd zonder monsters (= negatieve controles) beschouwd als de ondergrens voor positiviteit. Deze waarden waren 52-54 cpm wanneer de DNA-probe b1t b2 of b3 was, 58 cpm wanneer de DNA-probe b„ b2 was, 56 cpm wanneer de DNA probe 50 b^bg was, en 65 cpm wanneer de DNA-probe was. De gebroken stippellijn geeft de grens aan tussen negatieve en positieve waarden.
c) Chlamydia-diagnostiek onder toepassing van sandwich-hybridisatie met reeksen nucleïnezuur-fragmenten Monsters van het slijmvlies uit de urethra genomen van drie mannen die lijden aan urethritis en monsters 55 van de baarmoederhals van drie vrouwen die lijden aan cervicitis werden gebruikt voor de test. Chlamydia trachomatis werd geïsoleerd uit deze mannelijke urethrale monsters en deze vrouwelijke monsters genomen van de baarmoederhals. Hiernaast werd een overeenkomstig aantal soortgelijke monsters, waaruit geen 193663 8
Chlamydia kon worden geïsoleerd, gebruikt als vergelijkingsmateriaal. De te onderzoeken monsters werden genomen met katoenen gaasjes, die gedoopt waren in een buffer, die 0,2 M saccharose, 20 mM fosfaai-buffer, 3% foetaal kalverserum, 10 pg/ml gentamycine, 100 pg/ml vancomycine en 25 lU/ml nystatine bevatte. De uit de monsters geïsoleerde Chlamydia bacteriën werden voortgekweekt. De oorspronkelijke monsters 5 werden ook onderzocht met de sandwich-hybridisatie onder toepassing van een reeks nucleïnezuur-fragmenten volgens de onderhavige uitvinding. De monsters werden geconcentreerd onder toepassing van 2-butanol om daaruit vloeistof te verwijderen op zodanige wijze dat het eindvolume ongeveer 80 pi was, waarbij de concentratie van het DNA in het monster voor het testen ongeveer 3-7-voudig verhoogd was. Hierbij werd het protocol gevolgd, beschreven in Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 10 Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, p. 465. Er werd 170-330 μΙ 2-butanol gebruikt voor 340-660 μΙ monster, waarbij 240-560 μΙ vloeistof werd verwijderd. Hierna werd aan het geconcentreerde monster 70 mM EDTA, 0,7% SDS, 200 μg/ml proteinase K enzym toegevoegd, en het werd gedurende 15 minuten op 55°C en gedurende 45 minuten op 37°C verwarmd. Hierna werd het monster gedurende 5 minuten gekookt in 0,175 M NaoH. Het gekookte monster werd op 0°C gebracht, geneutraliseerd met een equimolaire 15 hoeveelheid azijnzuur en daarna getest. Het DNA aan het filter en de hybridisatieomstandigheden beschreven in Voorbeeld Ib werden gebruikt in de test. De gebruikte DNA-probe was mKTH1245 (b.,-b2), 300.000 cpm/400 μΙ hybridisatie-reactiemonster. Tabel C laat de resultaten zien.
TABEL C
20 -
Specimen Radioactiviteit van het hybride Resultaat van Chlamydia-cultuur
Man 1 151 +
Man 2 164 + 25 Man 3 154 +
Man 4 61
Man 5 76 -
Man 6 55 — 30 Vrouw 1 343 +
Vrouw 2 509 +
Vrouw 3 362 +
Vrouw 4 57 -
Vrouw 5 58 - 35 Vrouw 6 81 -
Buffer X4 30-55
Chi. trachomatis L2 bacterie, 106/1 ΟμΙ 419 + 40 -
Buffer X4 duidt op de gemiddelde waarde voor vier gemeten buffers. De grens voor positiviteit in de tests was 104 cpm.
Het resultaat in Tabel C laat zien dat sandwich-hybridisatie onder toepassing van een reeks 45 nucleïnezuur-fragmenten geschikt is voor de diagnose van chlamydia-infecties. De monsters die negatief waren in de cultuur-tests waren ook negatief in de sandwich-hybridisatie-test.
Voorbeeld II
50 a) Een reeks nucleïnezuren uit Cytomegalovirus en de bereiding daarvan
Voor de diagnostiek van Cytomegalovirus geschikte DNA-fragmenten werden bereid uit Cytomegalovirus (AD169, ATCC VR-538)-(CMV). Het DNA van dit virus werd geïsoleerd en gefragmenteerd met EcoRI volgens bekende methoden. EcoRI-fragment I van ongeveer 9kb, gedefinieerd in D.H. Specter e.a., J. Virol. 42, 558-582,1982, werd geïsoleerd uit agarose-gel door elektro-elutie waarbij de EcoRI-55 restrictiefragmenten werden gescheiden op basis van hun grootte. Het geëiueerde DNA werd geëxtraheerd met fenol, waarna het geprecipiteerd werd met ethanol. Het zo gezuiverde DNA werd door middel van T4-ligase gebonden aan de pBR325-plasmide vector, geopend door gebruik van het EcoRI-enzym, en het 9 193663 verkregen recombinant-DNA werd overgebracht naar E. coli K12 HB101 als gastheer-bacteria. Uit ampicilline- en tetracycline-resistente maar chlooramphenicol-gevoelige klonen werd er één gekozen die een cytomegalovirus-specifieke DNA-insertie van de juiste grootte bevatte'. Het karakter van dit gekloonde cytomegalovirus-DNA werd bevestigd door de Southern blot-methode. Deze test toonde aan dat het 5 gekozen 9 kb EcoRI-DNA-fragment was afgeleid van het DNA van Cytomegalovirus en, meer specifiek, deel uitmaakte van het Hindlll-D-fragment daarvan (J.D. Oram e.a., J. Gen. Virol., 59, 111-129, 1982). Het gekozen recombinant-plasmide werd pKTH1271 benoemd, en werd gedeponeerd bij de cultuurcollectie Deutsche Sammlung von Mikroorganismen onder nummer DSM 2826. Het recombinant-plasmide werd gekweekt en gezuiverd met bekende technieken.
