LU85768A1 - Reactifs d'acide nucleique perfectionnes et procedes pour leur preparation - Google Patents
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Description
La présente invention est relative à des réactifs d'acide nucléique perfectionnés comprenant une chaîne de frag ments d'acide nucléique et à des combinaisons de ces réactifs '·*» perfectionnés. L'invention concerne aussi des procédés de 5 préparation de réactifs d'acide nucléique composé d'une chaîne de clones et de combinaisons de ces réactifs d'acide nucléique v. * par des techniques d'ADN recombinant et leur utilisation pour - identifier des acides nucléiques par des méthodes d'hybridation.
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Diverses méthodes d'hybridation ont été couramment 10 utilisées pour identifier et étudier des acides nucléiques.
Certains exemples sont constitués par les méthodes d'hybridation directes, dans lesquelles l'échantillon contenant l'acide nucléique ä identifier est soit en solution (Bräutigam et coll., J. Clin. Microbiol., 1980, 1/2, 226-234 et la Publication du 15 brevet britannique n° 2 019 408) soit fixé à un support solide (brevets U.S. N° 4 139 346, 4 302 204, 4 358 535 et 4 395 486, ^ de brevet britannique N° 2 034 323 et 2 095 833, les Publica- „ tions de brevets européens N° 62 286, 62 237 et 61 740) et est détecté à l'aide d'un réactif d'agent nucléique marqué, qui 20 s'hybride avec l'acide nucléique à identifier.
D'autres méthodes d'hybridation connues comprennent la méthode d'hybridation en sandwich à deux étapes, présentée par Dunn et Hassell dans Cell, 1_2, 23-36, 1977 et les méthodes d'hybridation en sandwich à une étape présentées dans la publi-25 cation du brevet européen N° 79 139. Pour réaliser l'identifi-" cation des acides nucléiques par les méthodes en sandwich, il faut deux réactifs d'acide nucléique distincts pour détecter les acides nucléiques présents dans la solution d'échantillon. L'un des réactifs est fixé à un support solide et l'autre est marqué, c 30 Des réactifs d'acide nucléique, à la fois ceux qui ! sont fixés à un support solide et ceux qui sont marqués, sont caractérisés en ce que leur séquence de base est complémentaire ou pratiquement complémentaire de celle de l'acide nucléique à identifier, c'est-à-dire homologue. Les réactifs d'acide nuclé-35 ique utilisés sont, soit des acides nucléiques naturels tels 2 que ou des fragments de ceux-ci. Les fragments sont produits, par exemple, à l'aide d'enzymes de restriction. Des réactifs d'acide nucléique ont aussi été préparés par synthèse ou par des techniques d'ADN recombinant. Des plasmides naturels 5 (brevet U.S. N° 4 358 535), des acides nucléiques provenant de bactériophages (brevet U.S. N° 4 543 535), de l'ARN riboso-mique et de l'ARN messager (brevet U.S. N° 4 302 204) ou un Ä acide nucléique provenant de différents virus (Stâlhandske et coll., Curr. Top. Microbiol. Virol, 104, 1983) ont été utili-10 sés comme réactifs d'acide nucléique. Le génome viral entier a été utilisé pour identifier, par exemple, des parties appartenant aux différents virus dans l'ARN messager d'un virus hybride (Dunn et Hassell, Cell, 12^ 23-36, 1977). On a aussi t préparé des réactifs d'acide nucléique en utilisant des ) 15 techniques d'ADN recombinant (brevets ü.S. N° 4 395 486, et ·. 4 359 535, la demande de brevet européenN® 79 139 , la publi- , 1 cation du brevet britannique N 2 034 323, ainsi que la demande de brevet européen N° 62 286) . Des réactifs d'acide nucléique produits par des techniques d'ADN recombinant ont 20 été utilisés, soit de telle façon que le fragment d'ADN défini répliqué a été purifié à partir de l'ADN du vecteur, soit sous forme de molécules d'ADN recombinant liées à différents vecteurs. Les réactifs d'acide nucléique utilisé auparavant, * produits par des techniques d'ADN recombinant, sont constitués 25 d'un fragment continu d'acide nucléique d'identification ou . ’ de plusieurs clones distincts.
La demanderesse a mis au point de nouveaux réactifs d'acide nucléique plus sensibles, comprenant au moins deux séries de chaînes alternatës de fragments d'acide nucléique, 1 30 préparés à partir d'un ou de plusieurs segments homologues de l'acide nucléique à identifier.
Dans des tests d'hymidation en sandwich, des réactifs d'acide nucléique qui comprennent de telles chaînes de fragments d'acide nucléique, sont au moins deux fois plus sensibles 35 que les réactifs d'acide nucléique utilisés antérieurement.
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En utilisant les réactifs d'acide nucléique conformes à la présente invention ou leurs combinaisons, il est possible d'identifier de plus petites quantités d'acides nucléiques qu'auparavant, et ils sont particulièrement bien appropriés 5 aux méthodes d'hybridation en sandwich.
La plus grande sensibilité des réactifs d'acide -* nucléique conformes à la présente invention manifestée dans des méthodes d'hybridation en sandwich, repose en partie sur le fait que l'utilisation de plusieurs sondes augmente la quan-tité d'hybrides marqués sur le support solide. Il peut y avoir un acide nucléique marqué dérivé d'un vecteur avec chaque sonde hybridante (Figures 1 et 2) . Dans les Figures 1 et 2 v représente 1'ADN dérivé d'un vecteur, x est l'acide nucléique à identifier, b la sonde marquée, a le réactif d'acide nucléique d'identification fixé à un support solide et F est Ig filtre. Lorsqu'on utilise plusieurs sondes, la quantité de „ parties marquées d'acide nucléique dérivées du vecteur, augmente et davantage de substance de marquage est fixée aux - hybrides formés. Les hybrides sont ainsi plus facilement 2Q détectables.
Lorsque la chaîne de fragments d'acide nucléique conforme à la présente invention, est utilisée dans des méthodes d'hybridation en sandwich, on fixe au moins deux, ou comme cela est montré dans la Figure 1, trois fragments d'acide nucléique d'identification sur le support solide. Dans ce cas, 25 . les différentes zones du brin x d'acide nucléique à détecter, peuvent s'hybrider avec les fragments d'acide nucléique fixés en support solide, par exemple a^, a2 et a^ en un ou plusieurs points, en fonction du degré de réaction. Lorsque la réaction atteint son stade final, il peut se présenter une
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situation selon la Figure 1, dans laquelle le brin d'échantillon forme une ou des boucles auxquelles s'hybrident la ou les sondes, par exemple b^ et b2 dans la Figure 1. A ce moment, la distance entre les parties d'acide nucléique dérivées du 2^ vecteur et le point de jonction de l'hybridation (1) diminue 4 * '(Fig. 1) et l'hybride est plus stable que l'hybride formé par une paire de réactifs (art antérieur) montré sur la Figure 2, cet hybride étant de la même dimension que la surface totale de la chaîne des fragments d'acide nucléique. Les parties 5 dérivées du vecteur d'un hybride formé à partir d'une paire Λ de réactifs sont facilement rompus, par exemple par une tension mécanique, comme les secousses. Dans un tel cas, la marque déjà * liée à l'hybride, s'échappe.
