KR100748842B1

KR100748842B1 - 에이형 간염바이러스에 대한 항체 제조방법 및 그 응용

Info

Publication number: KR100748842B1
Application number: KR1020040072212A
Authority: KR
Inventors: 오호경; 허철성; 백영진; 유동완
Original assignee: 주식회사한국야쿠르트
Priority date: 2004-09-09
Filing date: 2004-09-09
Publication date: 2007-08-13
Also published as: KR20060023384A

Abstract

본 발명은 A형 간염바이러스에 대한 항체 제조방법 및 그 응용에 관한 것으로, A형 간염바이러스 감염환자로부터 분리한 A형 간염바이러스로부터 바이러스 감염 억제에 관련된 캡시드단백질인 VP1 유전자를 얻은후 이를 대장균에 재조합함으로써 단백질을 대량으로 생산하고, 이를 항원으로 사용하여 젖소를 포함한 포유류로부터 항 A형 간염바이러스 항체가 함유된 면역항체를 생산하여, 급성간염등의 원인인 A형 간염바이러스에 대한 예방의학적 기능성 소재를 생산하는 방법에 관한 것이다.

A형, 간염바이러스, 항체, 제조방법, 응용, 감염, 분리, 캡시드단백질, VP1 유전자

Description

에이형 간염바이러스에 대한 항체 제조방법 및 그 응용{Methods of Manufacturing Recombinant Antibody from Hepatitis A Virus and Applications Thereof}

도1은 재조합 캡시드항원 VP1 유전자 증폭사진이다.

도2는 대장균에서 발현된 재조합 캡시드항원 VP1 단백질사진이다.

도3은 백신을 통한 젖소, 난황, 돈혈 항체에 의해 동물세포 실험에서 바이러스 감염억제 효과를 나타낸 사진이다.

본 발명은 A형 간염바이러스 감염에 대한 억제효과를 가진 항체를 생산하기 위한 효율적인 항원을 제작하는 방법과 이를 이용한 초유항체 생산에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, A형 간염바이러스 감염환자로부터 분리한 A형 간염바이러스로부터 바이러스 감염 억제에 관련된 캡시드단백질인 VP1 유전자를 얻은후 이를 대장균에 재조합함으로써 단백질을 대량으로 생산하고, 이를 항원으로 사용하여 젖소를 포함한 포유류로부터 항 A형 간염바이러스 항체가 함유된 면역항체를 생산하여, 급성간염등의 원인인 A형 간염바이러스에 대한 예방의학적 기능성 소재를 생산하는 방법에 관한 것이다.

인체에 일어나는 바이러스에 의한 전염성 간염은 A, B, C, D, E형의 다섯종류가 주로 알려져 있다. 이 다섯 종류의 간염 중, B, C, D형 간염은 주로 바이러스에 감염된 환자의 혈액에 의하여 전파되는 반면, A형과 E형은 오염된 물이나 음식물을 통하여 경구 감염된다.

A형 간염은 상기한 다섯가지 타입의 바이러스성 간염중에서도 가장 빈번하게 발생하는 간염으로써, 아시아에 위치한 홍콩의 경우에는 이 수치가 더욱 높아서 67%내지 83%의 간염이 A형에 의한 것으로 진단된다.

A형 간염 바이러스는 피코나 바이러스그룹에 속하는 크기가 27nm 정도의 작은 바이러스로써 단일 나선 구조의 RNA를 유전자로 가지고 있으며, 경구 감염이 주요 감염 경로이므로 산성에서 내성을 가지며 용이하게 위장내의 산성을 통과하여 인체에 침입할 수있다. 소아마비, 감기, 결막염, 뇌막염 또는 동물에서의 구제역 바이러스가 이 바이러스 군에 속한다. 수많은 혈청형을 가지고 있는 로타바이러스등과 달리, A형 간염 바이러스는 전세계적으로 한개의 혈청형만 존재하는 것으로 알려져 있다.

A형 간염은 환자의 연령이 증가함에 따라 임상 증상이 심하게 나타난다. 예를 들어 간염 증상의 하나인 황달을 볼때, 6세 미만의 어린이에서는 약 10% 정도만이 황달을 나타내나, 6세 이상 14세의 경우는 40%내지 50%가, 14세 이상의 경우에 는 70%내지 80%의 간염환자에게서 황달을 볼수 있다. 따라서 치사율도 성인에서 높아지는 것을 볼 수 있는데, 50세 이상에서 A형 간염에 의한 치사율은 1.8%로 보고된다. 전반적인 연령을 대상으로 할때 치사율은 0.4%정도이다. 일단 경구를 통하여 인체에 침입한 바이러스는 약 30일간의 잠복기를 거쳐 전신에 전파된다. 전신 감염이 되면 이때 환자는 바이러스를 분변으로 방출하며 따라서 환자의 분변은 바이러스 전파의 주 오염원으로 작용하게 된다. A형 간염의 전파는 환자와의 접촉, 가족간의 전파, 유치원, 양로원, 또는 조리사에 의하여 쉽게 전파되는데, 잠복기에 있는 개인에 의하여 준비된 오염된 음식(주로 음식점 주방이나 구내식당, 집단급식), 불충분하게 조리된 해산물과 날 생선, 어패류, 오염된 음료수, 분변으로 오염된 수영장이나 하천 등을 통하여 쉽게 전파된다. 세계적으로 A형 간염의 전파 형태는 사회경제 수준 및 위생관념, 위생상태와 밀접하게 연관되어 있는 것을 알수 있다. 개발 도상국의 경우 9세 미만의 어린이들은 거의 모두가 바이러스에 대한 항체를 보유하고 있는데, 어린이의 경우 그 임상 증상이 없는 경우가 대부분이므로 어린이들이 A형 간염바이러스의 전파에 중요한 역할을 하는 것을 알수 있다.