10 Het verdere klonen van met restrictie-enzymen verkregen fragmenten van pKTH1271 werd uitgevoerd door bekende technieken waarbij als vectors het pBR322-plasmide en de M13mp7- en M13mp8-fagen werden toegepast. Figuur 10 laat het hybride-plasmide pKTH1271 zien, dat een insertie van ongeveer 9kb bevat. Figuur 10 laat ook de fragmenten van pKTH1271 zien die verkregen werden onder toepassing van de restrictie-enzymen EcoRI, BamHI, Clal en Pstl evenals de relatieve grootte en localisatie daarvan. Tabel 15 D geeft de grootten van de betreffende fragmenten en de voor verder klonen gebruikte vectoren, de namen van de zo verkregen recombinant plasmiden, en de toepassing daarvan hetzij als aan het filter gebonden nucleïnezuren hetzij als gelabelde DNA-probes. Figuur 11 laat een reeks sandwich-hybriden zien, die gevormd wordt wanneer de reeks nucleïnezuur-fragmenten gegeven in Tabel D wordt toegepast.
20 TABEL D
Restrictie-fragment Vector Benoeming Gebruik a1 EcoRI-Pstl (3,3 kb) pBR322 pKTH1273 Aan filter 25 a2 Clal-BamHI (3,0 kb) pBR322 pKTH1274 Aan filter b, Pstl-Pstl (0,6 kb) M13mp7 mKTH1277 Gelabelde DNA-probe b2 Pstl-Clal (1,0 kb) M13mp8 mKTH1278 Gelabelde DNA-probe b3 BamHI-EcORI (1,0 kb) M13mp8 mKTH1279 Gelabelde DNA-probe 30 b) Demonstratie van de gevoeligheid van een reeks nucleïnezuren uit cytomegalovirus met de sandwich-hybridisatie methode
De gevoeligheid van een reeks nucleïnezuren vergeleken met één continu reagens-paar werd getoetst met de sandwich-hybridisatie-methode. Het aan te tonen materiaal in de tests was CMV-DNA, dat 5 min.
35 gekookt was in 0,17 M NaOH om het enkelstrengs maken en daarna geneutraliseerd als in voorbeeld Ib. Filters die ieder 1011 moleculen van zowel pKTH1273 (aj DNA als pKTH1274 (a2) DNA, die enkelstrengs gemaakt waren, bevatten, en de volgende DNA-probes gelabeld met 125J gegeven in Tabel E: mKTH1277 (b,), mKTH1278 (b2) en mKTH1279 (b3), werden gebruikt in de test. Iedere DNA-probe bevatte 108 cpm/pg DNA. De hybridisatie werd uitgevoerd zoals beschreven in voorbeeld Ib. Tabel E laat de resultaten zien.
40
TABEL E
Aan te tonen DNA Radioactiviteit van het hybriden met (b) als de DNA probe moleculen/test - 45 b1 b2 b3 b„ b2 bj, b2, b3 0 35 33 38 45 53 106 38_______44_______46___| 95 125 4x106 85 135 142 205 292 50 1,6x107 203 254 265 415 645 b, 30.000 cpm/test b2 320.000 cpm/test b3 300.000 cpm/test 55 b,, b2 300.000 cpm van ieder/test b1t b2, b3 300.000 cpm van ieder/test 193663 10
In de test was de waarde van de ondergrens voor positiviteit 51-55 cpm wanneer de DNA-probe b.,, b2 of b3 was, 59 cpm wanneer de DNA-probe b1fb2 was, en 63 cpm wanneer de DNA-probe b^b^bg was.
De resultaten in Tabel E laten zien dat de sandwich-hybridisatie waarin een individuele DNA-probe wordt gebruikt (bv b2 of b3) in alle gevallen de aanwezigheid van 4x106 CMV-DNA-moleculen aantoont. Anderzijds 5 wordt bij hybridisatie met b.,, b2 of b1,b2,b3 reeds 106 moleculen CMV-DNA aangetoond. De resultaten laten derhalve zien dat reeksen nucleïnezuren 4 maal zo gevoelig zijn als individuele nucleïnezuren.
c) CMV-diagnostiek onder toepassing van sandwich-hybridisatie met een reeks nucleïnezuren Klinische monsters werden onderzocht onder toepassing van sandwich-hybridisatie met een reeks 10 nucleïnezuren. Deze monsters bevatten twee porties urine van kinderen onder de 1 jaar. Van deze kinderen vermoedde men dat zij leden aan een bij de geboorte aanwezige cytomegalo-ziekte. Een monster longweefsei van een patiënt met een CMV-longinfectie werd eveneens onderzocht met de onderhavige sandwich-hybridisatie. Zowel cytomegalovirus-geïnfecteerde als ongeïnfecteerde menselijk foetale cellen werden eveneens gebruikt als testmonsters.
15 Een oplossing die 1 % sarcosyl en 5 mM EDTA en 200 pg kalver-thymus-DNA bevatte, werd toegevoegd aan een monster van 10 ml urine, waarna het uit het virus afkomstige DNA, samen met het kalver-thymus-DNA, neergeslagen werd door toevoeging van 10 mi isopropanol bij kamertemperatuur. Het DNA-neerslag werd weer opgelost in 200 pg TE-buffer (Tris-EDTA buffer, 10:1 mM, pH 7,5-7, 9) en werd tot een enkelstrengsvorm gebracht door het gedurende 5 minuten te koken, waarna de DNA-oplossing werd 20 gekoeld tot 0°C en toegevoegd aan de hybridisatie oplossing met de samenstelling vermeld in voorbeeld Ib. Het longweefsel-monster (enkele mm3) werd met een mes fijngehakt. Daarna werd 200 pl TE-buffer, die 1 % SDS oplossing en 1 mg/ml proteinase K-enzym bevatte, eraan toegevoegd. Een digestie werd uitgevoerd bij +37°C gedurende 1 uur, waarna het monster tweemaal in een injectiespuit werd opgezogen door een dunne voor hypodermale injecties gebruikelijke naald. Het zo gehomogeniseerde monster werd 25 gekookt, waarna het werd toegevoegd aan de test-oplossing.
De met cytomegalovirus geïnfecteerde foetale cellen en de ongeïnfecteerde foetale cellen werden onderworpen aan een lysis door inwerking van SDS en proteinase K gehomogeniseerd en gekookt, zoals hierboven.