Comme les réactifs d'acide nucléique perfectionnés, 10 conformes à la présente invention, sont plus sensibles que des réactifs d'acide nucléique utilisés antérieurement, ils connennent pour mettre en évidence des réarrangements chromosomiques et des maladies héréditaires.
La présente invention concerne des réactifs d'acide 15 nucléique comprenant une chaîne de fragments d'acide nucléique, leur combinaison, leur préparation et leur utilisation pour détecter des acides nucléiques dans des méthodes d'hybridation, c Les caractéristiques de la présente invention sont rapportées dans les revendications et l'invention est décrite 20 en détail dans la description qui va suivre.
L'invention sera mieux comprise a l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère aux dessins annexés dans lesquels : - la Figure 1 montre une chaîne d'hybrides en sand- 25 wich, - la Figure 2 montre un hybride en sandwich de l'art antérieur, - la Figure 3 montre les sites de deux séries alternées de fragments d'acide nucléique dans un acide nucléique 30 qui a été choisi pour la préparation d'une chaîne de réactifs d'acide nucléique selon la présente invention, i - la Figure 4 montre les sites correspondants de trois séries alternées de chaînes de fragments d'acide nucléique, 35 - la Figure 5 montre une chaîne de fragments d'acide 5 nucléique selon la Figure 3/ distincts (a), réunis (b) et à la fois distincts et réunis (c), - la Figure 6 montre une chaîne d'hybrides en ,-r sandwich, 5 - la Figure 6a montre une chaîne d'hybrides en sandwich qui est formée dans le cas de l'utilisation de fragments distincts, - la Figure 6b montre une chaîne d'hybrides en sandwich qui est formée dans le cas de l'utilisation de frag- 10 ments b réunis, - la Figure 6c montre une chaîne d'hybrides en sandwich qui est formée dans le cas où l'on utilise à la fois des fragments b distincts et des fragments b réunis, - la Figure 7 montre une chaîne de réactifs d'acide 15 nucléique, qui identifie différents acides nucléiques, - la Figure 8 montre une chaîne d'hybrides en sand- ; " à wich qui est formée dans le cas où l'on utilise la chaîne de réactifs d'acide nucléique suivant la Figure 7, identifiant différents acides nucléiques, 20 - la Figure 9, montre une chaîne d'hybrides formée par un procédé d'hybridation directe, - la Figure 10 montre le plasmide recombinant pKTH1220;.
- la Figure 11 montre une chaîne d'hybrides en sand- , wich qui est formée lorsqu'on utilise une chaîne de fragments 25 d'acide nucléique préparée à partir du plasmide recombinant . * PKTH1220, - la Figure 12 montre le plasmide recombinant pKTHl27l, - la Figure 13 montre une chaîne d'hybrides en sand- c 30 wich qui est formée lorsqu'on utilise des chaînes de fragments d'acide nucléique, préparées à partir du plasmide recombinant PKTH1271.
Il doit être bien entendu, toutefois, que ces dessins et les parties descriptives correspondantes, sont donnés 35 uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, 6 dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
La présente invention est relative à des réactifs d'acide nucléique composés d'une chaîne de fragments d'acide nucléique. Ces chaînes de réactifs d'acide nucléique compren-5 nent au moins deux, mais de préférence plusieurs fragments d'acide nucléique alternés et jusqu'à 20 fragments, qui dérivent d'un ou de plusieurs acides nucléiques suffisamment homologués de l'acide nucléique devant être identifié. On obtient ainsi au moins deux séries de chaînes alternées de 10 fragments d'acide nucléique, qui ne doivent pas nécessairement être homologués les uns des autres.
Les chaînes de réactifs d'acide nucléique peuvent être préparées par synthèse. Dans ce cas, les fragments provenant des deux séries alternées de chaînes de fragments 15 d'acide nucléique ne doivent pas nécessairement être homologués les uns des autres. Mais, ils doivent être suffisamment homo-* χ logués. des sites alternés dans les acides nucléiques à identifier. Ces fragments peuvent facilement être préparés avec des machines complètement automatiques, après caractéri-20 sation de la séquence d’acides nucléiques de l'acide nucléique à identifier.
Les chaînes d'acide nucléique conformes à la présente invention sont composés de chaînes séparées, réunies ou à la fois séparées et réunies de fragments d'acide nucléique.
25 Les chaînes de fragments d'acide nucléique peuvent * être réunies à un vecteur, contenir des parties de vecteurs ou être totalement dépourvues de parties de vecteurs.
Les fragments d'acide nucléique utilisés ont une longueur minimum de 15 nucléotides. Il n'y a aucune limite 30 supérieure réelle quant à la longueur, mais il est avantageux d'utiliser des fragments ayant une longueur de 20 à 5000 nucléotides. Les fragments d'acide nucléique conformes à la présente invention sont dérivés, soit du génome à identifier, soit d'une partie du génome par exemple, d'un clone relativement 35 important représentant une certaine partie du génome. Les 7 chaînes de fragments d'acide nucléique conformes à la présente invention, peuvent ainsi être préparés à partir de plusieurs zones de génome indépendantes, qui ne sont pas directement adjacentes. Les chaînes de fragments d'acide nucléique ainsi 5 préparées sont combinées et utilisées pour le même réactif. Les chaînes de fragments d'acide nucléique peuvent aussi être isolées à partir d'un ADN qui n'est pas identique à l'acide nucléique à identifier, mais suffisamment homologue pour qu'il se forme un hybride stable entre le réactif et l'acide nucléique 10 à identifier. La préparation de chaînes appropriées de fragments d'acide nucléique n'est, en aucun cas, limitée à l'isolation des fragments convenables d'acide nucléique à partir du génome. Il existe de nombreuses méthodes également utiles pour préparer ces chaînes de fragments. Le spécialiste 15 peut préparer des chaînes de fragments d'acide nucléique selon a des méthodes synthétiques ou semisynthétiques.
xs ' Les réactifs sont isolés de manière telle qu'on , obtient au moins deux séries de fragments d'acide nucléique alternés a^ a2, a3 etc.., et b^ b2, b3, etc. . Les fragments 20 d'acide nucléique appartenant à la série a^, a2, a^, etc., sont composés de fragments situés près l'un de l'autre, mais non adjacents l'un à l'autre. Les fragments d'acide nucléique appartenant à la série b^, b2, b^ etc., sont aussi composés de fragments d'acide nucléique situés au voisinage, mais non 25 l'un à côté de l'autre. Les fragments d'acide nucléique appartenant à la série a^, a2, a^, etc> et ceux de la série b^, b2, b^ etc., ne doivent pas nécessairement être homologués les uns des autres. Il est préférable que les acides nucléiques appartenant à la série a^, a2, a3 etc., et ceux qui appartien-30 nent à la série b^, b2, b^ etc., soient isolés de manière telle qu'un fragment sur deux soit de la série a et l'autre fragment soit de la série b, comme cela est illustré par la Figure 3. Dans la Figure 3, a^, a2, a^ et b^, b2, b^ sont des chaînes de fragments d'acide nucléique suffisamment homologués de 35 l'acide nucléique à identifier. Il est évidemment possible 8 qu'une troisième série de fragments d'acide nucléique, c^, <z^· c^, etc., soit même isolée à partir du même acide nucléique, comme cela est représenté par la Figure 4. On préfère que les deux réactifs d'acide nucléique alternés se suivent direc-5 tement l'un l'autre, mais ceci ne constitue pas une condition préalable indispensable pour la présente invention.
