WO1993002217A2 - Sondes oligonucleotidiques pour le typage et la detection des papillomavirus humains - Google Patents

Sondes oligonucleotidiques pour le typage et la detection des papillomavirus humains Download PDF

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WO1993002217A2
WO1993002217A2 PCT/FR1992/000683 FR9200683W WO9302217A2 WO 1993002217 A2 WO1993002217 A2 WO 1993002217A2 FR 9200683 W FR9200683 W FR 9200683W WO 9302217 A2 WO9302217 A2 WO 9302217A2
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typing
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Martine Joannes
Côme BARRANGER
Sylvie Ott
Gérard Somme
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Clonatec S.A.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/708—Specific hybridization probes for papilloma

Definitions

  • European patent application No. 301 968 in the name of IRE-CELLTARG S.A. describes nucleic acid probes useful for indifferently detecting the different types of human papillomavirus.
  • the oligonucleotide of formula (VIII) is derived from the DNA sequence of PVH 16 and has 100% homology with the fragment thereof delimited by the nucleotides located at positions 634 to 659.
  • the oligonucleotide of formula (VIII) has more than 88% homology with a DNA fragment from PVH 6, PVH 11, PVH 31 and PVH 33, and 60% homology with a DNA fragment from PVH 18
  • the probes constituted by the oligonucleotide sequences of formulas I, II, III, IV, V and VI allow respectively, under conditions appropriate hybridization, specific detection of PVH 16, PVH 16/31/33, PVH 18/16, PVH 18, PVH 6/11 and PVH 6.
  • the probes constituted by the oligonucleotide sequences of formulas VII and VIII allow, under the same hybridization conditions, screening for one of these PVH
  • the probes can be labeled using a radioactive tracer such as 32 P, 35 S, 125 I, 3 H, 14 C.
  • a radioactive tracer such as 32 P, 35 S, 125 I, 3 H, 14 C.
  • the radioactive labeling can be carried out according to any method known to those skilled in the art.
  • the probes can be labeled in (3 ') by addition of one or more deoxyribonucleotides or ribonucleotides or of a nucleotide analog such as a dideoxynucleotide, labeled in the alpha position with 32 P, in the presence of the Deoxynucleotidyl Terminal Transferor; the probes can also be labeled in (5 ′) using a kinase, for example the T4 Polynucleotide Kinase; in this case, it is the transfer to the probe of the radioactive phosphate of a nucleotide labeled in gamma position.
  • the probes can also be labeled at each end by the addition of any radiolabelled sequence in the presence of a ligase.
  • the probes can also be marked with "Random Priming” or also during their chemical synthesis by incorporating one or more of their radioactive ribonucleotides or deoxyribonucleotides.
  • the cells are cultured on a monolayer in DMEM medium (Dulbecco modified Ea ⁇ le minimum essential medium) containing 10% fetal calf serum.
  • DMEM medium Dulbecco modified Ea ⁇ le minimum essential medium
  • the cells are counted, centrifuged and resuspended in 100 ⁇ l of 10 mM Tris-HCl buffer pH 7.5, 5 mM EDTA, 100 mM NaCl. They are treated for 1 hour at 60 ° C. in the presence of proteinase K, 1% SDS.
  • the oligonucleotides of formulas I, II, III, IV, V, VI, VII and VIII are prepared by chemical synthesis. They are marked in 5 'with a tracer molecule, adding a cycle during chemical synthesis in order to introduce an aminolinker arm in 5'.
  • the molecule incorporated is a biotin. It is added by treating the oligonucleotide aminolinker with biotin N-hydroxysuccinimide overnight at room temperature. The purification of the labeled oligonucleotide is carried out by ethanol precipitation.
  • the labeling is carried out by incubation in the presence of deoxynucleotidyl terminal transferase, according to the protocol described by RILEY et al. (DNA. (1986), 5: 333-337) and KUMAR et al. (Anal. Biochem. (1988), 169: 376-382).
  • the cells taken from the patients are diluted in a transport buffer containing 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 5 mM EDTA, 100 mM NaCl and then centrifuged.
  • the pellet is taken up in 100 ⁇ l of the Tris buffer described above and treated for 1 hour in the presence of 500 ⁇ g / ml of - proteinase K, 1% SDS, at 60 ° C.
  • the composition of the buffer and the proteolytic digestion temperature are given by way of example.
  • the DNA is deposited on a nitrocellulose membrane or on a charged or uncharged nylon membrane.
  • a nylon membrane is used.
  • the DNA is treated in order to be denatured with a solution such as 0.4 M NaOH, 0.6 M NaCl for 10 minutes, then neutralized using a solution such as 0.5 M Tris -HCl pH 7.5, 1.5 M NaCl for 10 minutes.
  • the membrane is treated with UV in order to fix the DNA.
  • the DNA is deposited on an agarose gel after enzymatic digestion using restriction enzymes.
  • the gel is treated for 30 minutes in a solution of 0.4 M NaOH, 0.6 M NaCl, then for 30 minutes in a solution 0.5 M Tris-
  • the membrane is blocked with a solution containing skim milk, for example 0.3 g / ml and heparin.
  • the concentration of this can be 100 ⁇ g / ml in the TEN buffer.
  • the incubation is preferably carried out for 15 minutes.
  • the tracer molecule is biotin.
  • the conjugate used is therefore composed of a molecule of streptavidin, of avidin or of an anti-biotin antibody, coupled to an enzyme, for example peroxidase or with fluorescent molecules, such as FITC or colloidal gold.
  • streptavidin is used in conjunction with alkaline phosphatase.
  • the alkaline streptavidin phosphatase conjugate is incubated for 7 minutes 30 at room temperature at a concentration of
  • alkaline phosphatase conjugate When the conjugate used is a streptavidin alkaline phosphatase conjugate, different substrates of alkaline phosphatase can be used such as 4-bromo-5-chloro-indolylphosphate (BCIP) associated or not with tetrazolium blue nitro (NBT) or naphthol phosphate and fast red or other molecules with a bond that can be hydrolyzed by alkaline phosphatase.
  • BCIP 4-bromo-5-chloro-indolylphosphate
  • NBT tetrazolium blue nitro
  • naphthol phosphate tetrazolium blue nitro
  • conjugate used is a streptavidin peroxidase conjugate
  • different combinations of substrates can be used, such as hydrogen peroxide and tetramethylbenzidine or alternatively hydrogen peroxide and aminoethylcarbazole.
  • each reagent is pipetted, deposited on the membrane until it is absorbed, and incubated as follows.
  • the membrane is prehybridized for 30 seconds in the presence of 100 ⁇ l of the hybridization medium containing for example 45% formamide, 6 x SSC, 0.1% SDS and 1 x Denhart. Denhart can also be combined with or replaced by PEG or Dextran Sulfate.
  • the membrane is washed with 300 ⁇ l of a solution containing for example 1 x SSC and 0.1% SDS until complete absorption.
  • the membrane is then washed with 300 ⁇ l of a solution containing 0.1 M of Na sulfate and 0.3% of a 30% BRIJ 35 solution until completely absorbed.
  • the substrate is NBT / BCIP
  • 200 ⁇ l of the 100 mM Tris-HCl revelation buffer pH 9.5, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl 2 containing 0.33 mg / ml of NBT and 0.17 mg / ml of BCIP is added until completely absorbed.
  • the conjugate used is a streptavidin peroxidase conjugate
  • different combinations of substrates can be used, such as hydrogen peroxide and tetramethylbenzidine or alternatively hydrogen peroxide and aminoethylcarbazole.
  • the tissues were placed in 10% formalin and prepared within 4 to 18 hours. They can also be fixed using the other fixers conventionally used in immunohistochemistry, such as PFA 4% or Carnoy.
  • the slides are pretreated to promote their adhesion to the slide.
  • the slides are dehydrated by incubation in two successive baths of 95 and 100% ethanol.
  • the slides are dried at room temperature.
