JP5886792B2 - Ａ型肝炎ウイルス核酸の検出のための組成物及び方法 - Google Patents
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Description
本発明は、ヒトウイルスの診断検出に関し、具体的には、インビトロ核酸増幅と増幅配
列の検出を用いてヒトＡ型肝炎ウイルスの配列を検出するためのアッセイに関する。
列の検出を用いてヒトＡ型肝炎ウイルスの配列を検出するためのアッセイに関する。
Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）は、発熱、疲労、吐気、腹痛、下痢、食欲喪失及び黄疸を
含む諸症状が２ヶ月未満現れる場合がある肝炎の１つの形態の原因物質である。ＨＡＶに
感染した約１０％〜１５％は、感染後６〜９ヶ月に長期化又は再発性の症状がある。症候
性と無症候性の感染後には、抗ＨＡＶ免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の個々の産生に基づく
ＨＡＶの免疫が続く。
含む諸症状が２ヶ月未満現れる場合がある肝炎の１つの形態の原因物質である。ＨＡＶに
感染した約１０％〜１５％は、感染後６〜９ヶ月に長期化又は再発性の症状がある。症候
性と無症候性の感染後には、抗ＨＡＶ免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の個々の産生に基づく
ＨＡＶの免疫が続く。
ＨＡＶ感染症の発症率は、ＨＡＶへのワクチン接種（例えば、不活性化ＨＡＶを用いる
ことによる）が１９９０年代後半以来広範に用いられた世界の諸地域では劇的に減少した
が、衛生状態不良な非免疫集団では、例えば、地震の後に、一過性でも、ＨＡＶ感染症の
大流行（人口１００，０００につき７００より多い症例）が発生し得る。ＨＡＶは、被感
染者の糞便中に流れて、通常、糞−口経路で伝播する。共同体全体の大発生は、ＨＡＶに
感染した食物取扱者により調理中の食物が汚染される場合、又は、流通システムにおける
生育、収穫、包装、又は加工の間に食材が汚染されて生じる食物媒介性の伝播で生じる場
合がある。伝播はまた、ＨＡＶ汚染された血清、血液製剤、又は輸血や注射薬の使用等の
汚染針との接触から生じる場合がある。ＨＡＶ感染のリスクがあるヒトとしては、ＨＡＶ
被感染者と生活しているか又は性的接触がある人々、凝固因子障害（例、血友病）又は慢
性肝疾患の人々、Ａ型肝炎が蔓延している国々へ旅行する人々、男性と性的交渉をもつ男
性、非合法薬の使用者及びＡ型肝炎が高率な（例えば、人口１００，０００につき＞２０
症例）地域で生活する子供があげられる。
ことによる）が１９９０年代後半以来広範に用いられた世界の諸地域では劇的に減少した
が、衛生状態不良な非免疫集団では、例えば、地震の後に、一過性でも、ＨＡＶ感染症の
大流行（人口１００，０００につき７００より多い症例）が発生し得る。ＨＡＶは、被感
染者の糞便中に流れて、通常、糞−口経路で伝播する。共同体全体の大発生は、ＨＡＶに
感染した食物取扱者により調理中の食物が汚染される場合、又は、流通システムにおける
生育、収穫、包装、又は加工の間に食材が汚染されて生じる食物媒介性の伝播で生じる場
合がある。伝播はまた、ＨＡＶ汚染された血清、血液製剤、又は輸血や注射薬の使用等の
汚染針との接触から生じる場合がある。ＨＡＶ感染のリスクがあるヒトとしては、ＨＡＶ
被感染者と生活しているか又は性的接触がある人々、凝固因子障害（例、血友病）又は慢
性肝疾患の人々、Ａ型肝炎が蔓延している国々へ旅行する人々、男性と性的交渉をもつ男
性、非合法薬の使用者及びＡ型肝炎が高率な（例えば、人口１００，０００につき＞２０
症例）地域で生活する子供があげられる。
ＨＡＶは、約７．５ｋｂの（＋）鎖一本鎖ＲＮＡゲノムを含有する２７ｎｍのＲＮＡウ
イルス（ピコルナウイルス）であり、世界中で単一の血清型が見出されている。ＨＡＶは
、感染症の急性期で肝臓で複製し、胆汁中に排泄されて糞便中に流出する（１０８個のウ
イルス／ｍｌまで）。潜伏期間は、通常、症状が現れるまでの２〜６週間である。Ａ型肝
炎の診断は、症状や他の臨床特徴（例えば、血清アミノトランスフェラーゼレベルの上昇
）では他の種類のウイルス肝炎から識別できない。典型的には、Ａ型肝炎の診断は、抗Ｈ
ＡＶ免疫グロブリン（Ｉｇ）が存在すると陽性の結果となる血清学的検査で確認する。一
般に、抗ＨＡＶ ＩｇＭは、症状の発症の５〜１０日前に存在しているが、ほとんどの患
者で６ヶ月以降までは検出できないのに対し、抗ＨＡＶ ＩｇＧは、感染早期に出現し、
個体が生存している期間に検出できる。ＨＡＶ ＲＮＡは、感染急性期で、例えば、ポリ
メラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅と核酸配列決定等の核酸検査法を用いて、大部分
の人々の血液及び大便から検出できるので、共同体全体の感染症を追跡するＨＡＶの遺伝
的関連性を同定するために用いられてきた（Dato et al., Morbidity Mortality Wkly. R
pt., 2003,52(47): 1155-57; LaPorte et al., Morbidity Mortality Wkly. Rpt., 2003
, 52(24):565-67）。しかしながら、これらの方法は、一般的には、診断目的には用いら
れていない。
イルス（ピコルナウイルス）であり、世界中で単一の血清型が見出されている。ＨＡＶは
、感染症の急性期で肝臓で複製し、胆汁中に排泄されて糞便中に流出する（１０８個のウ
イルス／ｍｌまで）。潜伏期間は、通常、症状が現れるまでの２〜６週間である。Ａ型肝
炎の診断は、症状や他の臨床特徴（例えば、血清アミノトランスフェラーゼレベルの上昇
）では他の種類のウイルス肝炎から識別できない。典型的には、Ａ型肝炎の診断は、抗Ｈ
ＡＶ免疫グロブリン（Ｉｇ）が存在すると陽性の結果となる血清学的検査で確認する。一
般に、抗ＨＡＶ ＩｇＭは、症状の発症の５〜１０日前に存在しているが、ほとんどの患
者で６ヶ月以降までは検出できないのに対し、抗ＨＡＶ ＩｇＧは、感染早期に出現し、
個体が生存している期間に検出できる。ＨＡＶ ＲＮＡは、感染急性期で、例えば、ポリ
メラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅と核酸配列決定等の核酸検査法を用いて、大部分
の人々の血液及び大便から検出できるので、共同体全体の感染症を追跡するＨＡＶの遺伝
的関連性を同定するために用いられてきた（Dato et al., Morbidity Mortality Wkly. R
pt., 2003,52(47): 1155-57; LaPorte et al., Morbidity Mortality Wkly. Rpt., 2003
, 52(24):565-67）。しかしながら、これらの方法は、一般的には、診断目的には用いら
れていない。
米国では、毎年約１００人がＡ型肝炎による急性肝不全で死亡する（死亡率約０．０１
５％）。非致命的なＡ型肝炎症例でも、患者の入院、外来受診及び労働日数の損失の費用
を含む、ＨＡＶ感染症に関連してかなりの費用がかかる。Ａ型肝炎大発生に関する公衆衛
生の費用としては、被感染者又は感染源（例、汚染された水又は食物）を特定して曝され
た人々に曝露から２週間以内に免疫グロブリンを投与することがあげられる。特に、共同
体全体で大発生した場合では、感染リスクの認知に起因する、かなりの心理的コストと経
済損失が生じる可能性がある。汚染された食物及び水でＨＡＶが比較的伝播しやすいこと
や、Ａ型肝炎に関連する罹病率のため、ＨＡＶは生物テロに用いる病原体となりうる。
５％）。非致命的なＡ型肝炎症例でも、患者の入院、外来受診及び労働日数の損失の費用
を含む、ＨＡＶ感染症に関連してかなりの費用がかかる。Ａ型肝炎大発生に関する公衆衛
生の費用としては、被感染者又は感染源（例、汚染された水又は食物）を特定して曝され
た人々に曝露から２週間以内に免疫グロブリンを投与することがあげられる。特に、共同
体全体で大発生した場合では、感染リスクの認知に起因する、かなりの心理的コストと経
済損失が生じる可能性がある。汚染された食物及び水でＨＡＶが比較的伝播しやすいこと
や、Ａ型肝炎に関連する罹病率のため、ＨＡＶは生物テロに用いる病原体となりうる。
生物試料や環境試料中のＨＡＶの存在を正確に検出する必要がある。ＨＡＶ被感染個体
を迅速に診断する必要がある。例えば、免疫グロブリンが有効であるためには、ＨＡＶ曝
露の２週間以内にヒトへ投与しなければならず、肝炎症状の食物取扱者を速やかに評価し
て、ＨＡＶ陽性源を公衆衛生当局へ報告する迅速で正確なアッセイが必要である。水や食
物等の汚染材料の使用又は消費から生じる共同体全体の大発生又は大流行を防ぐために、
上記の材料に存在するＨＡＶを検出する必要がある。また、例えば、輸血やヒト体液に由
来する諸因子の製造に用いる血液又は血清等の医学的処置に用い得る製品のＨＡＶ汚染を
検出する必要もある。
を迅速に診断する必要がある。例えば、免疫グロブリンが有効であるためには、ＨＡＶ曝
露の２週間以内にヒトへ投与しなければならず、肝炎症状の食物取扱者を速やかに評価し
て、ＨＡＶ陽性源を公衆衛生当局へ報告する迅速で正確なアッセイが必要である。水や食
物等の汚染材料の使用又は消費から生じる共同体全体の大発生又は大流行を防ぐために、
上記の材料に存在するＨＡＶを検出する必要がある。また、例えば、輸血やヒト体液に由
来する諸因子の製造に用いる血液又は血清等の医学的処置に用い得る製品のＨＡＶ汚染を
検出する必要もある。
本発明は、試料中のＨＡＶ核酸の存在を検出する核酸検査法に用いるオリゴヌクレオチ
ド配列を開示して、上記のニーズに応えるものである。
ド配列を開示して、上記のニーズに応えるものである。
発明の要約
本発明としては、ＨＡＶ標的配列の精製、増幅及び検出に有用な核酸オリゴマーがあげ
られる。本オリゴマー又はオリゴマーの組合せをキット形態に含めてもよく、その実施態
様としては、ＨＡＶ配列を増幅する及び／又は検出するための他のオリゴマー及び／又は
他の試薬があげられる。本発明としては、ＨＡＶ核酸を試料中の他の成分より精製する工
程、ＨＡＶ ＲＮＡ標的配列又はそれより作製されるｃＤＮＡを、インビトロ核酸ポリメ
ラーゼと本明細書に記載の増幅オリゴマーのあらゆる組合せを用いて増幅し、増幅産物を
生成する工程及び、増幅産物の少なくとも一部と特異的にハイブリダイズする検出プロー
ブを用いて増幅産物を検出する工程を用いる、試料中のＨＡＶを検出する方法があげられ
る。１つの実施態様としては、ＨＡＶ ＲＮＡ標的領域に特異的にハイブリダイズし、他
の試料成分から分離されるＨＡＶ ＲＮＡを含むハイブリダイゼーション複合体を形成す
る配列を含む少なくとも１つの捕捉オリゴマーを用いて、ＨＡＶ核酸を精製する。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
ＨＡＶ標的領域を増幅するための少なくとも２つのオリゴマーの組合せであって：
第１のＨＡＶ標的領域のための、配列番号６０の配列に含まれるか若しくは少なくとも
配列番号１５６の配列を含む配列番号８６の配列に含まれる約２１〜２７ｎｔのオリゴマ
ー、または配列番号２９〜３２のいずれか１つのＨＡＶ標的特異部分を含む約４８〜５４
ｎｔの範囲の大きさのプロモータープライマーオリゴマー；
第２のＨＡＶ標的領域のための、少なくとも配列番号１４８の配列を含む配列番号１４
７の配列に含まれるか若しくは少なくとも配列番号１５８の配列を含む配列番号１５７の
配列に含まれる約２４〜３０ｎｔのオリゴマー、または配列番号３１若しくは３２のＨＡ
Ｖ標的特異部位を含むプロモータープライマーオリゴマー；
第３のＨＡＶ標的領域のための、少なくとも配列番号９７、１５９、若しくは１６０の
配列を含む配列番号９３若しくは９５の配列に含まれる約１８〜２７ｎｔのオリゴマー、
または配列番号３３の標的特異部位を含むプロモータープライマーオリゴマー；
第４のＨＡＶ標的領域のための、少なくとも配列番号１５０の配列を含む配列番号１４
９の配列に含まれる約１９〜３１ｎｔのオリゴマー、または配列番号３４〜４０のいずれ
か１つのＨＡＶ標的特異部位を含む約５１〜５６ｎｔの範囲の大きさのプロモータープラ
イマーオリゴマー；
第５のＨＡＶ標的領域のための、少なくとも配列番号１６２の配列を含む配列番号１６
１の配列に含まれる約２４〜２８ｎｔのオリゴマー、または配列番号４１若しくは４２の
ＨＡＶ標的特異部位を含むプロモータープライマーオリゴマー；ならびに
第６のＨＡＶ標的領域のための、少なくとも配列番号１５２〜１５５のいずれか１つの
配列を含む配列番号１５１の配列に含まれるか、若しくは少なくとも配列番号１６４の配
列を含む配列番号１６３に含まれるか、若しくは配列番号１６６〜１６８のいずれか１つ
の配列を含む配列番号１６５に含まれる約２０〜３０ｎｔのオリゴマー、または配列番号
４３〜４９のいずれか１つのＨＡＶ標的特異部位を含む約５１〜５６ｎｔの範囲の大きさ
のプロモータープライマーオリゴマーを含む、前記組合せ。
（項目２）
配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号
５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、およ
び配列番号１５６からなる群より選択される、第１のＨＡＶ標的領域のための項目１の
少なくとも２つのオリゴマーの組合せ。
（項目３）
配列番号３１、配列番号３２、配列番号６１、配列番号６２、配列番号８９、配列番号
９０、配列番号９１、および配列番号１４８からなる群より選択される、第２のＨＡＶ標
的領域のための項目１の少なくとも２つのオリゴマーの組合せ。
（項目４）
配列番号３３、配列番号６３、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号
９５、配列番号９６、および配列番号９７からなる群より選択される、第３のＨＡＶ標的
領域のための項目１の少なくとも２つのオリゴマーの組合せ。
（項目５）
配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号
３９、配列番号４０、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列
番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号９７、配列番号１４９、および配列番
号１５０からなる群より選択される、第４のＨＡＶ標的領域のための項目１の少なくと
も２つのオリゴマーの組合せ。
（項目６）
配列番号４１、配列番号４２、配列番号７１、配列番号７２、配列番号９８、配列番号
９９、配列番号１０１、配列番号１６１、および配列番号１６２からなる群より選択され
る、第５のＨＡＶ標的領域のための項目１の少なくとも２つのオリゴマーの組合せ。
（項目７）
配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号
４８、配列番号４９、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列
番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１
０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１
５２、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１
６５、配列番号１６６、配列番号１６７、および配列番号１６８からなる群より選択され
る、第６のＨＡＶ標的領域のための項目１の少なくとも２つのオリゴマーの組合せ。
（項目８）
項目１の少なくとも２つのオリゴマーの組合せであって、少なくとも１つの捕捉プロ
ーブオリゴマーをさらに含み、ここで該少なくとも１つの捕捉オリゴマーが（ｉ）配列番
号１〜７からなる群より選択されるか、または（ｉｉ）固定化プローブに結合する配列も
しくは部分に共有結合した標的特異配列であって、該標的特異配列は配列番号８〜１４か
らなる群より選択される、組合せ
（項目９）
項目８の少なくとも２つのオリゴマーの組合せであって、ここで該少なくとも１つの
捕捉プローブオリゴマーが（ｉ）配列番号２、３、および４からなる群より選択されるか
、または（ｉｉ）固定化プローブに結合する配列もしくは部分に共有結合した標的特異配
列であって、該標的特異配列は配列番号９、１０、および１１からなる群より選択される
、組合せ。
（項目１０）
配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１
〜１２４、および配列番号１２６〜１３０からなる群より選択される少なくとも１つの検
出プローブオリゴマーをさらに含む、項目１の少なくとも２つのオリゴマーの組合せ。
（項目１１）
項目１に記載の少なくとも２つのオリゴマーの組合せを含むキット。
（項目１２）
試料中のＨＡＶの存在を検出する方法であって：
ＨＡＶを含有する試料中の他の成分からＨＡＶ核酸を精製する工程；
選択ＨＡＶ標的領域に特異的な少なくとも２つの増幅オリゴマーを含むインビトロ増幅
反応を用いて、精製したＨＡＶ核酸又はそれから作製されるｃＤＮＡ中のＨＡＶ標的配列
を増幅して、選択ＨＡＶ標的領域の増幅産物を生成する工程であって、
ＨＡＶ標的領域を増幅するための少なくとも２つのオリゴマーの組合せであって：
第１のＨＡＶ標的領域のための、配列番号６０の配列に含まれるか若しくは少なくとも
配列番号１５６の配列を含む配列番号８６の配列に含まれる約２１〜２７ｎｔのオリゴマ
ー、または配列番号２９〜３２のいずれか１つのＨＡＶ標的特異部分を含む約４８〜５４
ｎｔの範囲の大きさのプロモータープライマーオリゴマー；
第２のＨＡＶ標的領域のための、少なくとも配列番号１４８の配列を含む配列番号１４
７の配列に含まれるか若しくは少なくとも配列番号１５８の配列を含む配列番号１５７の
配列に含まれる約２４〜３０ｎｔのオリゴマー、または配列番号３１若しくは３２のＨＡ
Ｖ標的特異部位を含むプロモータープライマーオリゴマー；
第３のＨＡＶ標的領域のための、少なくとも配列番号９７、１５９、若しくは１６０の
配列を含む配列番号９３若しくは９５の配列に含まれる約１８〜２７ｎｔのオリゴマー、
または配列番号３３の標的特異部位を含むプロモータープライマーオリゴマー；
第４のＨＡＶ標的領域のための、少なくとも配列番号１５０の配列を含む配列番号１４
９の配列に含まれる約１９〜３１ｎｔのオリゴマー、または配列番号３４〜４０のいずれ
か１つのＨＡＶ標的特異部位を含む約５１〜５６ｎｔの範囲の大きさのプロモータープラ
イマーオリゴマー；
第５のＨＡＶ標的領域のための、少なくとも配列番号１６２の配列を含む配列番号１６
１の配列に含まれる約２４〜２８ｎｔのオリゴマー、または配列番号４１若しくは４２の
ＨＡＶ標的特異部位を含むプロモータープライマーオリゴマー；ならびに
第６のＨＡＶ標的領域のための、少なくとも配列番号１５２〜１５５のいずれか１つの
配列を含む配列番号１５１の配列に含まれるか、若しくは少なくとも配列番号１６４の配
列を含む配列番号１６３に含まれるか、若しくは配列番号１６６〜１６８のいずれか１つ
の配列を含む配列番号１６５に含まれる約２０〜３０ｎｔのオリゴマー、または配列番号
４３〜４９のいずれか１つのＨＡＶ標的特異部位を含む約５１〜５６ｎｔの範囲の大きさ
のプロモータープライマーオリゴマーを含む、前記工程；並びに
増幅産物の少なくとも一部と特異的にハイブリダイズする検出プローブを用いて増幅産
物を検出する工程
とを含む、前記方法。
（項目１３）
項目１２の方法であって、ここで精製工程が、少なくとも１つの捕捉プローブオリゴ
マーと試料を接触させ、ここで該少なくとも１つの捕捉プローブオリゴマーが（ｉ）配列
番号１〜７からなる群より選択されるか、または（ｉｉ）固定化プローブに結合する配列
もしくは部分に共有結合した標的特異配列であって、該標的特異配列が配列番号８〜１４
からなる群より選択され、そしてここで該捕捉プローブオリゴマーがＨＡＶ ＲＮＡ中の
配列に特異的にハイブリダイズしてＨＡＶ ＲＮＡとのハイブリダイゼーション複合体を
形成して、そしてＨＡＶ ＲＮＡを含有するハイブリダイゼーション複合体を他の試料成
分から分離する、項目１２の方法。
（項目１４）
増幅工程が、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３
２、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号８６、配列番号８７、配列番
号８８、および配列番号１５６からなる群より選択される、第２のＨＡＶ標的領域に特異
的な少なくとも２つのオリゴマーを用いて第２のＨＡＶ標的領域中の配列を増幅し；ここ
で検出工程は、第２のＨＡＶ標的領域の増幅産物に特異的にハイブリダイズする少なくと
も１つの検出プローブを用いる、項目１２の方法。
（項目１５）
増幅工程が、配列番号３１、配列番号３２、配列番号６１、配列番号６２、配列番号８
９、配列番号９０、配列番号９１、および配列番号１４８からなる群より選択される、第
３のＨＡＶ標的領域に特異的な少なくとも２つのオリゴマーを用いて第３のＨＡＶ標的領
域中の配列を増幅し；ここで検出工程は、第３のＨＡＶ標的領域の増幅産物に特異的にハ
イブリダイズする少なくとも１つの検出プローブを用いる、項目１２の方法。
（項目１６）
増幅工程が、配列番号３３、配列番号６３、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９
４、配列番号９５、配列番号９６、および配列番号９７からなる群より選択される、第４
のＨＡＶ標的領域に特異的な少なくとも２つのオリゴマーを用いて第４のＨＡＶ標的領域
中の配列を増幅し；ここで検出工程は、第４のＨＡＶ標的領域の増幅産物に特異的にハイ
ブリダイズする少なくとも１つの検出プローブを用いる、項目１２の方法。
（項目１７）
増幅工程が、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３
８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番
号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号９７、配列番号１４９及
び配列番号１５０からなる群より選択される、第５のＨＡＶ標的領域に特異的な少なくと
も２つのオリゴマーを用いて第５のＨＡＶ標的領域中の配列を増幅し；ここで検出工程は
、第５のＨＡＶ標的領域の増幅産物に特異的にハイブリダイズする少なくとも１つの検出
プローブを用いる、項目１２の方法。
（項目１８）
増幅工程が、配列番号４１、配列番号４２、配列番号７１、配列番号７２、配列番号９
８、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１６１及び配列番号１６２からなる群より
選択される、第６のＨＡＶ標的領域に特異的な少なくとも２つのオリゴマーを用いて第６
のＨＡＶ標的領域中の配列を増幅し；ここで検出工程は、第６のＨＡＶ標的領域の増幅産
物に特異的にハイブリダイズする少なくとも１つの検出プローブを用いる、項目１２の
方法。
（項目１９）
増幅工程が、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４
７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番
号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号１０２、配列番号１０３
、配列番号１０４、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８
、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１６３、配列番号１６４
、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７及び配列番号１６８からなる群より
選択される、第７のＨＡＶ標的領域に特異的な少なくとも２つのオリゴマーを用いて第７
のＨＡＶ標的領域中の配列を増幅し；そしてここで検出工程は、第７のＨＡＶ標的領域の
増幅産物に特異的にハイブリダイズする少なくとも１つの検出プローブを用いる、項目
１２の方法。
本発明としては、ＨＡＶ標的配列の精製、増幅及び検出に有用な核酸オリゴマーがあげ
られる。本オリゴマー又はオリゴマーの組合せをキット形態に含めてもよく、その実施態
様としては、ＨＡＶ配列を増幅する及び／又は検出するための他のオリゴマー及び／又は
他の試薬があげられる。本発明としては、ＨＡＶ核酸を試料中の他の成分より精製する工
程、ＨＡＶ ＲＮＡ標的配列又はそれより作製されるｃＤＮＡを、インビトロ核酸ポリメ
ラーゼと本明細書に記載の増幅オリゴマーのあらゆる組合せを用いて増幅し、増幅産物を
生成する工程及び、増幅産物の少なくとも一部と特異的にハイブリダイズする検出プロー
ブを用いて増幅産物を検出する工程を用いる、試料中のＨＡＶを検出する方法があげられ
る。１つの実施態様としては、ＨＡＶ ＲＮＡ標的領域に特異的にハイブリダイズし、他
の試料成分から分離されるＨＡＶ ＲＮＡを含むハイブリダイゼーション複合体を形成す
る配列を含む少なくとも１つの捕捉オリゴマーを用いて、ＨＡＶ核酸を精製する。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
ＨＡＶ標的領域を増幅するための少なくとも２つのオリゴマーの組合せであって：
第１のＨＡＶ標的領域のための、配列番号６０の配列に含まれるか若しくは少なくとも
配列番号１５６の配列を含む配列番号８６の配列に含まれる約２１〜２７ｎｔのオリゴマ
ー、または配列番号２９〜３２のいずれか１つのＨＡＶ標的特異部分を含む約４８〜５４
ｎｔの範囲の大きさのプロモータープライマーオリゴマー；
第２のＨＡＶ標的領域のための、少なくとも配列番号１４８の配列を含む配列番号１４
７の配列に含まれるか若しくは少なくとも配列番号１５８の配列を含む配列番号１５７の
配列に含まれる約２４〜３０ｎｔのオリゴマー、または配列番号３１若しくは３２のＨＡ
Ｖ標的特異部位を含むプロモータープライマーオリゴマー；
第３のＨＡＶ標的領域のための、少なくとも配列番号９７、１５９、若しくは１６０の
配列を含む配列番号９３若しくは９５の配列に含まれる約１８〜２７ｎｔのオリゴマー、
または配列番号３３の標的特異部位を含むプロモータープライマーオリゴマー；
第４のＨＡＶ標的領域のための、少なくとも配列番号１５０の配列を含む配列番号１４
９の配列に含まれる約１９〜３１ｎｔのオリゴマー、または配列番号３４〜４０のいずれ
か１つのＨＡＶ標的特異部位を含む約５１〜５６ｎｔの範囲の大きさのプロモータープラ
イマーオリゴマー；
第５のＨＡＶ標的領域のための、少なくとも配列番号１６２の配列を含む配列番号１６
１の配列に含まれる約２４〜２８ｎｔのオリゴマー、または配列番号４１若しくは４２の
ＨＡＶ標的特異部位を含むプロモータープライマーオリゴマー；ならびに
第６のＨＡＶ標的領域のための、少なくとも配列番号１５２〜１５５のいずれか１つの
配列を含む配列番号１５１の配列に含まれるか、若しくは少なくとも配列番号１６４の配
列を含む配列番号１６３に含まれるか、若しくは配列番号１６６〜１６８のいずれか１つ