De nucleïnezuren in de hybridisatie-test waren pKTH1273 (a,) en pKTH1274 (a2) op filters en mKTH1277 30 (b.,), mKTH1278 (b2), en mKTH1279 (b3) als DNA-probes, ieder 200.000 cpm/test. In andere opzichten werd de hybridisatie, het wassen van de filters en het vaststellen van de resultaten uitgevoerd zoals beschreven in voorbeeld Ib. Tabel F laat de resultaten van de onderhavige hybridisatie zien.
TABEL F
35 -
Specimen Radioactiviteit van de Virus-isolatie hybriden
Geïnfecteerde foetale 3521 Niet uitgevoerd 40 cellen (10S)
Urine 1 (10 ml) 243 CMV
Urine 2 (10 ml) 3215 CMV
Urine van een gezonde persoon (10 ml) 52 Niet uitgevoerd
Longweefselmonster 535 CMV
45 Ongeïnfecteerde foetale cellen 105 68 Niet uitgevoerd
Geen monster 65 Niet uitgevoerd
De resultaten in Tabel F laten zien dat het mogelijk is, onder toepassing van een reeks nucleïnezuren, de 50 aanwezigheid van CMV aan te tonen in verschillende klinische monsters zoals urine, longweefsei en foetale cellen.
De test is specifiek voor cytomegalovirus. De test wordt niet verstoord door het menselijk DNA dat in het monster aanwezig is en het toegevoegde kalver-thymus-DNA. In feite wordt de specificiteit van de test op geen enkele wijze verstoord door het type monster.
Claims (2)
1. Werkwijze voor het detecteren van een specifiek nucleïnezuur in ëen monster door middel van sandwich hybridisatie van nucleïnezuren, waarbij aan een vaste drager gehechte nucleïnezuren worden gebruikt voor 5 het met de vaste drager verbinden van het te detecteren nucleïnezuur en gelabelde nucleïnezuren worden gebruikt voor het labelen van het te detecteren nucleïnezuur waarbij de aan een vaste drager gehechte nucleïnezuren en de gelabelde nucleïnezuren complementair zijn aan van elkaar verschillende gebieden van het te detecteren nucleïnezuur, met het kenmerk, dat de aan de vaste drager gehechte nucleïnezuren, die een lengte hebben van ten minste 15 nucleotiden aanwezig zijn in een reeks (a, ... an) en complementair 10 zijn met n verschillende gebieden in het te detecteren nucleïnezuur, waarbij n ten minste 2 is en de gelabelde nucleïnezuren, die een lengte hebben van ten minste 15 nucleotiden aanwezig zijn in een reeks (b-, ... bn.) en complementair zijn met n’ verschillende, andere gebieden in het te detecteren nucleïnezuur, waarbij n' ten minste 2 is en waarbij de gebieden van het te detecteren nucleïnezuur die complementair zijn met de reeks (a1 ... an) alterneren met gebieden van het te detecteren nucleïnezuur die complementair zijn 15 met de reeks (b, ... bn.) en deze gebieden in hoofdzaak direct op elkaar aansluiten, terwijl verschillende nucleïnezuren uit de reeks (a, ... an) met elkaar kunnen zijn verbonden en/of verschillende nucleïnezuren uit de reeks (b1 ... bn.) met elkaar kunnen zijn verbonden.
2. Kit voor het detecteren van een specifiek nucleïnezuur in een monster door middel van sandwich hybridisatie van nucleïnezuren, waarbij de kit aan een vaste drager gehechte nucleïnezuren en gelabelde 20 nucleïnezuren bevat, waarbij de aan de vaste drager gehechte nucleïnezuren en de gelabelde nucleïnezu-ren complementair zijn aan van elkaar verschillende gebieden van het te detecteren nucleïnezuur, met het kenmerk, dat de aan de vaste fase gehechte nucleïnezuren, die een lengte hebben van ten minste 15 nucleotiden aanwezig zijn in een reeks (a., ... an) en complementair zijn met n verschillende gebieden in het te detecteren nucleïnezuur, waarbij n ten minste 2 is, en de gelabelde nucleïnezuren, die een lengte hebben 25 van ten minste 15 nucleotiden, aanwezig zijn in een reeks (b, ... b„.) en complementair zijn met n’ verschillende andere gebieden in het te detecteren nucleïnezuur, waarbij n’ ten minste 2 is en waarbij de gebieden van het te detecteren nucleïnezuur die complementair zijn met de reeks (a, ... an) alterneren met gebieden van het te detecteren nucleïnezuur die complementair zijn met de reeks (b, ... bn.) en deze gebieden in hoofdzaak direct op elkaar aansluiten, terwijl verschillende nucleïnezuren uit de reeks (a, ... an) 30 met elkaar kunnen zijn verbonden en/of verschillende nucleïnezuren uit de reeks (b·, ... bn.) met elkaar kunnen zijn verbonden. Hierbij 6 bladen tekening
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FI840655 | 1984-02-17 | ||
| FI840655A FI71768C (fi) | 1984-02-17 | 1984-02-17 | Foerbaettrade nykleinsyrareagenser och foerfarande foer deras framstaellning. |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NL8500424A NL8500424A (nl) | 1985-09-16 |
| NL193663B NL193663B (nl) | 2000-02-01 |
| NL193663C true NL193663C (nl) | 2000-06-06 |
Family
ID=8518568
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NL8500424A NL193663C (nl) | 1984-02-17 | 1985-02-14 | Werkwijze en kit voor het detecteren van een specifiek nucleïnezuur in een monster. |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4731325A (nl) |
| JP (1) | JPS60188100A (nl) |
| AT (1) | AT394578B (nl) |
| AU (1) | AU577568B2 (nl) |
| BE (1) | BE901671A (nl) |
| CA (1) | CA1248895A (nl) |
| CH (1) | CH671778A5 (nl) |
| DE (1) | DE3505287C2 (nl) |
| DK (1) | DK174675B1 (nl) |
| FI (1) | FI71768C (nl) |
| FR (1) | FR2559783B1 (nl) |
| GB (1) | GB2156074B (nl) |