  • Each section is covered with 25 to 30 ⁇ l of hybridization medium containing for example 45% formamide, 1 x Denhart, 6 x SSC, 100 ⁇ g / ml of salmon sperm DNA and 1 ⁇ g / ml of labeled oligonucleotide probe. Denhart can be combined with or replaced by PEG or Dextran Sulfate.
  • the sections are covered with coverslips and are denatured by incubation for 10 minutes at 95 ° C. They are then hybridized for 1 to 2 hours at room temperature. The slides are removed and the slides are washed in the presence of SSC buffer at a concentration which can vary between 4 and 0.1 ⁇ SSC. The slides are rinsed in 0.1 M Tris-HCl pH 7, 4, 0.1 M NaCl, 10 mM
  • the slides are incubated in the presence of streptavidin alkaline phosphatase at 1 ⁇ g / ml for 30 minutes at room temperature and then washed in the development buffer, 0.1 M Tris-HCl pH 9, 5.0.0 0.1 M NaCl, 50 mM MgCl 2 .
  • alkaline phosphatase conjugate different substrates of alkaline phosphatase can be used such as 4-Bromo-5-chloro-indolylphosphate (BCIP) associated or not with tetrazolium blue Nitro (NBT) or Naphtol phosphate and Fast Red or other molecules having a bond which can be hydrolyzed by alkaline phosphatase.
  • BCIP 4-Bromo-5-chloro-indolylphosphate
  • NBT tetrazolium blue Nitro
  • Naphtol phosphate and Fast Red or other molecules having a bond which can be hydrolyzed by alkaline phosphatase.
  • the DNA extracted from the cells according to the protocol described above is denatured for 10 minutes in the presence of sodium hydroxide at a final concentration of 0.4 M, then diluted in the presence of ammonium acetate in order to obtain a final concentration of 1 M.
  • the DNA is then deposited directly into the mierotitration plates at the rate of 50 ⁇ l per well.
  • Such an amplification method can in particular be implemented according to standard PCR conditions, with the following specific primers of PVH 16:
  • the incubation is preferably carried out for 15 minutes.
  • the wells are emptied and 100 ⁇ l of TEN buffer containing a conjugate recognizing the tracer molecule attached to the probe, or a substrate if the molecule in question is an enzyme, are added.
  • the tracer molecule is biotin.
  • the conjugate used is therefore composed of a molecule of streptavidin, of avidin or of anti-biotin antibodies, coupled to an enzyme, for example alkaline phosphatase or peroxidase. In the preferred protocol, streptavidin is used coupled with alkaline phosphatase.
  • the alkaline streptavidin phophatase conjugate is incubated for 10 minutes at room temperature at a concentration of 20 ⁇ g / ml.
  • the wells are emptied, rinsed twice, then washed for 15 minutes at room temperature in a solution containing 0.1 M Na sulphate and 0.3% of a 30% solution of BRU 35.
  • conjugate used is a streptavidin peroxidase conjugate
  • substrates such as hydrogen peroxide and tetramethylbenzidine or alternatively hydrogen peroxide and O-phenylene diamine.

Abstract

L'invention concerne des sondes oligonucléotidiques pour le typage et la détection des papillomavirus humains, notamment PVH 6, PVH 11, PVH 16, PVH 18, PVH 31 et PVH 33, dans un échantillon biologique, lesdites sondes comprenant tout ou partie d'au moins une des séquences oligonucléotidiques de formules (I), ou de leurs séquences complémentaires. L'invention concerne plus particulièrement des sondes spécifiques d'au moins un type de PVH, notamment de PVH 6, PVH 11, PVH 16, PVH 18, PVH 31 et PVH 33.

Description

SONDES OLIGONUCLEOTIDIQUES POUR LE TYPAGE ET LA DETECTION DES PAPILLOMAVIRUS HUMAINS
La présente invention concerne des sondes oligonucleotidiques const ituées par des séquences d ' a c i de s nuc l é i qu e s dé r i vant de l ' Ac i de Désoxyribonucléique (ADN) d' au moins un papillomavirus humain (PVH) , utiles pour le typage et la détection desdits PVH .
Les papillomavirus sont associés à un grand nombre d'infections virales plus ou moins graves; certains PVH infectent spécifiquement l'épiderme, d'autres infectent les muqueuses génitales, orales ou laryngées. Si la plupart des PVH provoquent des lésions bénignes telles que les verrues cutanées, d'autres sont responsables de lésions précancéreuses, telles que les néoplasies cutanées se développant chez des patients atteints d'épidermodysplasie verruciforme, telles que les néoplasies intra-épithéliales. En ce qui concerne les infections génitales, les papillomavirus de types 16 (PVH 16) et 18 (PVH 18) sont généralement associés à des dysplasies sévères, des cancers cervicaux et des carcinomes; de même, mais moins communément, pour les papillomavirus de types 31, 33, 35 ou 51. Par contre, les papillomavirus de types 6 et 11 sont le plus souvent associés à des lésions de type condylome acuminé ou des dysplasies légères.
Plus de 60 types de PVH ont été décrits. Ils s'agit dans tout les cas de virus de petite taille, dont la capside contient une molécule d'ADN double brin constituée d'environ 8 000 paires de bases. Leur classification est basée sur la comparaison des ADN viraux par hybridation moléculaire dans des conditions stringentes; par convention, un PVH constitue un nouveau type si son ADN montre une homologie inférieure à 50 % avec l'ADN des autres PVH.
Les techniques de clonage d'ADN recombinant ont permis d'isoler et de purifier l'ADN de plusieurs types de PVH, notamment ceux de PVH 6, 11, 16 et 18
(DURST M. et al., Proc. Natl.- Acad., USA (1983), 80 :
312; BOSHART M. et al., EMBO J. (1984), 3 : 1151; DE
VILLIERS E.-M. et al., J. Virol. (1981), 40 : 932;
GISSMANN L. et al., J. Virol. (1982), 44 : 393; LORINCZ A. T. et al., J. Virol. (1986), 58 : 225; BEAUDE ON S. et al.. Nature. (1986), 321 : 246) .
Les connaissances actuelles sur les PVH résultent en grande partie de l'étude de la séquence nucléique de ces ADN, ainsi que de leur utilisation pour préparer des sondes nucléiques pour le typage et la détection des papillomavirus dans des échantillons par hybridation .
La détection des PVH par des méthodes immunologiques n'est pas adaptée car les antigènes de capsides ne sont pas spécifiques du type de PVH et ces antigènes sont peu ou pas exprimés dans certains stades de l'infection. En outre, les papillomavirus ne peuvent être cultivés in vitro.
Ce sont les raisons pour lesquelles la détection par hybridation moléculaire est le meilleur moyen de détecter et typer les papillomavirus.
Cette détection et ce typage peuvent être réalisés soit par hybridation sur plaque ou membrane en dot-blot ou par la méthode de Southern à partir de grattages des cellules cervicales ou de biopsies (PAO CC et al., Journal of Clinical Microbiology. (1989), 27
:168-173; INOUE M. et al., Journal of Virologicals
Methods. (1989), 26 : 159-170; EBB DH. et al.. Journal of Infectious diseases . (1987), 156 n°6 : 912-919; HALLAM N. et al.. Journal of Médical Virology (1989), 27 : 317-321; MELCHERS W. J. G. et al.. Journal of Médical Virology. (1988), 25 : 11-16), soit par hybridation in situ sur des lames réalisées à "partir de biopsies ou de cellules provenant de frottis (SYRJANEN S. et al., Journal of Virology Methods. (1988), 19:225-238; LEWIS FA. et al.. Journal Of Clinical Pathol. (1987), 40 : 163-166; BURNS J. et al.. Journal of Clinical Pathol. (1987) , 40 : 858-864) .
Des tests de dépistage et/ou de typage en hybridation in situ ont été décrits notamment dans les demandes de brevets européens N° 294 659, 192 001 et 370 625. La plupart de ces tests repose sur l'utilisation de sondes correspondant au génome entier ou à une grande part du génome du virus, d'autres font appel à l'utilisation d'oligonucléotides comme amorces dans un processus d'amplification d'une séquence nucléique in vitro connu sous le nom de PCR ("Polymerase Chain Reaction" décrit par la Société CETUS CORPORATION) (MORRIS B. J. et al.. Journal of Médical Virology. (1990), 32 : 22-30; RAKOCZY P. et al.. Journal of
Médical Virology. (1990), 32 : 10-17; MELCHERS W. J. M. et al.. Journal of Médical Virology. (1989), 27 : 329-
335; DALLAS P. et al.. Journal of Médical Virology.