の配列を含む配列番号１６５に含まれる約２０〜３０ｎｔのオリゴマー、または配列番号
４３〜４９のいずれか１つのＨＡＶ標的特異部位を含む約５１〜５６ｎｔの範囲の大きさ
のプロモータープライマーオリゴマーを含む、前記組合せ。
（項目２）
配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号
５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、およ
び配列番号１５６からなる群より選択される、第１のＨＡＶ標的領域のための項目１の
少なくとも２つのオリゴマーの組合せ。
（項目３）
配列番号３１、配列番号３２、配列番号６１、配列番号６２、配列番号８９、配列番号
９０、配列番号９１、および配列番号１４８からなる群より選択される、第２のＨＡＶ標
的領域のための項目１の少なくとも２つのオリゴマーの組合せ。
（項目４）
配列番号３３、配列番号６３、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号
９５、配列番号９６、および配列番号９７からなる群より選択される、第３のＨＡＶ標的
領域のための項目１の少なくとも２つのオリゴマーの組合せ。
（項目５）
配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号
３９、配列番号４０、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列
番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号９７、配列番号１４９、および配列番
号１５０からなる群より選択される、第４のＨＡＶ標的領域のための項目１の少なくと
も２つのオリゴマーの組合せ。
（項目６）
配列番号４１、配列番号４２、配列番号７１、配列番号７２、配列番号９８、配列番号
９９、配列番号１０１、配列番号１６１、および配列番号１６２からなる群より選択され
る、第５のＨＡＶ標的領域のための項目１の少なくとも２つのオリゴマーの組合せ。
（項目７）
配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号
４８、配列番号４９、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列
番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１
０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１
５２、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１
６５、配列番号１６６、配列番号１６７、および配列番号１６８からなる群より選択され
る、第６のＨＡＶ標的領域のための項目１の少なくとも２つのオリゴマーの組合せ。
（項目８）
項目１の少なくとも２つのオリゴマーの組合せであって、少なくとも１つの捕捉プロ
ーブオリゴマーをさらに含み、ここで該少なくとも１つの捕捉オリゴマーが（ｉ）配列番
号１〜７からなる群より選択されるか、または（ｉｉ）固定化プローブに結合する配列も
しくは部分に共有結合した標的特異配列であって、該標的特異配列は配列番号８〜１４か
らなる群より選択される、組合せ
（項目９）
項目８の少なくとも２つのオリゴマーの組合せであって、ここで該少なくとも１つの
捕捉プローブオリゴマーが（ｉ）配列番号２、３、および４からなる群より選択されるか
、または（ｉｉ）固定化プローブに結合する配列もしくは部分に共有結合した標的特異配
列であって、該標的特異配列は配列番号９、１０、および１１からなる群より選択される
、組合せ。
（項目１０）
配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１
〜１２４、および配列番号１２６〜１３０からなる群より選択される少なくとも１つの検
出プローブオリゴマーをさらに含む、項目１の少なくとも２つのオリゴマーの組合せ。
（項目１１）
項目１に記載の少なくとも２つのオリゴマーの組合せを含むキット。
（項目１２）
試料中のＨＡＶの存在を検出する方法であって：
ＨＡＶを含有する試料中の他の成分からＨＡＶ核酸を精製する工程；
選択ＨＡＶ標的領域に特異的な少なくとも２つの増幅オリゴマーを含むインビトロ増幅
反応を用いて、精製したＨＡＶ核酸又はそれから作製されるｃＤＮＡ中のＨＡＶ標的配列
を増幅して、選択ＨＡＶ標的領域の増幅産物を生成する工程であって、
ＨＡＶ標的領域を増幅するための少なくとも２つのオリゴマーの組合せであって：
第１のＨＡＶ標的領域のための、配列番号６０の配列に含まれるか若しくは少なくとも
配列番号１５６の配列を含む配列番号８６の配列に含まれる約２１〜２７ｎｔのオリゴマ
ー、または配列番号２９〜３２のいずれか１つのＨＡＶ標的特異部分を含む約４８〜５４
ｎｔの範囲の大きさのプロモータープライマーオリゴマー；
第２のＨＡＶ標的領域のための、少なくとも配列番号１４８の配列を含む配列番号１４
７の配列に含まれるか若しくは少なくとも配列番号１５８の配列を含む配列番号１５７の
配列に含まれる約２４〜３０ｎｔのオリゴマー、または配列番号３１若しくは３２のＨＡ
Ｖ標的特異部位を含むプロモータープライマーオリゴマー；
第３のＨＡＶ標的領域のための、少なくとも配列番号９７、１５９、若しくは１６０の
配列を含む配列番号９３若しくは９５の配列に含まれる約１８〜２７ｎｔのオリゴマー、
または配列番号３３の標的特異部位を含むプロモータープライマーオリゴマー；
第４のＨＡＶ標的領域のための、少なくとも配列番号１５０の配列を含む配列番号１４
９の配列に含まれる約１９〜３１ｎｔのオリゴマー、または配列番号３４〜４０のいずれ
か１つのＨＡＶ標的特異部位を含む約５１〜５６ｎｔの範囲の大きさのプロモータープラ
イマーオリゴマー；
第５のＨＡＶ標的領域のための、少なくとも配列番号１６２の配列を含む配列番号１６
１の配列に含まれる約２４〜２８ｎｔのオリゴマー、または配列番号４１若しくは４２の
ＨＡＶ標的特異部位を含むプロモータープライマーオリゴマー；ならびに
第６のＨＡＶ標的領域のための、少なくとも配列番号１５２〜１５５のいずれか１つの
配列を含む配列番号１５１の配列に含まれるか、若しくは少なくとも配列番号１６４の配
列を含む配列番号１６３に含まれるか、若しくは配列番号１６６〜１６８のいずれか１つ
の配列を含む配列番号１６５に含まれる約２０〜３０ｎｔのオリゴマー、または配列番号
４３〜４９のいずれか１つのＨＡＶ標的特異部位を含む約５１〜５６ｎｔの範囲の大きさ
のプロモータープライマーオリゴマーを含む、前記工程；並びに
増幅産物の少なくとも一部と特異的にハイブリダイズする検出プローブを用いて増幅産
物を検出する工程
とを含む、前記方法。
（項目１３）
項目１２の方法であって、ここで精製工程が、少なくとも１つの捕捉プローブオリゴ
マーと試料を接触させ、ここで該少なくとも１つの捕捉プローブオリゴマーが（ｉ）配列
番号１〜７からなる群より選択されるか、または（ｉｉ）固定化プローブに結合する配列
もしくは部分に共有結合した標的特異配列であって、該標的特異配列が配列番号８〜１４
からなる群より選択され、そしてここで該捕捉プローブオリゴマーがＨＡＶ ＲＮＡ中の
配列に特異的にハイブリダイズしてＨＡＶ ＲＮＡとのハイブリダイゼーション複合体を
形成して、そしてＨＡＶ ＲＮＡを含有するハイブリダイゼーション複合体を他の試料成
分から分離する、項目１２の方法。
（項目１４）
増幅工程が、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３
２、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号８６、配列番号８７、配列番
号８８、および配列番号１５６からなる群より選択される、第２のＨＡＶ標的領域に特異
的な少なくとも２つのオリゴマーを用いて第２のＨＡＶ標的領域中の配列を増幅し；ここ
で検出工程は、第２のＨＡＶ標的領域の増幅産物に特異的にハイブリダイズする少なくと
も１つの検出プローブを用いる、項目１２の方法。
（項目１５）
増幅工程が、配列番号３１、配列番号３２、配列番号６１、配列番号６２、配列番号８
９、配列番号９０、配列番号９１、および配列番号１４８からなる群より選択される、第
３のＨＡＶ標的領域に特異的な少なくとも２つのオリゴマーを用いて第３のＨＡＶ標的領
域中の配列を増幅し；ここで検出工程は、第３のＨＡＶ標的領域の増幅産物に特異的にハ
イブリダイズする少なくとも１つの検出プローブを用いる、項目１２の方法。
（項目１６）
増幅工程が、配列番号３３、配列番号６３、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９
４、配列番号９５、配列番号９６、および配列番号９７からなる群より選択される、第４
のＨＡＶ標的領域に特異的な少なくとも２つのオリゴマーを用いて第４のＨＡＶ標的領域
中の配列を増幅し；ここで検出工程は、第４のＨＡＶ標的領域の増幅産物に特異的にハイ
ブリダイズする少なくとも１つの検出プローブを用いる、項目１２の方法。
（項目１７）
増幅工程が、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３
８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番
号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号９７、配列番号１４９及
び配列番号１５０からなる群より選択される、第５のＨＡＶ標的領域に特異的な少なくと
も２つのオリゴマーを用いて第５のＨＡＶ標的領域中の配列を増幅し；ここで検出工程は
、第５のＨＡＶ標的領域の増幅産物に特異的にハイブリダイズする少なくとも１つの検出
プローブを用いる、項目１２の方法。
（項目１８）
増幅工程が、配列番号４１、配列番号４２、配列番号７１、配列番号７２、配列番号９
８、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１６１及び配列番号１６２からなる群より
選択される、第６のＨＡＶ標的領域に特異的な少なくとも２つのオリゴマーを用いて第６
のＨＡＶ標的領域中の配列を増幅し；ここで検出工程は、第６のＨＡＶ標的領域の増幅産
物に特異的にハイブリダイズする少なくとも１つの検出プローブを用いる、項目１２の
方法。
（項目１９）
増幅工程が、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４
７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番
号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号１０２、配列番号１０３
、配列番号１０４、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８
、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１６３、配列番号１６４
、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７及び配列番号１６８からなる群より
選択される、第７のＨＡＶ標的領域に特異的な少なくとも２つのオリゴマーを用いて第７
のＨＡＶ標的領域中の配列を増幅し；そしてここで検出工程は、第７のＨＡＶ標的領域の
増幅産物に特異的にハイブリダイズする少なくとも１つの検出プローブを用いる、項目
１２の方法。
本発明の１つの態様としては、ＨＡＶ標的領域を増幅するのに特異的な少なくとも２つ
のオリゴマーの組合せがあり、それには：第１のＨＡＶ標的領域のための、少なくとも配
列番号１３９又は配列番号１４０の配列を含む配列番号１３８の配列に含まれる約２３〜
２６ｎｔのオリゴマー、又は配列番号１４２〜１４６の少なくとも１つの配列を含有する
配列番号１４１の配列に含まれる約１９〜２５ｎｔの範囲の大きさのオリゴマー、又は配
列番号２１〜２７のいずれか１つのＨＡＶ標的特異部分を含む約５０〜５３ｎｔの範囲の
大きさのプロモータープライマーオリゴマー；第２のＨＡＶ標的領域のための、配列番号
６０の配列に含まれるか又は少なくとも配列番号１５６の配列を含む配列番号８６の配列
に含まれる約２１〜２７ｎｔのオリゴマー、又は配列番号２９〜３２のいずれか１つのＨ
ＡＶ標的特異部分を含む約４８〜５４ｎｔの範囲の大きさのプロモータープライマーオリ
ゴマー；第３のＨＡＶ標的領域のための、少なくとも配列番号１４８の配列を含む配列番
号１４７の配列に含まれるか、又は少なくとも配列番号１５８の配列を含む配列番号１５
７の配列に含まれる約２４〜３０ｎｔのオリゴマー、又は配列番号３１又は配列番号３２
のＨＡＶ標的特異部分を含むプロモータープライマーオリゴマー；第４のＨＡＶ標的領域
のための、少なくとも配列番号９７、配列番号１５９、又は配列番号１６０の配列を含有
する配列番号９３又は配列番号９５の配列に含まれる約１８〜２７ｎｔのオリゴマー、又
は配列番号３３のＨＡＶ標的特異部分を含むプロモータープライマーオリゴマー；第５の
ＨＡＶ標的領域のための、少なくとも配列番号１５０の配列を含む配列番号１４９の配列
に含まれる約１９〜３１ｎｔのオリゴマー、又は配列番号３４〜４０のいずれか１つのＨ
ＡＶ標的特異部分を含む約５１〜５６ｎｔの範囲の大きさのプロモータープライマーオリ
ゴマー；第６のＨＡＶ標的領域のための、少なくとも配列番号１６２の配列を含む配列番
号１６１の配列に含まれる約２４〜２８ｎｔのオリゴマー、又は配列番号４１又は配列番
号４２のＨＡＶ標的特異部分を含むプロモータープライマーオリゴマー；並びに、第７の
ＨＡＶ標的領域のための、少なくとも配列番号１５２〜配列番号１５５の配列のいずれか
１つを含む配列番号１５１の配列に含まれるか、又は少なくとも配列番号１６４の配列を
含む配列番号１６３に含まれるか、又は少なくとも配列番号１６６〜配列番号１６８の配
列のいずれか１つを含む配列番号１６５に含まれる約２０〜３０ｎｔのオリゴマー、又は
配列番号４３〜４９のいずれか１つのＨＡＶ標的特異部分を含む約５１〜５６ｎｔの範囲
の大きさのプロモータープライマーオリゴマーを含む。第１のＨＡＶ標的領域に特異的な
少なくとも２つのオリゴマーの組合せの好ましい実施態様は、配列番号１５、配列番号１
６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番
号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号５０、配
列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６
、配列番号５７、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号
８４、配列番号８５、配列番号１４３、配列番号１４４及び配列番号１４５より選択され
る。第２のＨＡＶ標的領域に特異的な少なくとも２つのオリゴマーの組合せの好ましい実
施態様は、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、
配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８
８及び配列番号１５６より選択される。第３のＨＡＶ標的領域に特異的な少なくとも２つ
のオリゴマーの組合せの好ましい実施態様は、配列番号３１、配列番号３２、配列番号６
１、配列番号６２、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１及び配列番号より選択さ
れる、第４のＨＡＶ標的領域に特異的な少なくとも２つのオリゴマーの組合せの好ましい
実施態様は、配列番号３３、配列番号６３、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４
、配列番号９５、配列番号９６及び配列番号９７より選択される。第５のＨＡＶ標的領域
に特異的な少なくとも２つのオリゴマーの組合せの好ましい実施態様は、配列番号３４、
配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４
０、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番
号６９、配列番号７０、配列番号９７、配列番号１４９及び配列番号１５０より選択され
る。第６のＨＡＶ標的領域に特異的な少なくとも２つのオリゴマーの組合せの好ましい実
施態様は、配列番号４１、配列番号４２、配列番号７１、配列番号７２、配列番号９８、
配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１６１及び配列番号１６２より選択される。第
７のＨＡＶ標的領域に特異的な少なくとも２つのオリゴマーの組合せの好ましい実施態様
は、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番
号４８、配列番号４９、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配
列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号
１０４、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号
１５２、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号
１６５、配列番号１６６、配列番号１６７及び配列番号１６８より選択される。他の好ま
しい実施態様としては、配列番号１〜１４より選択される少なくとも１つの捕捉プローブ
オリゴマーがさらにあげられる。なお他の実施態様としては、配列番号１０９、配列番号
１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号
１２１〜配列番号１２４及び配列番号１２６〜配列番号１３０より選択される少なくとも
１つの検出プローブオリゴマーがさらにあげられる。オリゴマーの組合せの好ましい実施
態様としては、選択ＨＡＶ標的領域を増幅するのに特異的な少なくとも２つのオリゴマー
と、選択ＨＡＶ領域を増幅するのに特異的な選択された２つのオリゴマーの間に位置する
、ＨＡＶゲノム配列に含まれる配列に特異的である少なくとも１つの検出プローブオリゴ
マーあげられる。そのようなオリゴマーの組合せの好ましい実施態様をキットと共に包装
することができ、これには、ＨＡＶ ＲＮＡを試料より精製することに用いる試薬及び／
又はインビトロ核酸増幅に用いる試薬及び／又は検出プローブオリゴマーから検出可能シ
グナルを産生することに用いる試薬等他の試薬をさらに含有できる。
のオリゴマーの組合せがあり、それには：第１のＨＡＶ標的領域のための、少なくとも配
列番号１３９又は配列番号１４０の配列を含む配列番号１３８の配列に含まれる約２３〜
２６ｎｔのオリゴマー、又は配列番号１４２〜１４６の少なくとも１つの配列を含有する
配列番号１４１の配列に含まれる約１９〜２５ｎｔの範囲の大きさのオリゴマー、又は配
列番号２１〜２７のいずれか１つのＨＡＶ標的特異部分を含む約５０〜５３ｎｔの範囲の
大きさのプロモータープライマーオリゴマー；第２のＨＡＶ標的領域のための、配列番号
６０の配列に含まれるか又は少なくとも配列番号１５６の配列を含む配列番号８６の配列
に含まれる約２１〜２７ｎｔのオリゴマー、又は配列番号２９〜３２のいずれか１つのＨ
ＡＶ標的特異部分を含む約４８〜５４ｎｔの範囲の大きさのプロモータープライマーオリ
ゴマー；第３のＨＡＶ標的領域のための、少なくとも配列番号１４８の配列を含む配列番
号１４７の配列に含まれるか、又は少なくとも配列番号１５８の配列を含む配列番号１５
７の配列に含まれる約２４〜３０ｎｔのオリゴマー、又は配列番号３１又は配列番号３２
のＨＡＶ標的特異部分を含むプロモータープライマーオリゴマー；第４のＨＡＶ標的領域
のための、少なくとも配列番号９７、配列番号１５９、又は配列番号１６０の配列を含有
する配列番号９３又は配列番号９５の配列に含まれる約１８〜２７ｎｔのオリゴマー、又
は配列番号３３のＨＡＶ標的特異部分を含むプロモータープライマーオリゴマー；第５の
ＨＡＶ標的領域のための、少なくとも配列番号１５０の配列を含む配列番号１４９の配列
に含まれる約１９〜３１ｎｔのオリゴマー、又は配列番号３４〜４０のいずれか１つのＨ
ＡＶ標的特異部分を含む約５１〜５６ｎｔの範囲の大きさのプロモータープライマーオリ
ゴマー；第６のＨＡＶ標的領域のための、少なくとも配列番号１６２の配列を含む配列番
号１６１の配列に含まれる約２４〜２８ｎｔのオリゴマー、又は配列番号４１又は配列番
号４２のＨＡＶ標的特異部分を含むプロモータープライマーオリゴマー；並びに、第７の
ＨＡＶ標的領域のための、少なくとも配列番号１５２〜配列番号１５５の配列のいずれか
１つを含む配列番号１５１の配列に含まれるか、又は少なくとも配列番号１６４の配列を
含む配列番号１６３に含まれるか、又は少なくとも配列番号１６６〜配列番号１６８の配
列のいずれか１つを含む配列番号１６５に含まれる約２０〜３０ｎｔのオリゴマー、又は
配列番号４３〜４９のいずれか１つのＨＡＶ標的特異部分を含む約５１〜５６ｎｔの範囲
の大きさのプロモータープライマーオリゴマーを含む。第１のＨＡＶ標的領域に特異的な
少なくとも２つのオリゴマーの組合せの好ましい実施態様は、配列番号１５、配列番号１
６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番
号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号５０、配
列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６
、配列番号５７、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号
８４、配列番号８５、配列番号１４３、配列番号１４４及び配列番号１４５より選択され
る。第２のＨＡＶ標的領域に特異的な少なくとも２つのオリゴマーの組合せの好ましい実
施態様は、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、
配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８
８及び配列番号１５６より選択される。第３のＨＡＶ標的領域に特異的な少なくとも２つ
のオリゴマーの組合せの好ましい実施態様は、配列番号３１、配列番号３２、配列番号６
１、配列番号６２、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１及び配列番号より選択さ
れる、第４のＨＡＶ標的領域に特異的な少なくとも２つのオリゴマーの組合せの好ましい
実施態様は、配列番号３３、配列番号６３、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４
、配列番号９５、配列番号９６及び配列番号９７より選択される。第５のＨＡＶ標的領域
に特異的な少なくとも２つのオリゴマーの組合せの好ましい実施態様は、配列番号３４、
配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４
０、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番
号６９、配列番号７０、配列番号９７、配列番号１４９及び配列番号１５０より選択され
る。第６のＨＡＶ標的領域に特異的な少なくとも２つのオリゴマーの組合せの好ましい実
施態様は、配列番号４１、配列番号４２、配列番号７１、配列番号７２、配列番号９８、
配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１６１及び配列番号１６２より選択される。第
７のＨＡＶ標的領域に特異的な少なくとも２つのオリゴマーの組合せの好ましい実施態様
は、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番
号４８、配列番号４９、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配
列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号
１０４、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号
１５２、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号
１６５、配列番号１６６、配列番号１６７及び配列番号１６８より選択される。他の好ま
しい実施態様としては、配列番号１〜１４より選択される少なくとも１つの捕捉プローブ
オリゴマーがさらにあげられる。なお他の実施態様としては、配列番号１０９、配列番号
１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号
１２１〜配列番号１２４及び配列番号１２６〜配列番号１３０より選択される少なくとも
１つの検出プローブオリゴマーがさらにあげられる。オリゴマーの組合せの好ましい実施
態様としては、選択ＨＡＶ標的領域を増幅するのに特異的な少なくとも２つのオリゴマー
と、選択ＨＡＶ領域を増幅するのに特異的な選択された２つのオリゴマーの間に位置する
、ＨＡＶゲノム配列に含まれる配列に特異的である少なくとも１つの検出プローブオリゴ
マーあげられる。そのようなオリゴマーの組合せの好ましい実施態様をキットと共に包装
することができ、これには、ＨＡＶ ＲＮＡを試料より精製することに用いる試薬及び／
又はインビトロ核酸増幅に用いる試薬及び／又は検出プローブオリゴマーから検出可能シ
グナルを産生することに用いる試薬等他の試薬をさらに含有できる。
本発明の他の態様は、試料中のＨＡＶの存在を検出する方法であり、それには、ＨＡＶ
を含有する試料中の他の成分からＨＡＶ核酸を精製する工程；第１のＨＡＶ標的領域のた
めの、少なくとも配列番号１３９又は配列番号１４０の配列を含む配列番号１３８の配列
に含まれる約２３〜２６ｎｔのオリゴマー、又は配列番号１４２〜１４６の少なくとも１
つの配列を含有する配列番号１４１の配列に含まれる約１９〜２５ｎｔの範囲の大きさの
オリゴマー、又は配列番号２１〜２７のいずれか１つのＨＡＶ標的特異部分を含む約５０
〜５３ｎｔの範囲の大きさのプロモータープライマーオリゴマー；第２のＨＡＶ標的領域
のための、配列番号６０の配列に含まれるか又は少なくとも配列番号１５６の配列を含む
配列番号８６の配列に含まれる約２１〜２７ｎｔのオリゴマー、又は配列番号２９〜３２
のいずれか１つのＨＡＶ標的特異部分を含む約４８〜５４ｎｔの範囲の大きさのプロモー
タープライマーオリゴマー；第３のＨＡＶ標的領域のための、少なくとも配列番号１４８
の配列を含む配列番号１４７の配列に含まれるか、又は少なくとも配列番号１５８の配列
を含む配列番号１５７の配列に含まれる約２４〜３０ｎｔのオリゴマー、又は配列番号３
１又は配列番号３２のＨＡＶ標的特異部分を含むプロモータープライマーオリゴマー；第
４のＨＡＶ標的領域のための、少なくとも配列番号９７、配列番号１５９、又は配列番号