Les séries de fragments d'acide nucléique décrites ci-dessus peuvent être utilisées, soit sous forme de fragments séparés a^, a-2> a3 » etc., et b^, b2, b^, etc.. (Fig. 5a) soit 10 réunis en brins plus longs a1-a2~a2r etc., et etc..
(Figure 5b). Il est bien sûr possible de préparer toutes les sortes de formes intermédiaires, comme par exemple, une série a dans laquelle a^ est un fragment distinct et s°nt réunis et dans la série b, par exemple sont réunis et 15 b^ est séparé «te., comme cela est illustré par la Figure 5c.
= La Figure 6 illustre diverses chaînes d'hybrides en sandwich. La Figure 6a montre une chaîne d'hybrides en ^ sandwich, dans laquelle les chaînes de fragments d'acide nuclé ique sont séparées. La Figure 6b montre une chaîne d'hybrides 20 dans laquelle les chaînes marquées de fragments d'acide nucléique sont réunies. La Figure 6c montre un cas dans lequel une chaîne d'hybrides en sandwich est formée à partir de chaînes marquées, à la fois réunies et séparées de fragments d'acide nucléique.Dans la Figure 6, x représente l'acide nuclé-25 ique à identifier ; b.^, b2 et b^ représentent la sonde marquée et a^, a2 et a^ représentent des chaînes de fragments d'acide nucléique fixés à un support solide.
Des fragments d'acide nucléique qui appartiennent à la série b, pouvent par exemple, être marqués de manière telle 30 qu'on obtienne un réactif d'acide nucléique marqué, c'est-à-dire la sonde B. Les réactifs d'acide nucléique qui appartiennent à la série a peuvent être attachés à un support solide, de telle sorte qu'un réactif A d'acide nucléique lié à un support solide soit obtenu. Dans une variante, il est évidemment possi-35 ble de préparer un réactif A d'acide nucléique marqué et un réactif B d’acide nucléique correspondant lié à un support solide.
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Ces paires A et B d'acides nucléiques/ ou B et A, marquées ou fixées respectivement à un support solide, peu-5 vent être préparées pour plusieurs acides nucléiques différents à identifier. Elles peuvent être associées en combinaisons convenables de réactif d'acide nucléique, qui sont composées de différentes paires de réactifs d'acide nucléique A^ et B^, A2 et B2, A^ et B^, etc., ou B^ et A^, B2 et A2, 10 B^ et Aj, etc.. Des réactifs contenant des chaînes de fragments d'acide nucléique qui identifient différents acides nucléiques, peuvent aussi être combinés de façon à obtenir une sonde Αχ-Α^-Αζ, qui, par exemple, comprend une chaîne de fragments d'acide nucléique (a.-an-a0) -(a,-a.-a,) - (a,-a„-a_.) comme 15 cela est indiqué dans la Figure 7, dans laquelle alx, a2x et a^x sont des chaînes de fragments Αχ d'acide nucléique, qui identifient l'acide nucléique x ; a2y et a3y sont des chaînes de fragments A^ d'acide nucléique qui identifient l'acide nucléique y ; a^z, a2Z/ et a^z son^ des chaînes de 20 fragments A d'acide nucléique qui identifient l'acide nuclé-ique z et v est une partie d'acide nucléique dérivée d'un vecteur. Des chaînes réunies de fragments d'acide nucléique peuvent évidemment aussi être utilisées, en tant que fragments ’ séparés, sous forme de mélanges appropriés.
25 Les chaînes d'hybrides en sandwich suivant la Figure 8 sont obtenues avec les réactifs représentés dans la Figure 7. Si l'on désire effectuer une identification simultanée de plusieurs acides nucléiques différents, il est bien sûr nécessaire d'utiliser des filtres séparés, comme cela est 30 représenté dans la Figure 8. La Figure 8a montre un support 1 solide identifiant l'acide nucléique x, la Figure 8b un sup port solide identifiant l'acide nucléique y et la Figure 8c un support solide identifiant l'acide nucléique z. Dans les Figures 8a, 8b, et 8c, b^x et b2X sont des chaînes de frag-35 ments d'acide nucléique fixés à un support solide et identi- 10 fiant l'acide nucléique x ; et sont des chaînes de fragments d'acide nucléique fixés à un support solide et identifiant l'acide nucléique y ; et b. et b„ sont des
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chaînes de fragments d'acide nucléique fixés à un support 5 solide et identifiant l'acide nucléique z ; et x, y et z sont les acides nucléiques à identifier. F , F et F sont
«. x y Z
les filtres ou supports solides respectifs, Αχ-Α^-Αζ est une sonde qui identifie simultanément les trois acides nucléiques, dans le cas où des supports solides séparés sont mis en 10 cause
Les séries de fragments, réactifs et combinaisons de réactifs d'acide nucléique décrits ci-dessus, peuvent être préparés par des techniques connues en elles-mêmes, impliquant l'ADN recombinant. On produit un certain nombre de 15 fragments d'acide nucléique de différentes longueurs, en utilisant des enzymes de restriction, à partir de l'acide nucléique à · identifier ou d'une partie le représentant. Si la carte de restriction du génome à identifier est connue, il est possible de choisir à partir du génome, les fragments 20 adjacents convenables, engendrés par les enzymes de restriction, puis d'isoler les fragments et de les amplifier en mettant en oeuvre des techniques d'ADN recombinant.
Lorsqu'un génome inconnu est impliqué, on peut • utiliser une étape intermédiaire dans la préparation des 25 réactifs de façon à cloner un fragment de restriction relativement important, on dresse la carte de ce fragment et on produit les chaînes de séries de fragments d'acide nucléique a ja^ etc., et b^, 1>2ΐ b^, etc., sur la base de l'information ainsi obtenue.
. 30 II est bien sür possible d'utiliser des combinai sons des méthodes ci-dessus et d'employer plusieurs gros fragments de restriction clonés séparés, à titre de matières de départ, puis de préparer plusieurs séries distinctes qui sont associées en combinaisons convenables.
35 II est avantageux de préparer les séries de frag- 11 ments d'acide nucléique a^, a^/ a^, etc., et b^, bb^/ etc., selon la présente invention en utilisant des techniques d' ADN recombinant, par clonage de la série a dans un vecteur, 5 par exemple, dans le plasmide pBR322, tandis que la série 5 b est classée dans un autre vecteur convenable qui n'a pas de séquences en commun avec le vecteur précédent. Le bactériophage M13 est un exemple d'un tel second vecteur avantageux. Les fragments appartenant à la série a, peuvent être réunis les uns aux autres, et la série réunie peut être 10 clonée dans un vecteur. Par exemple, a1"a2 réunis peuvent être clonés en tant qu'élément d'insertion continu dans le même vecteur pBR322. De façon analogue, il est possible de préparer une série b^-bj de r^actif. On préfère utiliser dans le donage, des vecteurs auxquels peuvent être réunis 15 de très larges inserts d'ADN étranger. Par exemple,des vecteurs cosmidiques et lambdaphages conviennent à ce propos.