(1989), 27 : 105-111) . La demande de brevet européen N° 301 968 au nom de IRE-CELLTARG S.A. décrit des sondes d'acides nucléiques utiles pour détecter indifféremment les différents types de papillomavirus humain.
Les travaux menés par la Demanderesse sur les génomes de plusieurs types de PVH ont permis de déterminer des séquences oligonucleotidiques comprenant entre 20 et 30 bases et présentant des caractéristiques qui ont permis de préparer des sondes oligonucleotidiques utiles pour la détection et le typage, selon des procédés d'hybridation, des PVH, plus particulièrement des PVH 6, PVH 11, PVH 16, PVH 18, PVH 31 et PVH 33, avec ou sans recours à une amplification de type PCR.
Les sondes de 1'invention sont caractérisées en ce qu'elles comprennent tout ou partie d'au moins une des séquences de formules suivantes :
(5') CGGTGGACCGGTCGATGTATGT (3') (I) (5*) CTGAAGTGGAAACTCAGCAGATG (3*) (II) (5') ATCAGATGACGAGGACGAAAATGC (3') (III) (5') CGAGCAATTAAGCGACTCAGAG (3') (IV)
(5') GACCCTGTAGGGTTACATTGCT (3') (V) (5') CTGAAGTGGAAGCTGGAACGGGA (3') (VI) (5*) TAGATCAGTTTCCTTTAGGACGCAA (3') (VII) (5') TATGAGCAATTAAATGACAGCTCAGA (3") (VIII) Dans ces formules les lettres représentent les nucléotides suivants : A pour la. base adénine, C pour la base cytosine, G pour la base guanine et T pour la base thymine; (5') et (3') indiquent les extrémités 5' et 3' de l'oligonucleotide. Chacune des séquences des oligonucléotides de formules (I), (II), (III), (IV), (V), (VI), (VII) et (VIII) correspond à un fragment de l'ADN d'au moins un PVH, notamment de PVH 6, PVH 11, PVH 16, PVH 18, PVH 31 et PVH 33. En conséquence, l'invention a plus particulièrement pour objet des sondes oligonucleotidiques permettant dans des conditions d'hybridation adaptées, soit le dépistage en général des PVH impliqués dans les lésions génitales, soit la détection spécifique de PVH 6, PVH 11, PVH 16 et PVH 18 qui sont les plus fréquemment rencontrés et PVH 31 et PVH 33 qui sont moins fréquents.
Il sera fait référence dans ce qui suit aux figures annexées dans lesquelles : la figure 1 représente la séquence nucléotidique de l'ADN de PVH6, la figure 2 représente la séquence nucléotidique de l'ADN de PVH11, - la figure 3 représente la séquence nucléotidique de l'ADN de PVH16, la figure 4 représente la séquence nucléotidique de l'ADN de PVH18,
- la figure 5 représente la séquence nucléotidique de l'ADN de PVH31,
- la figure 6 représente la séquence nucléotidique de l'ADN de PVH33.
Une sonde selon l'invention, utile pour la détection et le typage de PVH 16 comprend tout ou partie de la séquence de formule suivante :
5' CGGTGGACCGGTCGATGTATGT 3' (I)
LOligonucleotide de formule (I) est issu de la séquence de l'ADN de PVH 16 et présente une homologie de 100 % avec le fragment de celui-ci délimité par les nucléotides situés aux positions 494 à 515. Parmi les sondes de 1'invention comprenant la séquence de formule (I), on peut citer celles constituées de la séquence de formule (I) prolongée de part et d'autre, par 1 à 10 nucléotides correspondants dans le génome de PVH 16. Une sonde préférée selon l'invention, utile pour la détection et le typage de PVH 16 dans un échantillon biologique, est constituée de la séquence de formule suivante :
5' CGGTGGACCGGTCGATGTATGT 3* (I) Une sonde selon l'invention, utile pour la détection et le typage de PVH 16, PVH 31 et PVH 33 comprend tout ou partie de la séquence de formule suivante :
5' CTGAAGTGGAAACTCAGCAGATG 3' (II) L'oligonucleotide de formule (II) est issu de la séquence de l'ADN de PVH 16 et de la séquence de l'ADN de PVH 33. Il présente une homologie de 100 % avec le fragment de l'ADN de PVH 16 délimité par les nucléotides situés aux positions 1273 à 1295, et une homologie de 100 % avec le fragment de l'ADN de PVH 33 délimité par les nucléotides situés aux positions 1285 et 1307. En outre l'oligonucleotide de formule (II) ne diffère que d'une base avec le fragment de l'ADN de PVH 31 délimité par les nucléotides situés aux positions 1268 à 1290. Parmi les sondes de l'invention comprenant la séquence de formule (II) , on peut citer celles constituées de la séquence de formule (II) prolongée de part et d'autre, par 1 à 10 nucléotides correspondants dans le génome de PVH 16, PVH 31 et PVH 33.
Une sonde préférée selon l'invention, utile pour la détection et le typage de PVH 16, PVH 31 et PVH 33 dans un échantillon biologique est constituée de la séquence de formule suivante : 5' CTGAAGTGGAAACTCAGCAGATG 3' (II)
Une sondes selon l'invention, utile pour la détection et le typage de PVH 16 et PVH 18 comprend tout ou partie de la séquence de formule suivante :
5' ATCAGATGACGAGGACGAAAATGC 3' (III) L'oligonucleotide de formule (III) est issu de la séquence de l'ADN de PVH 18 et présente une homologie de 100 % avec le fragment de l'ADN de celui-ci délimité par les nucléotides situés aux positions 1009 à 1032. En outre l'oligonucleotide de formule (III) ne diffère que de 2 bases avec le fragment de l'ADN de PVH 16 délimité par les nucléotides situés aux positions 963 à 986. Parmi les sondes de l'invention comprenant la séquence de formule (III) , on peut citer celles constituées de la séquence de formule (III) prolongée de part et d'autre, par 1 à 10 nucléotides correspondants dans le génome de PVH 16 et PVH 18.
Une sonde préférée selon l'invention, utile pour la détection et le typage de PVH 16 et PVH 18 dans un échantillon biologique est constituée de la séquence de formule suivante :
5' ATCAGATGACGAGGACGAAAATGC 3* (III) Une sonde selon l'invention, utile pour la détection et le typage de PVH 18 comprend tout ou partie de la séquence de formule suivante :
(5') CGAGCAATTAAGCGACTCAGAG (3') (IV)
LOligonucleotide de formule (IV) est issu de la séquence de l'ADN de PVH 18 et présente une homologie de 100 % avec le fragment de l'ADN de celui-ci délimité par les nucléotides situés aux positions 673 à
694. Parmi les sondes de l'invention comprenant la séquence de formule (IV) , on peut citer celles constituées de la séquence de formule (IV) prolongée de part et d'autre, par 1 à 10 nucléotides correspondants dans le génome de PVH 18.
