JPH0515399A - Ｒｎａの測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】高いコピ−数を有するが立体構造も有するため
に核酸プロ−ブがハイブリダイゼ−ションし難かったＲ
ＮＡについて、立体構造を有さないようにした後に測定
を行うことで高感度でＲＮＡを測定する。 【構成】測定されるべきＲＮＡをアルカリ加水分解処理
して断片化し、立体構造を有さないようにした後、核酸
プロ−ブをハイブリダイゼ−ションさせる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、臨床診断の分野で注目
されている核酸診断に関するものであり、特に細菌検査
やウイルス検査に好適なＲＮＡの測定に関するものであ
る。

【０００２】

【従来の技術】臨床検査の分野において、例えば細菌に
よる感染症の疑いがあるとされた場合には、患者から血
液等の試料（検体）を取得し、染色検鏡することにより
細菌の存在を確認後、試料（検体）中の細菌を各種培地
で培養することにより始めて細菌の同定までが終了す
る。

【０００３】この方法は細菌の種類までも決定できる、
という特徴を有する反面、培養を行わなければならない
ため、時間がかかるという課題があった。

【０００４】このため最近では、前記のような方法に代
わって核酸診断が頻繁に行われている。細菌の核酸診断
は、細菌中のＤＮＡ又はＲＮＡを抽出し、その中から細
菌に特異的な塩基配列を検出することで、細菌感染の有
無及び細菌種の同定を短期間に実施するものである。

【０００５】細菌の核酸診断については、ドット法、サ
ザンブロット法，ノ−ザンブロット法等のフィルタ−に
測定されるべき核酸を固定する方法や、インサイチュ−
ハイブリダイゼ−ション法、液層法等がある。サンドイ
ッチアッセイを一例として説明すれば、まず細菌から核
酸分画を通常の方法で核酸を抽出し、これを固相に結合
させた核酸プロ−ブと結合させ、次いで標識された核酸
プロ−ブを接触させて（固相−固相に結合された核酸プ
ロ−ブ−測定されるべき核酸−標識された核酸プロ−
ブ）という複合体を形成させる。次に、測定されるべき
核酸と結合していない標識された核酸プロ−ブを除去
し、最後に標識を測定して、測定されるべき核酸の存在
や量等を知るのである。なお標識は、例えばラジオアイ
ソト−プ、アルカリ性フォスファタ−ゼやβ−Ｄ−ガラ
クトシダ−ゼ等の酵素、蛍光物質又は発光物質が使用さ
れる。

【０００６】更に、固相に結合させる核酸プロ−ブか標
識された核酸プロ−ブの少なくとも一方を細菌が特異的
に有する塩基配列と相補的に作製しておけば、細菌の種
類までも知ることが可能である。

【０００７】

【従来技術の課題】従来の核酸診断では、測定されるべ
き核酸はゲノムＤＮＡ、プラスミッドＤＮＡ、メッセン
ジャ−ＲＮＡ、リボソ−ムＲＮＡであるが、ゲノムＤＮ
Ａは細菌当たり１又は数コピ−程度しか存在せず、高感
度の核酸診断には不適当である。

【０００８】これに対しプラスミドＤＮＡ、メッセンジ
ャ−ＲＮＡ又はリボゾ−ムＲＮＡ等は、１細胞当たりの
コピ−数が多く、高感度の測定に好適である。中でもリ
ボソ−ムＲＮＡは１細胞当たりのコピ−数が最も多く、
最も高感度の核酸診断を実現し得るものである。

【０００９】参考までに大腸菌における核酸量を列記す
れば、全核酸に対し、ゲノムＤＮＡ１％、メッセンジャ
−ＲＮＡ５％、トランスファ−ＲＮＡ１５％、リボソ−
ムＲＮＡ７９％である。従ってゲノムＤＮＡとリボソ−
ムＲＮＡでは、核酸のコピ−数に更に大きな違いがあ
る。

