KR100419842B1

KR100419842B1 - 한국에서 분리한 신규한 에이형 간염바이러스 뉴클레오티드 서열

Info

Publication number: KR100419842B1
Application number: KR10-2001-0018829A
Authority: KR
Inventors: 송진원; 김종헌; 변관수; 송기준
Original assignee: 부광약품 주식회사; 송진원
Priority date: 2001-04-10
Filing date: 2001-04-10
Publication date: 2004-02-25
Also published as: KR20020078708A

Abstract

본 발명은 한국의 급성 간염 환자의 혈청으로부터 분리한 신규한 한국형 A형 간염바이러스(HAV-YHA34)의 지놈(Genome)전체의 뉴클레오티드 서열과 이로부터 번역되는 아미노산 서열에 관한 것이다.

또한 본 발명은 본 발명의 유전자로부터 번역되는 아미노산 서열의 단백질로 제조되는 항원을 제공한다.

Description

한국에서 분리한 신규한 에이형 간염바이러스 뉴클레오티드 서열{The Novel Nucleotide Seguence of Hepatitis A Virus from Korean Patients}

본 발명은 한국의 급성간염환자 혈청으로부터 분리한 신규한 A형 간염바이러스의 유전자 및 그로부터 번역되는 아미노산 서열에 관한 것이다.

A형 간염바이러스(hepatitis A virus, 이하'HAV'라고 함)는 피코르나비리대 (picornaviridae)과의 헤파토비루스(hepatovirus)속으로 분류된다.

A형 간염의 임상상은 발열, 식욕감퇴, 구역, 구토, 쇠약감, 설사 등 다른 바이러스 감염과 유사하지만 유소아기의 감염은 증상이 없는 불현성 감염으로 나타나며 연령이 증가할수록 증상이 심해지는 것이 특징이다.

일반적으로 6세 이하의 소아에서는 대부분 증상이 없으며 증상이 있더라도 경미하여 간염으로 진단 받지 못하고 지나는 경우가 많고 성인에서는 대부분 증상을 보이고 황달을 동반한 예도 70% 이상으로 알려져 있다.

따라서 아프리카, 아시아의 일부 저개발 지역 주민에서는 유소아기의 불현성 감염으로 대부분 항체를 보유하게 되어 성인에서 현증 A형 간염은 매우 드문 것으로 알려져 있다. 그러나, 개인 위생 및 생활환경이 양호한 선진국에서는 A형 간염의 이환율이 매우 낮아 성인에서의 항체 보유율이 매우 낮고 따라서 환자와 접촉이 가능한 제한된 지역이나 격리된 장소에서 근무하는 고 위험군 성인(군인, 탁아소 근무자, 유행지역 여행자 등)에서 현증 A형 간염이 발생되어 사회, 경제 적 손실을 초래할 수 있다.

한국은 최근 20여 년 동안 눈부신 경제적 성장을 이루었고 이에 따라 위생 및 생활환경의 개선이 동반되었다. 따라서 소아, 청소년, 그리고 젊은 성인층에서 A형 간염항체의 보유율은 현격히 감소하였고, 역설적으로 성인 연령층에서 현증 A형 간염발생 위험은 더욱 증가하게 되었다.

1980년도에 1세에서 20세 사이의 항체 보유율은 60% 였으나 1995년에는 9%로매우 낮아지게 되었고 1990년대 초반에는 소수의 A형 간염환자가 보고되었으나, 1998년에는 1500명 정도의 A형 간염환자가 국내에서 발생한 점이 이를 입증하고 있다.

한편, A형 간염바이러스(HAV)는 약 7.5kb길이의 뉴클레오티드로 구성된 선형의 단일양성가닥(single-stranded positive sense)RNA 바이러스로, 다른 피코르나바이러스(picornabirus)와 같이 한 개의 큰 개방해독틀(open reading frame, ORF)을 가지고 있다.

HAV지놈은 P1, P2, P3, 이라는 3개의 기능적 구역으로 나누어지고, 이중 P1지놈 구역은 VP1, VP2, VP3, VP4로 불리는 캡시드 폴리펩티드를 구성한다.