１６０の配列を含有する配列番号９３又は配列番号９５の配列に含まれる約１８〜２７ｎ
ｔのオリゴマー、又は配列番号３３のＨＡＶ標的特異部分を含むプロモータープライマー
オリゴマー；第５のＨＡＶ標的領域のための、少なくとも配列番号１５０の配列を含む配
列番号１４９の配列に含まれる約１９〜３１ｎｔのオリゴマー、又は配列番号３４〜４０
のいずれか１つのＨＡＶ標的特異部分を含む約５１〜５６ｎｔの範囲の大きさのプロモー
タープライマーオリゴマー；第６のＨＡＶ標的領域のための、少なくとも配列番号１６２
の配列を含む配列番号１６１の配列に含まれる約２４〜２８ｎｔのオリゴマー、又は配列
番号４１又は配列番号４２のＨＡＶ標的特異部分を含むプロモータープライマーオリゴマ
ー；並びに第７のＨＡＶ標的領域のための、少なくとも配列番号１５２〜配列番号１５５
の配列のいずれか１つを含む配列番号１５１の配列に含まれるか、又は少なくとも配列番
号１６４の配列を含む配列番号１６３に含まれるか、又は少なくとも配列番号１６６〜配
列番号１６８の配列のいずれか１つを含む配列番号１６５に含まれる約２０〜３０ｎｔの
オリゴマー、又は配列番号４３〜４９のいずれか１つのＨＡＶ標的特異部分を含む約５１
〜５６ｎｔの範囲の大きさのプロモータープライマーオリゴマーを含む、選択ＨＡＶ標的
領域に特異的な少なくとも２つの増幅オリゴマーを含むインビトロ増幅反応を用いて、精
製したＨＡＶ核酸又はそれより作製されるｃＤＮＡ中のＨＡＶ標的配列を増幅して、選択
ＨＡＶ標的領域の増幅産物を生成する工程；並びに増幅産物の少なくとも一部と特異的に
ハイブリダイズする検出プローブを用いて増幅産物を検出する工程を含む。精製工程にお
ける好ましい実施態様は、ＨＡＶ ＲＮＡ中の配列に特異的にハイブリダイズする、配列
番号１〜１４のいずれか１つに含まれる配列を含む少なくとも１つの捕捉プローブオリゴ
マーと試料を接触させてＨＡＶ ＲＮＡとのハイブリダイゼーション複合体を形成して、
ＨＡＶ ＲＮＡを含有する該ハイブリダイゼーション複合体を他の試料成分から分離する
。第１のＨＡＶ標的領域中の配列を増幅する好ましい実施態様は、配列番号１５、配列番
号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配
列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号５０
、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号
５６、配列番号５７、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列
番号８４、配列番号８５、配列番号１４３、配列番号１４４及び配列番号１４５より選択
される、第１のＨＡＶ標的領域に特異的な少なくとも２つのオリゴマーを使用し；その後
、第１のＨＡＶ標的領域の増幅産物に特異的にハイブリダイズする少なくとも１つの検出
プローブを用いる。第２のＨＡＶ標的領域中の配列を増幅する好ましい実施態様は、配列
番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号５８、
配列番号５９、配列番号６０、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８及び配列番号
１５６より選択される、第２のＨＡＶ標的領域に特異的な少なくとも２つのオリゴマーを
用いて；その後、第２のＨＡＶ標的領域の増幅産物に特異的にハイブリダイズする少なく
とも１つの検出プローブを用いる。第３のＨＡＶ標的領域中の配列を増幅する好ましい実
施態様は、配列番号３１、配列番号３２、配列番号６１、配列番号６２、配列番号８９、
配列番号９０、配列番号９１及び配列番号１４８より選択される、第３のＨＡＶ標的領域
に特異的な少なくとも２つのオリゴマーを用いて；その後、第３のＨＡＶ標的領域の増幅
産物に特異的にハイブリダイズする少なくとも１つの検出プローブを用いる。第４のＨＡ
Ｖ標的領域中の配列を増幅する好ましい実施態様は、配列番号３３、配列番号６３、配列
番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６及び配列番号９７
より選択される、第４のＨＡＶ標的領域に特異的な少なくとも２つのオリゴマーを用いて
；その後、第４のＨＡＶ標的領域の増幅産物に特異的にハイブリダイズする少なくとも１
つの検出プローブを用いる。第５のＨＡＶ標的領域中の配列を増幅する好ましい実施態様
は、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番
号３９、配列番号４０、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配
列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号９７、配列番号１４９及び配列番号
１５０より選択される、第５のＨＡＶ標的領域に特異的な少なくとも２つのオリゴマーを
用いて；その後、第５のＨＡＶ標的領域の増幅産物に特異的にハイブリダイズする少なく
とも１つの検出プローブを用いる。第６のＨＡＶ標的領域中の配列を増幅する好ましい実
施態様は、配列番号４１、配列番号４２、配列番号７１、配列番号７２、配列番号９８、
配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１６１及び配列番号１６２より選択される、第
６のＨＡＶ標的領域に特異的な少なくとも２つのオリゴマーを用いて；その後、第６のＨ
ＡＶ標的領域の増幅産物に特異的にハイブリダイズする少なくとも１つの検出プローブを
用いる。第７のＨＡＶ標的領域中の配列を増幅する好ましい実施態様は、配列番号４３、
配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４
９、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番
号７８、配列番号７９、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１
０４、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１５２、配列番号１
５３、配列番号１５５、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１
６６、配列番号１６７及び配列番号１６８からなる群より選択される、第７のＨＡＶ標的
領域に特異的な少なくとも２つのオリゴマーを用いて；その後、第７のＨＡＶ標的領域の
増幅産物に特異的にハイブリダイズする少なくとも１つの検出プローブを用いる。
を含有する試料中の他の成分からＨＡＶ核酸を精製する工程；第１のＨＡＶ標的領域のた
めの、少なくとも配列番号１３９又は配列番号１４０の配列を含む配列番号１３８の配列
に含まれる約２３〜２６ｎｔのオリゴマー、又は配列番号１４２〜１４６の少なくとも１
つの配列を含有する配列番号１４１の配列に含まれる約１９〜２５ｎｔの範囲の大きさの
オリゴマー、又は配列番号２１〜２７のいずれか１つのＨＡＶ標的特異部分を含む約５０
〜５３ｎｔの範囲の大きさのプロモータープライマーオリゴマー；第２のＨＡＶ標的領域
のための、配列番号６０の配列に含まれるか又は少なくとも配列番号１５６の配列を含む
配列番号８６の配列に含まれる約２１〜２７ｎｔのオリゴマー、又は配列番号２９〜３２
のいずれか１つのＨＡＶ標的特異部分を含む約４８〜５４ｎｔの範囲の大きさのプロモー
タープライマーオリゴマー；第３のＨＡＶ標的領域のための、少なくとも配列番号１４８
の配列を含む配列番号１４７の配列に含まれるか、又は少なくとも配列番号１５８の配列
を含む配列番号１５７の配列に含まれる約２４〜３０ｎｔのオリゴマー、又は配列番号３
１又は配列番号３２のＨＡＶ標的特異部分を含むプロモータープライマーオリゴマー；第
４のＨＡＶ標的領域のための、少なくとも配列番号９７、配列番号１５９、又は配列番号
１６０の配列を含有する配列番号９３又は配列番号９５の配列に含まれる約１８〜２７ｎ
ｔのオリゴマー、又は配列番号３３のＨＡＶ標的特異部分を含むプロモータープライマー
オリゴマー；第５のＨＡＶ標的領域のための、少なくとも配列番号１５０の配列を含む配
列番号１４９の配列に含まれる約１９〜３１ｎｔのオリゴマー、又は配列番号３４〜４０
のいずれか１つのＨＡＶ標的特異部分を含む約５１〜５６ｎｔの範囲の大きさのプロモー
タープライマーオリゴマー；第６のＨＡＶ標的領域のための、少なくとも配列番号１６２
の配列を含む配列番号１６１の配列に含まれる約２４〜２８ｎｔのオリゴマー、又は配列
番号４１又は配列番号４２のＨＡＶ標的特異部分を含むプロモータープライマーオリゴマ
ー；並びに第７のＨＡＶ標的領域のための、少なくとも配列番号１５２〜配列番号１５５
の配列のいずれか１つを含む配列番号１５１の配列に含まれるか、又は少なくとも配列番
号１６４の配列を含む配列番号１６３に含まれるか、又は少なくとも配列番号１６６〜配
列番号１６８の配列のいずれか１つを含む配列番号１６５に含まれる約２０〜３０ｎｔの
オリゴマー、又は配列番号４３〜４９のいずれか１つのＨＡＶ標的特異部分を含む約５１
〜５６ｎｔの範囲の大きさのプロモータープライマーオリゴマーを含む、選択ＨＡＶ標的
領域に特異的な少なくとも２つの増幅オリゴマーを含むインビトロ増幅反応を用いて、精
製したＨＡＶ核酸又はそれより作製されるｃＤＮＡ中のＨＡＶ標的配列を増幅して、選択
ＨＡＶ標的領域の増幅産物を生成する工程；並びに増幅産物の少なくとも一部と特異的に
ハイブリダイズする検出プローブを用いて増幅産物を検出する工程を含む。精製工程にお
ける好ましい実施態様は、ＨＡＶ ＲＮＡ中の配列に特異的にハイブリダイズする、配列
番号１〜１４のいずれか１つに含まれる配列を含む少なくとも１つの捕捉プローブオリゴ
マーと試料を接触させてＨＡＶ ＲＮＡとのハイブリダイゼーション複合体を形成して、
ＨＡＶ ＲＮＡを含有する該ハイブリダイゼーション複合体を他の試料成分から分離する
。第１のＨＡＶ標的領域中の配列を増幅する好ましい実施態様は、配列番号１５、配列番
号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配
列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号５０
、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号
５６、配列番号５７、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列
番号８４、配列番号８５、配列番号１４３、配列番号１４４及び配列番号１４５より選択
される、第１のＨＡＶ標的領域に特異的な少なくとも２つのオリゴマーを使用し；その後
、第１のＨＡＶ標的領域の増幅産物に特異的にハイブリダイズする少なくとも１つの検出
プローブを用いる。第２のＨＡＶ標的領域中の配列を増幅する好ましい実施態様は、配列
番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号５８、
配列番号５９、配列番号６０、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８及び配列番号
１５６より選択される、第２のＨＡＶ標的領域に特異的な少なくとも２つのオリゴマーを
用いて；その後、第２のＨＡＶ標的領域の増幅産物に特異的にハイブリダイズする少なく
とも１つの検出プローブを用いる。第３のＨＡＶ標的領域中の配列を増幅する好ましい実
施態様は、配列番号３１、配列番号３２、配列番号６１、配列番号６２、配列番号８９、
配列番号９０、配列番号９１及び配列番号１４８より選択される、第３のＨＡＶ標的領域
に特異的な少なくとも２つのオリゴマーを用いて；その後、第３のＨＡＶ標的領域の増幅
産物に特異的にハイブリダイズする少なくとも１つの検出プローブを用いる。第４のＨＡ
Ｖ標的領域中の配列を増幅する好ましい実施態様は、配列番号３３、配列番号６３、配列
番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６及び配列番号９７
より選択される、第４のＨＡＶ標的領域に特異的な少なくとも２つのオリゴマーを用いて
；その後、第４のＨＡＶ標的領域の増幅産物に特異的にハイブリダイズする少なくとも１
つの検出プローブを用いる。第５のＨＡＶ標的領域中の配列を増幅する好ましい実施態様
は、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番
号３９、配列番号４０、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配
列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号９７、配列番号１４９及び配列番号
１５０より選択される、第５のＨＡＶ標的領域に特異的な少なくとも２つのオリゴマーを
用いて；その後、第５のＨＡＶ標的領域の増幅産物に特異的にハイブリダイズする少なく
とも１つの検出プローブを用いる。第６のＨＡＶ標的領域中の配列を増幅する好ましい実
施態様は、配列番号４１、配列番号４２、配列番号７１、配列番号７２、配列番号９８、
配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１６１及び配列番号１６２より選択される、第
６のＨＡＶ標的領域に特異的な少なくとも２つのオリゴマーを用いて；その後、第６のＨ
ＡＶ標的領域の増幅産物に特異的にハイブリダイズする少なくとも１つの検出プローブを
用いる。第７のＨＡＶ標的領域中の配列を増幅する好ましい実施態様は、配列番号４３、
配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４
９、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番
号７８、配列番号７９、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１
０４、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１５２、配列番号１
５３、配列番号１５５、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１
６６、配列番号１６７及び配列番号１６８からなる群より選択される、第７のＨＡＶ標的
領域に特異的な少なくとも２つのオリゴマーを用いて；その後、第７のＨＡＶ標的領域の
増幅産物に特異的にハイブリダイズする少なくとも１つの検出プローブを用いる。
発明の詳細な説明
本発明としては、ＨＡＶに汚染されるおそれがある、ヒト由来の生物試料（例、糞便、
血液、血清、唾液、又は尿）、環境試料（例、水、土壌）、又は他の材料（例、食物）で
あり得る試料に存在するＨＡＶを検出する方法があげられる。本方法は、ＨＡＶゲノムの
領域をインビトロで増幅し、本増幅核酸中の配列へ特異的に結合するプローブを用いて本
増幅核酸を検出し、ＨＡＶ核酸配列の存在を検出することに基づく。本方法の１つの実施
態様としては、ＨＡＶゲノムの領域を増幅する工程の前に、ＨＡＶ核酸を試料から単離又
は精製する工程があげられる。本実施態様は、好ましくは、増幅するＨＡＶゲノムの領域
の外側の、ＨＡＶゲノム中の配列へ特異的に結合する捕捉オリゴマーを用いて、捕捉オリ
ゴマーと結合したＨＡＶ ＲＮＡから作られた複合体を、捕捉オリゴマーも結合する粒子
等の捕捉支持体を用いて他の試料成分から分離してＨＡＶゲノムＲＮＡを単離する。ＨＡ
Ｖゲノム配列の一部を増幅することは、ＨＡＶ ＲＮＡ又は相補配列へ特異的に結合する
１以上の増幅オリゴマーと、増幅オリゴマーを他のコピーの合成のためのプライマーとし
て用いてＨＡＶゲノム配列又は相補配列の一部の他のコピーを作製するためのインビトロ
酵素合成を用いる。好ましい実施態様は、定温増幅反応を用いて、ＨＡＶゲノム配列の一
部の他のコピーを作製することである。その後、本増幅核酸へ１以上のプローブオリゴマ
ーを特異的に結合させて、増幅配列へ結合したプローブオリゴマーより生じるシグナルを
検出して増幅ＨＡＶ配列を検出する。増幅ＨＡＶ配列へ結合したプローブオリゴマーから
生じるシグナルを検出すると試料中のＨＡＶの存在が示される。上記の方法は、ＨＡＶ感
染症をヒトで診断するために用いる生物試料、汚染源の使用又は消費に起因するＨＡＶの
拡散を防ぐためのＨＡＶで汚染された環境試料等の多様な試料中でＨＡＶの存在を検出す
るのに有用である。上記の方法はまた、ヒトの体液試料について、血清又は血漿等中のＨ
ＡＶの存在を試験して、輸血又は治療因子の製造でヒト体液を用いることに起因するその
後のＨＡＶ感染症を防ぐのに有用である。本発明の方法は、ヒトの組織又は臓器について
ＨＡＶの存在をスクリーニングして、移植治療においてそれらを用いないようにすること
にも有用である。このように、上記の方法は、ヒト組織に由来するヒトの試料又は製品に
おけるＨＡＶ汚染を検出するのに特に重要である。
本発明としては、ＨＡＶに汚染されるおそれがある、ヒト由来の生物試料（例、糞便、
血液、血清、唾液、又は尿）、環境試料（例、水、土壌）、又は他の材料（例、食物）で
あり得る試料に存在するＨＡＶを検出する方法があげられる。本方法は、ＨＡＶゲノムの
領域をインビトロで増幅し、本増幅核酸中の配列へ特異的に結合するプローブを用いて本
増幅核酸を検出し、ＨＡＶ核酸配列の存在を検出することに基づく。本方法の１つの実施
態様としては、ＨＡＶゲノムの領域を増幅する工程の前に、ＨＡＶ核酸を試料から単離又
は精製する工程があげられる。本実施態様は、好ましくは、増幅するＨＡＶゲノムの領域
の外側の、ＨＡＶゲノム中の配列へ特異的に結合する捕捉オリゴマーを用いて、捕捉オリ
ゴマーと結合したＨＡＶ ＲＮＡから作られた複合体を、捕捉オリゴマーも結合する粒子
等の捕捉支持体を用いて他の試料成分から分離してＨＡＶゲノムＲＮＡを単離する。ＨＡ
Ｖゲノム配列の一部を増幅することは、ＨＡＶ ＲＮＡ又は相補配列へ特異的に結合する
１以上の増幅オリゴマーと、増幅オリゴマーを他のコピーの合成のためのプライマーとし
て用いてＨＡＶゲノム配列又は相補配列の一部の他のコピーを作製するためのインビトロ
酵素合成を用いる。好ましい実施態様は、定温増幅反応を用いて、ＨＡＶゲノム配列の一
部の他のコピーを作製することである。その後、本増幅核酸へ１以上のプローブオリゴマ
ーを特異的に結合させて、増幅配列へ結合したプローブオリゴマーより生じるシグナルを
検出して増幅ＨＡＶ配列を検出する。増幅ＨＡＶ配列へ結合したプローブオリゴマーから
生じるシグナルを検出すると試料中のＨＡＶの存在が示される。上記の方法は、ＨＡＶ感
染症をヒトで診断するために用いる生物試料、汚染源の使用又は消費に起因するＨＡＶの
拡散を防ぐためのＨＡＶで汚染された環境試料等の多様な試料中でＨＡＶの存在を検出す
るのに有用である。上記の方法はまた、ヒトの体液試料について、血清又は血漿等中のＨ
ＡＶの存在を試験して、輸血又は治療因子の製造でヒト体液を用いることに起因するその
後のＨＡＶ感染症を防ぐのに有用である。本発明の方法は、ヒトの組織又は臓器について
ＨＡＶの存在をスクリーニングして、移植治療においてそれらを用いないようにすること
にも有用である。このように、上記の方法は、ヒト組織に由来するヒトの試料又は製品に
おけるＨＡＶ汚染を検出するのに特に重要である。
本発明としては、ＨＡＶ ＲＮＡ又はＨＡＶ ＲＮＡに由来する核酸（例、ＨＡＶ Ｒ
ＮＡより作製されるｃＤＮＡ又は増幅配列）に特異的にハイブリダイズするオリゴマー等
の核酸組成物があげられる。そのような組成物の１つには、ＨＡＶ ＲＮＡに特異的にハ
イブリダイズして、このハイブリダイズしたＨＡＶ ＲＮＡを捕捉支持体（捕捉されたＨ
ＡＶ ＲＮＡを他の試料成分から分離できるようにする）に付けて、試料等の複雑な混合
物からＨＡＶ ＲＮＡを精製するために用いる捕捉オリゴマーがあげられる。そのような
捕捉オリゴマーを用いる精製の方法を、一般に標的捕捉といい、ここではＨＡＶ ＲＮＡ
が特異的な標的核酸である。本発明の他のオリゴマーは、核酸増幅オリゴマーである（プ
ライマーという場合もある）。他の実施態様としては、ＨＡＶ ＲＮＡ又は増幅ＨＡＶ核
酸配列に特異的にハイブリダイズして、ＨＡＶ特異配列の存在を検出するシグナルを提供
する、プローブオリゴマーがあげられる。これらの核酸配列は、ＨＡＶ特異配列を捕捉、
増幅及び検出するのに有用なため、試料中のＨＡＶの存在を検出するため共に機能する。
ＮＡより作製されるｃＤＮＡ又は増幅配列）に特異的にハイブリダイズするオリゴマー等
の核酸組成物があげられる。そのような組成物の１つには、ＨＡＶ ＲＮＡに特異的にハ
イブリダイズして、このハイブリダイズしたＨＡＶ ＲＮＡを捕捉支持体（捕捉されたＨ
ＡＶ ＲＮＡを他の試料成分から分離できるようにする）に付けて、試料等の複雑な混合
物からＨＡＶ ＲＮＡを精製するために用いる捕捉オリゴマーがあげられる。そのような
捕捉オリゴマーを用いる精製の方法を、一般に標的捕捉といい、ここではＨＡＶ ＲＮＡ
が特異的な標的核酸である。本発明の他のオリゴマーは、核酸増幅オリゴマーである（プ
ライマーという場合もある）。他の実施態様としては、ＨＡＶ ＲＮＡ又は増幅ＨＡＶ核
酸配列に特異的にハイブリダイズして、ＨＡＶ特異配列の存在を検出するシグナルを提供
する、プローブオリゴマーがあげられる。これらの核酸配列は、ＨＡＶ特異配列を捕捉、
増幅及び検出するのに有用なため、試料中のＨＡＶの存在を検出するため共に機能する。
試料としては、ＨＡＶを含有する可能性があるあらゆる液体、又はＨＡＶを含有するか
又は表面に有する場合がある固形物があげられる。試料としては、例えば、水等の環境源
、ヒトの体液又は汚物等の生物源及び食品、包装材料、又は食品加工に用いる他の成分由
来のものがあげられる。生物試料には、ＨＡＶ又はＨＡＶ核酸を含有し得る、生きている
か死んだヒト由来のあらゆる組織又は材料があげられ、例えば、唾液、血液、血漿、血清
、生検組織、胃腸組織、尿、糞便、又は他の体液、組織又は材料があげられる。試料は、
標準法を用いてその物理状態を物理的又は機械的に破壊して処理し、ＨＡＶ粒子又はＨＡ
Ｖ ＲＮＡを水溶液又は溶媒へ放出させることもできる。
又は表面に有する場合がある固形物があげられる。試料としては、例えば、水等の環境源
、ヒトの体液又は汚物等の生物源及び食品、包装材料、又は食品加工に用いる他の成分由
来のものがあげられる。生物試料には、ＨＡＶ又はＨＡＶ核酸を含有し得る、生きている
か死んだヒト由来のあらゆる組織又は材料があげられ、例えば、唾液、血液、血漿、血清
、生検組織、胃腸組織、尿、糞便、又は他の体液、組織又は材料があげられる。試料は、
標準法を用いてその物理状態を物理的又は機械的に破壊して処理し、ＨＡＶ粒子又はＨＡ
Ｖ ＲＮＡを水溶液又は溶媒へ放出させることもできる。
核酸としては、骨格構造で結合された、少なくとも２つ、好ましくは１０以上の塩基か
ら構成されるＤＮＡ若しくはその類似体、ＲＮＡ若しくはその類似体、又は混合ＤＮＡ−
ＲＮＡポリマー又はオリゴマーがあげられる。ＤＮＡとＲＮＡは、共通の塩基（ＤＮＡで
は、Ａ、Ｔ、Ｇ及びＣ、そしてＲＮＡでは、Ａ、Ｇ、Ｃ及びＵ）から構成され得るが、塩
基類似体（例、イノシン）と非塩基位置（即ち、１以上の位置でヌクレオチドを欠くホス
ホジエステル骨格、例えば、米国特許第５，５８５，４８１号を参照）も本用語に含まれ
る。ポリマーが数百又は数千の長さのヌクレオチドであり得るのに対し、オリゴマーは、
一般に１０００以下の結合ヌクレオチドの核酸を意味し、しばしば２〜約１００の結合ヌ
クレオチドが含まれる。一般に、オリゴマーは、下限が約１０塩基で上限が約１５０塩基
の範囲の大きさ、好ましくは、約１５〜約７０塩基の範囲の大きさが該当する。オリゴマ
ーは、天然に存在する生物源から精製できるが、好ましくは、いかなる様々な周知の酵素
法又は化学法をも用いてインビトロで合成する（例、Caruthers et al., 1987, Methods
in Enzymol.,154: 287）。
ら構成されるＤＮＡ若しくはその類似体、ＲＮＡ若しくはその類似体、又は混合ＤＮＡ−
ＲＮＡポリマー又はオリゴマーがあげられる。ＤＮＡとＲＮＡは、共通の塩基（ＤＮＡで
は、Ａ、Ｔ、Ｇ及びＣ、そしてＲＮＡでは、Ａ、Ｇ、Ｃ及びＵ）から構成され得るが、塩
基類似体（例、イノシン）と非塩基位置（即ち、１以上の位置でヌクレオチドを欠くホス
ホジエステル骨格、例えば、米国特許第５，５８５，４８１号を参照）も本用語に含まれ
る。ポリマーが数百又は数千の長さのヌクレオチドであり得るのに対し、オリゴマーは、
一般に１０００以下の結合ヌクレオチドの核酸を意味し、しばしば２〜約１００の結合ヌ
クレオチドが含まれる。一般に、オリゴマーは、下限が約１０塩基で上限が約１５０塩基
の範囲の大きさ、好ましくは、約１５〜約７０塩基の範囲の大きさが該当する。オリゴマ
ーは、天然に存在する生物源から精製できるが、好ましくは、いかなる様々な周知の酵素
法又は化学法をも用いてインビトロで合成する（例、Caruthers et al., 1987, Methods
in Enzymol.,154: 287）。
「核酸骨格」は、当該技術分野で公知の基又は結合（Eschenmoser, 1999, Science 284
: 2118-2124）、例えば、糖−ホスホジエステル結合、２’−Ｏ−メチル結合、ＤＮＡ中
のグアニジンリンカー（「ＤＮＧ」）、Ｓ−メチルチオ尿素リンカー、メチルホスホネー
ト結合、ホスホロアミデート結合、ポリアミド又はペプチド核酸（ＰＮＡ）等のアミド骨
格修飾物、ホスホロチオエート結合、ホスホン酸エステル核酸結合、ピラノシルオリゴヌ
クレオチド結合、ビシクロ及びトリシクロ核酸結合、ホルムアセタール及び３’−チオホ
ルムアセタール結合、モルホリノ結合又は天然のホスホジエステルヌクレオシド間結合の
他の修飾物又はこれらの組合せをいう（Majlessi et al., 1998, Nucl. Acid Res. 26(9)
: 2224-2229;Dempcy et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 6097-6101; Brow
ne et al.,1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 7051-7055; Arya & Bruice, 1998,
J. Am. Chem.Soc. 120: 6619-6620; Reynolds et al., 1996, Nucl. Acids Res. 24(22)
: 4584-4591;Gryaznov & Chen, 1994, Am. Chem. Soc. 116: 3143-3144; Chaturvedi et
al.,1996, Nucl. Acids Res. 24(12): 2318-2323; Hyrup & Nielsen, 1996, Bioorg.&
Med.Chem. 4: 5-23; Hydig-Hielsen et al., ＰＣＴ特許出願ＷＯ９５／３２３０５：M
esmaekerら, Syn.Lett., Nov. 1997: 1287-1290; Peyman et al., 1996, Angew. Chem..