【００１０】以上に説明したように、核酸診断において
はＤＮＡを対象とするよりも、ＲＮＡを対象とした方が
高感度の測定を実施できる。しかしながら、ＲＮＡは、
それ自体が２次や３次あるいはそれ以上の高次構造を有
している場合が多く、核酸プロ−ブとハイブリダイゼ−
ションし難いという課題がある。核酸同志のハイブリダ
イゼ−ションはＲＮＡ同志の結合が最も強固であり、Ｄ
ＮＡ−ＲＮＡの結合、ＤＮＡ同志の結合の順に結合が弱
くなる。従って特に、ＤＮＡを核酸プロ−ブとして使用
した場合には、前記課題が顕著になる。

【００１１】ＲＮＡの中でも、トランスファ−ＲＮＡや
リボソ−ムＲＮＡは特に複雑な立体構造を有することが
知られている。例えばリボソ−ムＲＮＡは、５Ｓリボソ
−ムＲＮＡ（約１２０塩基）、１６Ｓリボソ−ムＲＮＡ
（約１５００塩基）及び２３Ｓリボソ−ムＲＮＡの３種
類があるが、これらのリボソ−ムＲＮＡと蛋白質が結合
して巨大なリボゾ−ムを形成している。

【００１２】このため、高感度の核酸診断を実施しよう
とする場合にはコピ−数の多いリボソ−ムＲＮＡを対象
とすることが好ましいにもかかわらず、プロ−ブがハイ
ブリダイゼ−ションし難いため結局は期待したほどの測
定感度が達成されないのである。

【００１３】

【課題を解決するための手段】本発明者は、断片化され
たＲＮＡは立体構造を有し難いことに着眼し、測定され
るべきＲＮＡをアルカリ加水分解して立体構造を有さな
いようにすることで、従来の課題であったＲＮＡと核酸
プロ−ブのハイブリダイゼ−ションのし難さを解決し、
本発明を完成するに至った。

【００１４】即ち本発明は、測定対象であるＲＮＡをア
ルカリ加水分解処理して断片化し、次いで、断片化され
た測定対象ＲＮＡと該測定されるべきＲＮＡに含有され
る特定の塩基配列とハイブリダイゼ−ションし得るＤＮ
Ａ又はＲＮＡプロ−ブを接触させ、形成されたハイブリ
ッドを測定することからなる、ＲＮＡの測定方法を提供
するものである。以下本発明を詳細に説明する。

【００１５】本発明において直接の測定対象であるＲＮ
Ａは、例えば動物や人間から得られる血液、血清、細
胞、尿、便（糞便）、粘液、啖等から通常の方法に従っ
て調製されたもので良い。本発明では調製されたＲＮＡ
分画を使用しても良いし、更に可能であれば量及びコピ
−数の多いリボソ−ムＲＮＡ画分等を使用しても良い。
このように精製されたＲＮＡを対象とすることで、夾雑
物の影響を減少させることができる。

【００１６】また、本発明においては、前記した血液、
血清又は細胞破砕物等のＲＮＡを含む試料を直接使用し
ても良い。このように体液等を直接本発明に使用する場
合には、遠心分離やクロマトグラフィ−を実施して、Ｒ
ＮＡ断片と核酸プロ−ブとのハイブリダイゼ−ションを
妨害する恐れのある血球成分や蛋白質成分等を除去して
おくと良い。

【００１７】測定されるべきＲＮＡとしては、例えば細
菌やウイルスに特異的な蛋白をコ−ドするＲＮＡや、例
えば癌遺伝子の転写により製造された癌蛋白をコ−ドす
るＲＮＡ等が例示できる。言い換えれば、測定されるべ
きＲＮＡとしては、細菌、ウイルスまた時には癌遺伝子
に由来する、通常は製造されることのないＲＮＡで、通
常製造されるＲＮＡと比較した場合、特徴的な塩基配列
（特定の塩基配列）を含有しているＲＮＡ等である。従
って、このような特定の塩基配列の有無を測定すること
によって、ウイルス感染、細菌感染や癌の発病等はもと
より、その種類等も同定することが可能となる。