| HU (1) | HU194938B (nl) |
| IE (1) | IE57652B1 (nl) |
| IT (1) | IT1183184B (nl) |
| LU (1) | LU85768A1 (nl) |
| NL (1) | NL193663C (nl) |
| NO (1) | NO166543C (nl) |
| RO (1) | RO92633B (nl) |
| SE (1) | SE463103B (nl) |
| SU (1) | SU1523053A3 (nl) |
| ZA (1) | ZA85511B (nl) |
Families Citing this family (151)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1260372A (en) * | 1984-04-27 | 1989-09-26 | Elazar Rabbani | Hybridization method for the detection of genetic materials |
| US4725536A (en) * | 1985-09-19 | 1988-02-16 | Genetics Institute, Inc. | Reagent polynucleotide complex with multiple target binding regions, and kit and methods |
| US4876187A (en) * | 1985-12-05 | 1989-10-24 | Meiogenics, Inc. | Nucleic acid compositions with scissile linkage useful for detecting nucleic acid sequences |
| US4868105A (en) * | 1985-12-11 | 1989-09-19 | Chiron Corporation | Solution phase nucleic acid sandwich assay |
| US4910300A (en) * | 1985-12-11 | 1990-03-20 | Chiron Corporation | Method for making nucleic acid probes |
| US4882269A (en) * | 1985-12-13 | 1989-11-21 | Princeton University | Amplified hybridization assay |
| FI76119C (fi) * | 1986-02-27 | 1988-09-09 | Orion Yhtymae Oy | Kvantitativ bestaemning av nukleinsyramolekyler och reagensfoerpackning som anvaends vid foerfarandet. |
| US4925785A (en) * | 1986-03-07 | 1990-05-15 | Biotechnica Diagnostics, Inc. | Nucleic acid hybridization assays |
| US5281518A (en) * | 1986-05-01 | 1994-01-25 | Washington Research Foundation | Detection of a unique chlamydia strain associated with acute respiratory disease |
| CA1341065C (en) * | 1986-05-01 | 2000-08-01 | J. Thomas Grayston | Detection of a unique chlamydia strain associated with acute respiratory disease |
| US6270961B1 (en) * | 1987-04-01 | 2001-08-07 | Hyseq, Inc. | Methods and apparatus for DNA sequencing and DNA identification |
| US5202231A (en) * | 1987-04-01 | 1993-04-13 | Drmanac Radoje T | Method of sequencing of genomes by hybridization of oligonucleotide probes |
| US5359100A (en) * | 1987-10-15 | 1994-10-25 | Chiron Corporation | Bifunctional blocked phosphoramidites useful in making nucleic acid mutimers |
| CA1339351C (en) * | 1987-10-15 | 1997-08-26 | Michael S. Urdea | Nucleic acid multimers and amplified nucleic acid hybridization assays using same |
| US5124246A (en) * | 1987-10-15 | 1992-06-23 | Chiron Corporation | Nucleic acid multimers and amplified nucleic acid hybridization assays using same |
| CA1323293C (en) * | 1987-12-11 | 1993-10-19 | Keith C. Backman | Assay using template-dependent nucleic acid probe reorganization |
| GB8810400D0 (en) * | 1988-05-03 | 1988-06-08 | Southern E | Analysing polynucleotide sequences |
| US6054270A (en) * | 1988-05-03 | 2000-04-25 | Oxford Gene Technology Limited | Analying polynucleotide sequences |
| US5700637A (en) * | 1988-05-03 | 1997-12-23 | Isis Innovation Limited | Apparatus and method for analyzing polynucleotide sequences and method of generating oligonucleotide arrays |
| US7811751B2 (en) * | 1988-05-03 | 2010-10-12 | Oxford Gene Technology Limited | Analysing polynucleotide sequences |
| EP0379559B1 (en) * | 1988-06-24 | 1996-10-23 | Amgen Inc. | Method and reagents for detecting nucleic acid sequences |
| US5185243A (en) * | 1988-08-25 | 1993-02-09 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Method for detection of specific nucleic acid sequences |
| JPH0638758B2 (ja) * | 1989-02-03 | 1994-05-25 | イーストマン コダック カンパニー | 核酸試験片及び所定の核酸を検出するためのその使用 |
| US6346413B1 (en) | 1989-06-07 | 2002-02-12 | Affymetrix, Inc. | Polymer arrays |
| US5143854A (en) | 1989-06-07 | 1992-09-01 | Affymax Technologies N.V. | Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof |
| US6955915B2 (en) * | 1989-06-07 | 2005-10-18 | Affymetrix, Inc. | Apparatus comprising polymers |
| US5925525A (en) * | 1989-06-07 | 1999-07-20 | Affymetrix, Inc. | Method of identifying nucleotide differences |
| US6040138A (en) * | 1995-09-15 | 2000-03-21 | Affymetrix, Inc. | Expression monitoring by hybridization to high density oligonucleotide arrays |
| US6919211B1 (en) | 1989-06-07 | 2005-07-19 | Affymetrix, Inc. | Polypeptide arrays |
| US5800992A (en) | 1989-06-07 | 1998-09-01 | Fodor; Stephen P.A. | Method of detecting nucleic acids |
| US5424186A (en) | 1989-06-07 | 1995-06-13 | Affymax Technologies N.V. | Very large scale immobilized polymer synthesis |
| US6309822B1 (en) | 1989-06-07 | 2001-10-30 | Affymetrix, Inc. | Method for comparing copy number of nucleic acid sequences |
| US6406844B1 (en) | 1989-06-07 | 2002-06-18 | Affymetrix, Inc. | Very large scale immobilized polymer synthesis |
| US6379895B1 (en) | 1989-06-07 | 2002-04-30 | Affymetrix, Inc. | Photolithographic and other means for manufacturing arrays |
| US5744101A (en) | 1989-06-07 | 1998-04-28 | Affymax Technologies N.V. | Photolabile nucleoside protecting groups |
| US6551784B2 (en) | 1989-06-07 | 2003-04-22 | Affymetrix Inc | Method of comparing nucleic acid sequences |
| US5232829A (en) * | 1989-09-29 | 1993-08-03 | Hoffmann-La Roche Inc. | Detection of chlamydia trachomatis by polymerase chain reaction using biotin labelled lina primers and capture probes |