Int. Ed.Engl. 35(22): 2636-2638; Aerschot et al., 1995, Angew. Chem.. Int. Ed.
Engl.34(12): 1338-1339; Koshkin et al., 1998, J. Am. Chem. Soc. 120: 13252-132
53; Steffens& Leumann, 1997, J. Am. Chem. Soc. 119: 11548-11549; Jones et al.,
1993, J. Org.Chem. 58: 2983-2991; Summerton & Weller, 1997, Antisense & Nucl. A
cid Drug Dev.7: 187-195; Stirchak et al., 1989, Nucl. Acids Res. 17(15): 6129-6
141）。核酸骨格としては、同じオリゴマー又はポリマーの結合の混合物（例、鎖中１以
上の糖−ホスホジエステル結合と１以上の２’−Ｏ−メチル結合）があっても、鎖全体で
同じ結合（例、全て２’−Ｏ−メチル、又は全てアミド修飾の結合）があってもよい。
: 2118-2124）、例えば、糖−ホスホジエステル結合、２’−Ｏ−メチル結合、ＤＮＡ中
のグアニジンリンカー（「ＤＮＧ」）、Ｓ−メチルチオ尿素リンカー、メチルホスホネー
ト結合、ホスホロアミデート結合、ポリアミド又はペプチド核酸（ＰＮＡ）等のアミド骨
格修飾物、ホスホロチオエート結合、ホスホン酸エステル核酸結合、ピラノシルオリゴヌ
クレオチド結合、ビシクロ及びトリシクロ核酸結合、ホルムアセタール及び３’−チオホ
ルムアセタール結合、モルホリノ結合又は天然のホスホジエステルヌクレオシド間結合の
他の修飾物又はこれらの組合せをいう（Majlessi et al., 1998, Nucl. Acid Res. 26(9)
: 2224-2229;Dempcy et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 6097-6101; Brow
ne et al.,1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 7051-7055; Arya & Bruice, 1998,
J. Am. Chem.Soc. 120: 6619-6620; Reynolds et al., 1996, Nucl. Acids Res. 24(22)
: 4584-4591;Gryaznov & Chen, 1994, Am. Chem. Soc. 116: 3143-3144; Chaturvedi et
al.,1996, Nucl. Acids Res. 24(12): 2318-2323; Hyrup & Nielsen, 1996, Bioorg.&
Med.Chem. 4: 5-23; Hydig-Hielsen et al., ＰＣＴ特許出願ＷＯ９５／３２３０５：M
esmaekerら, Syn.Lett., Nov. 1997: 1287-1290; Peyman et al., 1996, Angew. Chem..
Int. Ed.Engl. 35(22): 2636-2638; Aerschot et al., 1995, Angew. Chem.. Int. Ed.
Engl.34(12): 1338-1339; Koshkin et al., 1998, J. Am. Chem. Soc. 120: 13252-132
53; Steffens& Leumann, 1997, J. Am. Chem. Soc. 119: 11548-11549; Jones et al.,
1993, J. Org.Chem. 58: 2983-2991; Summerton & Weller, 1997, Antisense & Nucl. A
cid Drug Dev.7: 187-195; Stirchak et al., 1989, Nucl. Acids Res. 17(15): 6129-6
141）。核酸骨格としては、同じオリゴマー又はポリマーの結合の混合物（例、鎖中１以
上の糖−ホスホジエステル結合と１以上の２’−Ｏ−メチル結合）があっても、鎖全体で
同じ結合（例、全て２’−Ｏ−メチル、又は全てアミド修飾の結合）があってもよい。
「標的」、「標的配列」、又は「標的核酸」は、例えば、標準的な相補塩基対合を用い
て他の核酸が結合する大きな配列（例、１０００ｎｔより大きい）又はより大きな核酸内
のより小さな配列を意味する場合がある。標的核酸は、天然の又は合成して作製された、
ＲＮＡでもＤＮＡでもよい。例えば、標的は、ＨＡＶゲノム等の比較的大きな核酸でも、
あるいは標的は、ＨＡＶ ＲＮＡに含まれるより小さなサブ配列、その相補体、又はそれ
から作製される増幅産物でもよく、オリゴマー中の他の配列に特異的に結合する。当業者
であれば、標的核酸がどのような形態でも、例えばセンス又はアンチセンス（＋又は−）
鎖で存在しうることを理解するであろう。
て他の核酸が結合する大きな配列（例、１０００ｎｔより大きい）又はより大きな核酸内
のより小さな配列を意味する場合がある。標的核酸は、天然の又は合成して作製された、
ＲＮＡでもＤＮＡでもよい。例えば、標的は、ＨＡＶゲノム等の比較的大きな核酸でも、
あるいは標的は、ＨＡＶ ＲＮＡに含まれるより小さなサブ配列、その相補体、又はそれ
から作製される増幅産物でもよく、オリゴマー中の他の配列に特異的に結合する。当業者
であれば、標的核酸がどのような形態でも、例えばセンス又はアンチセンス（＋又は−）
鎖で存在しうることを理解するであろう。
「相補的な核酸」(又は、核酸相補性)とは、官能基の配向により、例えばＡとＴ又はＵ
塩基の間、そしてＣとＧ塩基の間の水素結合により、対向する鎖中の塩基配列に結合する
核酸の一方の鎖の塩基配列を意味する。「実質的に相補的な」とは、一方の鎖の塩基配列
が対向する鎖の塩基配列に対して全て又は完全には相補的でないが、２つの鎖の塩基間に
十分な結合がおこり、ある一連の条件（例えば、水溶液中の塩濃度、又は温度）で安定し
たハイブリダイズ複合体を形成することを意味する。そのような条件は、その塩基配列と
、ハイブリダイズした鎖の５０％が変性する融解温度（Ｔｍ）を決定するための当業者に
公知の標準的数理計算を用いて、又は定型的な方法を用いて経験的にＴｍを決定して予測
できる（例えば、Sambrooket al.,（Molecular Cloning, A Laboratory Manual）第２版
（コールドスプリングハーバーラボラトリー、ニューヨーク州コールドスプリングハーバ
ー、1989）の9.50-51、11.46-49、11.55-57 を参照）。
塩基の間、そしてＣとＧ塩基の間の水素結合により、対向する鎖中の塩基配列に結合する
核酸の一方の鎖の塩基配列を意味する。「実質的に相補的な」とは、一方の鎖の塩基配列
が対向する鎖の塩基配列に対して全て又は完全には相補的でないが、２つの鎖の塩基間に
十分な結合がおこり、ある一連の条件（例えば、水溶液中の塩濃度、又は温度）で安定し
たハイブリダイズ複合体を形成することを意味する。そのような条件は、その塩基配列と
、ハイブリダイズした鎖の５０％が変性する融解温度（Ｔｍ）を決定するための当業者に
公知の標準的数理計算を用いて、又は定型的な方法を用いて経験的にＴｍを決定して予測
できる（例えば、Sambrooket al.,（Molecular Cloning, A Laboratory Manual）第２版
（コールドスプリングハーバーラボラトリー、ニューヨーク州コールドスプリングハーバ
ー、1989）の9.50-51、11.46-49、11.55-57 を参照）。
「ハイブリダイゼーション条件」とは、１つの核酸鎖が相補的な鎖相互作用により第２
の核酸鎖に結合してハイブリダイゼーション複合体を産生する、累積的な環境を意味する
。そのような条件としては、例えば、温度、化学成分、核酸を含有する水溶液及び／又は
有機溶液の化合物（例、塩類、緩衝剤、キレート剤、有機化合物）の濃度があげられる。
インキュベーション時間や反応チャンバの容量といった他の因子も、当業者に周知のハイ
ブリダイゼーション条件の一因となる場合がある（例えば、Sambrook et al., 同上、1.9
0-1.91、9.47-9.51、11.47-11.57を参照）。
の核酸鎖に結合してハイブリダイゼーション複合体を産生する、累積的な環境を意味する
。そのような条件としては、例えば、温度、化学成分、核酸を含有する水溶液及び／又は
有機溶液の化合物（例、塩類、緩衝剤、キレート剤、有機化合物）の濃度があげられる。
インキュベーション時間や反応チャンバの容量といった他の因子も、当業者に周知のハイ
ブリダイゼーション条件の一因となる場合がある（例えば、Sambrook et al., 同上、1.9
0-1.91、9.47-9.51、11.47-11.57を参照）。
「標識」とは、検出可能か又は、例えば、シグナルを産生する反応を触媒して検出でき
る応答を直接的又は間接的におこす分子部分をいう。標識としては、発光部分（例えば、
蛍光性、生物発光性、又は化学発光性の化合物）、放射性同位体、結合対メンバー（例、
ビオチン及びアビジン又はストレプタビジン）、酵素又は酵素基質、反応基又は例えば、
色素や検出可能な色をもたらす粒子等の発色団があげられる。検出可能な応答又はシグナ
ルは、例えば、光、色、放射性崩壊放射、電気シグナル、磁場又は消光又は混濁等のシグ
ナル妨害等の標識の存在を示すあらゆる認知可能又は測定可能な出力である。
る応答を直接的又は間接的におこす分子部分をいう。標識としては、発光部分（例えば、
蛍光性、生物発光性、又は化学発光性の化合物）、放射性同位体、結合対メンバー（例、
ビオチン及びアビジン又はストレプタビジン）、酵素又は酵素基質、反応基又は例えば、
色素や検出可能な色をもたらす粒子等の発色団があげられる。検出可能な応答又はシグナ
ルは、例えば、光、色、放射性崩壊放射、電気シグナル、磁場又は消光又は混濁等のシグ
ナル妨害等の標識の存在を示すあらゆる認知可能又は測定可能な出力である。
「固定化オリゴマー又はプローブ」とは、捕捉支持体マトリックスへ共有的又は非共有
的に結合又は付着するオリゴマーを意味し、標的核酸を含有する捕捉ハイブリッドを捕捉
支持体へ結合させる手段を提供する。好ましい固定化プローブは、標的核酸へ直接的又は
間接的に結合して、結合した標的核酸を非結合の試料材料から分離することを促進するオ
リゴマーである。１つの実施態様では、ハイブリダイゼーション複合体で標的と固定化プ
ローブを結合させる捕捉プローブを介して、標的を固定化プローブに間接的に結合させる
（米国特許第６，１１０，６７８及び６，２８０，９５２号、Weisburgらを参照）。例え
ば、ニトロセルロース、ナイロン、ガラス、ポリアクリレート、混合ポリマー、ポリスチ
レン、シランポリプロピレン及び磁気材料より作製されるマトリックス又は粒子等のあら
ゆる多様な支持体が用いられる。磁力を加えて溶液から容易に回収され得る相対的に均一
な大きさの単分散性磁気球体は、支持体の好ましい実施態様である。
的に結合又は付着するオリゴマーを意味し、標的核酸を含有する捕捉ハイブリッドを捕捉
支持体へ結合させる手段を提供する。好ましい固定化プローブは、標的核酸へ直接的又は
間接的に結合して、結合した標的核酸を非結合の試料材料から分離することを促進するオ
リゴマーである。１つの実施態様では、ハイブリダイゼーション複合体で標的と固定化プ
ローブを結合させる捕捉プローブを介して、標的を固定化プローブに間接的に結合させる
（米国特許第６，１１０，６７８及び６，２８０，９５２号、Weisburgらを参照）。例え
ば、ニトロセルロース、ナイロン、ガラス、ポリアクリレート、混合ポリマー、ポリスチ
レン、シランポリプロピレン及び磁気材料より作製されるマトリックス又は粒子等のあら
ゆる多様な支持体が用いられる。磁力を加えて溶液から容易に回収され得る相対的に均一
な大きさの単分散性磁気球体は、支持体の好ましい実施態様である。
「捕捉オリゴマー又はプローブ」とは、即ち、標的配列へ結合する標的特異部分と捕捉
プローブを固定化プローブへ付ける部分を用いて、標的核酸と固定化プローブを結合する
。１つの実施態様では、両方の付着が相補塩基配列のハイブリダイゼーション、即ち、捕
捉プローブの標的相補配列と標的配列のハイブリダイゼーションと、捕捉プローブの他の
部分の固定化プローブの相補配列へのハイブリダイゼーションに起因する。他の実施態様
では、当該技術分野で周知の特異結合対メンバー（例、ビオチン及びアビジン又はストレ
プタビジン）を用いて１以上の付着が起こり得る。捕捉プローブを用いる組成物及び方法
は公知である（米国特許第６，１１０，６７８号）。
プローブを固定化プローブへ付ける部分を用いて、標的核酸と固定化プローブを結合する
。１つの実施態様では、両方の付着が相補塩基配列のハイブリダイゼーション、即ち、捕
捉プローブの標的相補配列と標的配列のハイブリダイゼーションと、捕捉プローブの他の
部分の固定化プローブの相補配列へのハイブリダイゼーションに起因する。他の実施態様
では、当該技術分野で周知の特異結合対メンバー（例、ビオチン及びアビジン又はストレ
プタビジン）を用いて１以上の付着が起こり得る。捕捉プローブを用いる組成物及び方法
は公知である（米国特許第６，１１０，６７８号）。
「分離すること」又は「精製すること」とは、試料の１以上の成分を他の試料成分から
取り出すことを意味する。試料成分としては、タンパク質、炭水化物、脂質及び他の化合
物等の材料をあげてもよい。一般に水溶液相中の核酸があげられる。好ましくは、核酸を
分離するか又は精製して、少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約９０％、な
おより好ましくは、少なくとも約９５％の核酸が他の試料成分から取り出される。
取り出すことを意味する。試料成分としては、タンパク質、炭水化物、脂質及び他の化合
物等の材料をあげてもよい。一般に水溶液相中の核酸があげられる。好ましくは、核酸を
分離するか又は精製して、少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約９０％、な
おより好ましくは、少なくとも約９５％の核酸が他の試料成分から取り出される。
増幅オリゴヌクレオチド又はオリゴマーは、標的核酸又はその相補配列へハイブリダイ
ズして、核酸のインビトロ合成のプライマーとしての目的を果たすことにより核酸増幅反
応に関わるオリゴマーをいう。増幅オリゴマーは、プロモータープライマーというオリゴ
マーでＲＮＡポリメラーゼに結合するプロモーター配列等の他の機能配列を含有できる。
一般に、増幅オリゴヌクレオチドは、標的配列（又はその相補鎖）に相補的な、少なくと
も約１０の連続塩基、好ましくは少なくとも約１２の連続塩基を含有する。本連続塩基は
、増幅オリゴマーへ結合する配列に対して、好ましくは少なくとも約８０％、より好まし
くは少なくとも約９０％、そして最も好ましくは約１００％相補的である。増幅オリゴマ
ーは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、又は混合ＤＮＡ−ＲＮＡでもよく、場合によっては、修飾された
ヌクレオチド又は骨格結合を含んでいてもよい。
ズして、核酸のインビトロ合成のプライマーとしての目的を果たすことにより核酸増幅反
応に関わるオリゴマーをいう。増幅オリゴマーは、プロモータープライマーというオリゴ
マーでＲＮＡポリメラーゼに結合するプロモーター配列等の他の機能配列を含有できる。
一般に、増幅オリゴヌクレオチドは、標的配列（又はその相補鎖）に相補的な、少なくと
も約１０の連続塩基、好ましくは少なくとも約１２の連続塩基を含有する。本連続塩基は
、増幅オリゴマーへ結合する配列に対して、好ましくは少なくとも約８０％、より好まし
くは少なくとも約９０％、そして最も好ましくは約１００％相補的である。増幅オリゴマ
ーは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、又は混合ＤＮＡ−ＲＮＡでもよく、場合によっては、修飾された
ヌクレオチド又は骨格結合を含んでいてもよい。
プライマーは、鋳型核酸にハイブリダイズして、酵素により触媒される重合化反応にお
いて伸長され得る末端（通常、３’）を有するオリゴヌクレオチドをいう。プライマーの
５’領域は、例えば、標的配列にない５’プロモーター配列を含むプロモータープライマ
ー中等のように、標的核酸に相補的でなくてもよい。当業者であれば、プロモータープラ
イマーがそのプロモーター配列から独立したプライマーとして（即ち、プロモーター配列
の有無に関わらず）機能し得ること、そしてどの増幅オリゴマーも５’プロモーター配列
を含むように修飾し、それによりプロモータープライマーとして機能し得ることを理解す
るであろう。
いて伸長され得る末端（通常、３’）を有するオリゴヌクレオチドをいう。プライマーの
５’領域は、例えば、標的配列にない５’プロモーター配列を含むプロモータープライマ
ー中等のように、標的核酸に相補的でなくてもよい。当業者であれば、プロモータープラ
イマーがそのプロモーター配列から独立したプライマーとして（即ち、プロモーター配列
の有無に関わらず）機能し得ること、そしてどの増幅オリゴマーも５’プロモーター配列
を含むように修飾し、それによりプロモータープライマーとして機能し得ることを理解す
るであろう。
「増幅」は、標的配列、その相補体、又はそれらの断片のコピーを多数入手するための
あらゆる公知の手順をいう。断片の増幅は、完全な標的核酸配列又はその相補体よりも小
さいものを含有する増幅核酸の産生、例えば、完全なＨＡＶゲノムの一部の増幅等をいう
。完全な標的の断片又は一部の増幅は、標的核酸の内部位置にハイブリダイズして、重合
化を開始する増幅オリゴマーを用いることに起因する。公知の増幅法としては、例えば、
転写仲介増幅（ＴＭＡ）、レプリカーゼ仲介増幅、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リ
ガーゼ連鎖反応（ＬＣＰ）及び鎖置換増幅（ＳＤＡ）があげられる。レプリカーゼ仲介増
幅は、自己複製するＲＮＡ分子と、ＱＢ−レプリカーゼ等のレプリカーゼを用いる（例え
ば、米国特許第４，７８６，６００号、Krameら）。ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラーゼ、多
重プライマー及び熱サイクリングを用いて、ＤＮＡ又はｃＤＮＡの２つの相補鎖のコピー
を多数合成する（例、米国特許第４，６８３，１９５号、４，６８３，２０２号及び４，
８００，１５９号、Mullisら）。ＬＣＲは、少なくとも４つの異なるオリゴマーを用いて
、ハイブリダイゼーション、ライゲーション及び変性の多重サイクルを用いて標的とその
相補鎖を増幅する（例、米国特許第５，４２７，９３０号、Biekenmeyerら及び５，４９
４，８１０号、Baranyら）。ＳＤＡは、制限エンドヌクレアーゼの認識部位を含有するプ
ライマーを用いるが、本エンドヌクレアーゼは、標的配列を含むヘミ修飾化ＤＮＡ二重鎖
の１つの鎖に切れ目を入れて、一連のプライマー伸長及び鎖置換の工程を続ける（例、米
国特許第５，４２２，２５２号、Walkerら）。転写仲介性又は転写結合性の増幅反応は、
ポリメラーゼを用いて定温で循環し、検出可能な増幅産物となる転写産物の他のコピーを
産生できる転写産物を作製する特異的なＲＮＡポリメラーゼの機能的なプライマーを含有
する、標的への相補鎖を二本鎖の形態で作製する。
あらゆる公知の手順をいう。断片の増幅は、完全な標的核酸配列又はその相補体よりも小
さいものを含有する増幅核酸の産生、例えば、完全なＨＡＶゲノムの一部の増幅等をいう
。完全な標的の断片又は一部の増幅は、標的核酸の内部位置にハイブリダイズして、重合
化を開始する増幅オリゴマーを用いることに起因する。公知の増幅法としては、例えば、
転写仲介増幅（ＴＭＡ）、レプリカーゼ仲介増幅、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リ
ガーゼ連鎖反応（ＬＣＰ）及び鎖置換増幅（ＳＤＡ）があげられる。レプリカーゼ仲介増
幅は、自己複製するＲＮＡ分子と、ＱＢ−レプリカーゼ等のレプリカーゼを用いる（例え
ば、米国特許第４，７８６，６００号、Krameら）。ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラーゼ、多
重プライマー及び熱サイクリングを用いて、ＤＮＡ又はｃＤＮＡの２つの相補鎖のコピー
を多数合成する（例、米国特許第４，６８３，１９５号、４，６８３，２０２号及び４，
８００，１５９号、Mullisら）。ＬＣＲは、少なくとも４つの異なるオリゴマーを用いて
、ハイブリダイゼーション、ライゲーション及び変性の多重サイクルを用いて標的とその
相補鎖を増幅する（例、米国特許第５，４２７，９３０号、Biekenmeyerら及び５，４９
４，８１０号、Baranyら）。ＳＤＡは、制限エンドヌクレアーゼの認識部位を含有するプ
ライマーを用いるが、本エンドヌクレアーゼは、標的配列を含むヘミ修飾化ＤＮＡ二重鎖
の１つの鎖に切れ目を入れて、一連のプライマー伸長及び鎖置換の工程を続ける（例、米
国特許第５，４２２，２５２号、Walkerら）。転写仲介性又は転写結合性の増幅反応は、
ポリメラーゼを用いて定温で循環し、検出可能な増幅産物となる転写産物の他のコピーを
産生できる転写産物を作製する特異的なＲＮＡポリメラーゼの機能的なプライマーを含有
する、標的への相補鎖を二本鎖の形態で作製する。
転写仲介又は転写結合性の増幅は、ＲＮＡポリメラーゼを用いた、ＲＮＡポリメラーゼ
、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリブヌクレオシド三リン酸、リボヌクレオシド三リン酸
及びプロモータープライマーを用いて、場合によっては、１以上の他のオリゴヌクレオチ
ドを含んでいてもよい定温反応で核酸鋳型より多数のＲＮＡ転写産物を生成する。上記の
増幅の方法と反応条件は、すでに詳しく記載されている（例えば、米国特許第５，３９９
，４９１号及び５，５５４，５１６号、Kacianら、米国特許第５，４３７，９９０号、Bu
rgら、ＰＣＴ番号ＷＯ８８／０１３０２及びＷＯ／１０３１５、Gingerasら、米国特許第
５，１３０，２３８号、Malekら、米国特許第４，８６８，１０５号及び５，１２４，２
４６号、Urdeaらを参照）。
、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリブヌクレオシド三リン酸、リボヌクレオシド三リン酸
及びプロモータープライマーを用いて、場合によっては、１以上の他のオリゴヌクレオチ
ドを含んでいてもよい定温反応で核酸鋳型より多数のＲＮＡ転写産物を生成する。上記の
増幅の方法と反応条件は、すでに詳しく記載されている（例えば、米国特許第５，３９９
，４９１号及び５，５５４，５１６号、Kacianら、米国特許第５，４３７，９９０号、Bu
rgら、ＰＣＴ番号ＷＯ８８／０１３０２及びＷＯ／１０３１５、Gingerasら、米国特許第
５，１３０，２３８号、Malekら、米国特許第４，８６８，１０５号及び５，１２４，２
４６号、Urdeaらを参照）。
本発明の好ましい実施態様は、転写仲介増幅（米国特許第５，３９９，４９１及び５，
５５４，５１６号に記載のＴＭＡ）を用いる。しかしながら、当業者であれば、本明細書
に記載の方法及びオリゴヌクレオチドプライマーを、ポリメラーゼを用いてプライマーを
合成的に伸長させるあらゆる核酸増幅法と共に適用できることは明らかであろう。
５５４，５１６号に記載のＴＭＡ）を用いる。しかしながら、当業者であれば、本明細書
に記載の方法及びオリゴヌクレオチドプライマーを、ポリメラーゼを用いてプライマーを
合成的に伸長させるあらゆる核酸増幅法と共に適用できることは明らかであろう。
「検出プローブ」は、特異的な標的配列へ結合するオリゴマーであり、結合によって、
標的配列の存在を示す検出可能シグナルを直接的又は間接的に産生する。検出プローブは
、プローブが標的へ結合して生じる電気インパルス等の検出可能シグナルを産生するため
に標識する必要はない。標識化プローブは、標識へ直接的又は間接的に結合したオリゴマ
ーから構成される。標識化プローブを作製する及び／又は用いる方法は周知である（例、
Sambrookら、同上、第10章；米国特許第６，３６１，９４５号、Beckerら;５，６５８，
７３７号、Nelsonら;５，６５６，２０７号、Woodheadら;５，５４７，８４２号、Hogan
ら;５，２８３，１７４号、Arnoldら;４，５８１，３３３号、Kourilskyら；及び５，７