【００１８】一方、例えばｒＲＮＡのように特異な蛋白
質をコ−ドしないＲＮＡでも、後の実施例に記載するよ
うに、大腸菌等の細菌等に特異的なｒＲＮＡを測定する
ことにより、その細菌の存在を検出することが可能であ
る。

【００１９】本発明におけるアルカリ加水分解処理は、
調製されたＲＮＡ分画をアルカリ溶液に溶解することに
より、容易に実施できる。アルカリ溶液はｐＨが９〜１
２程度のものであれば良い。一方、体液等を直接本発明
に使用する場合には、これにアルカリ物質を直接添加す
れば良い。

【００２０】アルカリ加水分解によるＲＮＡの断片化の
度合は、アルカリ溶液のｐＨ、温度及び溶液中の他の夾
雑物により代わる。その一例を示せば、４０ｍＭ炭酸水
素ナトリウム−６０ｍＭ炭酸ナトリウム溶液（ｐＨ１
０）の６０℃溶液中では、ｔ＝（Ｌ０−Ｌｆ）／（ｋ・
Ｌ０・Ｌｆ）で現される。ここで、ｋ＝０．１１／（ｋ
ｂ・分）、Ｌ０＝ＲＮＡの最初の長さ、Ｌｆ＝ＲＮＡの
最後の長さ、そしてｔ＝時間（分）である。この式か
ら、例えば１６Ｓリボソ−ムＲＮＡについて考慮すれ
ば、１５００ベ−ス（ｂ）の１６Ｓリボゾ−ムＲＮＡを
前記溶液に添加した場合、３０分後には約５７０ベ−
ス、３０分後には約２５０ベ−ス、そして１時間後には
約１４０ベ−スにアルカリ加水分解される。

【００２１】本発明者の経験によれば、２５０塩基程度
まで断片化されたＲＮＡは立体構造を有し難くなること
から、前記式を参照して条件を決定し、更に予備実験を
行うことでアルカリ加水分解の際のｐＨ、温度、処理時
間等を決定すれば良い。また、２５０塩基程度まで断片
化したとしても、測定されるべきＲＮＡ中の特定配列が
消失する可能性は非常に小さい。また、２５０塩基程度
とすることで、特定の塩基配列を保存したままで断片を
フィルタ−に固定したり、また例えば、サンドイッチア
ッセイのため、２つの核酸プロ−ブとハイブリダイゼ−
ションさせたりすることも容易になる。

【００２２】以上のようにして断片化されたＲＮＡに対
し、続いて核酸プロ−ブを接触させる。核酸プロ−ブ
は、ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれでも良いが、核酸同志の
ハイブリダイゼ−ションの強さを考慮した場合、ＲＮＡ
とすることが好ましい。核酸プロ−ブは、測定されるべ
きＲＮＡに含有される特定配列に相補的な配列を有する
ものであれば良い。特定配列としては、特徴的な２０塩
基程度の連続した配列とすることが好ましい。この程度
以上の塩基配列を使用することで、理論的に核酸プロ−
ブが非特異的にＲＮＡ断片とハイブリダイゼ−ションす
る恐れを無くすことが可能である。なおこの特定配列は
特に限定されたものではなく、ウイルスや細菌の感染を
効率的に測定できるものであれば制限はない。

【００２３】測定されるべきＲＮＡ中の特定配列は、例
えば広く感染性ウイルスに存在する配列を選択すればウ
イルス感染の有無を知ることができるし、また、特定の
ウイルスに特異的な配列を選択すればウイルス感染の有
無と同時に感染ウイルスの同定が同時に達成できること
になる。従って、特定の配列は実施者が目的に応じて決
定すれば良い。