Une sonde préférée selon l'invention, utile pour la détection et le typage de PVH 18 dans un échantillon biologique est constituée de la séquence de formule suivante : (5') CGAGCAATTAAGCGACTCAGAG (3') (IV)
Une sonde selon l'invention, utile pour la détection et le typage de PVH 6 et PVH 11 comprend tout ou partie de la séquence de formule suivante :
(51) GACCCTGTAGGGTTACATTGCT (3') (V) L'oligonucleotide de formule (V) est issu de la séquence de l'ADN de PVH 6 et de la séquence de l'ADN de PVH 11. Il présente une homologie de 100 % avec les fragments de l'ADN de PVH 6 et PVH 11 délimités par les nucléotides situés aux positions 584 à 605. Parmi les sondes de l'invention comprenant la séquence de formule (V) , on peut citer celles constituées de la séquence de formule (V) prolongée de part et d'autre, par 1 à 10 nucléotides correspondants dans le génome de PVH 6 et PVH 11. Une sonde préférée selon l'invention, utile pour la détection et le typage de PVH 6 et PVH 11 dans un échantillon biologique est constituée de la séquence de formule suivante :
(5') GACCCTGTAGGGTTACATTGCT (3*) (V) Une sonde selon l'invention, utile pour la détection et le typage de PVH 6 comprend tout ou partie de la séquence de formule suivante :
(5') CTGAAGTGGAAGCTGGAACGGGA (31) (VI)
L'oligonucleotide de formule (VI) est issu de la séquence de l'ADN de PVH 6 et présente une homologie de 100 % avec le fragment de celui-ci délimité par les nucléotides situés aux positions 1250 à 1272.
Parmi les sondes de l'invention comprenant la séquence de formule (VI) , on peut citer celles constituées de la séquence de formule (VI) prolongée de part et d'autre, par 1 à 10 nucléotides correspondants dans le génome de
PVH 6.
Une sonde préférée selon l'invention, utile pour la détection de PVH 6 dans un échantillon biologique est constituée de la séquence de formule suivante :
(5*) CTGAAGTGGAAGCTGGAACGGGA (3*) (VI) Une sonde selon l'invention, utile pour la détection et le typage de PVH 6, PVH 11, PVH 16, PVH 18, PVH 31 et PVH 33, comprend tout ou partie de la séquence de formule suivante :
(5*) TAGATCAGTTTCCTTTAGGACGCAA (3') (VII) L'oligonucleotide de formule (VII) est issu de la séquence de l'ADN de PVH 16 et présente une homologie de 100 % avec le fragment de l'ADN de celui-ci délimité par les nucléotides situés aux positions 7012 à 7036. En outre 1'oligonucleotide de formule (VII) présente plus de 80 % d'homologie avec un fragment de l'ADN de PVH 6, PVH 11, PVH 31 et PVH 33, et 76 % d'homologie avec un fragment de l'ADN de PVH 18. Parmi les sondes de l'invention comprenant la séquence de formule (VII) , on peut citer celles constituées de la séquence de formule (VII) prolongée de part et d'autre, par 1 à 10 nucléotides correspondants dans le génome de PVH 16.
Une sonde préférée selon l'invention, utile pour la détection de PVH 6, PVH 11, PVH 16, PVH 18, PVH 31 et PVH 33 dans un échantillon biologique, est constituée de la séquence de formule suivante : (5') TAGATCAGTTTCCTTTAGGACGCAA (3') ' (VII)
Une sonde selon l'invention, utile pour la détection de PVH 6, PVH 11, PVH 16, PVH 18, PVH 31 et PVH 33, comprend tout ou partie de la séquence de formule suivante : (5') TATGAGCAATTAAATGACAGCTCAGA (3') (VIII)
L'oligonucleotide de formule (VIII) est issu de la séquence de l'ADN de PVH 16 et présente une homologie de 100 % avec le fragment de celui-ci délimité par les nucléotides situés aux positions 634 à 659. En outre, l'oligonucleotide de formule (VIII) présente plus de 88 % d'homologie avec un fragment de l'ADN de PVH 6, PVH 11, PVH 31 et PVH 33, et 60 % d'homologie avec un fragment de l'ADN de PVH 18. Parmi les sondes de l'invention comprenant la séquence de formule (VIII), on peut citer celles constituées de la séquence de formule (VIII) prolongée de part et d'autre, par 1 à 10 nucléotides correspondants dans le génome de PVH 16.
Les sondes constituées par les séquences oligonucleotidiques de formules I, II, III, IV, V et VI permettent respectivement, dans des conditions d' hybridation appropriées , la détection spécifique de PVH 16, PVH 16/31/33, PVH 18/16, PVH 18 , PVH 6/11 et PVH 6 . Les sondes constituées par les séquences oligonucleotidiques de formules VII et VIII permettent dans les mêmes conditions d' hybridation le dépistage de l 'un de ces PVH
L ' invention concerne naturellement aussi les s ondes oligonucleotidiques complémentaires des précédentes et donc capables de s ' apparier avec la même portion d'ADN de PVH en raison de sa nature bicaténaire .
Font aussi partie de l ' invention les sondes oligonucleotidiques précédentes dans la séquence desquelles les thymines sont remplacées par des uraciles ou dans lesquelles une des quatre bases est remplacée par une inosine .
L ' invention concerne également toute sonde ne se distinguant des précédentes au niveau de la séquence oligonucléotidique que par additions et/ou suppressions et/ou substitutions d ' un ou plusieurs nucléotides , dès lors que celles-ci n ' entraînent pas de modification des propriétés d' hybridation desdites sondes .
L ' invention a aussi pour objet toute association des sondes oligonucleotidiques précédentes entre elles ou avec des sondes déjà connues , pour un dépistage ou un typage spécifique des PVH; de tels mélanges permettent d ' améliorer la sensibilité et la spécificité de détection afin d ' obtenir une meilleure discrimination des infections à papillomavirus . L ' invention vise en outre tout acide nucléique recombinant contenant tout ou partie d ' au moins une des séquences oligonucleotidiques des sondes de 1 ' invention, ainsi que les sondes préparées à partir de ces acides nucléiques recombinants . Les sondes de l'invention sont utilisées avec des milieux d'hybridation et selon des conditions d'hybridation adaptés au dépistage ou au typage des PVH. Des milieux et conditions d'hybridation préférés seront décrits dans les exemples ci-après et peuvent être modifiés sans affecter les propriétés d*appariement des sondes et des ADN des PVH; notamment les conditions de température et de lavage peuvent être modifiées entre 18°C, 25 °C et 37 °C, ainsi que le pourcentage de formamide, en liaison ou non avec la température d'hybridation.
Les sondes de l'invention sont utilisées dans des procédés d'hybridation pour le typage et la détection de PVH contenus dans dans un échantillon biologique.
De tels procédés comprennent la mise en contact d'une sonde de l'invention ou d'un mélange de ces sondes avec l'échantillon biologique traité de façon à ce que les cellules qu'il contient soient lysées et éventuellement à ce que les acides nucléiques contenus dans lesdites cellules soient fragmentés à l'aide d'enzymes de restriction, puis hybrides dans des conditions permettant l'obtention d'un complexe d'hybridation entre la (ou les) sonde(s) et l'ADN cible de PVH contenu dans l'échantillon. La détection est réalisée à l'aide de tout moyen approprié pour mettre en évidence ledit hybride. Ces procédés peuvent être mis en oeuvre dans des tests sur membrane ou sur plaque ou sur tout autre support adapté, selon des méthodes de dot blot ou de Southern blot ou encore de filtration.
L'ADN extrait peut également, préalablement à l'hybridation avec les sondes de l'invention, être amplifié selon un processus d'amplification enzymatique à l'aide d'ADN-polymérase et d'amorces spécifiques des PVH à typer, connu sous le nom de PCR, consistant à répéter des cycles de dénaturation de l'ADN cible, hybridation des amorces et extension à partir des amorces, un nombre de fois suffisant pour augmenter la quantité de la séquence de départ dans une proportion exponentielle par rapport au nombre de cycles mis en oeuvre. Un aliquot du produit d'amplification est prélevé et traité dans les conditions décrites ci-après. Selon un protocole préféré, les produits d'amplification sont placés dans les puits des plaques de microtitration pendant une nuit à température ambiante, avant d'être mis en contact avec une sonde de l'invention, spécifique du fragment à amplifier.
Selon un autre mode de réalisation d'un procédé d'hybridation selon l'invention, des coupes histologiques sont réalisées à partir du prélèvement biologique et la sonde ou le mélange de sondes de l'invention sont mis en contact directement avec lesdites coupes histologiques pour la détection de l'ADN de PVH par hybridation in situ. Avantageusement, les sondes oligonucleotidiques de l'invention sont marquées par tout marqueur classiquement utilisé.