３１，１４８号、Beckerら）。検出プローブとしては、合成リンカー（米国特許第５，５
８５，４８１号及び５，６３９，６０４号、Arnoldら）と、アクリジニウムエステル（Ａ
Ｅ）化合物等の化学発光標識（米国特許第５，１８５，４３９号、５，６５６，２０７号
及び５，６５８，７３７号）があげられる。
標的配列の存在を示す検出可能シグナルを直接的又は間接的に産生する。検出プローブは
、プローブが標的へ結合して生じる電気インパルス等の検出可能シグナルを産生するため
に標識する必要はない。標識化プローブは、標識へ直接的又は間接的に結合したオリゴマ
ーから構成される。標識化プローブを作製する及び／又は用いる方法は周知である（例、
Sambrookら、同上、第10章；米国特許第６，３６１，９４５号、Beckerら;５，６５８，
７３７号、Nelsonら;５，６５６，２０７号、Woodheadら;５，５４７，８４２号、Hogan
ら;５，２８３，１７４号、Arnoldら;４，５８１，３３３号、Kourilskyら；及び５，７
３１，１４８号、Beckerら）。検出プローブとしては、合成リンカー（米国特許第５，５
８５，４８１号及び５，６３９，６０４号、Arnoldら）と、アクリジニウムエステル（Ａ
Ｅ）化合物等の化学発光標識（米国特許第５，１８５，４３９号、５，６５６，２０７号
及び５，６５８，７３７号）があげられる。
「同種（homogeneous）検出可能標識」は、標識が標的へ結合しているか又は非結合で
あるかに依存する同種の態様で検出され得る標識である。即ち、同種反応における標識の
検出は、シグナルが検出される混合物から標識の非結合体を物理的に分離しなくてもよい
。当業者であれば、均質な反応が、溶液中でも、アレイ、バイオチップ、又は遺伝子チッ
プ上等の支持体上でも起こり得ることを理解するであろう。同種検出可能標識とその検出
条件は周知である（例えば、米国特許第５，２８３，１７４号、５，６５６，２０７号及
び５，６５８，７３７号）。
あるかに依存する同種の態様で検出され得る標識である。即ち、同種反応における標識の
検出は、シグナルが検出される混合物から標識の非結合体を物理的に分離しなくてもよい
。当業者であれば、均質な反応が、溶液中でも、アレイ、バイオチップ、又は遺伝子チッ
プ上等の支持体上でも起こり得ることを理解するであろう。同種検出可能標識とその検出
条件は周知である（例えば、米国特許第５，２８３，１７４号、５，６５６，２０７号及
び５，６５８，７３７号）。
「から本質的になる」とは、本発明の基本的で新規の特性を実質的に変えない他の成分
（複数）、組成物（複数）、又は方法工程（複数）を、本発明の組成物、キット、又は方
法に含めうることをいう。本特性としては、本明細書に記載した捕捉プローブ、増幅プラ
イマー及び検出プローブの組合せを用いて、１ｍｌにつき２５〜３０コピーのＨＡＶを含
有する試料について少なくとも８０％の感度で試料中のＨＡＶ核酸の存在を特異的に検出
する能力があげられる。本明細書に記載の核酸オリゴマーとインビトロの方法を用いて、
試料中に存在するＨＡＶの検出の特異性及び／又は感度に実質的に影響を及ぼすいかなる
成分（複数）、組成物（複数）、又は方法工程（複数）も、本用語には該当しない。
（複数）、組成物（複数）、又は方法工程（複数）を、本発明の組成物、キット、又は方
法に含めうることをいう。本特性としては、本明細書に記載した捕捉プローブ、増幅プラ
イマー及び検出プローブの組合せを用いて、１ｍｌにつき２５〜３０コピーのＨＡＶを含
有する試料について少なくとも８０％の感度で試料中のＨＡＶ核酸の存在を特異的に検出
する能力があげられる。本明細書に記載の核酸オリゴマーとインビトロの方法を用いて、
試料中に存在するＨＡＶの検出の特異性及び／又は感度に実質的に影響を及ぼすいかなる
成分（複数）、組成物（複数）、又は方法工程（複数）も、本用語には該当しない。
他に定義しなければ、本明細書に用いる全ての科学及び技術用語は、通常当業者が理解
するのと同じ意味である。本明細書で用いる用語の定義の多くは、例えば、「Dictionary
ofMicrobiology and Molecular Biology」第２版（Singleton et al., 1994, ジョン・
ウィリー・アンド・サンズ、ニューヨーク州ニューヨーク）、「The Encyclopedia of Mo
lecular Biology」（Kendrew,Ed., 1994, Blackwell Science 社、マサチューセッツ州
ケンブリッジ）、又はThe Harper Collins Dictionary of Biology」（Hale and Marham,
1991, HarperPerennial, ニューヨーク州ニューヨーク）から提供される。他に言及し
なければ、本明細書で利用又は考慮する技術は、当業者に周知の標準的方法論である。実
施例をあげて好ましい実施態様を例示する。
するのと同じ意味である。本明細書で用いる用語の定義の多くは、例えば、「Dictionary
ofMicrobiology and Molecular Biology」第２版（Singleton et al., 1994, ジョン・
ウィリー・アンド・サンズ、ニューヨーク州ニューヨーク）、「The Encyclopedia of Mo
lecular Biology」（Kendrew,Ed., 1994, Blackwell Science 社、マサチューセッツ州
ケンブリッジ）、又はThe Harper Collins Dictionary of Biology」（Hale and Marham,
1991, HarperPerennial, ニューヨーク州ニューヨーク）から提供される。他に言及し
なければ、本明細書で利用又は考慮する技術は、当業者に周知の標準的方法論である。実
施例をあげて好ましい実施態様を例示する。
本発明としては、試料中のＨＡＶ核酸を検出するための組成物（核酸増幅オリゴマー、
検出プローブ及び場合によっては捕捉オリゴマー）と方法があげられる。本明細書に開示
するオリゴマーとしての使用に適した配列を選択するために、公知のデータベース（例え
ば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＢ０２０５６４〜ＡＢ０２０５６９）で利用可能な異なる
単離物のゲノム配列、部分配列及び相補配列を含む、公知のＨＡＶゲノム配列（Beneduce
, et al., 1995,Virus Res. 36(2-3): 299-309；Fujiwara, et al., 2001, J. Hepatol.
35(1):112-119；Hu et al., 2002, Acta Virol. 46(3): 153-157）を、同一又は類似の
配列の領域を適合させて並置し、周知技術を用いて並置した配列を比較した。配列比較は
アルゴリズムを用いれば容易となり得るが、当業者であれば、そのような比較をマニュア
ルで目視で容易に実施できる。比較配列間で配列変異が比較的少ないＨＡＶ配列の部分を
、本明細書に記載の捕捉、増幅及び検出工程での使用に適した合成オリゴマーを設計する
ための基礎として選択した。オリゴマー配列を選択する場合、ＧＣ含量や予測される二次
構造（例、ヘアピンターン又は分子内対合）の相対存在度といった、他の周知の配列特性
も考慮した。
検出プローブ及び場合によっては捕捉オリゴマー）と方法があげられる。本明細書に開示
するオリゴマーとしての使用に適した配列を選択するために、公知のデータベース（例え
ば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＢ０２０５６４〜ＡＢ０２０５６９）で利用可能な異なる
単離物のゲノム配列、部分配列及び相補配列を含む、公知のＨＡＶゲノム配列（Beneduce
, et al., 1995,Virus Res. 36(2-3): 299-309；Fujiwara, et al., 2001, J. Hepatol.
35(1):112-119；Hu et al., 2002, Acta Virol. 46(3): 153-157）を、同一又は類似の
配列の領域を適合させて並置し、周知技術を用いて並置した配列を比較した。配列比較は
アルゴリズムを用いれば容易となり得るが、当業者であれば、そのような比較をマニュア
ルで目視で容易に実施できる。比較配列間で配列変異が比較的少ないＨＡＶ配列の部分を
、本明細書に記載の捕捉、増幅及び検出工程での使用に適した合成オリゴマーを設計する
ための基礎として選択した。オリゴマー配列を選択する場合、ＧＣ含量や予測される二次
構造（例、ヘアピンターン又は分子内対合）の相対存在度といった、他の周知の配列特性
も考慮した。
上記の解析に基づいて、ヌクレオチド２００、３７００、４７００、５７００、５８０
０、６０００及び７０００付近のＨＡＶゲノムの領域を増幅ＨＡＶ配列の検出に見込みが
ありそうな標的領域として選択した。各領域について、他の試料成分から、増幅オリゴマ
ーとして、そしてプローブ配列として精製するために試料からＨＡＶ ＲＮＡを捕捉する
のに用いるためのオリゴマーを設計した。標的領域の好ましい実施態様としては、ＨＡＶ
ゲノムの０〜３０５ｎｔ、４７１４〜４７６５ｎｔ、５４９５〜５７８８ｎｔ、５７８８
〜６０６９ｎｔ及び６９５２〜７４１３ｎｔの部分である。
０、６０００及び７０００付近のＨＡＶゲノムの領域を増幅ＨＡＶ配列の検出に見込みが
ありそうな標的領域として選択した。各領域について、他の試料成分から、増幅オリゴマ
ーとして、そしてプローブ配列として精製するために試料からＨＡＶ ＲＮＡを捕捉する
のに用いるためのオリゴマーを設計した。標的領域の好ましい実施態様としては、ＨＡＶ
ゲノムの０〜３０５ｎｔ、４７１４〜４７６５ｎｔ、５４９５〜５７８８ｎｔ、５７８８
〜６０６９ｎｔ及び６９５２〜７４１３ｎｔの部分である。
一般に、捕捉オリゴマー配列には、標的領域付近の配列に特異的に結合して増幅される
配列と、標的を含むハイブリダイゼーション複合体を、例えば固定化オリゴマーへのハイ
ブリダイゼーションにより固形支持体へ付ける場合に用いる「テール」領域を含む（例、
米国特許第６，１１０，６７８号）。好ましい捕捉オリゴマーとしては、配列番号１〜１
７に示す、ＨＡＶ ＲＮＡ配列に特異的に結合する標的特異配列と、共有結合したテール
配列（例、ｄＴ３ｄＡ３０）があげられる。当業者であれば、捕捉オリゴマー（配列番号
８〜１４）の標的特異部分又はそのＲＮＡ同等物がそれを固定化プローブへ結合させるい
かなる部分（例えば、なるテール配列、又はビオチン又はアビジン等の結合対のメンバー
）にも結合できることを理解するであろう。いかなる骨格も、捕捉オリゴマーの塩基配列
を結合させることができる。ある実施態様としては、捕捉オリゴマーの標的特異部分の２
’−Ｏ−メチル結合と、テール部分の標準のＤＮＡ結合を用いる。ポリヌクレオチドテー
ル配列は、固定化プローブの配列に相補的であればいかなる配列でもよく、配列長は概ね
約５〜５０残基であり、好ましくは、固定化ホモポリマー配列（例、Ｇ１５）に対して相
補的な、約１０〜約４０残基（例えば、Ｃ１０〜Ｃ４０）の範囲の実質的にホモポリマー
の配列である。
配列と、標的を含むハイブリダイゼーション複合体を、例えば固定化オリゴマーへのハイ
ブリダイゼーションにより固形支持体へ付ける場合に用いる「テール」領域を含む（例、
米国特許第６，１１０，６７８号）。好ましい捕捉オリゴマーとしては、配列番号１〜１
７に示す、ＨＡＶ ＲＮＡ配列に特異的に結合する標的特異配列と、共有結合したテール
配列（例、ｄＴ３ｄＡ３０）があげられる。当業者であれば、捕捉オリゴマー（配列番号
８〜１４）の標的特異部分又はそのＲＮＡ同等物がそれを固定化プローブへ結合させるい
かなる部分（例えば、なるテール配列、又はビオチン又はアビジン等の結合対のメンバー
）にも結合できることを理解するであろう。いかなる骨格も、捕捉オリゴマーの塩基配列
を結合させることができる。ある実施態様としては、捕捉オリゴマーの標的特異部分の２
’−Ｏ−メチル結合と、テール部分の標準のＤＮＡ結合を用いる。ポリヌクレオチドテー
ル配列は、固定化プローブの配列に相補的であればいかなる配列でもよく、配列長は概ね
約５〜５０残基であり、好ましくは、固定化ホモポリマー配列（例、Ｇ１５）に対して相
補的な、約１０〜約４０残基（例えば、Ｃ１０〜Ｃ４０）の範囲の実質的にホモポリマー
の配列である。
プライマー配列は、標的やその相補配列に結合しない他の配列を含有し得るにもかかわ
らず、ＨＡＶ ＲＮＡ標的配列又は相補鎖に特異的に結合して増幅される標的配列の側面
に位置する。プライマーは、プロモータープライマーでもよく、Ｔ７ ＲＮＡポリメラー
ゼプロモーター（配列番号１９）等の５’プロモーター配列を含んでもよい。プロモータ
ープライマーの実施態様としては、配列番号２０〜２９があげられる。ＨＡＶ特異的プラ
イマーの他の実施態様としては、制限エンドヌクレアーゼ認識配列（配列番号１３２〜１
３５）等の補助（ancillary）配列があげられる。当業者であれば、プライマーの標的特
異配列が、付着プロモーター又は補助配列の有無にかかわらず、様々なインビトロ増幅条
件においてプライマーとしての目的を果たすことを理解できるであろう。ＨＡＶゲノムの
標的領域（例えば、ヌクレオチド部分２００、３７００、４７００、５７００、５８００
、６０００及び７０００付近）の配列のために増幅オリゴマーを設計した。当業者であれ
ば、上記の数字が近傍にあるＨＡＶ標的領域のみを意味し、オリゴマーが１より多い標的
領域のアッセイにおいて機能できることを理解することができる。即ち、上記のオリゴマ
ーは、本発明の好ましい実施態様を群分けするための手近な（shorthand）参照として提
供される標的領域数を同定して機能的に制限されるわけではない。増幅オリゴマーは、Ｄ
ＮＡ、ＲＮＡ、相補ＤＮＡ又はＲＮＡ、又は混合ＤＮＡ及びＲＮＡ配列として合成しても
、１以上の非標準的な核酸骨格結合を含みうる。例えば、配列番号１０６のオリゴマーは
、残基１〜４ではＲＮＡ塩基と２’−Ｏ−メチル結合で、他の残基では標準のＤＮＡ塩基
及び結合で合成した。
らず、ＨＡＶ ＲＮＡ標的配列又は相補鎖に特異的に結合して増幅される標的配列の側面
に位置する。プライマーは、プロモータープライマーでもよく、Ｔ７ ＲＮＡポリメラー
ゼプロモーター（配列番号１９）等の５’プロモーター配列を含んでもよい。プロモータ
ープライマーの実施態様としては、配列番号２０〜２９があげられる。ＨＡＶ特異的プラ
イマーの他の実施態様としては、制限エンドヌクレアーゼ認識配列（配列番号１３２〜１
３５）等の補助（ancillary）配列があげられる。当業者であれば、プライマーの標的特
異配列が、付着プロモーター又は補助配列の有無にかかわらず、様々なインビトロ増幅条
件においてプライマーとしての目的を果たすことを理解できるであろう。ＨＡＶゲノムの
標的領域（例えば、ヌクレオチド部分２００、３７００、４７００、５７００、５８００
、６０００及び７０００付近）の配列のために増幅オリゴマーを設計した。当業者であれ
ば、上記の数字が近傍にあるＨＡＶ標的領域のみを意味し、オリゴマーが１より多い標的
領域のアッセイにおいて機能できることを理解することができる。即ち、上記のオリゴマ
ーは、本発明の好ましい実施態様を群分けするための手近な（shorthand）参照として提
供される標的領域数を同定して機能的に制限されるわけではない。増幅オリゴマーは、Ｄ
ＮＡ、ＲＮＡ、相補ＤＮＡ又はＲＮＡ、又は混合ＤＮＡ及びＲＮＡ配列として合成しても
、１以上の非標準的な核酸骨格結合を含みうる。例えば、配列番号１０６のオリゴマーは
、残基１〜４ではＲＮＡ塩基と２’−Ｏ−メチル結合で、他の残基では標準のＤＮＡ塩基
及び結合で合成した。
第１のＨＡＶ標的領域（２００位付近）への増幅オリゴマーとしては、配列番号１３８
の配列に含まれる約２３〜２６ｎｔの範囲の大きさのものがあげられ、少なくとも配列番
号１３９又は配列番号１４９の配列があげられる。本オリゴマーの実施態様としては、配
列番号５１〜配列番号５７があげられる。本領域へのプロモータープライマーの実施態様
としては、約５０〜５３ｎｔの範囲の大きさの配列番号２１〜２７の標的特異部分があげ
られる。本標的領域の増幅オリゴマーとしては、配列番号１４１に含まれる約１９〜２５
ｎｔの範囲の大きさのものがあげられ、少なくとも配列番号１４２〜１４６のいずれか１
の配列があげられる。本標的領域のための増幅オリゴマーの実施態様としては、配列番号
１５〜１８、２０〜２７、５０〜５７及び８０〜８５のものがあげられる。
の配列に含まれる約２３〜２６ｎｔの範囲の大きさのものがあげられ、少なくとも配列番
号１３９又は配列番号１４９の配列があげられる。本オリゴマーの実施態様としては、配
列番号５１〜配列番号５７があげられる。本領域へのプロモータープライマーの実施態様
としては、約５０〜５３ｎｔの範囲の大きさの配列番号２１〜２７の標的特異部分があげ
られる。本標的領域の増幅オリゴマーとしては、配列番号１４１に含まれる約１９〜２５
ｎｔの範囲の大きさのものがあげられ、少なくとも配列番号１４２〜１４６のいずれか１
の配列があげられる。本標的領域のための増幅オリゴマーの実施態様としては、配列番号
１５〜１８、２０〜２７、５０〜５７及び８０〜８５のものがあげられる。
第２のＨＡＶ標的領域（３７００位付近）への増幅オリゴマーとしては、配列番号６０
又は配列番号８６の配列に含まれる約２１〜２７ｎｔの範囲の大きさのものがあげられ、
少なくとも配列番号１５６の配列があげられる。本領域に対する本標的特異部分を含み、
約４８〜５４ｎｔの範囲の大きさのプロモータープライマーの実施態様としては、配列番
号２９〜３２があげられる。本標的領域の増幅オリゴマーの実施態様には、配列番号２８
〜３０、５８〜６０及び８６〜８８があげられる。
又は配列番号８６の配列に含まれる約２１〜２７ｎｔの範囲の大きさのものがあげられ、
少なくとも配列番号１５６の配列があげられる。本領域に対する本標的特異部分を含み、
約４８〜５４ｎｔの範囲の大きさのプロモータープライマーの実施態様としては、配列番
号２９〜３２があげられる。本標的領域の増幅オリゴマーの実施態様には、配列番号２８
〜３０、５８〜６０及び８６〜８８があげられる。
第３のＨＡＶ標的領域（４７００位付近）の増幅オリゴマーとしては、配列番号１４７
に含まれ、少なくとも配列番号１４８の配列を含むか、又は配列番号１５７に含まれ、少
なくとも配列番号１５８の配列を含む、約２４〜３０ｎｔの範囲の大きさのものがあげら
れる。本標的領域の増幅オリゴマーの実施態様としては、配列番号３１、３２、６２、６
８、８９、９０及び９１があげられ、本うち配列番号３１と配列番号３２は、標的特異配
列に付く５’プロモーター配列を含むプロモータープライマーの実施態様である。
に含まれ、少なくとも配列番号１４８の配列を含むか、又は配列番号１５７に含まれ、少
なくとも配列番号１５８の配列を含む、約２４〜３０ｎｔの範囲の大きさのものがあげら
れる。本標的領域の増幅オリゴマーの実施態様としては、配列番号３１、３２、６２、６
８、８９、９０及び９１があげられ、本うち配列番号３１と配列番号３２は、標的特異配
列に付く５’プロモーター配列を含むプロモータープライマーの実施態様である。
第４のＨＡＶ標的領域（５７００位付近）の増幅オリゴマーとしては、配列番号９３又
は配列番号９５の配列に含まれる、約１８〜２７ｎｔの範囲の大きさのものがあげられる
。本オリゴマーの実施態様としては、少なくとも配列番号９７、配列番号１５９及び配列
番号１６０のいずれか１つを含有するものがあげられる。本標的領域の増幅オリゴマーの
実施態様としては、配列番号３３、６３及び９２〜９７があげられ、このうち配列番号３
３は、標的特異配列に付く５’プロモーター配列を含むプロモータープライマーの実施態
様である。
は配列番号９５の配列に含まれる、約１８〜２７ｎｔの範囲の大きさのものがあげられる
。本オリゴマーの実施態様としては、少なくとも配列番号９７、配列番号１５９及び配列
番号１６０のいずれか１つを含有するものがあげられる。本標的領域の増幅オリゴマーの
実施態様としては、配列番号３３、６３及び９２〜９７があげられ、このうち配列番号３
３は、標的特異配列に付く５’プロモーター配列を含むプロモータープライマーの実施態
様である。
第５のＨＡＶ標的領域（５８００位付近）の増幅オリゴマーとしては、配列番号１４９
に含まれる約１９〜３１ｎｔの範囲の大きさのものがあげられ、かつ少なくとも配列番号
１５０の配列があげられる。本標的特異部分を含む、約５１〜５６ｎｔの範囲の大きさの
プロモータープライマーの実施態様としては、配列番号３４〜４０があげられる。本標的
領域の増幅オリゴマーの他の実施態様としては、配列番号６４〜７０及び９７があげられ
る。
に含まれる約１９〜３１ｎｔの範囲の大きさのものがあげられ、かつ少なくとも配列番号
１５０の配列があげられる。本標的特異部分を含む、約５１〜５６ｎｔの範囲の大きさの
プロモータープライマーの実施態様としては、配列番号３４〜４０があげられる。本標的
領域の増幅オリゴマーの他の実施態様としては、配列番号６４〜７０及び９７があげられ
る。
第６のＨＡＶ標的領域（６０００位付近）の増幅オリゴマーとしては、配列番号１６１
に含まれる約２４〜２８ｎｔのものがあげられ、かつ配列番号１６２の配列があげられる
。本標的領域のための増幅オリゴマーの実施態様には、配列番号４１、４２、７１、７２
、９８、９９及び１０１があげられ、このうち配列番号４１及び４２は、標的特異配列に
付く５’プロモーター配列を含むプロモータープライマーの実施態様である。
に含まれる約２４〜２８ｎｔのものがあげられ、かつ配列番号１６２の配列があげられる
。本標的領域のための増幅オリゴマーの実施態様には、配列番号４１、４２、７１、７２
、９８、９９及び１０１があげられ、このうち配列番号４１及び４２は、標的特異配列に
付く５’プロモーター配列を含むプロモータープライマーの実施態様である。
第７のＨＡＶ標的領域（７０００位付近）への増幅オリゴマーとしては、配列番号１５
１に含まれる約２０〜３０ｎｔの範囲の大きさのものがあげられ、少なくとも配列番号１
５２〜配列番号１５５の配列のいずれか１つがあげられる。本標的領域のための増幅オリ
ゴマーの他の実施態様としては、配列番号１６３があげられ、少なくとも配列番号１６４
の配列があげられる。他の実施態様としては、配列番号１６５に含まれ、少なくとも配列
番号１６６〜１６８の配列のいずれか１つを含む増幅オリゴマーである。本領域へのＨＡ
Ｖ標的特異部分を含む、約５１〜５６ｎｔの範囲の大きさのプロモータープライマーの実
施態様は、配列番号４３〜４９である。本領域への増幅オリゴマーの他の実施態様として
は、配列番号７３〜７９及び１０２〜１０８があげられる。
１に含まれる約２０〜３０ｎｔの範囲の大きさのものがあげられ、少なくとも配列番号１
５２〜配列番号１５５の配列のいずれか１つがあげられる。本標的領域のための増幅オリ
ゴマーの他の実施態様としては、配列番号１６３があげられ、少なくとも配列番号１６４
の配列があげられる。他の実施態様としては、配列番号１６５に含まれ、少なくとも配列
番号１６６〜１６８の配列のいずれか１つを含む増幅オリゴマーである。本領域へのＨＡ
Ｖ標的特異部分を含む、約５１〜５６ｎｔの範囲の大きさのプロモータープライマーの実
施態様は、配列番号４３〜４９である。本領域への増幅オリゴマーの他の実施態様として
は、配列番号７３〜７９及び１０２〜１０８があげられる。
増幅するＨＡＶ配列にハイブリダイズしてそれを検出するようなオリゴマーを設計した
が、それには、配列番号１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１
２２、１２３，１２４及び１２６〜１３０の検出プローブがあげられる。当業者であれば
、用いる増幅オリゴマーの組合せで決定される、増幅する配列の内部に含まれる配列にハ
イブリダイズするように検出プローブを選択できることを理解するであろう。検出プロー
ブオリゴマーは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は混合ＤＮＡ及びＲＮＡポリマーとして合成でき、
２’−Ｏ−メチル結合等の代わりの骨格結合を含んでよい。例えば、配列番号１０９、１
１１、１１７、１１９、１２１、１２２、１２８及び１３０のオリゴマーは２’−Ｏ−メ
チル結合で合成して、配列番号１２４及び１２７のオリゴマーは第２残基から３’末端残
基までを２’−Ｏ−メチル結合で混合ＤＮＡ及びＲＮＡヌクレオチドとして合成した。検
出プローブの好ましい実施態様としては、付着した化学発光標識、好ましくはアクリジニ
ウムエステル（ＡＥ）化合物があり（米国特許第５，１８５，４３９号、５，６３９，６
０４号、５，５８５，４８１号及び５，６５６，７４４号）、これは、好ましい実施態様