【００２４】先に述べたように、ＲＮＡにはメッセンジ
ャ−ＲＮＡ、トランスファ−ＲＮＡ又はリボソ−ムＲＮ
Ａ等の種類がある。中でもリボソ−ムＲＮＡは量が最も
多くかつコピ−数も大きい。従って本発明では、リボソ
−ムＲＮＡ中に存在する特定の塩基配列と相補的な核酸
プロ−ブを用いることが高感度の測定を実施するうえで
好ましい。

【００２５】核酸プロ−ブを断片化された測定されるべ
きＲＮＡと接触させた後、形成されたハイブリッドを測
定するには、例えば高速液体クロマトグラフィ−の手法
を利用し、ハイブリッドがＲＮＡ酸断や核酸プロ−ブに
比較して大きな分子量を有することを手掛かりに行うこ
とが可能である。しかし、より簡単には、核酸プロ−ブ
にラジオアイソト−プ等の標識物質を結合させておくと
良い。中でも酵素、蛍光物質、発光物質又は吸収物質等
の光学的手段により測定可能な物質（酵素は、酵素基質
を添加して酵素反応を生じさせ、後に生じた酵素反応生
成物を光学的に測定する）を標識物質として使用すれ
ば、人体への影響もなく、かつ、測定自体も簡単であ
る。核酸プロ−ブと標識の結合は、通常の方法に従って
行えばよく、特別の制限はない。

【００２６】本発明のＲＮＡの測定方法においては、断
片化した対象ＲＮＡをフィルタ−等に固定して核酸プロ
−ブをハイブリダイゼ−ションさせ、後に測定を実施し
ても良いし、核酸プロ−ブとはことなる部分で対象ＲＮ
Ａとハイブリダイゼ−ションするような核酸プロ−ブを
適当な固相に固定しておき、後に特定の塩基配列と相補
的な核酸プロ−ブをハイブリダイゼ−ションさせる、い
わゆるサンドイッチアッセイを行っても良い。

【００２７】サンドイッチアッセイにおいては、２種の
核酸プロ−ブを使用する。一方は対象ＲＮＡを捕捉する
ためのプロ−ブであり、もう一方は標識と結合した測定
用のプロ−ブである。通常は捕捉用の核酸プロ−ブを適
当な固相に固定化して対象プロ−ブを捕捉し、次に測定
用プロ−ブをハイブリダイゼ−ションさせて測定される
べきＲＮＡを測定するのである。

【００２８】しかしながら、測定されるべきＲＮＡ中の
特定の塩基配列とハイブリダイゼ−ションし得る核酸プ
ロ−ブを固定化しておき、最初に対象ＲＮＡの中から測
定されるべきＲＮＡを捕捉して他のＲＮＡを除去し、後
にＲＮＡに共通の塩基配列とハイブリダイゼ−ションし
得る標識と結合した核酸プロ−ブを用いて、残ったＲＮ
Ａの全てを測定することもある。

【００２９】

【実施例】以下に本発明を更に詳細に説明するために実
施例を記載するが、これら実施例は本発明を限定するも
のではない。

【００３０】実施例１ （１）ＤＮＡ固定化ゲルの作製 ２１ｍｅｒのアミノ化合成ＤＮＡ、１０ＯＤ（２６０ｎ
ｍの吸光度が１０であることを示す。以下同じ）を、Ｄ
ＮＡ合成装置（アプライドバイオシステム社製３８１
Ａ）で合成後、２ｍｌの１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ８．８）
に溶解してトレシル化ＮＰＲ（東ソ−（株）製）１００
ｍｇに添加して攪拌しながら１時間放置した。なお、こ
のＤＮＡの塩基配列は、（５´）−ＧＣＣ ＴＴＣ Ｇ
ＣＣ ＡＣＣＧＧＴ ＡＴＴ ＣＣＴ−（３´）であ
り、大腸菌の１６ＳｒＲＮＡに対してハイブリダイゼ−
ションする合成ＤＮＡである。