Il faut donc deux paires de réactifs comprenant des chaînes de fragments d'acide nucléique dans la méthode ^ d'hybridation en sandwich conforme à la présente invention, 20 un réactif marqué avec la substance de marquage à identifier, c'est-à-dire une sonde et un réactif, dit filtre, fixé à un support solide.
On utilise, le plus couramment, des radio isotopes pour marquer les sondes. Par exemple , on emploie les 32 125 131 3 25 isotopes p, I, I, et H dans le brevet britannique N° 2 034 323, les brevets US N° 4 358 535 et 4 302 204.
125 L'isotope I est utilisé dans le brevet européen N° 79 139. Des sondes d'acide nucléique ont aussi été modifiées de diverses façons et marquées, par exemple , avec des traceurs 30 fluorescents (brevet français N° 2 518 755) . On utilise aussi des marqueurs enzymatiques ou mesurables par voie enzymatique (le brevet britannique N° 2 019 408, le brevet européen N° 63 879 et le brevet français N° 2 519 005) . Les brevets européens N° 70 685 et 70687 décrivent une substance de 35 marquage émettant de la lumière et une méthode de marquage, 12 et le brevet français N° 2 518 755 décrit une substance de marquage mesurable par voie immunologique. Les chelates de lanthanides décrites dans le brevet US N° 4 374 120, en particulier d'europium, peuvent être mis en oeuvre comme 5 substances de marquage. La substance de marquage biotine- avidine décrite par Leary et al. (PNAS 8J), 4045-4049, 1983), convient comme marqueur. Quelques exemples de substances de marquage utilisables pour effectuer le marquage des réactifs d'acide nucléique conformes à la présente invention, sont 10 mentionnés ci-dessus, mais il est évident que de nouvelles substances de marquage améliorées vont être mises au point, qui conviendront aussi pour le marquage de chaînes de fragments d'acide nucléique conformes à la présente invention.
Les supports appropriés pour des réactifs-filtres 15 comprennent divers filtres de nitrocellulose (brevet US
N° 4 358 535 et brevet britannique N° 2 095 833). Le brevet DDR N° 148 955 décrit une méthode pour fixer chimiquement des acides nucléiques au support (papier). Les brevets US N° 4 359 535 et 4 302 204 décrivent des papiers chimiquement 20 modifiés, qui peuvent être utilisés comme supports solides. D'autres possibilités comprennent des membranes de nylon et des filtres de nitrocellulose modifiée. Mais il est bien évident qu'il va appraître de nouveaux matériaux qui conviendront encore mieux en tant que supports solides conformes à 25 la présente invention. Il est bien sûr possible d'utiliser aussi d'autres supports solides, comme diverses matrices de chromatographie, telles que de la cellulose activée par la triazine ou un époxy, du latex, etc.. En principe, il n'y a pas d'autres limitations quant au choix du support solide 30 que celles qui sont indiquées ci-après. Il doit être possible de fixer l'acide nucléique en forme de brin unique sur le support solide, de manière telle que ces acides nucléiques à brin unique puissent s'hybrider avec l'acide nucléique complémentaire. Le support solide doit aussi être 35 facile à enlever de la solution d'hybridation ou la solution 13 d'hybridation doit être facile à éliminer du support solide.
La sonde ne doit pas non plus adhérer au matériau support lui-même au point qu'elle ne puisse en être éliminée par lavage.
5 Avec les combinaisons ci-dessus de chaînes de paires de réactifs d'acide nucléique A et B ou B et A, marqués et fixés à un support solide respectivement, il est possible d'assembler une combinaison Av et B , A et B , A et B à
„ X X y y Z Z
partir de ces paires d'acide nucléique préparées, pour 10 identifier différents acides nucléiques. Ces combinaisons peuvent être utilisées pour l'identification simultanée des acides nucléiques x, y et z par des méthodes d'hybridation en sandwich.
L'échantillon est traité de manière telle que les 15 acides nucléiques sont libérés dans la solution d'hybridation et qu'ils sont mis sous forme de brin unique. L'hybridation est effectuée dans une solution d'hybridation dans laquelle sont ajoutés les réactifs d'acide nucléique fixés à un * support solide et les réactifs marqués. Lorsque l'hybrida- 20 tion a eu lieu, on sort les filtres de la solution d'hybridation si des filtres ont été utilisés comme supports solides. Si des matrices de chromatographie, un latex ou similaires, ont été mis en oeuvre, on enlève la solution d'hybridation. Les supports solides sont rincés avec une 25 solution de lavage appropriée. Les chaînes d'hybrides en . . sandwich formés (Figures 8a, 8b, 8c) sont détectées par des méthodes connues en elles-mêmes. Le traceur radioactif est mesuré, par exemple, par autoradiographie, par compteur de scintillations ou compteur de rayonnement gamma. Par 30 exemple, on identifie une substance de marquage enzymatique, par exemple après une réaction colorée, par photométrie ou à partir d'un précipité. Des chélates de lanthanides peuvent être détectées par la méthode dite de "fluorescence dissipée dans le temps". Une substance de marquage immunologique est 35 détectée par des méthodes immunologiques appropriées.
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Plusieurs mélanges différents peuvent être utilisés comme solution d'hybridation ; les variantes décrites dans le brevet européen N° 79 139 et le brevet US 4 302 204 ” sont cités à titre d'exemples. Il est bien sûr possible d'uti- 5 User d'autres mélanges d'hybridation. L'hybridation a lieu à une température de 0 à 80°C, mais il est avantageux d'utiliser par exemple, une température de 65°C. Une hybridation suffisante peut apparaître en une très brève période, mais il est avantageux d'utiliser des périodes d'hybridation de, par 10 exemple, 12 à 20 heures.
Le procédé d'hybridation en sandwich à deux étapes est effectué en principe de la même façon, mais dans ce cas, on ajoute d'abord dans la solution d'hybridation, le réactif d'acide nucléique fixé à un support solide. Lorsque l'hybri-15 dation a eu lieu, on lave le support solide et on effectue la seconde hybridation, dans laquelle est présent le réactif d'acide nucléique marqué.
Les réactifs marqués d'acide nucléique ou combinaisons de réactifs 1 A , A , A etc., et B , B , B , etc..
x y z x y z 20 décrits plus haut, peuvent bien sûr être utilisés dans des méthodes d'hybridation directe. Dans un tel cas, on doit répartir l'échantillon d’acide nucléique en des solutions pour chacun des acides nucléiques x, y, et z à identifier ou, si l'échantillon est fixé à un support solide, on doit préparer 25 un échantillon séparé fixé à un support pour chaque échantillon. La chaîne d'hybrides formée (Figure 9) est détectée par des méthodes connues en elles-mêmes. Dans les Figures 9, F représente le support solide, c'est-à-dire le filtre,_jç_ est l'acide nucléique à identifier et v représente les parties dérivées 30 d'un vecteur. Les sondes marquées utilisées sont a , a2 et a^ (Figure 9a), b^ et b2 (Figure 9b) et a^ b^ a2, b2 ; a^ (Figure 9c).