において、非ヌクレオチドリンカーによりプローブに付く（米国特許第５，５８５，４８
１号、５，６５６，７４４号及び５，６３９，６０４号、特に、第１０欄第６行〜第１１
欄第３行及び実施例８）。本プローブオリゴマーの実施態様としては、公知の方法を用い
て、配列番号１１９、１２１及び１２４では残基９と１０の間、配列番号１１５、１１７
、１２６、１２７及び１２８では残基１０と１１の間、配列番号１０９、１１１、１２３
、１２４及び１３０では残基１１と１２の間、配列番号１１３，１２２及び１２９では残
基１２と１３の間、そして配列番号１２２では残基１３と１４の間に、ＡＥ化合物で標識
した。プローブオリゴマーは、相補オリゴマー配列とのハイブリダイゼーションにより、
Ｔｍを決定するための標準的な方法及び／又はハイブリダイゼーション複合体におけるア
クリジニウムエステルのディファレンシャル加水分解を用いて試験して特性を決定した（
詳細は米国特許第５，２８３，１７４号に記載）。例えば、ハイブリダイゼーションは、
配列番号１０９及び配列番号１１０、配列番号１１１及び配列番号１１２、配列番号１１
３及び配列番号１１４、配列番号１１５及び配列番号１１６、配列番号１１７及び配列番
号１１８、配列番号１１９及び配列番号１２０、配列番号１２４及び配列番号１２５、配
列番号１２８及び配列番号１００及び配列番号１３０及び配列番号１３１の配列の相補対
を用いて実施した。ハイブリダイゼーション試験は、配列番号１２４と配列番号１３７、
配列番号１２９と配列番号１３６等の他の相補配列を用いて実施することができる。
が、それには、配列番号１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１
２２、１２３，１２４及び１２６〜１３０の検出プローブがあげられる。当業者であれば
、用いる増幅オリゴマーの組合せで決定される、増幅する配列の内部に含まれる配列にハ
イブリダイズするように検出プローブを選択できることを理解するであろう。検出プロー
ブオリゴマーは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は混合ＤＮＡ及びＲＮＡポリマーとして合成でき、
２’−Ｏ−メチル結合等の代わりの骨格結合を含んでよい。例えば、配列番号１０９、１
１１、１１７、１１９、１２１、１２２、１２８及び１３０のオリゴマーは２’−Ｏ−メ
チル結合で合成して、配列番号１２４及び１２７のオリゴマーは第２残基から３’末端残
基までを２’−Ｏ−メチル結合で混合ＤＮＡ及びＲＮＡヌクレオチドとして合成した。検
出プローブの好ましい実施態様としては、付着した化学発光標識、好ましくはアクリジニ
ウムエステル（ＡＥ）化合物があり（米国特許第５，１８５，４３９号、５，６３９，６
０４号、５，５８５，４８１号及び５，６５６，７４４号）、これは、好ましい実施態様
において、非ヌクレオチドリンカーによりプローブに付く（米国特許第５，５８５，４８
１号、５，６５６，７４４号及び５，６３９，６０４号、特に、第１０欄第６行〜第１１
欄第３行及び実施例８）。本プローブオリゴマーの実施態様としては、公知の方法を用い
て、配列番号１１９、１２１及び１２４では残基９と１０の間、配列番号１１５、１１７
、１２６、１２７及び１２８では残基１０と１１の間、配列番号１０９、１１１、１２３
、１２４及び１３０では残基１１と１２の間、配列番号１１３，１２２及び１２９では残
基１２と１３の間、そして配列番号１２２では残基１３と１４の間に、ＡＥ化合物で標識
した。プローブオリゴマーは、相補オリゴマー配列とのハイブリダイゼーションにより、
Ｔｍを決定するための標準的な方法及び／又はハイブリダイゼーション複合体におけるア
クリジニウムエステルのディファレンシャル加水分解を用いて試験して特性を決定した（
詳細は米国特許第５，２８３，１７４号に記載）。例えば、ハイブリダイゼーションは、
配列番号１０９及び配列番号１１０、配列番号１１１及び配列番号１１２、配列番号１１
３及び配列番号１１４、配列番号１１５及び配列番号１１６、配列番号１１７及び配列番
号１１８、配列番号１１９及び配列番号１２０、配列番号１２４及び配列番号１２５、配
列番号１２８及び配列番号１００及び配列番号１３０及び配列番号１３１の配列の相補対
を用いて実施した。ハイブリダイゼーション試験は、配列番号１２４と配列番号１３７、
配列番号１２９と配列番号１３６等の他の相補配列を用いて実施することができる。
本発明の組成物としては、ＨＡＶ核酸配列を検出するためのキットがあげられる。本キ
ットとしては、ＨＡＶ核酸配列をインビトロで増幅するためのプライマーとして機能する
、本明細書に開示する増幅オリゴマーがあげられる。キットの例示としては、ＨＡＶ Ｒ
ＮＡゲノムの標的領域中の配列又はその相補配列に特異的にハイブリダイズする第１の増
幅オリゴマーと、標的領域中の他のＨＡＶ配列に特異的にハイブリダイズする第２の増幅
オリゴマーがあげられ、好ましくは、１つがＨＡＶ ＲＮＡゲノム配列に相補的である。
キットの実施態様としては、本明細書に記載するようなプライマー及びプロモータープラ
イマーの組合せである増幅オリゴマーがあげられる。キットは、キットのために選択され
るプライマーの標的領域の増幅ＨＡＶ配列を検出するための検出プローブとしての目的を
果たす１以上のオリゴマーも含有しうる。プローブオリゴマーを含む実施態様のキットと
しては、本明細書に記載するプローブオリゴマーに直接的又は間接的に付着する標識があ
げられ、検出プローブ配列の１以上を用いる。キットは、標的ＨＡＶ ＲＮＡを試料から
精製するための捕捉オリゴマーとして機能するオリゴマーも含有しうる。本明細書に記載
する捕捉オリゴマーの実施態様としては、共有結合したテール配列、又は標的捕捉に用い
る他の結合部分を含有しうる。本明細書に記載の方法を実施するのに有用なキットも本発
明に含まれ、好ましい実施態様としては、本明細書に記載等の少なくとも２つの増幅オリ
ゴマーがあげられ、インビトロ増幅を実施するための、例えば、酵素、塩溶液及び核酸合
成基質化合物等の試薬もあげられる。本明細書に記載のオリゴマーは、多様な異なる実施
態様に包装でき、当業者であれば、本発明には多くの異なるキット配置を含むと理解する
であろう。例えば、キットには、ＨＡＶゲノムの唯１つの標的領域のための増幅オリゴマ
ーが含まれても、多数の標的領域のための増幅オリゴマーが含まれてもよい。当業者であ
れば、検出プローブを含むキットとして、キットの増幅オリゴマーにより増幅される配列
に結合するプローブがあげられることを理解するであろう。即ち、キットの増幅オリゴマ
ー及び検出プローブオリゴマーの選択は意図する標的領域に関連する。
ットとしては、ＨＡＶ核酸配列をインビトロで増幅するためのプライマーとして機能する
、本明細書に開示する増幅オリゴマーがあげられる。キットの例示としては、ＨＡＶ Ｒ
ＮＡゲノムの標的領域中の配列又はその相補配列に特異的にハイブリダイズする第１の増
幅オリゴマーと、標的領域中の他のＨＡＶ配列に特異的にハイブリダイズする第２の増幅
オリゴマーがあげられ、好ましくは、１つがＨＡＶ ＲＮＡゲノム配列に相補的である。
キットの実施態様としては、本明細書に記載するようなプライマー及びプロモータープラ
イマーの組合せである増幅オリゴマーがあげられる。キットは、キットのために選択され
るプライマーの標的領域の増幅ＨＡＶ配列を検出するための検出プローブとしての目的を
果たす１以上のオリゴマーも含有しうる。プローブオリゴマーを含む実施態様のキットと
しては、本明細書に記載するプローブオリゴマーに直接的又は間接的に付着する標識があ
げられ、検出プローブ配列の１以上を用いる。キットは、標的ＨＡＶ ＲＮＡを試料から
精製するための捕捉オリゴマーとして機能するオリゴマーも含有しうる。本明細書に記載
する捕捉オリゴマーの実施態様としては、共有結合したテール配列、又は標的捕捉に用い
る他の結合部分を含有しうる。本明細書に記載の方法を実施するのに有用なキットも本発
明に含まれ、好ましい実施態様としては、本明細書に記載等の少なくとも２つの増幅オリ
ゴマーがあげられ、インビトロ増幅を実施するための、例えば、酵素、塩溶液及び核酸合
成基質化合物等の試薬もあげられる。本明細書に記載のオリゴマーは、多様な異なる実施
態様に包装でき、当業者であれば、本発明には多くの異なるキット配置を含むと理解する
であろう。例えば、キットには、ＨＡＶゲノムの唯１つの標的領域のための増幅オリゴマ
ーが含まれても、多数の標的領域のための増幅オリゴマーが含まれてもよい。当業者であ
れば、検出プローブを含むキットとして、キットの増幅オリゴマーにより増幅される配列
に結合するプローブがあげられることを理解するであろう。即ち、キットの増幅オリゴマ
ー及び検出プローブオリゴマーの選択は意図する標的領域に関連する。
試料中のＨＡＶ核酸を検出するアッセイの実施態様としては、捕捉オリゴマーを用いて
ＨＡＶ標的核酸を試料より捕捉する工程、捕捉されたＨＡＶ核酸の領域を、少なくとも２
つのプライマーの組合せを用いて増幅する工程及び増幅ＨＡＶ配列を、それを検出プロー
ブオリゴマーと特異的にハイブリダイズさせることによって検出して、増幅ＨＡＶ配列へ
結合したプローブより生じるシグナルを検出する工程があげられる。好ましい実施態様は
、転写関連又は転写仲介性の増幅反応を用いる。増幅核酸又はプローブのいずれか一方を
標識しても、両方を非標識にしてもよく、検出可能シグナルは、そのプローブと増幅核酸
のハイブリダイゼーションより生じる電気インパルスのように、ハイブリダイゼーション
複合体と関連した間接的な標識又は応答により生じる。
ＨＡＶ標的核酸を試料より捕捉する工程、捕捉されたＨＡＶ核酸の領域を、少なくとも２
つのプライマーの組合せを用いて増幅する工程及び増幅ＨＡＶ配列を、それを検出プロー
ブオリゴマーと特異的にハイブリダイズさせることによって検出して、増幅ＨＡＶ配列へ
結合したプローブより生じるシグナルを検出する工程があげられる。好ましい実施態様は
、転写関連又は転写仲介性の増幅反応を用いる。増幅核酸又はプローブのいずれか一方を
標識しても、両方を非標識にしてもよく、検出可能シグナルは、そのプローブと増幅核酸
のハイブリダイゼーションより生じる電気インパルスのように、ハイブリダイゼーション
複合体と関連した間接的な標識又は応答により生じる。
捕捉工程は、好ましくは、ＨＡＶ標的配列に特異的にハイブリダイズする標的特異配列
（例えば、配列番号８〜１４）と、本ハイブリダイズした標的核酸を他の試料成分から分
離できる部分を含む捕捉オリゴマーを用いる。捕捉工程は、上記のように（米国特許第６
，１１０，６７８号）、テール部分の固定化プローブへのハイブリダイゼーションにより
、標的核酸が他の試料成分から分離できる部分として機能する、例えば配列番号１〜７等
のテール部分も含む捕捉オリゴマーを用いてもよい。好ましい実施態様は、捕捉オリゴマ
ーの相補テール配列にハイブリダイズする共有結合又は固定化したポリｄＴオリゴマーの
ある、単分散性（即ち、サイズにおいて±約５％の均質性）の磁気球体である指示体を用
いる。少なくとも標的核酸と捕捉オリゴマーを含み、好ましくは、固定化プローブも含む
ハイブリダイゼーション複合体は、標準的な物理的分離方法（例、磁力の適用、濾過、又
は遠心分離）を用いて他の試料成分から分離し、捕捉した標的核酸は、１回以上洗浄して
、標的核酸を他の試料成分からさらに精製できる。例えば、ハイブリダイゼーション複合
体において標的核酸が付着した粒子を、本複合体を維持する洗浄溶液において１回以上懸
濁させてから、上記のように、洗浄溶液から複合体が付着した粒子を回収する。
（例えば、配列番号８〜１４）と、本ハイブリダイズした標的核酸を他の試料成分から分
離できる部分を含む捕捉オリゴマーを用いる。捕捉工程は、上記のように（米国特許第６
，１１０，６７８号）、テール部分の固定化プローブへのハイブリダイゼーションにより
、標的核酸が他の試料成分から分離できる部分として機能する、例えば配列番号１〜７等
のテール部分も含む捕捉オリゴマーを用いてもよい。好ましい実施態様は、捕捉オリゴマ
ーの相補テール配列にハイブリダイズする共有結合又は固定化したポリｄＴオリゴマーの
ある、単分散性（即ち、サイズにおいて±約５％の均質性）の磁気球体である指示体を用
いる。少なくとも標的核酸と捕捉オリゴマーを含み、好ましくは、固定化プローブも含む
ハイブリダイゼーション複合体は、標準的な物理的分離方法（例、磁力の適用、濾過、又
は遠心分離）を用いて他の試料成分から分離し、捕捉した標的核酸は、１回以上洗浄して
、標的核酸を他の試料成分からさらに精製できる。例えば、ハイブリダイゼーション複合
体において標的核酸が付着した粒子を、本複合体を維持する洗浄溶液において１回以上懸
濁させてから、上記のように、洗浄溶液から複合体が付着した粒子を回収する。
捕捉されたＨＡＶ標的配列を増幅することは、例えば、配列番号６６及び配列番号９５
、又はそれらの相補配列が側面にあるＨＡＶ配列等の増幅する配列の側面にある少なくと
も２つのプライマーを用いるインビトロ増幅反応を用いる。１つの実施態様は、転写結合
増幅反応を用いて、実質的に定温条件において多数のＲＮＡコピーの配列を作製する（上
記した米国特許第５，３９９，４９１号及び５，５５４，５１６号）。転写結合増幅は、
２種類のプロモーター（１つは、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を含有するプロ
モータープライマー）、酵素（逆転写酵素とＲＮＡポリメラーゼ）、基質（デオキシリボ
ヌクレオシド三リン酸、リボヌクレオシド三リン酸）、並びに、溶液状態の適切な塩及び
緩衝剤を用いて、核酸鋳型から多数のＲＮＡ転写産物を生成する。簡潔には、プロモータ
ープライマーを標的ＲＮＡ配列に特異的にハイブリダイズさせて、逆転写酵素によるプロ
モータープライマーの３’端からの伸長により第１鎖ｃＤＮＡを作製して、生じるＤＮＡ
：ＲＮＡ二重鎖中の鋳型鎖を、ＲＮアーゼＨ活性を用いて分解する。本ｃＤＮＡへ第２の
プライマーが結合して、第２のプライマーの端から逆転写酵素により他のＤＮＡ鎖を合成
して、ＲＮＡポリメラーゼが結合する機能性プロモーター配列がある二本鎖ＤＮＡを作製
する。多数のＲＮＡ転写産物（「アンプリコン」）が転写され、各々が上記のような新た
な複製ラウンドの鋳型になり得ることから、多量の一本鎖増幅配列が産生される（例えば
、単一の鋳型から約１００〜３，０００の転写産物）。転写結合増幅反応を用いる本発明
の実施態様は、プロモータープライマー（配列番号２０〜４９）を他のプライマー（配列
番号１５〜１８、８０〜９９及び１０１〜１０８）とともに用いて、検出のために選択Ｈ
ＡＶ配列を増幅する。
、又はそれらの相補配列が側面にあるＨＡＶ配列等の増幅する配列の側面にある少なくと
も２つのプライマーを用いるインビトロ増幅反応を用いる。１つの実施態様は、転写結合
増幅反応を用いて、実質的に定温条件において多数のＲＮＡコピーの配列を作製する（上
記した米国特許第５，３９９，４９１号及び５，５５４，５１６号）。転写結合増幅は、
２種類のプロモーター（１つは、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を含有するプロ
モータープライマー）、酵素（逆転写酵素とＲＮＡポリメラーゼ）、基質（デオキシリボ
ヌクレオシド三リン酸、リボヌクレオシド三リン酸）、並びに、溶液状態の適切な塩及び
緩衝剤を用いて、核酸鋳型から多数のＲＮＡ転写産物を生成する。簡潔には、プロモータ
ープライマーを標的ＲＮＡ配列に特異的にハイブリダイズさせて、逆転写酵素によるプロ
モータープライマーの３’端からの伸長により第１鎖ｃＤＮＡを作製して、生じるＤＮＡ
：ＲＮＡ二重鎖中の鋳型鎖を、ＲＮアーゼＨ活性を用いて分解する。本ｃＤＮＡへ第２の
プライマーが結合して、第２のプライマーの端から逆転写酵素により他のＤＮＡ鎖を合成
して、ＲＮＡポリメラーゼが結合する機能性プロモーター配列がある二本鎖ＤＮＡを作製
する。多数のＲＮＡ転写産物（「アンプリコン」）が転写され、各々が上記のような新た
な複製ラウンドの鋳型になり得ることから、多量の一本鎖増幅配列が産生される（例えば
、単一の鋳型から約１００〜３，０００の転写産物）。転写結合増幅反応を用いる本発明
の実施態様は、プロモータープライマー（配列番号２０〜４９）を他のプライマー（配列
番号１５〜１８、８０〜９９及び１０１〜１０８）とともに用いて、検出のために選択Ｈ
ＡＶ配列を増幅する。
検出工程は、増幅ＨＡＶ配列へ特異的に結合する少なくとも１つのプローブを用いる。
実施態様は、検出プローブの増幅ＨＡＶ配列への結合を検出するために、あらゆる公知の
検出法（例、放射活性、蛍光、酵素、比色、電気、又は発光シグナルの検出）を用いてよ
く、この検出されるシグナルが試料中のＨＡＶの存在を示す。プローブオリゴマーの実施
態様（配列番号１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２２〜１
２４、１２６〜１３０）としては、非標識であっても、多種のいかなる公知の標識を用い
て標識してもよい。好ましい実施態様としては、非結合の検出プローブを混合物から除去
しない同種の検出反応において検出工程を実施する。同種の検出反応に用いるプローブオ
リゴマーの実施態様は、好ましくは、上記で詳細した（米国特許第５，２８３，１７４号
、５，６５６，７４４号及び５，６５８，７３７号）ように検出される化学発光シグナル
を産生する多種のＡＥ化合物の１つで標識する。
実施態様は、検出プローブの増幅ＨＡＶ配列への結合を検出するために、あらゆる公知の
検出法（例、放射活性、蛍光、酵素、比色、電気、又は発光シグナルの検出）を用いてよ
く、この検出されるシグナルが試料中のＨＡＶの存在を示す。プローブオリゴマーの実施
態様（配列番号１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２２〜１
２４、１２６〜１３０）としては、非標識であっても、多種のいかなる公知の標識を用い
て標識してもよい。好ましい実施態様としては、非結合の検出プローブを混合物から除去
しない同種の検出反応において検出工程を実施する。同種の検出反応に用いるプローブオ
リゴマーの実施態様は、好ましくは、上記で詳細した（米国特許第５，２８３，１７４号
、５，６５６，７４４号及び５，６５８，７３７号）ように検出される化学発光シグナル
を産生する多種のＡＥ化合物の１つで標識する。
一般に、好ましいアッセイ実施態様としては、以下の工程が含まれる。ＨＡＶ含有試料
をもたらし、標準実験法を用いてこれを調製して、ＨＡＶを含有する実質的に水性の溶液
又は懸濁液を作製してよい。本試料溶液又は懸濁液のアリコート（０．５ｍｌ）を等量（
０．４〜０．５ｍｌ）の標的捕捉試薬、即ち、１以上の捕捉オリゴマー（４ピコモル／反
応）、捕捉オリゴマーの一部へ相補的な固定化プローブが付いた磁気粒子及び塩化合物を
含有する溶液と混合して、ハイブリダイゼーション条件をもたらす。標的捕捉試薬として
は、好ましくは、ＨＡＶ粒子を崩壊させてＨＡＶ ＲＮＡを捕捉オリゴマーとのハイブリ
ダイゼーションのために放出させる、界面活性剤又は他のカオトロピック剤があげられる
。本混合物を、捕捉オリゴマーの標的特異部分のＨＡＶ標的配列へのハイブリダイゼーシ
ョンさせるために６０℃で２０〜３０分、その後、捕捉オリゴマーと固定化プローブの結
合させるために室温で２０〜３０分間インキュベートする。反応容器の外側へ約１０分間
磁場をかけて、ＨＡＶ ＲＮＡを含むハイブリダイゼーション複合体が付いた粒子を分離
して、他の試料成分を含有する溶液相を吸引除去する。ハイブリダイゼーション複合体の
付いた粒子を洗浄するために、それらを１ｍｌの洗浄緩衝液に懸濁し、実質的に上記のよ
うに溶液から分離して本溶液を除去する。精製されたＨＡＶ ＲＮＡを含むハイブリダイ
ゼーション複合体の付いた粒子を、増幅試薬（緩衝剤、塩、ｄＸＴＰ及びＸＴＰ基質）と
増幅オリゴマーの組合せ（プロモータープライマー及びプライマーの組合せ、各々３〜３
０ピコモル、概して１５ピコモル）を含有する溶液と混合して、オイル（０．２ｍｌの濾
過済みシリコンオイル）で覆って蒸発を防ぎ、６０℃で１０分間、その後４２℃で１０分
間インキュベートしてから、酵素（逆転写酵素とＲＮＡポリメラーゼ）を加えて、本混合
物を４２℃で６０分間インキュベートする。検出には、この増幅された反応混合物を少な
くとも１つのアクリジニウム標識された検出プローブオリゴマーとともにインキュベート
して、ルミノメーター（例、Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ Ｌｅａｄｅｒ（登録商標）、Ｇｅｎ−
Ｐｒｏｂｅ社、カリフォルニア州サンディエゴ）の標準的な方法を用いて検出できるよう
に、２百万以下の最大の検出可能シグナル（相対発光量、又はＲＬＵ）を提供する。ハイ
ブリダイゼーション溶液中の増幅された反応混合物の非希釈又は希釈アリコートと検出プ
ローブを混合し、６０℃で２０分間インキュベートして、増幅された標的配列にプローブ
オリゴマーがハイブリダイゼーションできるようにする。その後、選択試薬（例、塩基）
を用いて非結合プローブ上の標識を加水分解して、６０℃で１０分間インキュベートし、
続けて検出試薬（例、Ｈ２Ｏ２）を加えて化学発光を産生し、ｐＨの中和（例えば、酸の
添加による）を続けて、ルミノメーターで化学発光シグナル（ＲＬＵ）を（例えば、１〜
５秒）検出する。
をもたらし、標準実験法を用いてこれを調製して、ＨＡＶを含有する実質的に水性の溶液
又は懸濁液を作製してよい。本試料溶液又は懸濁液のアリコート（０．５ｍｌ）を等量（
０．４〜０．５ｍｌ）の標的捕捉試薬、即ち、１以上の捕捉オリゴマー（４ピコモル／反
応）、捕捉オリゴマーの一部へ相補的な固定化プローブが付いた磁気粒子及び塩化合物を
含有する溶液と混合して、ハイブリダイゼーション条件をもたらす。標的捕捉試薬として
は、好ましくは、ＨＡＶ粒子を崩壊させてＨＡＶ ＲＮＡを捕捉オリゴマーとのハイブリ
ダイゼーションのために放出させる、界面活性剤又は他のカオトロピック剤があげられる
。本混合物を、捕捉オリゴマーの標的特異部分のＨＡＶ標的配列へのハイブリダイゼーシ
ョンさせるために６０℃で２０〜３０分、その後、捕捉オリゴマーと固定化プローブの結
合させるために室温で２０〜３０分間インキュベートする。反応容器の外側へ約１０分間
磁場をかけて、ＨＡＶ ＲＮＡを含むハイブリダイゼーション複合体が付いた粒子を分離
して、他の試料成分を含有する溶液相を吸引除去する。ハイブリダイゼーション複合体の
付いた粒子を洗浄するために、それらを１ｍｌの洗浄緩衝液に懸濁し、実質的に上記のよ
うに溶液から分離して本溶液を除去する。精製されたＨＡＶ ＲＮＡを含むハイブリダイ
ゼーション複合体の付いた粒子を、増幅試薬（緩衝剤、塩、ｄＸＴＰ及びＸＴＰ基質）と
増幅オリゴマーの組合せ（プロモータープライマー及びプライマーの組合せ、各々３〜３
０ピコモル、概して１５ピコモル）を含有する溶液と混合して、オイル（０．２ｍｌの濾
過済みシリコンオイル）で覆って蒸発を防ぎ、６０℃で１０分間、その後４２℃で１０分
間インキュベートしてから、酵素（逆転写酵素とＲＮＡポリメラーゼ）を加えて、本混合
物を４２℃で６０分間インキュベートする。検出には、この増幅された反応混合物を少な
くとも１つのアクリジニウム標識された検出プローブオリゴマーとともにインキュベート
して、ルミノメーター（例、Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ Ｌｅａｄｅｒ（登録商標）、Ｇｅｎ−
Ｐｒｏｂｅ社、カリフォルニア州サンディエゴ）の標準的な方法を用いて検出できるよう
に、２百万以下の最大の検出可能シグナル（相対発光量、又はＲＬＵ）を提供する。ハイ
ブリダイゼーション溶液中の増幅された反応混合物の非希釈又は希釈アリコートと検出プ
ローブを混合し、６０℃で２０分間インキュベートして、増幅された標的配列にプローブ
オリゴマーがハイブリダイゼーションできるようにする。その後、選択試薬（例、塩基）
を用いて非結合プローブ上の標識を加水分解して、６０℃で１０分間インキュベートし、
続けて検出試薬（例、Ｈ２Ｏ２）を加えて化学発光を産生し、ｐＨの中和（例えば、酸の
添加による）を続けて、ルミノメーターで化学発光シグナル（ＲＬＵ）を（例えば、１〜
５秒）検出する。
上記の方法における使用への捕捉オリゴマー、増幅オリゴマー及び検出プローブは、Ｄ
ＮＡ、ＲＮＡ、又は混合ＤＮＡ及びＲＮＡポリマーを生成する標準的な方法を用いて合成
できる。本オリゴマーには、標準又は修飾結合及び／又は天然に存在するヌクレオシド（
Ａ、Ｔ又はＵ、Ｇ、Ｃ）、類似体（例、イノシン）、又は合成プリン及びピリミジン誘導
体（例、Ｐ又はＫ塩基）を含めることができる（Lin & Brown, 1989, Nucl. Acids Res.