【００３１】この混合物を遠心分離してゲルを沈殿させ
て上澄を捨てた後、３ｍｌの１００ｍＭトリス−塩酸緩
衝液（ｐＨ８．０）を添加して攪拌しながら５分間放置
し、ゲル上の未反応トレシル基を反応させた。

【００３２】この混合物を更に遠心分離に供し、同様の
操作を３回繰り返した。

【００３３】以上の操作により得られた混合物の上澄を
捨て、３ｍｌの５×ＳＳＣ（３ＭＮａＣｌ，０．３Ｍ
Ｓｏｄｉｕｍ Ｃｉｔｒａｔｅ ｐＨ７．０）、０．５
％ポリビニルピロリドンＫ−３０（ナカライテスク社
製）、０．５％牛血清アルブミン（千葉畜産工業（株）
製）溶液に再懸濁した。

【００３４】（２）アルカリ性フォスファタ−ゼ（ＡＬ
Ｐ）標識の結合したＤＮＡの作製 ２１ｍｅｒのアミノ化合成ＤＮＡ３ＯＤをＤＮＡ合成装
置（アプライドバイオシステム社製３８１Ａ）で合成
後、５０μｌの０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム、２ｍＭＥ
ＤＴＡに添加し、ＤＭＳＯ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌ
ｆｏｘｉｄｅ）に溶解した１００μｌＤＳＳ（Ｄｉｓｕ
ｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ Ｓｕｂｅｒｒａｔｅ、ＰＩＥＲ
ＣＥ社製）と混合して３７℃で５分間放置した後、高速
液体クロマトグラフィ−（東ソ−（株）製、ＨＷ４０
Ｆ）に供して分離し、凍結乾燥した。なおこのＤＮＡの
塩基配列は、（５´）−ＡＴＣ ＴＣＴ ＡＣＧ ＣＡ
Ｔ ＴＴＣ ＡＣＣ ＧＣＴ−（３´）であり、大腸菌
の１６ＳｒＲＮＡに対してハイブリダイゼ−ションする
合成ＤＮＡである。

【００３５】このＤＳＳ化合成ＤＮＡに５０μｌの３Ｍ
塩化ナトリウム、０．１Ｍほう酸緩衝液（ｐＨ８．０）
に溶解したＡＬＰを加え、室温で２時間放置した。

【００３６】上記の溶液を高速液体クロマトグラフィ−
（東ソ−（株）製、Ｇ３０００ＳＷＸＬ）に供し、ＡＬ
Ｐと結合した合成ＤＮＡを取得した。

【００３７】（３）ＲＮＡの測定 大腸菌（Ｋ１２株、Ｃ６００）からホットフェノ−ル法
により単離、乾燥された核酸分画に、４０ｍＭ炭酸水素
ナトリウム、６０ｍＭ炭酸ナトリウム（ｐＨ１０．３）
を細胞最終濃度が１０⁶ 細胞／１０μｌとなるように添
加し、６０℃条件下で０、１０、３０又は６０分間放置
してアルカリ加水分解処理を行った（０は、アルカリ加
水分解処理を実施していない場合である）。

【００３８】加水分解処理は、１／３０容量の３Ｍ酢酸
ナトリウムと１／２００容量の氷酢酸からなる中和液を
添加して停止した。

【００３９】アルカリ加水分解処理が終了した核酸分画
溶液の１０μｌをハイブリダイゼ−ション溶液（５×Ｓ
ＳＣ、０．５％ポリビニルピロリドンＫ−３０、０．５
％牛血清アルブミン、１％ＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍ Ｄｏ
ｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ和光製薬（株）製）、デキ
ストランサルフェイト（Ｍｗ〜５０００００、ファルマ
シア社製）、１ｍＭ塩化マグネシウム、０．１ｍＭ硫酸
亜鉛）と混合し、先に作製したＤＮＡ固定化ゲル１ｍｇ
に加えて５０℃で３０分間放置した（５分おきに攪拌操
作を行った）。