| US6506558B1 (en) | 1990-03-07 | 2003-01-14 | Affymetrix Inc. | Very large scale immobilized polymer synthesis |
| CA2039517C (en) * | 1990-04-03 | 2006-11-07 | David Segev | Dna probe signal amplification |
| US5071962A (en) * | 1990-05-31 | 1991-12-10 | The United State Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Nucleotide, deduced amino acid sequence, isolation and purification of heat-shock chlamydial proteins |
| DE69112309T2 (de) * | 1990-06-28 | 1996-01-25 | Wakunaga Seiyaku Kk | Verfahren zum Nukleinsäurenachweis. |
| US5645994A (en) * | 1990-07-05 | 1997-07-08 | University Of Utah Research Foundation | Method and compositions for identification of species in a sample using type II topoisomerase sequences |
| GB9020621D0 (en) * | 1990-09-21 | 1990-10-31 | Imp Cancer Res Tech | Identification of organisms |
| GB2262987A (en) * | 1990-09-21 | 1993-07-07 | Imp Cancer Res Tech | Identification of organisms |
| EP0834576B1 (en) | 1990-12-06 | 2002-01-16 | Affymetrix, Inc. (a Delaware Corporation) | Detection of nucleic acid sequences |
| US5437976A (en) * | 1991-08-08 | 1995-08-01 | Arizona Board Of Regents, The University Of Arizona | Multi-domain DNA ligands bound to a solid matrix for protein and nucleic acid affinity chromatography and processing of solid-phase DNA |
| US5632957A (en) * | 1993-11-01 | 1997-05-27 | Nanogen | Molecular biological diagnostic systems including electrodes |
| US6569382B1 (en) * | 1991-11-07 | 2003-05-27 | Nanogen, Inc. | Methods apparatus for the electronic, homogeneous assembly and fabrication of devices |
| US6017696A (en) | 1993-11-01 | 2000-01-25 | Nanogen, Inc. | Methods for electronic stringency control for molecular biological analysis and diagnostics |
| US6051380A (en) * | 1993-11-01 | 2000-04-18 | Nanogen, Inc. | Methods and procedures for molecular biological analysis and diagnostics |
| US6652808B1 (en) * | 1991-11-07 | 2003-11-25 | Nanotronics, Inc. | Methods for the electronic assembly and fabrication of devices |
| US5849486A (en) * | 1993-11-01 | 1998-12-15 | Nanogen, Inc. | Methods for hybridization analysis utilizing electrically controlled hybridization |
| US5605662A (en) * | 1993-11-01 | 1997-02-25 | Nanogen, Inc. | Active programmable electronic devices for molecular biological analysis and diagnostics |
| US6048690A (en) * | 1991-11-07 | 2000-04-11 | Nanogen, Inc. | Methods for electronic fluorescent perturbation for analysis and electronic perturbation catalysis for synthesis |
| US5556961A (en) * | 1991-11-15 | 1996-09-17 | Foote; Robert S. | Nucleosides with 5'-O-photolabile protecting groups |
| DE69233331T3 (de) | 1991-11-22 | 2007-08-30 | Affymetrix, Inc., Santa Clara | Kombinatorische Strategien zur Polymersynthese |
| US6943034B1 (en) | 1991-11-22 | 2005-09-13 | Affymetrix, Inc. | Combinatorial strategies for polymer synthesis |
| US6468740B1 (en) | 1992-11-05 | 2002-10-22 | Affymetrix, Inc. | Cyclic and substituted immobilized molecular synthesis |
| US6864101B1 (en) | 1991-11-22 | 2005-03-08 | Affymetrix, Inc. | Combinatorial strategies for polymer synthesis |
| WO1993013227A1 (en) * | 1991-12-23 | 1993-07-08 | Chiron Corporation | Cmv probes for use in solution phase sandwich hybridization assays |
| JPH07502414A (ja) * | 1991-12-23 | 1995-03-16 | バイエル コーポレイション | 溶液相サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイに用いるためのクラミジアプローブ |
| US5583211A (en) * | 1992-10-29 | 1996-12-10 | Beckman Instruments, Inc. | Surface activated organic polymers useful for location - specific attachment of nucleic acids, peptides, proteins and oligosaccharides |
| US7713528B1 (en) | 1993-02-18 | 2010-05-11 | Enzo Therapeutics, Inc. | Method for in vivo delivery of active compounds using reagent conjugate |
| EP0787183A4 (en) | 1993-07-23 | 1998-05-27 | Hyseq Inc | METHOD FOR DETECTION OF UNKNOWN ORGANISMS |
| FR2710075B1 (fr) * | 1993-09-15 | 1995-10-27 | Bio Merieux | Réactif et procédé pour la détection d'une séquence nucléotidique avec amplification de signal. |
| US20040077074A1 (en) * | 1993-11-01 | 2004-04-22 | Nanogen, Inc. | Multi-chambered analysis device |
| US6375899B1 (en) | 1993-11-01 | 2002-04-23 | Nanogen, Inc. | Electrophoretic buss for transport of charged materials in a multi-chamber system |
| US6331274B1 (en) | 1993-11-01 | 2001-12-18 | Nanogen, Inc. | Advanced active circuits and devices for molecular biological analysis and diagnostics |
| US7314708B1 (en) | 1998-08-04 | 2008-01-01 | Nanogen, Inc. | Method and apparatus for electronic synthesis of molecular structures |
| US6315953B1 (en) | 1993-11-01 | 2001-11-13 | Nanogen, Inc. | Devices for molecular biological analysis and diagnostics including waveguides |
| US6319472B1 (en) | 1993-11-01 | 2001-11-20 | Nanogen, Inc. | System including functionally separated regions in electrophoretic system |
| US6309602B1 (en) | 1993-11-01 | 2001-10-30 | Nanogen, Inc. | Stacked, reconfigurable system for electrophoretic transport of charged materials |
| US6225059B1 (en) | 1993-11-01 | 2001-05-01 | Nanogen, Inc. | Advanced active electronic devices including collection electrodes for molecular biological analysis and diagnostics |