P2, P3 구역은 바이러스 증식에 필요한 비구조적 폴리펩티드를 구성하는 것으로 알려졌다. (도1참조)

종전까지 HAV에 대하여 서로 다른 지역에서 분리한 아래와 같은 11개의 HAV 전체 지놈 서열이 알려져 있다.

(1) HAV-FH1-Japan (AB020567)

(2) HAV-FH2-Japan (AB020568)

(3) HAV-FH3-Japan (AB020569)

(4) HAV-AH1-Japan (AB020564)

(5) HAV-AH2-Japan (AB020565)

(6) HAV-AH3-Japan (AB020566)

(7) HAV-LA85-USA (K02990)

(8) HAV-MBB-N.Africa (M20273)

(9) HAV-HM175-wild type-Australia (M14707)

(10) HAV-HM175-Australia (NC001489)

(11) HAV-HM175 (attenuated)

이와 같이 각각 다른 뉴클레오티드 서열을 비교하여 보면, 서열의 다양성(Seguence diversity)에 유의성이 있음을 알 수 있다.

예를 들어, 호주에서 분리한 것과 일본에서 분리한 것간에는 93% 정도의 서열 상동성(Seguence Homology)을 보이고 있는 것이다.

이러한 관찰결과는 몇몇의 유전자형이 다양한 지역에서 공존하며, 세계 여러지역으로부터 얻어지는 더 많은 서열자료들이 HAV 유전자형의 이질성 (heterogeneity)을 확인하기 위해 필요하다는 점이 지적되어 왔다.

HAV의 유전자 서열이 호주, 일본, 미국등지에서 분리되어 왔지만 이들 나라 이외의 지역에서는 서열정보가 적고, 특히 한국에서는 아직까지 HAV의 전체 지놈서열에 대한 정보가 전혀 없는 실정이었다.

한편, 한국에서의 종래의 간염바이러스에 대해서는 한국특허출원 1994-014115(한국에서 분리한 신규한 씨형 바이러스 유전자), 한국특허출원 1998-0027236(C형 간염바이러스에 대한 DNA면역 백신), 한국특허출원 1998-0032644(B형 간염바이러스의 표면항원 S에 대한 인간화항체 및 이의 제조방법)등이 있으나, 본원 발명의 A형 간염바이러스와는 다른 C형 또는 B형 간염바이러스에 관한 것들이었다.

1998년 국내에서 1,500여명의 A형 간염환자가 주로 20∼30대에 폭발적으로 발생하여 유행함으로써 A형 간염바이러스에 대한 유전자 분석과 역학조사 및 체계적인 방제대책 수립이 시급하게 요구되었다.

하지만 종전까지는 국내에서 분리한 A형 간염바이러스의 유전자 염기 서열등에 대한 정보가 전혀 없었고, 한국형 A형 간염바이러스 항원을 진단하는 방법도 확립되어 있지 못했다.

또한 A형 간염 백신으로는 호주에서 분리한 HM175 주를 이용하여 만든 예방백신(Havrix)을 수입하여 사용했기 때문에, 한국형 A형 바이러스에 대한 보다 정확한 예방이 어려웠고, 수입에 따른 외화유출도 있었다.

본 발명의 발명자들은 한국의 급성간염을 앓고 있는 환자의 혈청으로부터 분리한 HAV(이하 'HAV-YHA34'라고 함) 지놈의 전체 서열을 밝히고, 이것을 기존에 알려진 서열들과 비교한 결과 이 서열이 신규하고 유용성이 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 한국에서 분리한 신규한 한국형 간염바이러스 HAV-YHA34 지놈 전체의 뉴클레오티드 서열을 제공함을 주목적으로 한다.

본 발명의 두 번째 목적은 상기 HAV-YHA34 유전자 서열로부터 번역된 아미노산 서열을 제공하는 것이다.

본 발명의 세 번째 목적은 상기 HAV-YHA34 유전자 및 번역된 아미노산 서열의 단백질로부터, 제조되는 항원을 제공하는데 있다.

도1은 본 발명의 한국형 A형 간염바이러스(HAV-YHA34) 전체 cDNA 클론의 유전자 지도를 나타낸다.