【００４０】この混合物を遠心分離して上澄を捨て、ハ
イブリダイゼ−ション溶液でＤＮＡ濃度を１００ｎｇ／
ｍｌとなるように希釈された先に作製したＡＬＰと結合
した合成ＤＮＡを１００μｌ添加し、５０℃で１５分間
放置した。

【００４１】次にこの混合物を遠心分離して上澄を捨
て、７５０μｌの洗浄液（１％Ｔｗｅｅｎ２０、１％デ
キストランサルフェ−ト、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、
０．０１５Ｍ ＴＥＡ酢酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍ
Ｍ塩化マグネシウム、０．１ｍＭ硫酸亜鉛）を添加して
攪拌し、更に遠心分離して上澄を捨てた。

【００４２】以上の洗浄操作を合計６回繰り返した後、
上澄を捨てて得られたゲルを１００μｌの０．５Ｍ Ａ
ＭＰ（アミノメチルプロパノ−ル）緩衝液（ｐＨ１０．
０）に懸濁し、３７℃で５分間放置した。

【００４３】以上のようにして得られたゲルを含む溶液
に対し、２ｍＭ ４ＭＵＰ（４メチルウンベリフェロン
フォスフェ−ト）溶液の１００μｌを添加した後、蛍光
強度を蛍光検出器を用いて測定し、その増加割合（ｒａ
ｔｅ）を算出した。

【００４４】この結果、アルカリ加水分解処理を行って
いない場合には１００未満のｒａｔｅしか得られなかっ
たのに対し、３０分又は６０分のアルカリ加水分解処理
を行った場合には６００以上のｒａｔｅが得られた。本
実施例による大腸菌の検出下限界はおよそ４００細胞で
あるが、一方、ＲＮＡを断片化していない場合の検出下
限界はその１０倍の４０００細胞である。このように、
本発明の測定方法により１０倍の感度上昇が実現でき
た。

【００４５】以上の結果を図１に示す。図１によれば、
アルカリ加水分解処理によりＲＮＡが立体構造を有さな
くなり、ゲルに固定化したＤＮＡ及びＡＬＰと結合した
ＤＮＡとハイブリダイゼ−ションし易くなったことが分
かる。

【００４６】また、本実施例で対象とした核酸分画のよ
うに、夾雑物の少ない対象では、アルカリ加水分解処理
を３０〜６０分程度とすることで、良好な結果が得られ
ることが分かる。

【００４７】実施例２ 大腸菌の溶菌測定 １０⁸ 細胞／ｍｌの大腸菌懸濁溶液の１０μｌに、３０
μｌの６ＭＧｄｎ、１００ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ１０．０）を添加して６０℃で０、１、２、３、
４又は５分間放置した。

【００４８】この溶液に、８０μｌの停止液（３７．５
ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、０．１９％
（ｖ／ｖ）酢酸、５×ＳＳＣ）を添加してアルカリ加水
分解を停止し、更に実施例１で作製したＤＮＡ固定化ゲ
ルを加えて５０℃で３０分間放置した。

【００４９】この混合物を遠心分離して上澄を捨て、ハ
イブリダイゼ−ション溶液でＤＮＡ濃度を１００ｎｇ／
ｍｌとなるように希釈されたＡＬＰと結合した合成ＤＮ
Ａ（実施例１で作製）を１００μｌ添加し、５０℃で１
５分間放置した。

【００５０】次にこの混合物を遠心分離して上澄を捨
て、７５０μｌの洗浄液を添加して攪拌し、更に遠心分
離して上澄を捨てた。

【００５１】以上の洗浄操作を合計６回繰り返した後、
上澄を捨てて得られたゲルを１００μｌの０．５Ｍ Ａ
ＭＰ（アミノメチルプロパノ−ル）緩衝液（ｐＨ１０．
０）に懸濁し、３７℃で５分間放置した。