Comme déjà décrit ci-dessus, on peut préparer diverses combinaisons de réactifs d'acide nucléique à partir 35 des chaînes de fragments d'acide nucléique conformes à la 15 présente invention. Il est possible d'identifier plusieurs différents acides nucléiques simultanément, en utilisant ces combinaisons. On peut utiliser des chaînes de fragments d'acide nucléique homologues des différents acides nucléiques 5 à identifier, sous forme de fragments séparés dans les mélanges ou réunis ensemble, de façon à obtenir une sonde identifiant plusieurs acides nucléiques différents. Des réactifs d'acide nucléique fixés à un support solide doivent évidemment être maintenus séparés, pour réussir l'identification.
10 L'hybridation utilisant des chaînes de fragments d'acide nucléique peut servir à identifier divers microorganismes pathogènes de l'homme, d'animaux ou de végétaux. Il est possible avec cette méthode d'identifier des microorganismes présents dans des denrées alimentaires, comme des clostri-15 diales, des salmonelles, des staphylocoques qui provoquent des empoisonnements alimentaires. La méthode convient pour . identifier des agents contaminants présents dans l'eau, comme des entérobactéries et des entérovirus.
Comme le test d'hybridation en sandwich utilisant 20 des chaînes de fragments d'acide nucléiques est une méthode quantitative, il est également applicable par exemple, à la détection et à la mesure de l'amplification des gènes. Cette caractéristique est significative par exemple, dans le domaine de la détection et du traitement du cancer. La forma-25 tion d'une chaîne stable d'hybrides nécessite que les séquences homologues de l'agent sonde et de l'agent filtre soient situées à une distance modérée l'une de l'autre, de préférence à moins de 5 kilobases (kb) dans le brin d'échantillon.
S'il apparaît effectivement des changements de distance entre 30 ces deux régions, on peut nettement observer ce changement grâce à cette méthode. La méthode convient donc aussi pour » la détection d'ARN messagère modifié, de réarrangements chromosomiques, de réarrangement des gènes d'immunoglobuline d'expression et des maladies héréditaires. Il est ainsi pos-35 sible de construire diverses combinaisons de réactifs à 16 partir des chaînes de fragments d'acide nucléique. Par exemple, pour effectuer l'identification d'agents provoquant des maladies vénériennes, il est possible de préparer des ensembles comprenant une sonde qui contient des chaînes de frag-5 ments d'acide nucléique capables d'identifier la gonorrhie, la syphilis, l'herpès et les chlamydias. Dans ce cas, on peut réaliser l'identification en utilisant des filtres distincts pour la gonorrhée, la syphilis, l'herpès et les chlamydiae.
10 La présente invention concerne en particulier des chaînes de fragments d'acide nucléique comprenant les plasmides recombinants pKTHl220 et pKTHl27l. Le plasmide recombinant pKTH1220 comprend 1'ADN de Chlamydia trachomatis L2 qui est spécifique des Chlamydiae, dans le vecteur constitué 15 par le plasmide pBR322. Ce plasmide recombinant est cloné dans l'hôte Escherichia coli Kl2 HB101. Dans le vecteur plasmide pBR325, le plasmide recombinant 1271 comprend l'ADN provenant du cytomégalovirus ADI 69. Ce plasmide recombinant est cloné dans l'hôte Escherichia coli Kl2 HN101. Les hôtes 20 contenant les plasmides recombinants pKTH1220 et pKTH1271 ont été déposés à la collection de cultures Deutsche Sammlung von Mikrooganismen (DSM), Griesebachstrasse 8, D-3400 Göttingen, R.F.A. Le numéro du dépôt contenant le plasmide recombinant pKTHl220 est DSM2825 et le numéro du dépôt contenant le 25 plasmide recombinant pKTH1271 est DMS2826. Les dépôts seront librement disponibles après publication de cette demande de brevet.
La présente invention est davantage décrite dans les exemples suivants, qui ne sauraient en aucune manière : 30 limiter la portée de celle-ci. La structure de l'acide nuclé ique (ADN et ARN) est semblable, qu'il s'agisse d'un acide nucléique dérivé d'une cellule eucarystée ou procaryste.
Pour cette raison, les modes présentés dans les exemples sont également applicables aux acides nucléiques des animaux 35 (l'homme compris), des plantes et des microbes ou virus. Ainsi, 17 les réactifs conformes à la présente invention, peuvent être utilisés pour détecter les acides nucléiques de l'homme, des animaux, des végétaux, des microbes et de virus. Les chaînes de fragments d'acides nucléiques peuvent aussi être préparées 5 par voie synthétique. La séquence des acides nucléiques à identifier peut être caractérisée et des chaînes homologues de fragments peuvent être préparées à l'aide de machines automatiques de préparation d'acides nucléiques.
Exemple 1 10 a) Chaîne de réactifs d'acide nucléique provenant de Chlamydia trachomatis et leur préparation.
On prépare des fragments d'ADN convenables pour réaliser le diagnostic du groupe Chlamydia trachomatis à partir de 1'ADN du Sérotype L2 de Chlamydia trachomatis .
15 L'ADN est isolé et fragmenté selon des méthodes connues, les fragments d'ADN résultants sont clonés dans le plasmide pBR322et transférés dans l'organisme d'accueil Escherichia coli Kl2 HBiOl selon des méthodes connues. On obtient une banque de gènes de la Bactérie Chlamydia trachomatis L2 à 20 la suite du clonage, c'est-à-dire un grand nombre de plasmides recombinants, ayant chacun un fragment de restriction distinct BamHI de l'ADN dérivé de chlamydia. Afin de produire un réactif, on choisit dans la banque de gènes, des plasmides recan-binants contenant de plus grandes insertions d'ADN dérivés d'ADN chlairydicue. 25 Un tel plasmide est désigné sous le nom de pKTHl220 ; il a été déposé à la collection de cultures Deutsche Sammlung von Micro-organismen sous le numéro (DMS 2825) et l'on a mis en évidence l'aptitude de celui-ci à être utilisé en tant que réactif par un test d'hybridation directe. Ce test a montré que le . 30 pKTHl220 a identifié tous les acides nucléiques dérivés des différents sérotypes de Chlamydia trachomatis, mais pas d' autres acides nucléiques.
Les fragments applicables, pouvant être obtenus à l'aide de diverses enzymes de restrictions, sont choisis à 35 partir de l'ADN du plasmide pKTH!220 et certains de ces frag- 18 ments sont transférés au cours d'un clonage ultérieur dans le plasmide pAT153 (Maniatis et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold String Harbor Laboratory, P .6, 1982) et d'autres dans la phage Ml3. La Figure 10 montre le plasmide 5 recombinant pKTHl220 ayant une longueur moléculaire de 14 kb. Dans la Figure 10, BamHI, Sali et Clal représentent les enzymes de restriction mises en oeu.vre et a^ a2, bj, b2 et b^ illustrent la dimension et les situations mutuelles des fragments produits à l'aide de ces enzymes de restriction.
10 Les fragments appartenant à la série b servent de sondes marquées. Le Tableau I fournit les dimensions des fragments et les vecteurs utilisés pour un clonage ultérieur, le nom des plasmides recombinants et leur utilisation.
Tableau I
15 __
Fragment Dimension Vecteur - . Plasmide utilisation
RecOTbinant
Clal-Sall 3,0kb pATl53 pKTHl252 Filtre a„ Sall-Clal 2,9kb pAT153 pKTHl250 Filtre b1 SalI-BamHI 0,7kb M13mp8 mKTH1242 sonde marquée b2 BamHI-SalI l,4kb M13mp8 mKTH1239 b3 Clal-Clal l,7kb M13mp8 mKTHl248 " b1-b2 BamHI-BamHI 2,lkb M13mp8 mKTH1245 25 “
Les fragments indiqués dans le Tableau I sont isolés à partir d'un gel d'agarose par électro-élution et sont clonés dans les sites appropriés d'identification de l'enzyme de restriction des vecteurs énumérés dans le Tableau I, à 30 l'aide de méthodes connues.