도2는 본 발명의 한국형 A형 간염바이러스(HAV-YHA34) 전체 뉴클레오티드 서열을 얻기 위한 8개 분절의 위치와 길이를 나타낸다.

도3는 본 발명의 한국형 A형 간염바이러스(HAV-YHA34) 전체 뉴클레오티드 서열의 계통수(phylogenetic tree)에서의 위치를 나타낸 도표이다.

도4은 본 발명의 한국형 A형 간염바이러스(HAV-YHA34) 전체 아미노산 서열의 계통수(phylogenetic tree)에서의 위치를 나타낸 도표이다.

국내에서 발생한 A형 간염환자의 혈청으로부터 RNA를 추출하고, 프라미어를 설계한 다음 역전사 - 중합효소연쇄반응법(RT-PCR)으로 A형 간염바이러스 유전자를 대량 증폭하였다.

PCR산물을 DNA 정제시스템으로 정제한 다음 자동 염기 서열 분석기로 바이러스의 염기 서열을 결정했다.

HAV-YHA34의 전체지놈은 첨부된 염기 서열 목록의 서열번호 1에 나타낸바와 같이 7,477bp로 확인되었다.

이 염기 서열로부터 서열번호 2의 2,227개 아미노산 서열을 추론해 냈다.

확인된 염기 서열과 아미노산 서열은 DNASTAR의 메가라인(Megalign)프로그램을 이용하여 이전에 보고된 HAV의 서열들과 비교분석하였다.

이하 실시예를 들어 본 발명을 자세히 설명한다.

<실시예 1> (인간 혈청으로부터 RNA 추출)

항-HAV 항체에 양성반응을 보인 반면 기타 다른 간염을 나타내는 표지자에는 음성을 나타내는 간염환자의 혈청을 고려대학교 구로병원에서 얻었다.

냉동고에 보관했던 혈청 100㎕에 Tri-pure 1㎖을 섞은 후 클로로포름 200㎕를 더한 다음 이소푸로파놀 600㎕로 침전시켜 RNA를 추출하였다.(Tri-pure extraction kit 사용, Boehringer Mannheim, Germany)

<실시예2> (올리고 뉴클레오티드 프라이머의 합성)

본 발명의 HAV-YHA34 지놈의 클로닝을 위한 프라이머는 하기 표1에 개시된 서열을 합성하여 사용하였다.

[표1]

본 발명의 HAV-YHA34 지놈의 클로닝을 위한 PCR 증폭에 사용한 프라이머의 염기 서열

Seg IDNO

Primer list for amplification of HAV

345678910111213141516

Upper primerHAV F1:5'- TTC AAG AGG GGT CTC CG- 3'HAV F1(2):5'- TTC AAG AGG GGT CTC CGG AG- 3'HAV F1(3):5'- TTC AAG AGG GGT CTC- 3'HAV F45:5'- CCA TGG TGA GGG GAC TTG ATA CHAV F659:5'- TCT TTG GGG CCT TAT GTG GTG TTT- 3'HAV F690:5'- AGG TAC TCA GGG GCA TTT AGG TT- 3'HAV F1005:5'- GGC TCA CTA CAC ATG CTC TTT TTC- 3'HAV F1439:5'- TTG CAT GGG TTA ACT CCT CTT TCT- 3' ¹ HAV F2020 :5- ACA GGT ATA CAA AGT CAG-3 ² HAV F2167 :5- GTT TTG CTC CTC TTT ATC ATG CTA TG-3HAV F2713:5'- TTG GGT KGA AAA GGA GTC AGC- 3'HAV F2870:5'- GAC AGA TTC TAC ATT TGG ATT GGT- 3'HAV F2897:5'- CTA TTC AGA TTG CAA ATT ACA AT- 3'HAV F2982:5'- TTC CTA GAG CTC CAT TAA A- 3'