Les sondes peuvent être marquées à l'aide d'un traceur radioactif comme 32P, 35S, 125I, 3H, 14C. Le marquage radioactif peut être réalisé selon une méthode quelconque connue de l'homme du métier.
Les sondes peuvent être marquées en (3') par addition d'un ou plusieurs déoxyribonucleotides ou ribonucléotides ou d'un analogue de nucléotide tel qu'un didéoxynucléotide, marqués en position alpha par le 32P, en présence de la Déoxynucléotidyl Terminal Transférase; les sondes peuvent également être marquées en (5') à l'aide d'une kinase, par exemple la T4 Polynucléotide Kinase; il s'agit dans ce cas du transfert sur la sonde du phosphate radioactif d'un nucléotide marqué en position gamma . Les sondes peuvent encore être marquées à chaque extrémité par adjonction d ' une séquence quelconque radiomarquée en présence d ' une ligase .
Les sondes peuvent aussi être marquées par "Random Priming" ou également lors de leur synthèse chimique en y incorporant un ou plus ieurs ribonucléotides ou déoxyribonucleotides radioactifs .
La méthode de détection de l ' hybridation dépendra du marqueur radioactif utilisé et pourra reposer sur 1 ' autoradiographie , la scintillation liquide, le comptage de rayonnement gamma ou tout autre technique permettant de détecter le rayonnement émis par le marqueur radioactif .
Un marquage non radioactif peut également être utilisé, en associant aux sondes de l ' invention des groupements présentant des propriétés immunologiques , comme un antigène ou un haptène, une affinité spécifique pour certains réactifs comme un ligand, des propriétés permettant la complétion de réactions enzymatiques comme une enzyme ou un substrat d ' enzyme , les sondes peuvent être marquées par "Random Priming" ou lors de la synthèse chimique en incorporant un ou plusieurs ribonucléotides ou déoxyribonucleotides marqués non radioactivement . Le marquage non radioactif peut encore être réalisé par incorporation à l ' extrémité 3 ' d ' un ou plusieurs déoxyribonucleotides ou ribonucléotides ou d ' un analogue de nucléotide tel qu ' un didéoxynucléotide comportant l ' un de ces groupements . Le marquage peut aussi être fait directement par modification chimique de l ' oligonucleotide , comme la photobiotinylation ou la sulfonation . Il peut également être réalisé par addition en 3 ' ou 5 ' de molécules traceuses par réaction chimique après synthèse; les sondes peuvent encore être marquées à chaque extrémité par adjonction d ' une séquence quelconque portant des molécules traceuses, en présence d'une ligase. La méthode de détection et de révélation de l'hybridation dépendra du marqueur non radioactif utilisé.
L'invention a également pour objet des kits pour la mise en oeuvre des procédés de détection et de typage des PVH in vitro définis ci-dessus.
A titre d'exemple, de tels kits comprennent notamment :
- un milieu permettant le traitement de l'échantillon à tester,
- une quantité déterminée d'une sonde ou d'un mélange de sondes conformes à l'invention,
- un milieu approprié à la réalisation d'une réaction d'hybridation entre l'ADN de PVH et lesdites sondes,
- des réactifs permettant la détection des hybrides formés entre l'ADN de PVH et ladite sonde lors de la réaction d'hybridation.
Outre les caractéristiques qui précèdent, l'invention comporte d'autres caractéristiques qui apparaîtront au cours de la description qui suit et qui se réfèrent à des exemples de réalisation et de mise en oeuvre de la présente invention, étant entendu que ces exemples ne sauraient constituer une quelconque limitation à la portée des revendications. i - Préparation â&s ee iuies
Les différentes études réalisées pour contrôler la sensibilité et la spécificité de détection des sondes oligonucleotidiques sélectionnées ont été réalisées sur les lignées cellulaires CaSki et HeLa ou SiHa contenant respectivement 1000-500 copies de PVH 16, 50-10 copies de PVH 18 et 10-1 copies de PVH 16 par cellule.
Les cellules sont cultivées sur monocouche en milieu DMEM (Dulbecco modified Eaσle minimum essential médium) contenant 10 % de sérum de veau foetal. Les cellules sont comptées, centrifugées et resuspendues dans 100 μl de tampon 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 5 mM EDTA, 100 mM NaCl. Elles sont traitées pendant 1 heure à 60 °C en présence de protéinase K, 1 % SDS.
Après arrêt de la réaction, l'ADN est précipité à l'alcool, puis resuspendu dans 20 μl de tampon Tris-HCl pH 8,0, 1 mM N 4EDTA.
ZI ~ Préparation et marquage des sondes
Les oligonucléotides de formules I, II, III, IV, V, VI, VII et VIII sont préparés par synthèse chimique. Ils sont marqués en 5' avec une molécule traceuse, en ajoutant un cycle lors de la synthèse chimique afin d'introduire un bras aminolinker en 5'. Dans le protocole préféré, la molécule incorporée est une biotine. Elle est ajoutée par traitement de 1'oligonucleotide aminolinker avec du N-hydroxysuccinimide biotine pendant une nuit à température ambiante. La purification de 1'oligonucleotide marqué est réalisée par précipitation à l'ethanol.
Lorsque la sonde est marquée en 3' , le marquage est réalisé par incubation en présence de désoxynucléotidyl terminal transférase, selon le protocole décrit par RILEY et al. (DNA. (1986), 5 : 333- 337) et KUMAR et al. (Anal. Biochem. (1988) , 169 : 376- 382) .
III - Préparation des échantillons pour hybridation en dot. en Southern. e n filtration S1£ membrane ou sur plaque d e mierotitration
Les cellules prélevées sur les patients sont diluées dans un tampon de transport contenant 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 5 mM EDTA, 100 mM NaCl puis centrifugées . Le culot est repris dans 100 μl du tampon Tris décrit ci-dessus et traité pendant 1 heure en présence de 500 μg/ml de - protéinase K, 1 % SDS, à 60 °C. La composition du tampon et la température de digestion protéolytique sont données à titre d'exemple.
Selon le type de support utilisé pour l'hybridation, les cellules lysées sont utilisées dans le test de dépistage ou de typage après arrêt de la réaction ou l'ADN est précipité à l'ethanol, puis resuspendu dans 20 μl de Tris-HCl pH 8,0, 1 mM Na4EDTA.
IV - Hybridation en dot ou en Southern
1) Préparation de la membrane pour le dot L'ADN est déposé sur une membrane de nitrocellulose ou sur une membrane de Nylon chargée ou non. Dans le protocole préféré, une membrane Nylon est utilisée. Après séchage, l'ADN est traité afin d'être dénaturé par une solution telle que 0,4 M NaOH, 0,6 M NaCl pendant 10 minutes, puis neutralisé à l'aide d'une solution telle que 0,5 M Tris-HCl pH 7,5, 1,5 M NaCl pendant 10 minutes. Après séchage, la membrane est traitée aux UV afin de fixer l'ADN.
2) P éparat on des échantillons et de la membrane pour le Southern
L'ADN est déposé sur un gel d'agarose après digestion enzymatique à l'aide d'enzymes de restriction.
Après electrophorese et coloration du gel au bromure d'éthidium afin de visualiser les fragments de restriction obtenus, le gel est traité pendant 30 minutes dans une solution de 0,4 M NaOH, 0,6 M NaCl, puis pendant 30 minutes dans une solution de 0,5 M Tris-
HCl pH 7,5, 1,5 M NaCl. L'ADN est transféré du gel sur une membrane de nitrocellulose ou sur une membrane de Nylon chargée ou non, par transfert actif de type Southern ou par transfert passif. Dans le protocole préféré la membrane Nylon utilisée est fixée aux UV pendant 10 minutes après séchage.