17: 10373-83;Lin & Brown, 1992, Nucl. Acids Res. 20: 5149-52）。
ＮＡ、ＲＮＡ、又は混合ＤＮＡ及びＲＮＡポリマーを生成する標準的な方法を用いて合成
できる。本オリゴマーには、標準又は修飾結合及び／又は天然に存在するヌクレオシド（
Ａ、Ｔ又はＵ、Ｇ、Ｃ）、類似体（例、イノシン）、又は合成プリン及びピリミジン誘導
体（例、Ｐ又はＫ塩基）を含めることができる（Lin & Brown, 1989, Nucl. Acids Res.
17: 10373-83;Lin & Brown, 1992, Nucl. Acids Res. 20: 5149-52）。
本発明の一般原理は、本発明のいくつかの実施態様を記載する以下の実施例を参照すれ
ばより完全に理解することができる。本実施例に記載する具体的な成分に加えて、一般に
、以下に記載する実験では、以下の試薬を使用した。標的捕捉試薬は、７９０ｍＭ ＨＥ
ＰＥＳ，６８０ｍＭ ＬｉＯＨ，１０％（ｖ／ｖ）ラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ），２
３０ｍＭコハク酸、０．０３％（ｖ／ｖ）消泡剤、ポリｄＴ１４が共有結合した１００μ
ｇ／ｍｌ磁気粒子（１ミクロンのＳｅｒａ−ＭａｇＴＭ粒子、Ｓｅｒａｄｙｎ社、インデ
ィアナ州インディアナポリス）及び１以上の捕捉オリゴマー（４００μｌにつき各４ピコ
モル）で構成される。洗浄緩衝液は、１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，６
．５ｍＭ ＮａＯＨ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．３％（ｖ／ｖ）エタノール、０．１％ Ｓ
ＤＳ，０．０２％（ｗ／ｖ）メチルパラベン，０．０１％（ｗ／ｖ）プロピルパラベンよ
りｐＨ７．５から構成される。増幅試薬は、１１．６ｍＭ Ｔｒｉｓ塩基，１５ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ，２２．７ｍＭ ＭｇＣｌ２，２３．３ｍＭ ＫＣｌ，３．３３％グリセ
ロール，０．０５ｍＭ酢酸亜鉛，０．６６５ｍＭ ｄＡＴＰ，０．６６５ｍＭ ｄＣＴＰ
，０．６６５ｍＭ ｄＧＴＰ，０．６６５ｍＭ ｄＴＴＰ，５．３２ｍＭ ＡＴＰ，５．
３２ｍＭ ＣＴＰ，５．３２ｍＭ ＧＴＰ，及び５．３２ｍＭ ＵＴＰよりｐＨ７で構成
される。酵素試薬は、１４０Ｕ／μｌ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ，２２４ＲＴＵ／μｌ
のＭｏｌｏｎｅｙマウス白血病ウイルス逆転写酵素（ＭＭＬＶ−ＲＴ），１６ｍＭ ＨＥ
ＰＥＳ，７０ｍＭ Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、３ｍＭ ＥＤＴＡ，０．０５％（ｗ
／ｖ）アジ化ナトリウム，２０ｍＭ Ｔｒｉｓ，５０ｍＭ ＫＣｌ，２０％（ｖ／ｖ）グ
リセロール，１０％（ｖ／ｖ）ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１０２，１５０ｍＭトレハ
ロースよりｐＨ７で構成された。（酵素単位は、典型的には、Ｔ７プロモーターを含有す
るＤＮＡ鋳型を用いて、３７℃で１時間で１ナノモルのＡＴＰをＲＮＡへ取り込むＴ７
ＲＮＡポリメラーゼを１Ｕとし、１ＵのＭＭＬＶ−ＲＴは、２００〜４００μＭのオリゴ
ｄＴプライマーとポリＡ鋳型を用いて３７℃で１０分で１ナノモルのｄＴＴＰを取り込む
）。プローブ試薬は、１００ｍＭコハク酸，２％（ｗ／ｖ）ＬＬＳ，２３０ｍＭ ＬｉＯ
Ｈ，１５ｍＭ Ａｌｄｒｉｔｈｉｏｌ−２，１．２ｍＭ ＬｉＣｌ，２０ｍＭ ＥＤＴＡ
，２０ｍＭ ＥＧＴＡ，３％（ｖ／ｖ）エタノールより構成し、ＬｉＯＨでｐＨ４．７へ
調整した。選択試薬は、６００ｍＭホウ酸，１８２ｍＭ ＮａＯＨ，１％（ｖ／ｖ）オク
トキシノール（ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００）よりｐＨ８．５で構成される。検
出試薬は、１ｍＭ硝酸と３２ｍＭ Ｈ２Ｏ２を含有する検出試薬Ｉと、１．５Ｍ ＮａＯ
Ｈである検出試薬ＩＩ（ｐＨを中和する）であった（詳細は、米国特許第５，２８３，１
７４号を参照）。
ばより完全に理解することができる。本実施例に記載する具体的な成分に加えて、一般に
、以下に記載する実験では、以下の試薬を使用した。標的捕捉試薬は、７９０ｍＭ ＨＥ
ＰＥＳ，６８０ｍＭ ＬｉＯＨ，１０％（ｖ／ｖ）ラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ），２
３０ｍＭコハク酸、０．０３％（ｖ／ｖ）消泡剤、ポリｄＴ１４が共有結合した１００μ
ｇ／ｍｌ磁気粒子（１ミクロンのＳｅｒａ−ＭａｇＴＭ粒子、Ｓｅｒａｄｙｎ社、インデ
ィアナ州インディアナポリス）及び１以上の捕捉オリゴマー（４００μｌにつき各４ピコ
モル）で構成される。洗浄緩衝液は、１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，６
．５ｍＭ ＮａＯＨ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．３％（ｖ／ｖ）エタノール、０．１％ Ｓ
ＤＳ，０．０２％（ｗ／ｖ）メチルパラベン，０．０１％（ｗ／ｖ）プロピルパラベンよ
りｐＨ７．５から構成される。増幅試薬は、１１．６ｍＭ Ｔｒｉｓ塩基，１５ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ，２２．７ｍＭ ＭｇＣｌ２，２３．３ｍＭ ＫＣｌ，３．３３％グリセ
ロール，０．０５ｍＭ酢酸亜鉛，０．６６５ｍＭ ｄＡＴＰ，０．６６５ｍＭ ｄＣＴＰ
，０．６６５ｍＭ ｄＧＴＰ，０．６６５ｍＭ ｄＴＴＰ，５．３２ｍＭ ＡＴＰ，５．
３２ｍＭ ＣＴＰ，５．３２ｍＭ ＧＴＰ，及び５．３２ｍＭ ＵＴＰよりｐＨ７で構成
される。酵素試薬は、１４０Ｕ／μｌ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ，２２４ＲＴＵ／μｌ
のＭｏｌｏｎｅｙマウス白血病ウイルス逆転写酵素（ＭＭＬＶ−ＲＴ），１６ｍＭ ＨＥ
ＰＥＳ，７０ｍＭ Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、３ｍＭ ＥＤＴＡ，０．０５％（ｗ
／ｖ）アジ化ナトリウム，２０ｍＭ Ｔｒｉｓ，５０ｍＭ ＫＣｌ，２０％（ｖ／ｖ）グ
リセロール，１０％（ｖ／ｖ）ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１０２，１５０ｍＭトレハ
ロースよりｐＨ７で構成された。（酵素単位は、典型的には、Ｔ７プロモーターを含有す
るＤＮＡ鋳型を用いて、３７℃で１時間で１ナノモルのＡＴＰをＲＮＡへ取り込むＴ７
ＲＮＡポリメラーゼを１Ｕとし、１ＵのＭＭＬＶ−ＲＴは、２００〜４００μＭのオリゴ
ｄＴプライマーとポリＡ鋳型を用いて３７℃で１０分で１ナノモルのｄＴＴＰを取り込む
）。プローブ試薬は、１００ｍＭコハク酸，２％（ｗ／ｖ）ＬＬＳ，２３０ｍＭ ＬｉＯ
Ｈ，１５ｍＭ Ａｌｄｒｉｔｈｉｏｌ−２，１．２ｍＭ ＬｉＣｌ，２０ｍＭ ＥＤＴＡ
，２０ｍＭ ＥＧＴＡ，３％（ｖ／ｖ）エタノールより構成し、ＬｉＯＨでｐＨ４．７へ
調整した。選択試薬は、６００ｍＭホウ酸，１８２ｍＭ ＮａＯＨ，１％（ｖ／ｖ）オク
トキシノール（ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００）よりｐＨ８．５で構成される。検
出試薬は、１ｍＭ硝酸と３２ｍＭ Ｈ２Ｏ２を含有する検出試薬Ｉと、１．５Ｍ ＮａＯ
Ｈである検出試薬ＩＩ（ｐＨを中和する）であった（詳細は、米国特許第５，２８３，１
７４号を参照）。
検出プローブの特定
標準のホスホロアミダイト化学（Caruthers et al., 1987, Methods in Enzymol., 154
: 287）を用いて配列番号１０９、１１１、１１３、１１９、１２３、１２６及び１３０
のオリゴマーを合成して、周知の方法（米国特許第５，１８５，４３９号及び５，２８３
，１７４号）を用いてリンカーを介してアクリジニウムエステル（ＡＥ）標識を付け、定
型のクロマトグラフィー法（例、ＨＰＬＣ）を用いてプローブを精製した。プローブは、
配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１２３及び配列番号１３０では残基１１と１
２の間、配列番号１１３では残基１２と１３の間、配列番号１２６では残基１０と１１の
間、そして配列番号１１９では残基９と１０の間にＡＥ標識した。本プローブオリゴマー
を特定するために、プローブの予測Ｔｍより低温で、各々を相補的なＤＮＡ及び／又はＲ
ＮＡオリゴマー（例えば、配列番号１１０と配列番号１０９、配列番号１１２と配列番号
１１１、配列番号１１４と配列番号１１３、配列番号１２０と配列番号１１９、そして配
列番号１３１と配列番号１３０）とハイブリダイズさせてから、標準的な方法を用いてＴ
ｍを実験的に決定した。非結合プローブ中のＡＥと比較した、相補的なオリゴマーにハイ
ブリダイズしたプローブ中のＡＥ標識のディファレンシャル加水分解も、標準的な方法（
米国特許第５，２８３，１７４号を参照）を用いて実験的に決定した。簡潔には、非結合
プローブ中の標識の半分の加水分解に必要な時間と比較した、シグナルの半分がハイブリ
ッドでのＡＥ加水分解により失われるのに必要な時間の比を決定した。Ｔｍは、配列番号
１０９、１１１、１１３、１１９及び１３０のオリゴマーでは、相補的なＤＮＡへハイブ
リダイズする場合、５９℃〜６６℃の範囲であり、配列番号１０９、１１１、１２３、１
２６及び１３０のオリゴマーでは、相補的なＲＮＡへハイブリダイズする場合、７６℃〜
８１℃の範囲であった。ディファレンシャル加水分解の比は、配列番号１０９、１１１、
１１３、１１９及び１３０のプローブでは、相補的なＤＮＡへハイブリダイズする場合、
１２〜２５の範囲であり、ディファレンシャル加水分解の比は、配列番号１０９、１１１
、１２３、１２６及び１３０のプローブでは、相補的なＲＮＡへハイブリダイズする場合
、１８〜１０４の範囲であった。別に、残基９と１０の間で標識した配列番号１２１、残
基１３と１４の間で標識した配列番号１２２、残基９と１０の間で標識した配列番号１２
４、そして残基１１と１２の間で標識した配列番号１３０のプローブで、同様のハイブリ
ダイゼーション及びディファレンシャル加水分解試験を実施すると、プローブを相補的な
ＲＮＡへハイブリダイズさせる場合、ディファレンシャル加水分解比は、４３〜１９０の
範囲であった。上記の結果は、これら合成プローブオリゴマーの全てがその相補的な標的
配列に特異的にハイブリダイズして、増幅ＨＡＶ配列を特異的に検出するのに有用な検出
可能シグナルを産生することを示した。
標準のホスホロアミダイト化学（Caruthers et al., 1987, Methods in Enzymol., 154
: 287）を用いて配列番号１０９、１１１、１１３、１１９、１２３、１２６及び１３０
のオリゴマーを合成して、周知の方法（米国特許第５，１８５，４３９号及び５，２８３
，１７４号）を用いてリンカーを介してアクリジニウムエステル（ＡＥ）標識を付け、定
型のクロマトグラフィー法（例、ＨＰＬＣ）を用いてプローブを精製した。プローブは、
配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１２３及び配列番号１３０では残基１１と１
２の間、配列番号１１３では残基１２と１３の間、配列番号１２６では残基１０と１１の
間、そして配列番号１１９では残基９と１０の間にＡＥ標識した。本プローブオリゴマー
を特定するために、プローブの予測Ｔｍより低温で、各々を相補的なＤＮＡ及び／又はＲ
ＮＡオリゴマー（例えば、配列番号１１０と配列番号１０９、配列番号１１２と配列番号
１１１、配列番号１１４と配列番号１１３、配列番号１２０と配列番号１１９、そして配
列番号１３１と配列番号１３０）とハイブリダイズさせてから、標準的な方法を用いてＴ
ｍを実験的に決定した。非結合プローブ中のＡＥと比較した、相補的なオリゴマーにハイ
ブリダイズしたプローブ中のＡＥ標識のディファレンシャル加水分解も、標準的な方法（
米国特許第５，２８３，１７４号を参照）を用いて実験的に決定した。簡潔には、非結合
プローブ中の標識の半分の加水分解に必要な時間と比較した、シグナルの半分がハイブリ
ッドでのＡＥ加水分解により失われるのに必要な時間の比を決定した。Ｔｍは、配列番号
１０９、１１１、１１３、１１９及び１３０のオリゴマーでは、相補的なＤＮＡへハイブ
リダイズする場合、５９℃〜６６℃の範囲であり、配列番号１０９、１１１、１２３、１
２６及び１３０のオリゴマーでは、相補的なＲＮＡへハイブリダイズする場合、７６℃〜
８１℃の範囲であった。ディファレンシャル加水分解の比は、配列番号１０９、１１１、
１１３、１１９及び１３０のプローブでは、相補的なＤＮＡへハイブリダイズする場合、
１２〜２５の範囲であり、ディファレンシャル加水分解の比は、配列番号１０９、１１１
、１２３、１２６及び１３０のプローブでは、相補的なＲＮＡへハイブリダイズする場合
、１８〜１０４の範囲であった。別に、残基９と１０の間で標識した配列番号１２１、残
基１３と１４の間で標識した配列番号１２２、残基９と１０の間で標識した配列番号１２
４、そして残基１１と１２の間で標識した配列番号１３０のプローブで、同様のハイブリ
ダイゼーション及びディファレンシャル加水分解試験を実施すると、プローブを相補的な
ＲＮＡへハイブリダイズさせる場合、ディファレンシャル加水分解比は、４３〜１９０の
範囲であった。上記の結果は、これら合成プローブオリゴマーの全てがその相補的な標的
配列に特異的にハイブリダイズして、増幅ＨＡＶ配列を特異的に検出するのに有用な検出
可能シグナルを産生することを示した。
試料からのＨＡＶ ＲＮＡの精製
標準のホスホロアミダイト化学を用いて合成して、標準的な方法を用いて精製した配列
番号１〜７の捕捉オリゴマーについて、ヒト血漿試料中のウイルスから放出されるＨＡＶ
ＲＮＡを捕捉する能力を試験した。ＨＡＶ粒子を正常なヒト血漿（０．５ｍｌ）へ公知
の濃度で加えて試料を作製し、ＨＡＶ（例えば、各反応につき５００〜１０００）を含有
する試料を等量の、各捕捉オリゴマーを個別に（４ピコモル／反応）、そしてポリｄＴ磁
気粒子を含有する標的捕捉試薬と混合した。本混合物を６０℃で３０分間、その後室温で
３０分間インキュベートして、ＨＡＶ ＲＮＡを粒子へ捕捉するハイブリダイゼーション
複合体を形成した。容器の外側へ磁場を１０分間かけて、捕捉したＨＡＶ ＲＮＡが付い
た磁気粒子を分離してから、溶液相を吸引して他の試料成分を除去して、ハイブリダイゼ
ーション複合体の付いた粒子を連続して２回洗浄し、各々、１ｍｌの洗浄緩衝液を室温で
用いて、洗浄溶液を粒子の外へ吸引した。その後、実施例１に記載のように、ハイブリダ
イゼーション複合体の付いた粒子を、標識された検出プローブを含有するプローブ試薬（
０．１ｍｌ）に懸濁させて、６０℃で２０分間インキュベートし、選択試薬（０．２ｍｌ
）の添加、混合及び６０℃で１０分間のインキュベーションを続けた。化学発光シグナル
の産生及び検出は、実質的に上記のように、２００μｌの検出試薬Ｉを加え、インキュベ
ーション及び２００μｌの検出試薬ＩＩを加えて混合物のｐＨ中和、そしてルミノメータ
ーを用いてＲＬＵを測定して実施した。試験した捕捉オリゴマーの全てについて、バック
グラウンド（ＨＡＶを含有しない同様の試料のＲＬＵ）より有意に高い陽性シグナルを検
出して、試料中のＨＡＶ ＲＮＡの存在を検出した。本アッセイでは、捕捉オリゴマーの
間の性能に有意差がほとんど示されなかった。
標準のホスホロアミダイト化学を用いて合成して、標準的な方法を用いて精製した配列
番号１〜７の捕捉オリゴマーについて、ヒト血漿試料中のウイルスから放出されるＨＡＶ
ＲＮＡを捕捉する能力を試験した。ＨＡＶ粒子を正常なヒト血漿（０．５ｍｌ）へ公知
の濃度で加えて試料を作製し、ＨＡＶ（例えば、各反応につき５００〜１０００）を含有
する試料を等量の、各捕捉オリゴマーを個別に（４ピコモル／反応）、そしてポリｄＴ磁
気粒子を含有する標的捕捉試薬と混合した。本混合物を６０℃で３０分間、その後室温で
３０分間インキュベートして、ＨＡＶ ＲＮＡを粒子へ捕捉するハイブリダイゼーション
複合体を形成した。容器の外側へ磁場を１０分間かけて、捕捉したＨＡＶ ＲＮＡが付い
た磁気粒子を分離してから、溶液相を吸引して他の試料成分を除去して、ハイブリダイゼ
ーション複合体の付いた粒子を連続して２回洗浄し、各々、１ｍｌの洗浄緩衝液を室温で
用いて、洗浄溶液を粒子の外へ吸引した。その後、実施例１に記載のように、ハイブリダ
イゼーション複合体の付いた粒子を、標識された検出プローブを含有するプローブ試薬（
０．１ｍｌ）に懸濁させて、６０℃で２０分間インキュベートし、選択試薬（０．２ｍｌ
）の添加、混合及び６０℃で１０分間のインキュベーションを続けた。化学発光シグナル
の産生及び検出は、実質的に上記のように、２００μｌの検出試薬Ｉを加え、インキュベ
ーション及び２００μｌの検出試薬ＩＩを加えて混合物のｐＨ中和、そしてルミノメータ
ーを用いてＲＬＵを測定して実施した。試験した捕捉オリゴマーの全てについて、バック
グラウンド（ＨＡＶを含有しない同様の試料のＲＬＵ）より有意に高い陽性シグナルを検
出して、試料中のＨＡＶ ＲＮＡの存在を検出した。本アッセイでは、捕捉オリゴマーの
間の性能に有意差がほとんど示されなかった。
ＨＡＶ配列の増幅及び検出
正常ヒト血漿中のＨＡＶ試料を実質的に実施例２に記載のように調製して、ＨＡＶゲノ
ムの選択した標的領域を増幅して検出するアッセイのために様々な捕捉オリゴマーの組合
せを用いてＨＡＶ ＲＮＡを捕捉した。本ゲノムの０〜３０５残基の標的領域については
捕捉工程で配列番号２、３及び４を使用した。ゲノムの４７１４〜４７６５残基の標的領
域については捕捉工程で配列番号４、５、６及び７を使用した。ゲノムの５４９５〜５７
８８残基の標的領域については捕捉工程で配列番号１及び６を使用した。ゲノムの５７８
８〜６０６９残基の標的領域については捕捉工程で配列番号２を使用した。ゲノムの６９
５２〜７４１３残基の標的領域については捕捉工程で配列番号１、４、５及び７を使用し
た。捕捉工程は実質的に実施例２に記載のように実施した。
正常ヒト血漿中のＨＡＶ試料を実質的に実施例２に記載のように調製して、ＨＡＶゲノ
ムの選択した標的領域を増幅して検出するアッセイのために様々な捕捉オリゴマーの組合
せを用いてＨＡＶ ＲＮＡを捕捉した。本ゲノムの０〜３０５残基の標的領域については
捕捉工程で配列番号２、３及び４を使用した。ゲノムの４７１４〜４７６５残基の標的領
域については捕捉工程で配列番号４、５、６及び７を使用した。ゲノムの５４９５〜５７
８８残基の標的領域については捕捉工程で配列番号１及び６を使用した。ゲノムの５７８
８〜６０６９残基の標的領域については捕捉工程で配列番号２を使用した。ゲノムの６９
５２〜７４１３残基の標的領域については捕捉工程で配列番号１、４、５及び７を使用し
た。捕捉工程は実質的に実施例２に記載のように実施した。
ＨＡＶゲノム中の異なる標的領域のプライマーとして機能する増幅オリゴマーの様々な
組合せを含む、実質的に上記の反応物中で、捕捉したＨＡＶ ＲＮＡを増幅した。標的領
域を増幅するために用いるプライマーは、以下の通りであった：０〜３０５残基領域につ
いては配列番号１６及び配列番号２２、４７１４〜４７６５残基領域については配列番号
８９及び配列番号３２、５４９５〜５７８８残基領域については配列番号９２及び配列番
号３３、５７８８〜６０６９残基領域については配列番号９４及び配列番号３７、そして
６９５２〜７４１３残基領域については配列番号１０８及び配列番号４６。増幅反応は、
いずれも実質的に上記と同様に実施した。即ち、標的捕捉工程由来のＨＡＶ ＲＮＡが付
いた粒子を、増幅試薬と上記の増幅オリゴマーの個別の組合せ（一般的には各々１５ピコ
モル）と共に混合して、シリコンオイル（０．２ｍｌ）で覆って蒸発を防ぎ、６０℃で１
０分間、その後４２℃で１０分間インキュベートした。酵素試薬（逆転写酵素とＲＮＡポ
リメラーゼ）を加えて、本増幅反応物を４２℃で６０分間インキュベートした。
組合せを含む、実質的に上記の反応物中で、捕捉したＨＡＶ ＲＮＡを増幅した。標的領