| US7582421B2 (en) * | 1993-11-01 | 2009-09-01 | Nanogen, Inc. | Methods for determination of single nucleic acid polymorphisms using a bioelectronic microchip |
| US7172864B1 (en) | 1993-11-01 | 2007-02-06 | Nanogen | Methods for electronically-controlled enzymatic reactions |
| US7101661B1 (en) | 1993-11-01 | 2006-09-05 | Nanogen, Inc. | Apparatus for active programmable matrix devices |
| US6068818A (en) | 1993-11-01 | 2000-05-30 | Nanogen, Inc. | Multicomponent devices for molecular biological analysis and diagnostics |
| US6254827B1 (en) | 1993-11-01 | 2001-07-03 | Nanogen, Inc. | Methods for fabricating multi-component devices for molecular biological analysis and diagnostics |
| US6726880B1 (en) | 1993-11-01 | 2004-04-27 | Nanogen, Inc. | Electronic device for performing active biological operations and method of using same |
| US6638482B1 (en) | 1993-11-01 | 2003-10-28 | Nanogen, Inc. | Reconfigurable detection and analysis apparatus and method |
| US6287517B1 (en) | 1993-11-01 | 2001-09-11 | Nanogen, Inc. | Laminated assembly for active bioelectronic devices |
| US6287850B1 (en) * | 1995-06-07 | 2001-09-11 | Affymetrix, Inc. | Bioarray chip reaction apparatus and its manufacture |
| EP0695941B1 (en) * | 1994-06-08 | 2002-07-31 | Affymetrix, Inc. | Method and apparatus for packaging a chip |
| US5807522A (en) * | 1994-06-17 | 1998-09-15 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Methods for fabricating microarrays of biological samples |
| US7378236B1 (en) | 1994-06-17 | 2008-05-27 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Method for analyzing gene expression patterns |
| US7323298B1 (en) * | 1994-06-17 | 2008-01-29 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Microarray for determining the relative abundances of polynuceotide sequences |
| US6306657B1 (en) * | 1994-06-28 | 2001-10-23 | Kalyx Biosciences, Inc. | Polynucleotide probe and kit for amplifying signal detection in hybridization assays |
| US6403367B1 (en) | 1994-07-07 | 2002-06-11 | Nanogen, Inc. | Integrated portable biological detection system |
| US7857957B2 (en) * | 1994-07-07 | 2010-12-28 | Gamida For Life B.V. | Integrated portable biological detection system |
| US6121048A (en) * | 1994-10-18 | 2000-09-19 | Zaffaroni; Alejandro C. | Method of conducting a plurality of reactions |
| US8236493B2 (en) * | 1994-10-21 | 2012-08-07 | Affymetrix, Inc. | Methods of enzymatic discrimination enhancement and surface-bound double-stranded DNA |
| US6720149B1 (en) * | 1995-06-07 | 2004-04-13 | Affymetrix, Inc. | Methods for concurrently processing multiple biological chip assays |
| US20040086917A1 (en) * | 1995-09-27 | 2004-05-06 | Nanogen, Inc. | Methods for electronic fluorescent perturbation for analysis and electronic perturbation catalysis for synthesis |
| EP0880598A4 (en) * | 1996-01-23 | 2005-02-23 | Affymetrix Inc | RAPID EVALUATION OF NUCLEIC ACID ABUNDANCE DIFFERENCE, WITH A HIGH-DENSITY OLIGONUCLEOTIDE SYSTEM |
| US6706473B1 (en) | 1996-12-06 | 2004-03-16 | Nanogen, Inc. | Systems and devices for photoelectrophoretic transport and hybridization of oligonucleotides |
| US6297006B1 (en) | 1997-01-16 | 2001-10-02 | Hyseq, Inc. | Methods for sequencing repetitive sequences and for determining the order of sequence subfragments |
| US6309824B1 (en) | 1997-01-16 | 2001-10-30 | Hyseq, Inc. | Methods for analyzing a target nucleic acid using immobilized heterogeneous mixtures of oligonucleotide probes |
| US20020042048A1 (en) | 1997-01-16 | 2002-04-11 | Radoje Drmanac | Methods and compositions for detection or quantification of nucleic acid species |
| US6326489B1 (en) | 1997-08-05 | 2001-12-04 | Howard Hughes Medical Institute | Surface-bound, bimolecular, double-stranded DNA arrays |
| DE19741715A1 (de) | 1997-09-22 | 1999-03-25 | Hoechst Ag | Pentopyranosyl-Nucleosid, seine Herstellung und Verwendung |
| US6485944B1 (en) | 1997-10-10 | 2002-11-26 | President And Fellows Of Harvard College | Replica amplification of nucleic acid arrays |
| US6511803B1 (en) * | 1997-10-10 | 2003-01-28 | President And Fellows Of Harvard College | Replica amplification of nucleic acid arrays |
| AU737174B2 (en) | 1997-10-10 | 2001-08-09 | President & Fellows Of Harvard College | Replica amplification of nucleic acid arrays |
| US6548021B1 (en) | 1997-10-10 | 2003-04-15 | President And Fellows Of Harvard College | Surface-bound, double-stranded DNA protein arrays |
| AU746061B2 (en) * | 1997-12-12 | 2002-04-11 | Qiagen Gaithersburg, Inc. | Assessment of human papilloma virus-related disease |
| US6355419B1 (en) | 1998-04-27 | 2002-03-12 | Hyseq, Inc. | Preparation of pools of nucleic acids based on representation in a sample |
| US6232067B1 (en) * | 1998-08-17 | 2001-05-15 | The Perkin-Elmer Corporation | Adapter directed expression analysis |
| US6545264B1 (en) | 1998-10-30 | 2003-04-08 | Affymetrix, Inc. | Systems and methods for high performance scanning |
| US7510841B2 (en) | 1998-12-28 | 2009-03-31 | Illumina, Inc. | Methods of making and using composite arrays for the detection of a plurality of target analytes |
| AU4025300A (en) * | 1999-03-24 | 2000-10-09 | Packard Bioscience Company | Continuous porous matrix arrays |