3) Hvbridati-on
La membrane est préhybridée pendant 15 minutes à température ambiante en présence du milieu d'hybridation contenant par exemple 45 % formamide, 6 x SSC, 0,1 % SDS, 1 x Denhart et 100 μg/ml d'ADN de sperme de saumon dénaturé. Le tampon SSC est défini comme suit : 1 x SSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M Na3Citrate, pH 7. La solution de Denhart est définie comme suit : 50 x Denhart = 1 % Ficoll, 1 % polyvinylpyrrolidone, 1 % BSA. Le Denhart peut également être associé à ou remplacé par du PEG ou du Dextran Sulfate. La ou les sondes oligonucleotidiques marquées sont ajoutées à une concentration comprise entre 10 et 1000 ng/ml selon la molécule traceuse utilisée. Dans l'exemple cité précédemment la concentration est de 100 ng/ml. L'hybridation est réalisée à 18 °C pendant une heure. Après rinçage rapide dans un tampon contenant SSC et SDS, par exemple 1 x SSC, 0,1 % SDS, trois lavages de 10 minutes sont réalisés avec cette même solution à température ambiante sous agitation.
La membrane, rincée en tampon TEN (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA, 50 mM NaCl) est prête pour l'étape de détection.
4) Détection
La membrane est bloquée avec une solution contenant du lait écrémé, par exemple 0,3 g/ml et de l'héparine. La concentration de celle-ci peut être de 100 μg/ml dans le tampon TEN. L'incubation est réalisée préférentiellement pendant 15 minutes. Un conjugué reconnaissant la molécule traceuse fixée à la sonde, ou un substrat si la molécule en question est une enzyme, est ajouté. Dans le protocole préféré, la molécule traceuse est la biotine. Le conjugué utilisé est donc composé d'une molécule de streptavidine, d'avidine ou encore d'un anticorps anti-biotine, couplé à une enzyme, par exemple la peroxydase ou avec des molécules fluorescentes, telles que le FITC ou l'or colloïdal. Dans le protocole préféré, la streptavidine est utilisée conjuguée à la phosphatase alcaline. Le conjugué streptavidine phosphatase alcaline est incubé pendant 7 minutes 30 à température ambiante à une concentration de
40 μg/ml. Après rinçage rapide dans une solution contenant 0,1 M Na sulfate et 0,3 % d'une solution 30 % de BRIJ 35, trois lavages de 15 minutes sont effectués avec cette même solution à température ambiante.
5) Révélation
Lorsque le conjugué utilisé est un conjugué streptavidine phosphatase alcaline, différents substrats de la phosphatase alcaline peuvent être utilisés tels que le 4-bromo-5-chloro-indolylphosphate (BCIP) associé ou non avec du nitro bleu de tétrazolium (NBT) ou du naphtol phosphate et du fast red ou encore d'autres molécules présentant une liaison pouvant être hydrolysee par la phosphatase alcaline.
Si le substrat est NBT/BCIP, la membrane est recouverte du tampon de révélation, 100 mM Tris-HCl pH 9,5, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2 en présence de 0,33 mg/ml de NBT et de 0,17 mg/ml de BCIP.
Lorsque le conjugué utilisé est un conjugué streptavidine peroxydase, différentes associations de substrats peuvent être utilisées, telles que l'eau oxygénée et la tétraméthylbenzidine ou encore l'eau oxygénée et l'aminoéthylcarbazole.
V - Hybrida ion en fil ration sur mem rane,
1) Préparation de l a membrane L 'ADN est traité afin d' être dénaturé, par une solution concentrée de NaOH pour obtenir une concentration finale de 0,4 M. Après 10 minutes de traitement à température ambiante, l'ADN est déposé sur une membrane de nitrocellulose" ou de Nylon, chargée ou non. Cette membrane est elle-même adaptée sur un absorbant de type POREX ou autre, le tout étant disposé dans un support plastique du- type de ceux utilisés en immunofiltration.
2) Hybridation en filtration
Toutes les étapes sont effectuées à température ambiante. Chaque réactif est pipeté, déposé sur la membrane jusqu'à son absorption, et incubé comme suit. La membrane est préhybridée pendant 30 secondes en présence de 100 μl du milieu d'hybridation contenant par exemple 45 % formamide, 6 x SSC, 0,1 % SDS et 1 x Denhart. Le Denhart peut également être associé à ou remplacé par du PEG ou du Dextran Sulfate.
L'hybridation est effectuée pendant 15 minutes en présence de 100 μl du milieu d'hybridation contenant la ou les sondes oligonucleotidiques marquées à une concentration comprise entre 10 et 100 ng/ml selon la molécule traceuse utilisée. Dans l'exemple cité la concentration est de 50 ng/ml.
Puis la membrane est lavée avec 300 μl d'une solution contenant par exemple 1 x SSC et 0,1 % SDS jusqu'à complète absorption.
3) Détection en filtration
La membrane est bloquée pendant 30 secondes avec 100 μl d'une solution contenant du lait écrémé, par exemple 1 g pour 100 ml d'un tampon Tris 100 mM, 150 mM NaCl, et de l'héparine à une concentration de 100 μg/ml.
Un conjugué reconnaissant la molécule traceuse fixée à la sonde, ou un substrat si ladite molécule est une enzyme, est ajouté. Selon le protocole préféré, la molécule traceuse est la biotine. Le conjugué utilisé est donc composé d'une molécule de streptavidine, avidine ou encore anticorps anti-biotine, couplée à une enzyme, par exemple la peroxydase, ou à des molécules fluorescentes "comme FITC ou à l'or colloïdal. Selon le protocole préféré, la streptavidine est utilisée conjuguée à la phosphatase alcaline. Le conjugué streptavidine phosphatase alcaline peut être dilué dans la solution de blocage et incubé 30 secondes à une concentration de 6 μg/ml.
La membrane est ensuite lavée avec 300 μl d'une solution contenant 0,1 M de Na sulfate et 0,3 % d'une solution de BRIJ 35 à 30 % jusqu'à complète absorption.
4) Révélation en filtration
Lorsque le conjugué utilisé est un conjugué streptavidine phosphatase alcaline, différents substrats de la phosphatase alcaline peuvent être utilisés tels que le 4-bromo-5-chloro-indolylphosphate (BCIP) associé ou non avec du nitro bleu de tétrazolium (NBT) ou du naphtol phosphate et du fast red ou encore d'autres molécules présentant une liaison pouvant être hydrolysee par la phosphatase alcaline.
Si le substrat est le NBT/BCIP, 200 μl du tampon de révélation 100 mM Tris-HCl pH 9,5, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2 contenant 0,33 mg/ml de NBT et 0,17 mg/ml de BCIP est ajouté jusqu'à complète absorption. Lorsque le conjugué utilisé est un conjugué streptavidine peroxydase, différentes associations de substrats peuvent être utilisées, telles que l'eau oxygénée et la tétraméthylbenzidine ou encore l'eau oxygénée et 1'aminoéthylcarbazole.
VI - Hybridation in situ
Ce protocole est utilisable sur des coupes congelées, des coupes en paraffine contenant des cellules épithéliales ainsi que sur des frottis cytologiques. D Préparation des prélèvements
Les tissus sont placés dans 10 % formaline et préparés dans les 4' à 18 heures qui suivent. Ils peuvent également être fixés à l'aide des autres fixateurs classiquement utilisés en immunohistochimie, tels que PFA 4 % ou Carnoy.
Les cellules lorsqu'il s'agit de frottis sont fixées préférentiellement sur les lames à l'acétone ou au Carnoy. Quand les coupes sont en paraffine, une à trois sections (de 4 à 6 μm d'épaisseur) de spécimen sont déposées sur des lames.
Qu'il s'agisse de cellules ou de coupes, les lames sont prétraitées afin de favoriser leur adhérence sur la lame.
Le par:.ffinage des coupes est réalisé selon un protocole classique par traitement au xylène. Il s'agit de deux bains de 5 minutes dans le xylène suivis de deux bains de 5 minutes en ethanol 100 % puis d'un séchage à température ambiante.
Quand les coupes sont congelées, on applique une a trois sections (6 à 8 μm d'épaisseur) de tissu fixé et congelé sur les lames prétraitées; puis l'on cuit les lames pendant une heure à 60 °C, on les fixe dans un bain d'acétone et on les sèche à température ambiante.