【００５２】以上のようにして得られたゲルを含む溶液
に対し、２ｍＭ ４ＭＵＰ（４メチルウンベリフェロン
フォスフェ−ト）溶液の１００μｌを添加した後、蛍光
強度を蛍光検出器を用いて測定し、その増加割合（ｒａ
ｔｅ）を算出した。

【００５３】この結果、アルカリ加水分解処理を行って
いない場合にはｒａｔｅは非常に小さかったのに対し、
アルカリ加水分解処理を行った場合には大きなｒａｔｅ
が得られた。

【００５４】以上の結果を図２に示す。図２によれば、
アルカリ加水分解処理によりＲＮＡが立体構造を有さな
くなり、ゲルに固定化したＤＮＡ及びＡＬＰと結合した
ＤＮＡとハイブリダイゼ−ションし易くなったことが分
かる。このように、僅か数分のアルカリ加水分解処理で
あっても、得られるｒａｔｅは大きく変化する。

【００５５】実施例３ マイコバクテリウムの溶菌測定 実施例１と同様の操作により、２１ｍｅｒの合成ＤＮＡ
を作製し、ゲルに固定化した。なおこのＤＮＡは、（５
´）−ＣＧＧ ＴＡＴ ＴＡＧ ＡＣＣ ＣＡＧＴＴＴ
ＣＣＣ−（３´）である。また、実施例１と同様の操
作により、更に２１ｍｅｒの合成ＤＮＡを作製し、ＡＬ
Ｐと結合させた。このＤＮＡは、（５´）−ＡＧＡ Ｃ
ＡＴ ＧＣＡ ＴＣＣ ＣＧＴ ＧＧＴ ＣＣＴ−（３
´）である。これら合成ＤＮＡは、共にマイコバクテリ
ウムの１６ＳｒＲＮＡに対してハイブリダイゼ−ション
するＤＮＡである。

【００５６】マイコバクテリウムボビスＢＣＧの培養液
１ｍｌを遠心分離して得た菌体に、２００μｌの脱脂液
（メタノ−ルとクロロフォルムの混合液）を添加し、６
０℃で２分間処理した。この溶液に３００μｌの１００
ｍＭ炭酸ナトリウム溶液（ｐＨ １１．０）を添加し、
攪拌して５０℃で４０分間、放置した。

【００５７】この溶液に酢酸ナトリウム溶液を添加して
中和を行い、７５μｌの上澄と７５μｌのハイブリダイ
ゼ−ション溶液を混合し、この混合液をＤＮＡ固定化ゲ
ルに加えて５０℃で３０分間放置した。なお、この間、
５分おきに攪拌を行った。

【００５８】以上の混合物を遠心分離して上澄を捨て、
ハイブリダイゼ−ション溶液でＤＮＡ濃度を１００ｎｇ
／ｍｌとなるように希釈されたＡＬＰと結合した合成Ｄ
ＮＡを１００μｌ添加し、５０℃で１５分間放置した。

【００５９】次にこの混合物を遠心分離して上澄を捨
て、７５０μｌの洗浄液を添加して攪拌し、更に遠心分
離して上澄を捨てる洗浄操作を合計６回繰り返した後、
上澄を捨てて得られたゲルを１００μｌの０．５Ｍ Ａ
ＭＰ（アミノメチルプロパノ−ル）緩衝液（ｐＨ１０．
０）に懸濁し、３７℃で５分間放置した。

【００６０】以上のようにして得られたゲルを含む溶液
に対し、２ｍＭ ４ＭＵＰ（４メチルウンベリフェロン
フォスフェ−ト）溶液の１００μｌを添加した後、蛍光
強度を蛍光検出器を用いて測定した。

【００６１】その結果、溶菌したマイコバクテリウムボ
ビスＢＣＧのＲＮＡ（ｒＲＮＡ）を測定することができ
た。

【００６２】

【発明の効果】本発明は、ＲＮＡをアルカリ加水分解処
理して断片化して立体構造を有さないようにすること
で、核酸プロ−ブと測定されるべきＲＮＡとのハイブリ
ダイゼ−ションを生じ易くするものである。