Le fragment BamHI-BamHI 2,1 kb est produit de la façon suivante : les fragments BamHi-SalI l,4kb et SalI-BamHi 0,7kb du plasmide pKTHl220 sont séparés par électrophorèse sur gel, dans un gel d'agarose à partir duquel ils sont isolés.
35 Les fragments purifiés sont réunis à l'aide de l'enzyme ligase 19 T4 et parmi les fragments d’ADN 2,1 kb produits dans la réaction, ceux qui ont des extrémités libres qui sont identifiés par l'enzyme BamHI, sont ensuite réunis au site de restriction BamHI de la forme à double brin de l'ADN du phage 5 M13mp8. On a ainsi fabriqué un ADN de phage recombinant „ (mKTHl245), qui contient l'ADN de Chlamydia trachomatis compo sant deux fragments d'ADN distincts, qui ne sont pas situés de façon adjacente dans le génome. Cependant, ils sont situés dans le génome, à côté des réactifs d'ADN pKTH1250 et pKTH1252 10 devant être fixés au filtre (Figure 11). La Figure 11 montre une chaîne d'hybrides en sandwich, qui est formée lorsqu'on utilise les plasmides recombinants et les phages recombinants énumérés dans le Tableau I comme chaînes de réactifs d'acide nucléique.
15 b) Démonstration de la sensibilité d'une chaîne de réactifs d'acide nucléique provenant de Chlamydia trachomatis selon la méthode d'hybridation en sandwich.
La sensibilité d'une chaîne de réactifs d'acide nucléique par rapport à celle d'une paire de réactifs continue 20 unique, a été étudiée selon la méthode d'hybridation en sandwich. On a effectué le test en utilisant des filtres qui contenaient tous 10^ molécules à la fois d'ADN de pKTHl250 (a2) et de pKTH1252 (a^) mis sous la forme de brin unique. L'échantillon étudié était le plasmide pKTH1220 que l'on a 25 mis sous forme de brin unique, pour cette expérience en le faisant bouillir pendant 5 minutes dans de la NaOH 0,17M, puis on l'a porté à 0°C et neutralisé avec une quantité équimolaire d'acide acétique. On a employé dans les tests, les sondes ci- 125 après, marquées avec I et énumérés dans le Tableau I : : 30 mKTHl242 (b^) , mKTH1239 (b2) , mKTHl248(b3) et mKTH1245 (bj-b^ .
L'hybridation a été réalisée à + 65°C pendant 17 heures dans une solution d'hybridation ayant la composition suivante : 4 x SSC, 0,02 % de Ficoll, 0,02 % de polyvinyl pyrrolidone, 0,2 % de SDS, et 200 yg/ml d'ADN de sperme de 35 hareng. Les filtres ont été lavés pendant 2 heures à 50°C
i 20 avec une solution de lavage ayant la composition suivante : 0,1 x SSC, 0,2 % de SDS et ont été soumis à un comptage avec un compteur de rayonnement gamma. Les résultats sont rassemblés dans le Tableau II et sont la moyenne de cinq 5 essais parallèles.
Tableau II
M
Molécules de Radioactivité hybridée, avec (b) comme sonde 10 SP6ClMeP/teSt bl b2 b3 tW
0 37 37 33 49_39_52 106 48 44 48 93 68 140 107 226 236 232 396 416 686 15 108 1475 1415 1456 2912 2637 3580
; b^ 380 000 cpm/test; 5 x 107 cpm/yg d'ADN
b9 340 000 cpm/test; 4 x 107 cpm/yg d'ADN
z 7
b^ 350 000 cpm/test; 5 x 10 cpm/yg d'ADN
20 ^i-^2 310 000 cpm/test; 7 x 107 cpm/yg d'ADN
b^, b2 700 000 cpm/test ; (bi-b2),b3 700 000 cpm/test; 25 On a considéré que la limite de confiance de 95 % • calculée statistiquement pour des tests effectués sans échantillon (= témoins négatifs) était la limité inférieure pour le caractère positif. Ces valeurs étaient de 52-54 cpm lorsque la sonde était b1, b2 ou b3, de 58 cpm lorsque la 30 sonde était b^, b2, de 56 cpm lorsque la sonde était b1-b2 et de 65 cpm lorsque la sonde était b^b^b^.
c) Diagnostics du chlamydia à l'aide d'une hybridation en sandwich avec des chaînes de fragments.
On a choisi pour cet essai, des spécimens prélevés 35 chez trois hommes souffrant d'urétrite et chez trois femmes 21 souffrant de cervicite. On a isolé le Chlamydia trachomatis dans les spécimens urétraux masculins/ tandis que les spécimens féminins ont été prélevés dans le col de l'utérus. De plus# on a étudié un nombre correspondant de spécimens analo-5 gués de malades à partir desquels la chlamydia n'a pas été isolée. Les spécimens à étudier ont été prélevés avec des écouvillons à bout de coton, qui ont été plongés dans une solution tampon de prélèvement d'échantillon de chlamydie, contenant du saccharose 0,2 M, 20 mM de tampon au phosphate, 3 % de 10 sérum de veau fœtal, 10 yg/ml de gentamicine, 100 yg/ral de vancomycine et 25 IU/ml de nystatine.
La chlamydia a été cultivée à partir des spécimens. Les spécimens d'origine ont été aussi évalués par hybridation en sandwich avec une chaîne de fragments d'acide nucléique. 15 On a concentré les spéciments en utilisant du 2-butanol pour en éliminer le liquide, de manière telle que le volume final était d'environ 80 VI, leur concentration étant de 3 à 7 fois environ pour l'essai. On a ajouté ensuite au spécimen, 70 mM d'EDTA, 0,7 % de SDS, 200 yg/ml d'enzyme K protéinase et on 20 l'a traité pendant 15 minutes à 55°C.et pendant 45 minutes à 37°C. Le spécimen a ensuite été porté à ébullition pendant 5 minutes avec de la NaOH, 0,175 M. Après ébullition, le spécimen a été mis à 0°C et neutralisé avec une quantité équimolaire d'acide acétique, puis soumis au test. Les filtres et les 25 conditions d'hybridation décrits dans l'exemple lb ont été mis en oeuvre dans le test. La sonde utilisée était le mKTH1245 (b^-b2), réaction d'hybridation : 300 000 cpra/400 μΐ. Les résultats sont rassemblés dans le Tableau III.
’ . 30 22
TABLEAU III
- Spécimen Radioactivité Résultat de la culture hydridée de chlamydia ** Homme 1. 151 +
Homme 2. 164 +
Homme 3. 154 +
Homme 4. 61 -
Homme 5. 76
Homme 6. 55
Femme 1. 343 +
Femme 2. 509 +
Femme 3. 362 + 15 Femme 4. 57
Femme 5. 58
Femme 6. 81 20 Tampon, X4 30-55
Bactérie Chl. trachomatis L2, 106 419 + 25
Dans les tests, la limite était de 104 cpm pour le caractère positif.