2) Traitement à la protéinase K
Les lames préparées à partir de biopsies en paraffine ou congelées sont incubées en présence de protéinase K ou de pronase pendant 15 minutes à 37 °C, à une concentration dépendant du type et du temps de fixation. Une concentration de 1 μg/ml a été utilisée dans les exemples cités ci-après pour les coupes en paraffine. L'arrêt de la réaction est effectué par trois rinçages success ifs de 5 minutes dans de l ' eau distillée .
3 ) Déshydratation des lames
Les lames sont déshydratées par incubation dans deux bains successifs d ' ethanol 95 et 100 % . Les lames sont séchées à température ambiante .
4) Hybridation
Chaque coupe est recouverte de 25 à 30 μl de milieu d ' hybridation contenant par exemple 45 % formamide, 1 x Denhart, 6 x SSC, 100 μg/ml d 'ADN de sperme de saumon et 1 μg/ml de sonde oligonucléotidique marquée . Le Denhart peut être associé à ou remplacé par du PEG ou du Dextran Sulfate . Les coupes sont recouvertes de lamelles et sont dénaturées par incubation pendant 10 minutes à 95 °C . Elles sont ensuite hybridées pendant 1 à 2 heures à température ambiante . Les lamelles sont enlevées et les lames sont lavées en présence de tampon SSC à une concentration pouvant varier entre 4 et 0 , 1 x SSC . Les lames sont rincées en 0 , 1 M Tris-HCl pH 7 , 4 , 0 , 1 M NaCl, 10 mM
MgCl2, trois fois 5 minutes à température ambiante .
5) Détection
Un conjugué reconnaissant la molécule traceuse fixée sur la sonde, ou un substrat si la molécule en question est une enzyme, est ajouté. Dans le protocole préféré, la molécule traceuse est la biotine. Le conjugué utilisé est donc composé d'une molécule de streptavidine, d'avidine ou encore d'un anticorps anti- biotine; couplé à une enzyme, par exemple la peroxydase ou avec des molécules fluorescentes, telles que le FITC ou l'or colloïdal. Dans le protocole préféré, la streptavidine est utilisée conjuguée à la phosphatase alcaline.
Les lames sont incubées en présence de streptavidine phosphatase alcaline à 1 μg/ml pendant 30 minutes à température ambiante puis lavées dans le tampon de révélation, 0 , 1 M Tris-HCl pH 9, 5, 0 , 1 M NaCl, 50 mM MgCl2 .
6) Révélation Lorsque le conjugué utilisé est un conjugué streptavidine phosphatase alcaline, différents substrats de la phosphatase alcaline peuvent être utilisés tels que le 4-Bromo-5-chloro-indolylphosphate (BCIP) associé ou non avec du Nitro bleu de tétrazolium (NBT) ou du Naphtol phosphate et du Fast Red ou encore d'autres molécules présentant une liaison pouvant être hydrolysee par la phosphatase alcaline.
Si le substrat est NBT/BCIP, la révélation est réalisée dans le tampon de révélation en présence de 0,33 mg/ml de NBT et de 0,17 mg/ml de BCIP pendant 1 à 2 heures 30 à température ambiante et à l'abri de la lumière.
Lorsque le conjugué utilisé est un conjugué streptavidine peroxydase, différentes associations de substrats peuvent être utilisées, telles que l'eau oxygénée et la tétraméthylbenzidine ou encore l'eau oxygénée et 1'aminoéthylcarbazole. vu - Hybridation sur plaque e mierotitration 1) Préparation des échantillons
L'ADN extrait à partir des cellules selon le protocole décrit ci-avant est dénaturé pendant 10 minutes en présence de soude à une concentration finale 0,4 M, puis dilué en présence d'acétate d'ammonium afin d'obtenir une concentration finale de 1 M. L'ADN est ensuite déposé directement dans les plaques de mierotitration à raison de 50 μl par puits.
L'ADN extrait peut également, préalablement à l'hybridation avec les sondes de l'invention, être amplifié selon un processus d'amplification enzymatique à l ' aide d'ADN-polymérase et d' amorces spécifiques des PVH à typer, connu sous le nom de PCR, consistant à répéter le cycle de dénaturât ion de l ' ADN cible , hybridation des amorces et extension à partir des amorces , un nombre de fois suffisant pour augmenter la quantité de la séquence de départ dans une proportion exponentielle par rapport au nombre de cycles mis en oeuvre .
Un aliquot du produit d ' amplification est prélevé et traité dans les conditions décrites ci-avant .
Selon un protocole préféré les plaques sont incubées pendant la nuit à température ambiante .
Un tel procédé d ' amplificat ion peut notamment être mis en oeuvre selon les conditions standards de PCR, avec les amorces spécifiques de PVH 16 suivantes :
- ACCGAAACCGGTTAGTATAAAAGC
- TCATTTAATTGCTCATAACAGTAG 2) Hybridation Les puits sont vidés et 100 μl de milieu d'hybridation sont ajoutés. Le milieu d'hybridation préféré contient 30 % formamide, 6 x SSC, 0,1 % SDS, 1 x Denhart et 100 μg/ml d'ADN de sperme de saumon dénaturé. Le Denhart peut également être associé à ou remplacé par du PEG ou du Dextran Sulfate.
La sonde oligonucléotidique marquée est ajoutée à une concentration comprise entre 10 et 1000 ng/ml selon la molécule traceuse utilisée. Dans l'exemple cité, la sonde est marquée à la biotine et utilisée à une concentration de 100 ng/ml. L'hybridation est réalisée à 18 °C pendant une heure. Les puits sont vidés, rincés deux fois puis lavés une fois 15 minutes en présence d'un tampon contenant SSC et SDS, par exemple 1 x SSC et 0,1 % SDS. 3) Détection
Les puits sont bloqués avec une solution contenant du lait écrémé par exemple 100 mg/ml et de l'héparine. La concentration de celle-ci peut être de 100 μg/ml dans le tampon TEN (50 mM Tris HC1 pH 8,0,
1 mM EDTA, 50 mM NaCl) . L'incubation est réalisée préférentiellement pendant 15 minutes. Les puits sont vidés et 100 μl de tampon TEN contenant un conjugué reconnaissant la molécule traceuse fixée à la sonde, ou un substrat si la molécule en question est une enzyme, sont ajoutés. Dans le protocole préféré, la molécule traceuse est la biotine. Le conjugué utilisé est donc composé d'une molécule de streptavidine, d'avidine ou encore d'anticorps anti-biotine, couplé à une enzyme, par exemple la phosphatase alcaline ou la peroxydase. Dans le protocole préféré, la streptavidine est utilisée couplée à la phosphatase alcaline. Le conjugué streptavidine phophatase alcaline est incubé pendant 10 minutes à température ambiante à une concentration de 20 μg/ml. Les puits sont vidés, rincés deux fois, puis lavés 15 minutes à température ambiante dans une solution contenant 0,1 M Na sulfate et 0,3 % d'une solution 30 % de BRU 35.
4) Révélation Lorsque le conjugué utilisé est un conjugué streptavidine phosphatase alcaline, différents substrats de la phosphatase alcaline peuvent être utilisés, tels que du p-Nitrophényl Phosphate (PNPP) ou d'autres molécules présentant une liaison pouvant être hydrolysee par la phosphatase alcaline.
Si le substrat est ""e PNPP, une solution à
2 mg/ml de PNPP en tc-ipon diéthanolamine (1 M diéthanolamine, pH 9,8, 0,5 mM MgCl2> est ajoutée à raison de 100 μl par puits. Cette solution est préparée extemporanement. La révélation est réalisée en 3 heures à 37 °C, à l'abri de la lumière.
Lorsque le conjugué utilisé est un conjugué streptavidine peroxydase, différentes associations de substrats peuvent être utilisées tels que l'eau oxygénée et la tétraméthylbenzidine ou- encore l'eau oxygénée et la O-phénylène diamine.