1718192021222324252627282930313233343536373839

³ HAV F2984 :5- TCC CAG AGC TCC ATT GAA-3HAV F3343:5'- TAT GGC YGC TGG TAG AAG TG- 3'HAV F3671:5'- CAG GGT GTT GGG TTG ATA GCA - 3'HAV F3892:5'- TAT TGG CTG CTC AGT TAT CTC AT - 3'HAV F4277:5'- ATG GCT CAA GTC GAC CCT AAC C- 3'HAV F4429:5'- AGG RGG AGG GAA RAG YTT GAC- 3' HAV F4582:5'- TGG CCA AAA YAC AAC AGA TGA AGA- 3'HAV F5190:5'- CCC GCA AAG AGG AAG AAC C - 3'HAV F5384:5'- TTG GGA GTG AAG GAT GAT TG - 3'HAV F6091:5'- TCC AAT GGC TGT GAT GTT AT- 3'HAV F6543:5'- GGG GTC CAG CTA TTA GTT ATT TTC - 3'HAV F6714:5-TGA TCA GGG AGG CGG GTA GA-3HAV F7170:5'- TTA GRC CTG CAA TTT C- 3'Lower primer HAV R145:5'- TTA CAA ACA AAA CAA AAG GA- 3'HAV R350:5'- ACT GCA AGG CGA CGT CCC AAA CAT- 3'HAV R374:5'- GGT TCA TGA AAG CCA AGT TA- 3'HAV R467:5'- TAT CCG CCG CTG TTA CCC TAT CC- 3'HAV R504:5'- TCG GCG TTG AAT GGT TTT TGT CTT- 3'HAV R785:5'- GGT CAA GGC CAC TCC CAA CAG- 3'HAV R1158:5'- AAG GGT GTG GGG TTT ATC TGA - 3'HAV R1657:5'- CTG GGC AGC TAA AGT TGG A - 3'HAV R1806:5'- CCC CTC CAA AAR CAA AAC ATC TG- 3' HAV R1941:5'- GCA CAA GGG GCA GTA GTT- 3'

404142434445464748495051525354

⁴ HAV R2211 :5-CTC CAG AAT GAT C-3 ⁵ HAV R2389 :5-GGA AAT GTC TCA GGT ACT TTC TTT G 3HAV R2868:5'- TTA TCY CCC ARA CCA TCC AGT GCT- 3' ⁶ HAV R3265 :5-CAT TAT TTC ATG CTC CTC AG-3 HAV R3288:5'- AAC TTC ATT ATT TCA TGC TCC T- 3'HAV R3381:5'- CCA TTT CAA GAG TCC ACA CAC T- 3'HAV R4443:5'- CTC TTC CCT CCC CCT CTT TT - 3'HAV R4443:5'- CTC TTC CCT CCC CCT CTT TT - 3'HAV R5505:5'- TTK CCW GCT GAA ATT GAR TAG TA- 3'HAV R5819:5'- CCA GRG CCC CAC CAC AC- 3'HAV R5820:5'- ACC AGA GCC CCA CCA CA - 3'HAV R6250:5'- RCC TGG AGC CCC TGT AAT GG- 3'HAV R6736:5'- GAT TCY ACC CGC CTC CCT RAT- 3'HAV R7117:5'- TGG CTT CAG TTG AGG CAC ATT- 3'HAV R7479:5'- ATT TAC TGA TAA AAG AAA TAA AC- 3'

* primer 이름의 번호는 5 끝에 해당하는 HAV genome 위치.**1-6 ; 아래 논문들에서 인용한 primer1, 3, 4, 6 ; PNASUSA, 87, 2867-2871, 19902, 5 ; Journal of Infectious Disease, 163, 286-292, 19916 ; Journal of General virology, 73, 1365-1377, 1992*** ; 나머지 primer들은 기존에 보고된 HAV 유전자 염기 서열을 바탕으로 본 발명에서 자체 설계

<실시예3> (RT-PCR에 의한 증폭)

실시예1에서 얻어진 RNA pellet을 75% 에탄올로 씻은 다음, total RNA 10㎕에 cDNA 합성을 위해 primer 0.1㎛을 첨가하고 70℃에서 10분간 RNA를 denature 시키고 효소 혼합물(enzyme mixture) 8㎕을 첨가하고 42℃에서 1시간 Thermal PCR 기기(Perkin Eler 480)를 이용, 반응시켰다. 효소 혼합물은 5x RT 버퍼 4㎕, dNTPs (200㎛) 1㎕, 200units Superscript Ⅱ RNase Reverse Transcriptase enzyme(GIBCOBRL Gaithersburg, MD, USA), DTT(Dithiothreitol, 0.1 mM) 2㎕를 혼합하여 만들었다. cDNA 합성에 사용된 primer는 모두 4종으로 HAV R467, HAV R2389, HAV R 5280 및 HAV R7479 였다.