Les résultats du Tableau III montrent qu'une hybridation en sandwich utilisant une chaîne de fragments 3.0 d'acide nucléique, convient pour réaliser le diagnostic de maladies vénériennes. Les échantillons qui étaient négatifs dans les tests de culture, étaient également négatifs dans le test d'hybridation en sandwhich.
Exemple 2 35 a) Chaînes de fragments d'acide nucléique prove- 23 nant du Cytomégalovirus et leur préparation.
On a préparé des fragments d'ADN convenant pour réaliser le diagnostic du Cytomégalovirus à partir de Cytomégalovirus (AD 169, ATCC VR-538) - (CMV) . On a isolé et 5 fragmenté 1'ADN selon des méthodes connues. On a isolé le fragment I EcoRI d'environ 9 kb, défini dans Spector et al., J. Virol. 4_2, 558-582, 1982 par électroélution à partir d'un gel d'agarose, après avoir séparé les fragments de restriction EcoRI en fonction de leur dimension. L'ADN élué a été extrait 10 avec du phénol, puis précipité avec de l'éthanol. L'ADN, ainsi purifié, a été réuni au moyen de la ligase T^, au vecteur constitué par le plasme de pBR325 ouvert à l'aide de l'enzyme EcoRI et l'ADN recombinant produit a été transféré dans les bactéries hôtes E.coli K12 HB101. On a choisi parmi des clones 15 résitants à l'ampicilline et à la tétracycline mais sensibles au chloramphénicol, un clone qui contient une insertion d'ADN spécifique du cytomégalovirus de dimension correcte.
On a vérifié le caractère de l'ADN cloné de cytomégalovirus par la méthode de la tache Southern. On a ainsi constaté que 20 le fragment d' ADN EcoRI 9 kb décrit dérivait de l'ADN du Cytomégalovirus et, plus spécifiquement, était compris dans son fragment HindIII-D (Oram et al., J. Gen.Virol., 59_, 111-129, 1982). On a dénommé pKTHl271 le plasmide recombinant ainsi décrit et on l'a déposé dans la collection de cultures 25 Deutsch Sammlung von Microorganismen sous le numéro DSM 2826.
On a développé et purifié le plasmide recombinant selon des techniques connues.
Les clonages ultérieurs ont été effectués par des techniques connues, en utilisant comme vecteurs, le plasmide 30 pBR322 et les phages M13mp7 et M13mp8. La Figure 12 montre ; le plasmide hybride pKTHl27l ayant une longueur moléculaire d'environ 9 kb. La chaîne de fragments d'acide nucléique illustrée dans la Figure 12 a été préparée à l'aide des enzymes de restriction EcoRI, BamHI, Clal et Pstl. La Figure 12 35 montre les fragments obtenus avec les enzymes de restriction, 24 ainsi que leur situation et dimension relative. Le Tableau IV énumère les dimensions des fragments en question et les vecteurs utilisés pour le clonage ultérieur, les noms des plasmides recombinants ainsi obtenus et leur utilisation soit 5 en tant que réactifs-filtre, soit comme sondes marquées. La . Figure 13 montre une rangée d'hybrides en sandwich qui est formée lorsque la chaîne de fragments d'acide nucléique indi-. quée dans le Tableau IV est utilisée.
TABLEAU IV
10 _
Fragment de restriction Vecteur Désignation Utilisation a1 EcoRI-PstI (3,3kb) pBR322 pKTH1273 Filtre a2 Clal-BamHI (3,0kb) pBR322 pKTFl274 Filtre 15 bj^ Pstl-PstI (0,6kb) M13mp7 mKTHl277 sonde marquée b2 Pstl-Clal (l,0kb) M13mp8 mKTHl278 sonde marquée : : b^ BamHO-EcoRI (l,0kb) M13mp8 mKTH1279 sonde marquée 20 b) Démonstration de la sensibilité d'une chaîne de réactifs d'acide nucléique provenant du cytomégalovirus selon la méthode d'hybridation en sandwich.
___ La sensibilité d'une chaîne de réactifs d'acide nucléique par rapport à celle d'une paire continue de réactifs, 25 a été évalué par la méthode d'hybridation en sandwich. Dans les tests, on a utilisé comme spécimen de l'ADN de CMV que l'on a porté à ébullition dans de la NaOH 0,17 M pendant 5 minutes, puis neutralisé de la façon indiquée dans l'exemple lb. On a mis en oeuvre dans le test, des filtres contenant 30 tous 1011 molécules à la fois d'ADN de pKTHl273 (a^) et d'ADN du pKTH1274 (a-) mis sous forme de brin unique et les Δ 125 sondes ci-après, marquées avec I et énumérées dans le Tableau IV : mKTHl277(bx), mKTH1278(b2) et mKTH1279(b3). Les sondes contenaient chacune 108 cpm/yg d'ADN. L'hybridation a 35 été effectuée selon la procédure de 1' exemple lb. Les résul- 25 tats sont rassemblés dans le Tableau V.
TABLEAU V
Molécules de Radioactivité hybridée avec (b) comme sonde 5 spécimen test r-r-r-r—r-r—r-r— bl b2 b3 b^b^ b1(b2,b3 0 35 33 38 45_53_ 106 38 44 46 95 - 10 4 x 10b 85 135 142 205 292 1,6 x 107 203 254 265 415 645 bl 310 000 cpm/test b2 320 000 cpm/test b3 300 000 cpm/test bl,b2 300 000 cpm de chaque test ' bl,b2,b3 300 000 cpm de chaque test
Dans le test, la valeur de la limite inférieure du 20 caractère positif étant de 51-55 cpm lorsque la sonde était b1, b2 ou b^, de 59 cpm lorsque la sonde était b1# b2 et de 63 cpm lorsque la sonde était b^, b2, b^.
Les résultats fournis dans le Tableau V montrent qu'une hybridation en sandwich réalisée avec un réactif-sonde 25 individuel (b^,b2 ou b3) , détecte dans chaque cas, 4.10^ moles d'ADN de CMV. D'un autre côté, l'hybridation effectuée avec un réactif du type b^, b2 ou bj, b2/ b^ ne détecte que 10^ molécules d'ADN de CMV. Les résultats indiquent que les chaînes de réactifs d'acide nucléique sont quatre fois ? 30 plus sensibles que des réactifs individuels d'acide nucléique.
: c) Diagnostic du CMV par hybridation en sandwich avec une chaîne de réactifs d'acide nucléique.
On a dosé des spécimens cliniques en utilisant une méthode d'hybridation en sandwich avec une chaîne de 35 réactifs. Ces échantillons comprenaient deux spécimens d'urine 26 provenant d'enfants de moins d'un an . On supposait que ces enfants souffraient d'une maladie cytomégalovirale congénitale. Un spécimen biopsique du poumon prélevé chez un malade atteint d'une infection pulmonaire par CMV, a aussi 5 été dosé selon la méthode d'hybridation en sandwich conforme à la présente invention. Des cellules fœtales humaines à la fois non-infectées et infectées par le cytomégalovirus ont aussi été utilisées comme spécimens dans le test.