Claims

REVENDICATIONS
1) Sonde oligonuclêotidique pour le typage et la détection des papillomavirus humains, notamment de PVH 6, PVH 11, PVH 16, PVH 18, PVH 31, PVH 33, dans un échantillon biologique, caractérisée en ce qu'elle comprend tout ou partie d'au moins une des séquences oligonucleotidiques suivantes :
(5') CGGTGGACCGGTCGATGTATGT (3*) (I) (5') CTGAAGTGGAAACTCAGCAGATG (3') (II)
(5') ATCAGATGACGAGGACGAAAATGC (3') (III) (5') CGAGCAATTAAGCGACTCAGAG (3') (IV) (5«) GACCCTGTAGGGTTACATTGCT (3') (V) (5') CTGAAGTGGAAGCTGGAACGGGA (3') (VI) (51) TAGATCAGTTTCCTTTAGGACGCAA (3') (VII)
(5' ) TATGAGCAATTAAATGACAGCTCAGA (3 ' ) (VIII) ou de leurs séquences complémentaires.
2) Sonde oligonuclêotidique pour le typage et la détection de PVH 16, dans un échantillon biologique, selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend tout ou partie de la séquence oligonuclêotidique suivante :
(5') CGGTGGACCGGTCGATGTATGT (3') (I) ou de sa séquence complémentaire . 3) Sonde oligonuclêotidique pour le typage et la détection de PVH 16, PVH 31 et PVH 33, dans un échantillon biologique, selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend tout ou partie de la séquence oligonuclêotidique suivante : (5') CTGAAGTGGAAACTCAGCAGATG (3') (II) ou de sa séquence complémentaire. 4) Sonde oligonuclêotidique pour le typage et la détection de PVH 16 et PVH 18, dans un échantillon biologique, selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend tout ou partie de la séquence oligonuclêotidique de formule suivante ;
(5*) ATCAGATGACGAGGACGAAAATGC (3') (III) ou de sa séquence complémentaire. 5) Sonde oligonuclêotidique pour le typage et la détection de PVH 1-8, dans un échantillon biologique, selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend tout ou partie de la séquence oligonuclêotidique de formule suivante : (5') CGAGCAATTAAGCGACTCAGAG (3') (IV) ou de sa séquence complémentaire.
6) Sonde nucléotidique pour le typage et la détection de PVH 6 et PVH 11, dans un échantillon biologique, selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend tout ou partie de la séquence oligonuclêotidique de formule suivante :
(5') GACCCTGTAGGGTTACATTGCT (3') (V) ou de sa séquence complémentaire.
7) Sonde oligonuclêotidique pour le typage et la détection de PVH 6, dans un échantillon biologique, selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend tout ou partie de la séquence oligonuclêotidique de formule suivante :
(5') CTGAAGTGGAAGCTGGAACGGGA (3') (VI) ou de sa séquence complémentaire.
8) Sonde oligonuclêotidique pour la détection des PVH, notamment PVH 6 PVH 11, PVH 16, PVH 18, PVH 31, PVH 33, dans un échantillon biologique, selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend tout ou partie de la séquence oligonuclêotidique de formule suivante :
(5') TAGATCAGTTTCCTTTAGGACGCAA (3') (VII) ou de sa séquence complémentaire.
9) Sonde oligonuclêotidique pour la détection des PVH, notamment PVH 6, PVH 11, PVH 16, PVH 18, PVH 31, PVH 33, dans un échantillon biologique, selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend tout ou - partie de la séquence oligonuclêotidique de formule suivante : ( 5 ' ) TATGAGCAATTAAATGACAGCTCAGA ( 3 * ) (VIII) ou de sa séquence • complémentaire .
10) Sonde oligonuclêotidique selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisée en ce qu'elle est marquée radioactivement ou par un marqueur du type enzymatique, antigénique, ligand, luminescent ou fluorescent .
11) Composition pour la détection et/ou le typage des PVH, notamment de PVH 6, PVH 11, PVH 16, PVH
18, PVH 31, PVH 33, dans un échantillon biologique, caractérisée en ce quelle comporte plusieurs sondes distinctes selon les revendications 1 à 10.
12) Procédé pour le typage et la détection des PVH, notamment PVH 6, PVH 11, PVH 16, PVH 18, PVH 31, PVH 33, dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend :
- la mise en contact d'une sonde selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 ou d'un mélange de sondes selon la revendication 11, avec l'échantillon biologique préalablement traité de façon à ce que les cellules qu'il contient soient lysées et éventuellement à ce que les acides nucléiques contenus dans lesdites cellules soient fragmentés à l'aide d'enzymes de restriction,
- la réalisation d'une hybridation en dot ou Southern sur membrane entre la sonde ou le mélange de sondes et l'ADN de PVH contenu dans l'échantillon,
- la détection à l'aide de tout moyen approprié, du complexe d'hybridation éventuellement formé . 13) Procédé pour le typage et la détection des PVH, notamment PVH 6, PVH 11, PVH 16, PVH 18, PVH 31, PVH 33, dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend : - la mise en contact d'une sonde selon l'une quelconque des revendications -1 à 10 ou d'un mélange de sondes selon la revendication 11, avec l'échantillon biologique préalablement traité de façon à ce que les cellules qu'il contient soient lysées et éventuellement à ce que les acides nucléiques contenus dans lesdites cellules soient fragmentés à l'aide d'enzyme de restriction,
- la réalisation d'une hybridation sur membrane en filtration entre la sonde ou le mélange de sondes et l'ADN de PVH contenu dans l'échantillon,
- la détection en filtration à l'aide de tout moyen approprié, du complexe d'hybridation éventuellement formé.
14) Procédé pour le typage et la détection des PVH, notamment PVH 6, PVH 11, PVH 16, PVH 18, PVH
31, PVH 33, dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend :
- la mise en contact d'une sonde selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 ou d'un mélange de sondes selon la revendication 11, avec des coupes histologiques ou avec des prélèvements cytologiques réalisés à partir de l'échantillon biologique,
- la réalisation in situ d'une hybridation entre la sonde ou le mélange de sondes et l'ADN de PVH contenu dans l'échantillon,
- la détection à l'aide de tout moyen approprié, du complexe d'hybridation éventuellement formé.
15) Procédé pour le typage et la détection des PVH, notamment PVH 6, PVH 11, PVH 16, PVH 18, PVH 31, PVH 33, dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu ' il comprend :
- la mise en' contact d'une sonde selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 ou d'un mélange de sondes selon la revendication 11, avec l'échantillon biologique préalablement traité de façon à ce que les cellules qu'il contient soient lysées et éventuellement à ce que les acides nucléiques contenus dans lesdites cellules soient fragmentés à l'aide d'enzyme de restriction,
- la réalisation d'une hybridation sur plaque de mierotitration entre la sonde ou le mélange de sondes et l'ADN de PVH contenu dans l'échantillon,
- la détection à l'aide de tout moyen approprié, du complexe d'hybridation éventuellement formé .
16) Procédé pour le typage et la détection des PVH, notamment PVH 6, PVH 11, PVH 16, PVH 18, PVH 31, PVH 33, dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend :
- l'extraction de l'ADN de PVH contenu dans les cellules de l'échantillon biologique,
- l'amplification génétique dudit ADN au moyen d'amorces adaptées, - la mise en contact d'une sonde selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 ou d'un mélange de sondes selon la revendication 11, avec l'ADN de PVH amplifié,
- la réalisation d'une hybridation sur plaque de mierotitration entre la sonde ou le mélange de sondes et l'ADN de PVH amplifié,
- la détection à l'aide de tout moyen approprié, du complexe d'hybridation éventuellement formé . 17) Kit pour la mise en oeuvre d'un procédé de typage et de détection in vitro des PVH, notamment
PVH 6, PVH 11, PVH 16, PVH 18, PVH 31 et PVH 33, selon l'une des revendications 12 à 15, caractérisé en ce qu'il comprend : un milieu permettant le traitement de l'échantillon à tester,
- une quantité déterminée d'une sonde selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 ou d'un mélange de sondes selon la revendication 11,
- un milieu approprié à la réalisation d'une réaction d'hybridation entre l'ADN de PVH et la sonde ou le mélange de sondes,
- des réactifs permettant la détection des complexes d'hybridation formés lors de la réaction d'hybridation.
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