| EP1088101A4 (en) * | 1999-03-30 | 2004-10-20 | Nanogen Inc | UNIQUE NUCLEOTIDE POLYMORPHIC DISCRIMINATION BY ELECTRONIC DOT BLOT TEST ON SEMICONDUCTOR MICROCHIPS |
| JP2003524772A (ja) | 1999-04-27 | 2003-08-19 | シファーゲン バイオシステムズ， インコーポレイテッド | 気相イオン分析計のためのプローブ |
| EP1054259A1 (en) * | 1999-05-19 | 2000-11-22 | Remacle, José | Method for the identification of a target compound |
| US20030096321A1 (en) * | 1999-05-19 | 2003-05-22 | Jose Remacle | Method for the identification and/or the quantification of a target compound obtained from a biological sample upon chips |
| US6465183B2 (en) * | 1999-07-01 | 2002-10-15 | Agilent Technologies, Inc. | Multidentate arrays |
| JP2001017166A (ja) * | 1999-07-02 | 2001-01-23 | Fuji Photo Film Co Ltd | Ｄｎａチップ、ｄｎａチップの検定キットおよびｄｎａチップの検定法 |
| US6428957B1 (en) * | 1999-11-08 | 2002-08-06 | Agilent Technologies, Inc. | Systems tools and methods of assaying biological materials using spatially-addressable arrays |
| US6235483B1 (en) | 2000-01-31 | 2001-05-22 | Agilent Technologies, Inc. | Methods and kits for indirect labeling of nucleic acids |
| US7955794B2 (en) | 2000-09-21 | 2011-06-07 | Illumina, Inc. | Multiplex nucleic acid reactions |
| US7582420B2 (en) | 2001-07-12 | 2009-09-01 | Illumina, Inc. | Multiplex nucleic acid reactions |
| US8076063B2 (en) | 2000-02-07 | 2011-12-13 | Illumina, Inc. | Multiplexed methylation detection methods |
| US6455007B1 (en) * | 2000-06-13 | 2002-09-24 | Symyx Technologies, Inc. | Apparatus and method for testing compositions in contact with a porous medium |
| US7439016B1 (en) | 2000-06-15 | 2008-10-21 | Digene Corporation | Detection of nucleic acids by type-specific hybrid capture method |
| US7601497B2 (en) | 2000-06-15 | 2009-10-13 | Qiagen Gaithersburg, Inc. | Detection of nucleic acids by target-specific hybrid capture method |
| US6905816B2 (en) | 2000-11-27 | 2005-06-14 | Intelligent Medical Devices, Inc. | Clinically intelligent diagnostic devices and methods |
| CA2440656A1 (en) * | 2001-03-09 | 2002-09-19 | Apollo Biotechnology, Inc. | Conjugate probes and optical detection of analytes |
| EP2246438B1 (en) | 2001-07-12 | 2019-11-27 | Illumina, Inc. | Multiplex nucleic acid reactions |
| US6893822B2 (en) | 2001-07-19 | 2005-05-17 | Nanogen Recognomics Gmbh | Enzymatic modification of a nucleic acid-synthetic binding unit conjugate |
| US7601493B2 (en) * | 2002-07-26 | 2009-10-13 | Nanogen, Inc. | Methods and apparatus for screening and detecting multiple genetic mutations |
| US20040241659A1 (en) * | 2003-05-30 | 2004-12-02 | Applera Corporation | Apparatus and method for hybridization and SPR detection |
| US7622281B2 (en) | 2004-05-20 | 2009-11-24 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Methods and compositions for clonal amplification of nucleic acid |
| US7828954B2 (en) * | 2004-09-21 | 2010-11-09 | Gamida For Life B.V. | Electrode based patterning of thin film self-assembled nanoparticles |
| US7314542B2 (en) * | 2004-09-23 | 2008-01-01 | Nanogen, Inc. | Methods and materials for optimization of electronic transportation and hybridization reactions |
| US20060246576A1 (en) | 2005-04-06 | 2006-11-02 | Affymetrix, Inc. | Fluidic system and method for processing biological microarrays in personal instrumentation |
| JP5187847B2 (ja) | 2005-05-06 | 2013-04-24 | ジェン−プローブ・インコーポレーテッド | 核酸標的の捕獲方法 |
| WO2007070553A2 (en) * | 2005-12-12 | 2007-06-21 | The Johns Hopkins University | Double-tiled and multi-tiled arrays and methods thereof |
| EP1971690B1 (en) | 2005-12-28 | 2018-10-17 | Translational Therapeutics, Inc. | Translational dysfunction based therapeutics |
| US20080003667A1 (en) * | 2006-05-19 | 2008-01-03 | Affymetrix, Inc. | Consumable elements for use with fluid processing and detection systems |
| NZ576149A (en) | 2006-09-29 | 2012-06-29 | Translational Therapeutics Inc | Eif4e regulon-based diagnostics |
| EP1912067A1 (en) * | 2006-10-12 | 2008-04-16 | Eppendorf Array Technologies S.A. | Method for quantification of a target compound obtained from a biological sample upon chips |
| US9938641B2 (en) * | 2006-12-18 | 2018-04-10 | Fluidigm Corporation | Selection of aptamers based on geometry |
| WO2008085777A2 (en) * | 2007-01-03 | 2008-07-17 | Xgenetics Inc. | A method for early detection of cancer |
| JP2012506705A (ja) * | 2008-10-27 | 2012-03-22 | キアジェン ゲイサーズバーグ インコーポレイテッド | 迅速に結果を得るハイブリッドキャプチャー法による分析およびシステム |
| CA2750338C (en) * | 2009-01-28 | 2019-06-25 | Qiagen Gaithersburg, Inc. | Sequence-specific large volume sample preparation method and assay |
| JP5738278B2 (ja) * | 2009-05-01 | 2015-06-24 | キアジェン ゲイサーズバーグ インコーポレイテッド | 試料中のｒｎａスプライシング形態を検出するための非標的増幅法 |
| WO2011032124A1 (en) | 2009-09-14 | 2011-03-17 | Qiagen Gaithersburg, Inc. | Compositions and methods for recovery of nucleic acids or proteins from tissue samples fixed in cytology media |
| JP6103941B2 (ja) | 2010-01-29 | 2017-03-29 | キアジェン ゲイサーズバーグ インコーポレイテッド | 核酸の配列特異的精製および多重分析のための方法および組成物 |
| JP2013517803A (ja) | 2010-01-29 | 2013-05-20 | キアジェン ゲイサーズバーグ インコーポレイテッド | サンプル中のｈｐｖの存在を決定および確認する方法 |
| JP2013528049A (ja) | 2010-05-19 | 2013-07-08 | キアゲン ガイサーズバーグ アイエヌシー． | 核酸の配列特異的な精製及び多重分析のための方法及び組成物 |
| US9376727B2 (en) | 2010-05-25 | 2016-06-28 | Qiagen Gaithersburg, Inc. | Fast results hybrid capture assay and associated strategically truncated probes |