【００６３】より具体的にいえば、２５０〜３００塩基
程度のＲＮＡ断片では立体構造を有し難いから、この程
度の断片にアルカリ加水分解してやるのである。特に本
発明で行うアルカリ加水分解処理は、主に処理時間、処
理ｐＨ、処理温度を調整することだけで、断片化の度合
を任意に決定することが可能であり、状況に応じて最も
好ましい大きさに対象ＲＮＡを断片化することが可能で
ある。

【００６４】本発明は、対象ＲＮＡ中の、特定の塩基配
列を含有する測定されるべきＲＮＡを測定するものであ
る。特定の塩基配列は測定されるべきＲＮＡを他のＲＮ
Ａと区別し得る配列であり、例えば、人のＲＮＡには存
在せず、細菌のＲＮＡ中にのみ認められる配列等であ
る。

【００６５】アルカリ加水分解処理により、この特定の
塩基配列が破壊されてしまう可能性もある。しかしなが
ら、２５０塩基程度に断片化するのであれば、その可能
性は非常に小さいものとなる。

【００６６】ＲＮＡはＤＮＡと比較してコピ−数が大き
く、大量に含まれている。従って、ＲＮＡが立体構造を
有することに起因する、核酸プロ−ブとのハイブリダイ
ゼ−ションのし難さを解決する本発明は、臨床診断等の
分野における細菌やウイルス感染の測定等に好適であ
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は本発明の実施例１の結果を示すものであ
り、横軸はアルカリ加水分解処理を行った時間、縦軸は
蛍光測定の結果から計算されたｒａｔｅ（蛍光強度増加
率）を示している。アルカリ加水分解処理が０、即ちア
ルカリ加水分解処理を行っていない場合には、１００未
満の小さいｒａｔｅしか得られないが、加水分解処理を
行った場合にはより大きなｒａｔｅが得られることが分
かる。ｒａｔｅが大きいことは、結局、反応溶液中にＡ
ＬＰが多量に含まれていることを示している。ＡＬＰは
合成ＤＮＡと結合されており、測定されるべきＲＮＡを
介してゲルに固定化された合成ＤＮＡと結合している。
従ってアルカリ加水分解処理によりＡＬＰの量が多くな
ったということは、測定されるべきＲＮＡと、ゲルに固
定化された合成ＤＮＡ又はＡＬＰと結合した合成ＤＮＡ
の両方のハイブリダイゼ−ションが起こり易くなったこ
とを示している。

【図２】図２は本発明の実施例２の結果を示すものであ
り、横軸はアルカリ加水分解処理を行った時間、縦軸は
蛍光測定の結果から計算されたｒａｔｅを示している。
この図からも、アルカリ加水分解処理を行った場合に
は、行っていない場合に比較して、測定されたｒａｔｅ
が大きく、従ってアルカリ加水分解分解により測定され
るべきＲＮＡと合成ＤＮＡとのハイブリダイゼ−ション
が生じ易くなったことが分かる。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】測定対象であるＲＮＡをアルカリ加水分解
   処理して断片化し、次いで、断片化された測定対象ＲＮ
   Ａと該測定されるべきＲＮＡに含有される特定の塩基配
   列とハイブリダイゼ−ションし得るＤＮＡ又はＲＮＡプ
   ロ−ブを接触させ、形成されたハイブリッドを測定する
   ことからなる、ＲＮＡの測定方法。
2. 【請求項２】ＲＮＡをｐＨ９〜１２の溶液中でアルカリ
   加水分解処理して断片化することを特徴とする請求項１
   に記載の方法。
3. 【請求項３】測定されるべきＲＮＡがリボソ−ムＲＮＡ
   である請求項１又は２に記載の方法。