HAV-YHA34주의 전체게놈 염기서열을 얻기 위해 7,477bp 길이의 전체 게놈을 8개의 분절로 나누어 PCR을 진행하였다. 이들 8개 분절의 위치 및 길이는 다음과 같고 도 2에 표시되어 있다. (분절1; 염기서열 1-385, 분절2; 염기서열 45-785, 분절3; 염기서열 690-1, 159, 분절4; 염기서열 1,005-2, 389, 분절5; 염기서열 2,167-3, 265, 분절6; 2,984-4, 443, 분절7; 염기서열 3,343-5, 505, 분절8; 염기서열 5,384-7, 477) 아우터 프리미어 셋트(outer primer set)에 5 units의 Taq polymerase (Boehringer Mannhein, Germany)를 놓고 PCR기기(Perkin Elmer Cetus 9600, USA)를 이용하여 95℃ 40초, 45-55℃ 1분, 72℃ 1-3분을 45회 반복하여 첫 번째 PCR을 시행하였다.

여기서 얻어진 PCR 산물 10㎕로 이너 프라미어 셋트(inner primer set)를 사용하여 같은 조건으로 45회 반복하여, 두 번째 PCR을 하였다.

본 발명에 사용된 51종의 프라미어들은 표 1에 정리되어 있다.

이 nested-PCR에서 포지티브 콘트롤(positive control)은 호주에서 분리된 HM 175주의 세포배양 상층액을 사용하였으며 네거티브 콘트롤(negative control)은 증류수(Ultraspec water, Biotecx laboratories, USA)를 사용하였고 매 실험마다 양성 및 음성 대조군을 포함하여 실험하였다. PCR 산물을 1.5% 아가로스 겔에서 전기영동한 후 에티디움 브로마이드(ethidium bromide ; 0.5㎎/㎖)로 염색하여 UV하에서 결과를 확인후 촬영하였다.

<실시예4> (HAV-YHA34전체 염기 서열 결정 및 그로부터 아미노산 서열의 결정)

PCR 산물은 DNA 정제시스템(Wizard PCR Preps DNA Purification System, Promega, USA)으로 정제하였다.

DNA염기 서열 결정은 자동 염기분석기(모델 377A, Perkin Elmer Cetus, USA)에서 킷트(Dye termination cycle seguencing ready reaction kit, Applied Biosystems Inc., USA)를 이용하여 각 PCR산물의 양방향으로 시행하였다.

본 발명의 A형 간염바이러스 HAV-YHA34는 첨부된 서열목록의 서열번호 1에 나타난 바와 같이 전체 7,477bp가 확인되었다.

이 염기 서열로부터 서열번호 2의 2,227개의 아미노산 서열을 추론해 냈다.

<실시예5> (다른 HAV 클론들과의 서열 비교)

확인된 염기 서열과 아미노산 서열을 DNASTAR의 메가라인(Megalign)프로그램을 이용하여 기존에 보고된 HAV들의 염기 서열 및 아미노산 서열을 비교하였다.

그 결과는 표2에 나타냈다.