| WO2012116220A2 (en) | 2011-02-24 | 2012-08-30 | Qiagen Gaithersburg, Inc. | Materials and methods for detection of hpv nucleic acid |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4366246A (en) * | 1977-11-08 | 1982-12-28 | Genentech, Inc. | Method for microbial polypeptide expression |
| US4293652A (en) * | 1979-05-25 | 1981-10-06 | Cetus Corporation | Method for synthesizing DNA sequentially |
| FI63596C (fi) * | 1981-10-16 | 1983-07-11 | Orion Yhtymae Oy | Mikrobdiagnostiskt foerfarande som grundar sig pao skiktshybridisering av nukleinsyror och vid foerfarandet anvaenda kombinationer av reagenser |
| GB8306426D0 (en) * | 1983-03-09 | 1983-04-13 | Malcolm A D B | Detecting polynucleotide sequence |
| CA1260372A (en) * | 1984-04-27 | 1989-09-26 | Elazar Rabbani | Hybridization method for the detection of genetic materials |
| US4563417A (en) * | 1984-08-31 | 1986-01-07 | Miles Laboratories, Inc. | Nucleic acid hybridization assay employing antibodies to intercalation complexes |
-
1984
- 1984-02-17 FI FI840655A patent/FI71768C/fi not_active IP Right Cessation
-
1985
- 1985-01-22 ZA ZA85511A patent/ZA85511B/xx unknown
- 1985-01-24 US US06/694,325 patent/US4731325A/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-01-29 IE IE202/85A patent/IE57652B1/en not_active IP Right Cessation
- 1985-02-04 AU AU38422/85A patent/AU577568B2/en not_active Expired
- 1985-02-07 BE BE214463A patent/BE901671A/fr not_active IP Right Cessation
- 1985-02-07 IT IT19432/85A patent/IT1183184B/it active
- 1985-02-08 DK DK198500589A patent/DK174675B1/da not_active IP Right Cessation
- 1985-02-12 CA CA000474112A patent/CA1248895A/en not_active Expired
- 1985-02-12 LU LU85768A patent/LU85768A1/fr unknown
- 1985-02-13 NO NO850554A patent/NO166543C/no not_active IP Right Cessation
- 1985-02-14 NL NL8500424A patent/NL193663C/nl not_active IP Right Cessation
- 1985-02-15 GB GB08503900A patent/GB2156074B/en not_active Expired
- 1985-02-15 JP JP60029207A patent/JPS60188100A/ja active Granted
- 1985-02-15 AT AT0044185A patent/AT394578B/de not_active IP Right Cessation
- 1985-02-15 SU SU853856877A patent/SU1523053A3/ru active
- 1985-02-15 FR FR858502188A patent/FR2559783B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1985-02-15 CH CH725/85A patent/CH671778A5/de not_active IP Right Cessation
- 1985-02-15 DE DE3505287A patent/DE3505287C2/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-02-15 HU HU85570A patent/HU194938B/hu unknown
- 1985-02-15 SE SE8500733A patent/SE463103B/sv not_active IP Right Cessation
- 1985-02-18 RO RO117684A patent/RO92633B/ro unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| NL193663C (nl) | Werkwijze en kit voor het detecteren van een specifiek nucleïnezuur in een monster. | |
| JP2820749B2 (ja) | 核酸ハイブリダイゼーションの増進手段および方法 | |
| Meier et al. | Antigenic variation is associated with DNA rearrangements in a relapsing fever Borrelia | |
| Tornatore et al. | Detection of JC virus DNA in peripheral lymphocytes from patients with and without progressive multifocal leukoencephalopathy | |
| US7960357B2 (en) | PKR activation via hybridization chain reaction | |
| Swanson et al. | Pilus-gonococcal variants. Evidence for multiple forms of piliation control. | |
| Aldovini et al. | Synthesis of the complete trans-activation gene product of human T-lymphotropic virus type III in Escherichia coli: demonstration of immunogenicity in vivo and expression in vitro. | |
| JPS62229068A (ja) | サンプル中の核酸配列の存在を検出するための液体ハイブリダイゼ−シヨン法及びそのためのキツト | |
| JP3436538B2 (ja) | 改良型の鎖置換アッセイおよびそれに有用な複合体 | |
| JPH09501562A (ja) | ヒト・免疫不全ウイルスに対する活性を有するオリゴヌクレオチド | |
| US5389515A (en) | Isolated nucleotide sequences for identifying Neisseria gonorrhoeae | |
| US6818402B2 (en) | Method and kit for the detection of schistosomiasis through the polymerase chain reaction | |
| JPS62502686A (ja) | 標的ヌクレオチド配列の検定に有用な試薬複合体を作製するための方法および核酸構築物 | |
| US5776693A (en) | Specific detection of the mycobacterium tuberculosis | |
| JP4964230B2 (ja) | ネコ・ヘモプラズマの分離株 | |
| JP2004514437A (ja) | ネグレリア属の原虫を検出する方法 | |
| WO1991008310A1 (en) | Detection of human adenovirus | |
| RU2135583C1 (ru) | ПЛАЗМИДА ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ АНТИ-мРНК РЕТРОВИРУСА HIV-1 (ВАРИАНТЫ) | |
| JPH04506747A (ja) | リサウィルス感染症の検出法および／または同定法、モコラリサウィルスのペプチドおよび／またはペプチドの断片をコードする遺伝子のクローン化と発現、モコラウィルスおよび／またはリサウィルス群に対するワクチン、および遺伝子工学による前記ワクチンの製造方法 | |
| Mahloogi | An investigation into the effects of adenosine tracts on nucleosome structure | |
| JPS61158792A (ja) | ブル−タングウイルス検出用ｄｎａプロ−ブ |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| BA | A request for search or an international-type search has been filed | ||
| BB | A search report has been drawn up | ||
| BC | A request for examination has been filed | ||
| CNR | Transfer of rights (patent application after its laying open for public inspection) |
Free format text: SANGTEC MEDICAL AB |
|
| SNR | Assignments of patents or rights arising from examined patent applications |
Owner name: SANGTEC MOLECULAR DIAGNOSTICS AB |
|
| V4 | Discontinued because of reaching the maximum lifetime of a patent |
Effective date: 20050214 |