On a ajouté une solution contenant 1 % de sar-10 cosyle et 5 mM d'EDTA, et 200 yg d'ADN du thymus de veau, à un spécimen de 10 ml d'urine, puis on a fait précipiter l'ADN libéré à partir du virus, avec le support, en utilisant 10 ml d'isopropanol à la température ambiante. Le précipité d'ADN a été dissous dans 200 yl de tampon TE et mis sous 15 forme de brin unique par ébullition pendant 5 minutes, puis la solution d'ADN a été refroidie à 0°C et ajoutée à la solution d’hybridation.
On a haché mécaniquement au couteau, le spécimen 3 biopsique du poumon (quelques mm ) et on y a ajouté 200 yl 20 de tampon TE contenant une solution à 1 % de SDS et 1 mg/ml d'enzyme protéinase K. On a effectué une digestion à +37°C pendant une heure, puis on a soutiré le spécimen dans une seringue à injection à travers une mince aiguille hypodermique.
' . Le spécimen ainsi homogénéisé a été porté à ébullition, puis 25 ajouté à la solution d'essai.
On a morcelé les cellules infectées avec le cytomégalovirus et les cellules non-infectées, grâce à un traitement avec le SDS et la protéinase K, on les a homogénéisées et portées à ébullition, comme ci-dessus.
30 Les réactifs utilisés dans le test d'hybridation : étaient pKTH1273(a1) et pKTH1274(a2) sur des filtres et mKTHl277(b^), mKTHl278(b2), mKTH1279(b^) comme sondes, chacun à raison de 200 000 cpm/réaction. Par ailleurs, on a effectué l'hybridation, le lavage des filtres et le comptage des 35 résultats de la façon qui est décrite dans l'exemple lb. Les 27 résultats de l'hybridation selon l'invention sont rassemblés dans le Tableau VI.
TABLEAU VI
5 „ . Radioactivité _ , ,. .
Spécimen hybridée Isolation du virus
Cellules infectées (10^) 3521 pas faite
Urine 1(10 ml) 243 CMV
10 Urine 2(10 ml) 3215 CMV
Urine provenant d'une personne bien portante (10 ml) 52 pas faite 15 Spécimen biopsique de
poumon 535 CMV
Cellules servant de témoin (10^) 68 pas faite 20 Pas de spécimen 65 pas faite ; Les résultats du Tableau VI montrent qu'il est possible de mettre en évidence le CMV dans différents spéci-25 mens cliniques, comme l'urine, des fragments biopsiques du poumon et des cellules, en utilisant une chaîne de réactifs d'acide nucléique.
Le test est spécifique du cytomégalovirus ; il n'identifie pas 1'ADN humain, c'est-à-dire que le test n'est pas : _ 30 perturbé par l'ADN humain présent dans l'échantillon. En fait, • ; le type de spécimen n'interfère en aucune manière avec la spécificité du test.
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre de réalisation et d'application gui viennent d'être décrits de 35 façon plus explicite; elle en êmbrasse"au contraire'toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée de la présente inven- •Hnn.
Claims (13)
1. Réactifs d'acide nucléique, caractérisés en .·* ce qu'ils comprennent des chaînes de fragments alternés d'acide nucléique. 5
2. Réactifs d'acide nucléique suivant la reven dication 1, caractérisés en ce qu'ils comprennent deux ou . ' plusieurs séries d'au moins deux, mais de préférence plusieurs chaînes de fragments alternés d'acide nucléique suffisamment ' homologués de l'acide nucléique à identifier, mais non 10 homologués les uns des autres.
3. Réactifs d'acide nucléique suivant les revendications 1 et 2, caractérifés en ce qu'ils comprennent des chaînes qui sont séparées, soit réunies, de fragments alternés d'acide nucléique. 15
4. Réactifs d'acide nucléique suivant les reven dications 1, 2 ou 3, caractérisés en ce qu'ils comprennent des chaînes, de fragments d'acide nucléique, qui ont ou non des ^ parties dérivées d'un vecteur.
5. Réactifs d'acide nucléique suivant les reven-20 dications 1,2,3 ou 4, caractérisés en ce qu'ils comprennent des chaînes marquées de fragments d'acide nucléique.
6. Réactifs d'acide nucléique suivant les revendications 1, 2, 3 ou 4, caractérisés en ce qu'ils comprennent des chaînes de fragments d'acide nucléique fixées à un support 25 solide.
* 7. Réactifs d'acide nucléique suivant les reven dications 1, 2, 3 ou 4, caractérisés en ce qu'ils comprennent le plasmide recombinant pKTH1220 ou des dérivés de celui-ci et en ce que ce plasmide recombinant contient 1'ADN de la 30 bactérie Chlamydia trachomatis L2 et est cloné dans l'hôte ~ Escherichia coli Kl2 HB101, que le numéro de dépôt de cet hôte contenant le plasmide recombinant pKTHl220 étant DSM 2825.
8. Réactifs d'acide nucléique suivant les revendications 1,2,3, 4,5 ou 6, caractérisés en ce qu'ils compren-35 nent le plasmide recombinant pKTH1271 ou des dérivés de celui- 29 ci et en ce que ce plasmide recombinant contient 1' ADN du Cytomégalovirus AD 169 et est cloné dans l'hôte Escherichia coli K12 HB1Û1, le numéro de dépôt de cet hôte contenant le plasmide recombinant pKTHl271 étant DSM 2826.
9. Utilisation des réactifs d'acide nucléique suivant l'une des revendications précédentes pour identifier plusieurs acides nucléiques différents, caractérisée en ce que des combinaisons convenables de réactifs d'acide nucléique sont assemblées à partir de chaînes de fragments d'acide 10 nucléique suffisamment homologués de ces différents acides nucléiques.
10. Utilisation des réactifs d’acide nuclérique suivant l'une des revendications 1 à 8 dans des méthodes d'hybridation, caractérisée en ce que les chaînes d'hybrides 15 formées dans la méthode d'hybridation sont mises en évidence par des méthodes en soi connues.
11. Utilisation des réactifs d'acide nucléique suivant l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans des méthodes d'hybridation en sandwich, caractérisée en ce que 20 les chaînes d'hybrides en sandwich formés dans les méthodes d'hybridation en sandwich sont mises en évidence par des méthodes en connues.
12. Procédé de préparation de réactifs d'acide nucléique suivant l'une quelconque des revendications 1 à 8, 25 caractérisé en ce que les chaînes de fragments d'acide nucléique V sont préparées par des techniques utilisant l'ADN recombinant, synthétiques ou semisynthétiques.
13. Procédé suivant la revendication 12, caractérisé en ce que la préparation des chaînes de fragments 30 d'acide nucléique comprend : ' a) l'isolation d'un acide nucléique choisi de lon- ' gueur convenable, b) le clonage de l'acide nucléique choisi dans des vecteurs convenables, 35 c) la fragmentation des acides nucléiques à l'aide des 30 enzymes de restriction, d) la combinaison de chaînes convenables de fragments en série, à l'aide de ligases appropriées, e) le clonage des chaînes de fragments dans des vec-5 teurs convenables, en clonant de préférence des fragments appartenant à différentes séries dans différents vecteurs, f) le marquage des fragments d'acide nucléique, soit séparés, soit réunis et appartenant à une série, g) la fixation sur un support solide des fragments 10 d'acide nucléique, soit séparés, soit réunis, appartenant à l'autre série. "J U
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