域を増幅するために用いるプライマーは、以下の通りであった：０〜３０５残基領域につ
いては配列番号１６及び配列番号２２、４７１４〜４７６５残基領域については配列番号
８９及び配列番号３２、５４９５〜５７８８残基領域については配列番号９２及び配列番
号３３、５７８８〜６０６９残基領域については配列番号９４及び配列番号３７、そして
６９５２〜７４１３残基領域については配列番号１０８及び配列番号４６。増幅反応は、
いずれも実質的に上記と同様に実施した。即ち、標的捕捉工程由来のＨＡＶ ＲＮＡが付
いた粒子を、増幅試薬と上記の増幅オリゴマーの個別の組合せ（一般的には各々１５ピコ
モル）と共に混合して、シリコンオイル（０．２ｍｌ）で覆って蒸発を防ぎ、６０℃で１
０分間、その後４２℃で１０分間インキュベートした。酵素試薬（逆転写酵素とＲＮＡポ
リメラーゼ）を加えて、本増幅反応物を４２℃で６０分間インキュベートした。
検出では、増幅領域に含有する配列に特異的にハイブリダイズする標識した検出プロー
ブオリゴマーと共に本増幅混合物をインキュベートした。これには、０〜３０５残基領域
として配列番号１０９又は配列番号１１１、４７１４〜４７６５残基領域として配列番号
１１５、５４９５〜５７８８残基領域として配列番号１１７、５７８８〜６０６９残基領
域として配列番号１２１及び／又は配列番号１２２、そして６９５２〜７４１３残基領域
として配列番号１２９又は配列番号１３０が含まれていた。プローブは、プローブ試薬中
に、ハイブリダイズした標識化プローブより２百万以下のＲＬＵの最大検出可能シグナル
を産生する標識化プローブの比活性に基づいてすでに決定した量を提供した。本プローブ
と増幅配列をプローブ試薬中で５５〜６０℃でインキュベートして、実質的に実施例１及
び２に記載のように、ハイブリダイズしたプローブから化学発光シグナルを産生させて検
出した。捕捉されたＨＡＶ ＲＮＡと共に試験したプライマー組合せの全てで、増幅アッ
セイの感度は、試料中に存在する４００〜１０００コピーのＨＡＶ ＲＮＡを検出した。
ブオリゴマーと共に本増幅混合物をインキュベートした。これには、０〜３０５残基領域
として配列番号１０９又は配列番号１１１、４７１４〜４７６５残基領域として配列番号
１１５、５４９５〜５７８８残基領域として配列番号１１７、５７８８〜６０６９残基領
域として配列番号１２１及び／又は配列番号１２２、そして６９５２〜７４１３残基領域
として配列番号１２９又は配列番号１３０が含まれていた。プローブは、プローブ試薬中
に、ハイブリダイズした標識化プローブより２百万以下のＲＬＵの最大検出可能シグナル
を産生する標識化プローブの比活性に基づいてすでに決定した量を提供した。本プローブ
と増幅配列をプローブ試薬中で５５〜６０℃でインキュベートして、実質的に実施例１及
び２に記載のように、ハイブリダイズしたプローブから化学発光シグナルを産生させて検
出した。捕捉されたＨＡＶ ＲＮＡと共に試験したプライマー組合せの全てで、増幅アッ
セイの感度は、試料中に存在する４００〜１０００コピーのＨＡＶ ＲＮＡを検出した。
上記の試験で使用した捕捉オリゴマー、増幅オリゴマー及び検出プローブの組合せを表
１に概略要約する。
表１：試料中のＨＡＶを試験するためのオリゴマーの組合せ
１に概略要約する。
表１：試料中のＨＡＶを試験するためのオリゴマーの組合せ
ＨＡＶ含有試料とは別に、異なる捕捉オリゴマー（配列番号１、２、３、４、５、６及
び７）を用いて同様の実験を実施し、ここでは、標的捕捉工程を、各アッセイ条件につい
て９回の反復で実質的に上記に記載のように実施した。これらの試験の全てで、標的領域
はＨＡＶの残基５７８８〜６０６９であり、これについて配列番号３６及び配列番号９６
の同じ増幅オリゴマーを、上記のように実施して捕捉したＨＡＶ ＲＮＡとともに増幅反
応で用いて、上記のように、ハイブリダイズした検出プローブ（残基１１と１２の間にＡ
Ｅで標識した、配列番号１２３又は１２４）からの化学発光を測定して増幅産物を検出し
た。上記のアッセイの結果（９回の反復での平均ＲＬＵ）を表２に示す。
び７）を用いて同様の実験を実施し、ここでは、標的捕捉工程を、各アッセイ条件につい
て９回の反復で実質的に上記に記載のように実施した。これらの試験の全てで、標的領域
はＨＡＶの残基５７８８〜６０６９であり、これについて配列番号３６及び配列番号９６
の同じ増幅オリゴマーを、上記のように実施して捕捉したＨＡＶ ＲＮＡとともに増幅反
応で用いて、上記のように、ハイブリダイズした検出プローブ（残基１１と１２の間にＡ
Ｅで標識した、配列番号１２３又は１２４）からの化学発光を測定して増幅産物を検出し
た。上記のアッセイの結果（９回の反復での平均ＲＬＵ）を表２に示す。
表２：残基５７８８〜６０６９の標的領域の増幅及び検出
上記の結果は、捕捉オリゴマーの全てが、試料中のＨＡＶの存在を示すために増幅及び
検出されるのに十分なほどＨＡＶ ＲＮＡを試料から精製したことを示す。
検出されるのに十分なほどＨＡＶ ＲＮＡを試料から精製したことを示す。
血漿試料中のＨＡＶの検出
本実施例は、ＨＡＶ陽性血漿試料中のＨＡＶ核酸を検出したアッセイを用いる。試料を
調製するために、ヒト血漿中のＨＡＶの市販ストックをＨＡＶ陰性血漿へ希釈して、２５
、３０、１００、３００及び５００ＨＡＶコピー／ｍｌの試料を得た；陰性対照は、ＨＡ
Ｖなしの血漿であった。各アッセイでは、２０回の反復試料で実施して、捕捉オリゴマー
の配列番号４（６．５ピコモル／反応）及び配列番号５（１．３ピコモル／反応）を含有
する０．４ｍｌの標的捕捉試薬と０．５ｍｌの試料を混合して、標的捕捉工程は、６０℃
で２０分のインキュベーションを用いること以外は、実質的に実施例３に記載のように実
施した。各アッセイで、ＨＡＶ ＲＮＡに結合した配列番号４及び５の捕捉オリゴマーを
含むハイブリダイゼーション複合体が付いた洗浄済みの磁気粒子を、増幅オリゴマーを（
配列番号３６は１３ピコモル／反応で、配列番号９６は２０ピコモル／反応で）含有する
７５μｌの増幅試薬を含有する増幅反応物に使用した。上記のように、各混合物をオイル
層で覆い、６０℃で１０分インキュベートし、酵素試薬（２５μｌ）を加えて、本混合物
を４１．５℃で６０分間インキュベートして、ＨＡＶ標的配列を増幅できるようにした。
増幅した配列は、２−メチル−ＡＥ標識化検出プローブを（配列番号１２１及び１２２、
各々２５μｌのプローブ試薬中０．００７〜０．１３ピコモル／反応で）用いて、これを
増幅ＨＡＶ配列へのプローブのハイブリダイゼーションのために６０℃で１５分間インキ
ュベートして検出した。その後、２５０μｌの選択試薬を加えて、本混合物を６０℃で１
０分インキュベートして、非結合プローブ上の標識を加水分解し、上記のように検出試薬
Ｉ及びＩＩを用いて検出を実施し、化学発光（ＲＬＵ）を産生して、ルミノメーター（Ｌ
ＥＡＤＥＲＴＭＨＭ Ｐｌｕｓ，Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ社）で測定した。本結果は、本アッ
セイが、２５ＨＡＶ／ｍｌを含有する試料で約８０〜１００％、３０ＨＡＶ／ｍｌを含有
する試料で約９０〜１００％、１００ＨＡＶ／ｍｌを含有する試料で約９８〜１００％、
そして３００及び５００ＨＡＶ／ｍｌを含有する試料で１００％の感度であることを示し
た。陰性対照（ＨＡＶを含有しない）では、陽性結果が検出されなかった。上記の結果は
、本アッセイが臨床試料中のＨＡＶを１ｍｌの試料につき約２５コピーのＨＡＶの感度で
検出することを示す。
本実施例は、ＨＡＶ陽性血漿試料中のＨＡＶ核酸を検出したアッセイを用いる。試料を
調製するために、ヒト血漿中のＨＡＶの市販ストックをＨＡＶ陰性血漿へ希釈して、２５
、３０、１００、３００及び５００ＨＡＶコピー／ｍｌの試料を得た；陰性対照は、ＨＡ
Ｖなしの血漿であった。各アッセイでは、２０回の反復試料で実施して、捕捉オリゴマー
の配列番号４（６．５ピコモル／反応）及び配列番号５（１．３ピコモル／反応）を含有
する０．４ｍｌの標的捕捉試薬と０．５ｍｌの試料を混合して、標的捕捉工程は、６０℃
で２０分のインキュベーションを用いること以外は、実質的に実施例３に記載のように実
施した。各アッセイで、ＨＡＶ ＲＮＡに結合した配列番号４及び５の捕捉オリゴマーを
含むハイブリダイゼーション複合体が付いた洗浄済みの磁気粒子を、増幅オリゴマーを（
配列番号３６は１３ピコモル／反応で、配列番号９６は２０ピコモル／反応で）含有する
７５μｌの増幅試薬を含有する増幅反応物に使用した。上記のように、各混合物をオイル
層で覆い、６０℃で１０分インキュベートし、酵素試薬（２５μｌ）を加えて、本混合物
を４１．５℃で６０分間インキュベートして、ＨＡＶ標的配列を増幅できるようにした。
増幅した配列は、２−メチル−ＡＥ標識化検出プローブを（配列番号１２１及び１２２、
各々２５μｌのプローブ試薬中０．００７〜０．１３ピコモル／反応で）用いて、これを
増幅ＨＡＶ配列へのプローブのハイブリダイゼーションのために６０℃で１５分間インキ
ュベートして検出した。その後、２５０μｌの選択試薬を加えて、本混合物を６０℃で１
０分インキュベートして、非結合プローブ上の標識を加水分解し、上記のように検出試薬
Ｉ及びＩＩを用いて検出を実施し、化学発光（ＲＬＵ）を産生して、ルミノメーター（Ｌ
ＥＡＤＥＲＴＭＨＭ Ｐｌｕｓ，Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ社）で測定した。本結果は、本アッ
セイが、２５ＨＡＶ／ｍｌを含有する試料で約８０〜１００％、３０ＨＡＶ／ｍｌを含有
する試料で約９０〜１００％、１００ＨＡＶ／ｍｌを含有する試料で約９８〜１００％、
そして３００及び５００ＨＡＶ／ｍｌを含有する試料で１００％の感度であることを示し
た。陰性対照（ＨＡＶを含有しない）では、陽性結果が検出されなかった。上記の結果は
、本アッセイが臨床試料中のＨＡＶを１ｍｌの試料につき約２５コピーのＨＡＶの感度で
検出することを示す。
同一試料中のＨＡＶ ＲＮＡと他のウイルス標的の検出
本アッセイには、実質的に実施例１〜４に記載のＨＡＶを検出する標的捕捉、増幅及び
検出の工程が含まれ、本試料中の他の標的、ヒトパルボウイルスＢ１９を捕捉、増幅及び
検出するための他のオリゴマーを含む。ＨＡＶを検出するための捕捉オリゴマーは配列番
号４及び５であり、増幅オリゴマーは配列番号３６及び９６であり、そして検出プローブ
は配列番号１２１及び１２２であり、実質的に実施例４に記載のように用いた。パルボウ
イルスＢ１９の核酸を検出するには、パルボウイルスＢ１９を検出するための既報のアッ
セイ（米国特許公開公報番号ＵＳ−２００３−０１２４５７８−Ａ１）と同様に、配列番
号１６９の捕捉プローブ、配列番号１７０及び１７１の増幅オリゴマー、残基５と６の間
で標識した配列番号１７３と残基９と１０の間で標識した配列番号１７４の検出プローブ
を用いる。既知量のＨＡＶ及びパルボウイルスＢ１９が含まれるように０．５ｍｌの正常
ヒト血漿の試料を調製し、捕捉オリゴマー（配列番号４、５及び１６９）を含有する０．
４ｍｌの標的捕捉試薬と混合する。実質的に実施例２に記載のように標的捕捉工程を実施
して、上記のＨＡＶ特異的及びパルボウイルス特異的な増幅オリゴマーを用いること以外
は、実質的に実施例３及び４に記載のように、精製したウイルス標的を同じ増幅反応混合
物中で増幅させる。ウイルス標的配列の増幅に続き、検出工程は、上記のようなＨＡＶ特
異的プローブとパルボウイルス特異的プローブを用いるが、異なるウイルス標的のプロー
ブは異なるＡＥ化合物で標識して、ディファレンシャル速度論を用いて、検出工程におい
て異なるシグナルの検出を可能にする（米国特許第５，６５８，７３７号に記載）。本ア
ッセイにおいて、ＨＡＶとパルボウイルス１９のいずれの核酸も、両方の標的を含有する
試料中に検出される。ＨＡＶの検出のアッセイの感度は約２５コピー／ｍｌであり、即ち
、２５、３０、１００、３００及び５００コピーのＨＡＶを１ｍｌに含有する試料の８０
％〜１００％で陽性シグナルを検出する。試料中のパルボウイルスＢ１９の検出のアッセ
イ感度は１５０国際単位／ｍｌ（ＩＵ／ｍｌ）程度低く、即ち、１５０ＩＵ／ｍｌを含有
する試料の２０％〜４０％で陽性シグナルを検出する。本アッセイは、４００以上のパル
ボウイルスＢ１９ ＩＵ／ｍｌを信頼し得るほどに検出する、即ち、４００、６００、８
００、１６００及び３０００ＩＵ／ｍｌを含有する試料で７０％〜１００％の陽性検出で
ある。上記の結果は、ＨＡＶと（やはり特異的に検出される）他のウイルス、パルボウイ
ルスＢ１９が試料に含まれる場合にもＨＡＶ核酸が特異的に検出されることを示す。
本アッセイには、実質的に実施例１〜４に記載のＨＡＶを検出する標的捕捉、増幅及び
検出の工程が含まれ、本試料中の他の標的、ヒトパルボウイルスＢ１９を捕捉、増幅及び
検出するための他のオリゴマーを含む。ＨＡＶを検出するための捕捉オリゴマーは配列番
号４及び５であり、増幅オリゴマーは配列番号３６及び９６であり、そして検出プローブ
は配列番号１２１及び１２２であり、実質的に実施例４に記載のように用いた。パルボウ
イルスＢ１９の核酸を検出するには、パルボウイルスＢ１９を検出するための既報のアッ
セイ（米国特許公開公報番号ＵＳ−２００３−０１２４５７８−Ａ１）と同様に、配列番
号１６９の捕捉プローブ、配列番号１７０及び１７１の増幅オリゴマー、残基５と６の間
で標識した配列番号１７３と残基９と１０の間で標識した配列番号１７４の検出プローブ
を用いる。既知量のＨＡＶ及びパルボウイルスＢ１９が含まれるように０．５ｍｌの正常
ヒト血漿の試料を調製し、捕捉オリゴマー（配列番号４、５及び１６９）を含有する０．
４ｍｌの標的捕捉試薬と混合する。実質的に実施例２に記載のように標的捕捉工程を実施
して、上記のＨＡＶ特異的及びパルボウイルス特異的な増幅オリゴマーを用いること以外
は、実質的に実施例３及び４に記載のように、精製したウイルス標的を同じ増幅反応混合
物中で増幅させる。ウイルス標的配列の増幅に続き、検出工程は、上記のようなＨＡＶ特
異的プローブとパルボウイルス特異的プローブを用いるが、異なるウイルス標的のプロー
ブは異なるＡＥ化合物で標識して、ディファレンシャル速度論を用いて、検出工程におい
て異なるシグナルの検出を可能にする（米国特許第５，６５８，７３７号に記載）。本ア
ッセイにおいて、ＨＡＶとパルボウイルス１９のいずれの核酸も、両方の標的を含有する
試料中に検出される。ＨＡＶの検出のアッセイの感度は約２５コピー／ｍｌであり、即ち
、２５、３０、１００、３００及び５００コピーのＨＡＶを１ｍｌに含有する試料の８０
％〜１００％で陽性シグナルを検出する。試料中のパルボウイルスＢ１９の検出のアッセ
イ感度は１５０国際単位／ｍｌ（ＩＵ／ｍｌ）程度低く、即ち、１５０ＩＵ／ｍｌを含有
する試料の２０％〜４０％で陽性シグナルを検出する。本アッセイは、４００以上のパル
ボウイルスＢ１９ ＩＵ／ｍｌを信頼し得るほどに検出する、即ち、４００、６００、８
００、１６００及び３０００ＩＵ／ｍｌを含有する試料で７０％〜１００％の陽性検出で
ある。上記の結果は、ＨＡＶと（やはり特異的に検出される）他のウイルス、パルボウイ
ルスＢ１９が試料に含まれる場合にもＨＡＶ核酸が特異的に検出されることを示す。
Claims (17)
- Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）標的領域を増幅するための少なくとも２つのオリゴマーの組合せであって、該オリゴマーが、
少なくとも配列番号１５０の配列を含む配列番号１４９の配列に含まれる長さ１９〜３１ヌクレオチドのオリゴマー；および
配列番号３４〜４０のいずれか１つのＨＡＶ標的特異部分を含む長さ５１〜５６ヌクレオチドの範囲の大きさのプロモータープライマーオリゴマー
からなる群より選択される、組合せ。 - 前記オリゴマーの配列が、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号９７、配列番号１４９および配列番号１５０からなる群より選択される、請求項１に記載の少なくとも２つのオリゴマーの組合せ。
- 請求項１または２に記載の少なくとも２つのオリゴマーの組合せであって、少なくとも１つの捕捉プローブオリゴマーをさらに含み、ここで該少なくとも１つの捕捉プローブオリゴマーが、配列番号１〜７、および、配列番号８〜１４より選択される標的特異部分を持つ捕捉プローブオリゴマーからなる群より選択される配列を含む、組合せ。
- 配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、および配列番号１２６からなる群より選択される、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡ配列を含む少なくとも１つの検出プローブオリゴマーをさらに含む、請求項１、２または３に記載の少なくとも２つのオリゴマーの組合せ。
- 前記検出プローブの少なくとも１つの骨格の結合が２’−Ｏ−メチル結合である、請求項４に記載の組合せ。
- 前記検出プローブが検出可能標識をさらに含む、請求項４または５に記載の組合せ。
- 前記検出可能標識が化学発光標識である、請求項６に記載の組合せ。
- 請求項１〜７のいずれか１項において規定されるオリゴマーの組合せを含むキット。
- 試料中のＡ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）の存在を検出する方法であって：
ＨＡＶを含有する試料中の他の成分からＨＡＶ核酸を精製する工程；
選択したＨＡＶ標的領域に特異的な少なくとも２つの増幅オリゴマーを含むインビトロ増幅反応を用いることにより、精製したＨＡＶ核酸又はそれから作製されるｃＤＮＡ中のＨＡＶ標的配列を増幅して、該選択したＨＡＶ標的領域の増幅産物を生成する工程であって、
該少なくとも２つの増幅オリゴマーは、少なくとも配列番号１５０の配列を含む配列番号１４９の配列に含まれる長さ１９〜３１ヌクレオチドのオリゴマー、および
配列番号３４〜４０のいずれか１つのＨＡＶ標的特異部分を含む長さ５１〜５６ヌクレオチドの範囲の大きさのプロモータープライマーオリゴマー
からなる群より選択されるオリゴマーを含む、工程；並びに
該増幅産物と特異的にハイブリダイズする検出プローブを用いることにより該増幅産物を検出する工程
を含む、方法。 - 請求項９の方法であって、ここで前記精製工程において、前記試料を、ＨＡＶ ＲＮＡ中の配列に特異的にハイブリダイズする、配列番号１〜１４のいずれか１つに含まれる配列を含む少なくとも１つの捕捉プローブオリゴマーと接触させて、該ＨＡＶ ＲＮＡとのハイブリダイゼーション複合体を形成させ、そして該ＨＡＶ ＲＮＡを含有する該ハイブリダイゼーション複合体を他の試料成分から分離する、方法。
- 前記増幅工程が、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号９７、配列番号１４９および配列番号１５０からなる群より選択されるＨＡＶ標的領域に特異的な少なくとも２つのオリゴマーを使用することによって第１のＨＡＶ標的領域中の配列を増幅し、そして、前記検出工程が、該ＨＡＶ標的領域の増幅産物に特異的にハイブリダイズする少なくとも１つの検出プローブを使用する、請求項９または１０に記載の方法。
- 前記検出プローブが、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、および配列番号１２６からなる群より選択される、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡ配列を含む、請求項９、１０または１１に記載の方法。
- 前記検出プローブの少なくとも１つの骨格の結合が２’−Ｏ−メチル結合である、請求項１２に記載の方法。
- 前記検出プローブが検出可能標識をさらに含む、請求項１２または１３に記載の方法。
- 前記検出可能標識が化学発光標識である、請求項１４に記載の方法。
- 配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１〜配列番号１２４、および配列番号１２６〜配列番号１３０からなる群より選択される少なくとも１つの検出プローブオリゴマーをさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の少なくとも２つのオリゴマーの組合せ。
- 請求項１６において規定されるオリゴマーの組合せを含むキット。
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