[표2] HAV-YHA34와 공지의 HAV와의 염기 서열과 아미노산 서열 비교

HAV strain	YHA34	FH1	FH2	FH3	AH1	AH2	AH3	LA85 USA	MBB(M20273)	HM175 (M14707)	HM175 (NC001489)	HM175 attenuated
YHA34 Korea	_	1.0	3.5	3.4	3.5	3.7	3.7	4.0	8.3	8.3	8.3	8.4
FH1 Japan	0.6	_	3.4	3.3	3.5	3.6	3.7	4.1	8.3	8.2	8.2	8.3
FH2 Japan	0.8	0.9	_	3.1	1.9	3.4	3.5	4.5	8.6	8.6	8.6	8.8
FH3 Japan	0.7	0.8	0.6	_	2.9	2.9	3.0	3.9	8.1	8.2	8.2	8.3
AH1 Japan	0.9	1.0	0.5	0.6	_	3.2	3.3	4.2	8.6	8.7	8.7	8.8
AH2 Japan	0.6	0.7	0.5	0.4	0.5	_	1.7	4.3	8.5	8.6	8.6	8.8
AH3 Japan	0.9	1.1	0.9	0.7	0.9	0.5	_	4.3	8.6	8.8	8.8	9.0
LA85 USA	1.1	1.2	1.1	0.9	1.2	0.9	1.3	_	8.4	8.3	8.3	8.5
MBB(M20273)	1.8	1.9	1.8	1.6	1.9	1.7	1.9	1.9	_	4.9	4.9	5.0
HM175(M14707)	1.2	1.3	1.3	1.0	1.3	1.1	1.4	1.4	0.8	_	0.0	0.5
HM175(NC001489)	1.2	1.3	1.3	1.0	1.3	1.1	1.4	1.4	0.8	0.0	_	0.5
HM175 attenuated	1.6	1.7	1.7	1.4	1.8	1.5	1.8	1.8	1.0	0.5	0.5	_

Note. Pairwise distances based on the entire genome of hepatitis A virus are presented as a triangular matrix. Nucleotide distances are presented in the top half and amino acid distances in the bottom half.

표 2에서 보듯이, 염기 서열의 차이는 한국에서 분리된 HAV-YHA34와 일본에서 분리된 FH1과는 1.0%, FH2, FH3, AH1, AH2, AH3와 미국에서 분리된 LA85와는 3.4%∼4.0%, 아프리카에서 분리된 MBB와 호주에서 분리된 HM175와는 8.3∼8.4%의 차이를 나타냈다.

또한 아미노산 서열의 차이는 한국에서 분리된 HAV-YHA34와 일본에서 분리된FH1과는 0.6%, FH2, FH3, AH1, AH2, AH3와는 0.6%∼0.9%의 차이를 나타냈고, 미국에서 분리된 LA85와 아프리카에서 분리된 MBB 및 호주에서 분리된 HM175와는 1.1∼1.8%의 차이를 나타냈다.

위 결과를 보면 한국에서 분리된 HAV-YHA34와 일본에서 분리된 FH1과는 밀접한 관계가 있는 독특한 아형(subtype)임이 확인되었다.

또한, 호주에서 분리된 HM175와 미국에서 분리된 LA85 및 일본에서 분리된 AH1, AH2, AH3는 서로 다른 아형인 것으로 나타냈다.(도3, 도4 참조)

특히 본 발명의 HAV-YHA34는 현재 간염백신 제조에 사용되고 있는 호주에서 분리된 HM175 attenuated와는 뉴클레오티드 서열에서 8.4%의 차이를, 아미노산 서열에서 1.6%의 차이를 나타내고 있다.

본 발명에서 공지의 HAV유형과는 다른 독특한 한국형 A형 간염바이러스 HAV-YHA34 전체 지놈의 뉴클레오티드 서열이 제공되고, 이로부터 번역되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 항원이 제공된다.

이에 따라 한국형 A형 간염바이러스 진단이 보다 정확해지고, 보다 우수한 A형 간염바이러스 백신을 제조하여 사용할 수 있게되며, 현재 전량 수입되어 사용되고 있는 A형 간염예방 백신의 국산화가 가능하게 된다.

Claims

서열번호 1의 한국형 A형 간염 백신 제조용으로 이용되는 간염바이러스(HAV-YHA34) 뉴클레오티드 서열.
제 1항의 뉴클레오티드 서열로부터 번역되는 서열번호 2의 아미노산 서열.
제 2항의 아미노산 서열을 포함하는 한국형 A형 간염바이러스(HAV-YHA34) 항원.