항체를 생산하는데 있어서, 초유에는 항 바이러스성 구성성분이 함유되어있을뿐 아니라 상당량의 이뮤노글로불린이 포함되어있다. 모든 종의 포유동물에서의 이뮤노글로불린은 모체로부터 새끼에게로 전달됨으로써 갓 태어난 자식에게 많은 종류의 병원체에 대한 수동면역을 부여시켜준다. 또한 돼지에서 백신을 투여하여 돈혈을 통해 항체를 생산할 수 있다. 또한 최근에 산란계에 백신을 투여하여 특정항원에 면역능을 갖는 항체의 개발이 활발하게 이루어지고 있다.

따라서, 본 발명에서는 이러한 점을 감안하여, A형 간염바이러스 에 대한 항체 생산함에 있어서, A형 간염바이러스 캡시드 단백질 VP1을 유전공학적 기술로 대량 생산하여 항원생산을 간편하게 하고, 이를 통해 특정 고도면역 항체를 생산하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기한 과제는, A형 간염바이러스 감염환자로부터 분리한 A형 간염바이러스로부터 바이러스 감염 억제에 관련된 캡시드단백질인 VP1 유전자를 얻은후 이를 대장균에 재조합함으로써 단백질을 대량으로 생산하고, 이를 항원으로 사용하여 젖소를 포함한 포유류로부터 항 A형 간염바이러스 항체가 함유된 면역항체를 생산하여, 급성간염등의 원인인 A형 간염바이러스에 대한 예방의학적 기능성 소재를 생산하는 방법을 개발함으로써 그 목적이 달성된다.

즉, 본 발명에서는 A형 간염바이러스에서 중화항체를 만드는 항원으로써 알려진 캡시드단백질인 VP1을 유전자조작을 통해서 대장균에서의 VP1 단백질을 생산하는 방법이 고안한다. 또한 발현율 향상을 위한 조건들을 실험을 통해 최적화시킨후 이를 통한 백신개발을 통해 고도면역을 가진 항 A형 바이러스 항체를 생산하는 기술을 개발하고, A형 간염바이러스의 중화능을 갖는 유전자를 유전공학 적 방법을 통해 항원을 생산하여 고도면역 시킴으로써 A형 간염바이러스로부터 감염억제 효과 를 가진 항체를 생산하기위한 방법을 개발하는 것이다.

이하, 본 발명의 구성에 대해 설명한다.

1. A형 간염바이러스의 분리 및 배양

A형 간염환자로부터의 배설물을 수거하여 희석한후 이를 동물세포에 감염시킨 후 병변 현상이 나타날 때까지 배양하였다. 세포를 수거하여 동결, 해동을 3회 반복한 후 원심분리하여 상등액을 소량 분주하여 -70℃에 저장하여 유전자 증폭, 분석, 배양에 사용하였다. (실시예 1 참조).

2. A형 간염바이러스 항원 유전자의 증폭

A형 간염바이러스를 감염시킨 세포로부터 세포내의 총 RNA를 추출하고, RNA에서 cDNA를 합성하기 위해 제작된 올리고뉴클레오타이드 프라이머와 역전사효소를 이용하여 cDNA를 합성한 후 다른 한 개의 프라이머를 이용하여 PCR 방법으로 항원 RNA 유전자를 dsDNA로 증폭 전환시켰다(실시예 2 참조).

3. A형 간염바이러스 항원 유전자의 대장균 전이 및 염기서열 분석

cDNA로 변환한 항원유전자는 클로닝 벡터 플라스미드에 삽입해야 하는데 이때 적절한 제한효소를 이용하여 절단 변환한 후 플라스미드에 삽입하였다. 이 플라스미드로 형질 전환된 대장균으로부터 다량의 플라스미드를 제조하고 이후 모든 실험의 모체로 삼았다. 클로닝된 항원 유전자의 염기 서열을 분석하되 양쪽 방향에서 결정함으로 서열 결정에 오류가 없도록 하였다(실시예 3 참조).

4. 재조합 캡시드단백질 VP1의 대장균에서 발현

염기서열 분석을 마친 후 항원유전자를 발현벡터 클로닝하였다. 형질 전환된 대장균을 선택한 후 유전자 발현을 시도하였다. 발현된 단백질이 항원 단백질인지를 확인하기 위하여 단백질 전기 영동을 실시하였다(실시예 4 참조).

5. 재조합 캡시드단백질 VP1을 이용한 백신제조 및 면역

발현 된 재조합 항원 단백질은 원심분리후 부분 정제된 것을 이용하였다. 적정량의 항원을 이용해 백신을 제조하였다. 젖소의 경우 출산예정 2달 전에 충분한 항체가가 얻어질 때까지 2주 간격으로 4회 면역한 후 2주후에 출산하도록 계획을 잡았다. 각각의 가축들에게 이행된 특이적 항체 값은 분자 면역학적방법을 이용하여 측정하였다. (실시예 5 참조).

6. 면역항체의 A형간염바이러스 저해효과

면역으로 얻어진 항체의 바이러스감염 저해능을 알기위해서 동물세포실험을 통한 in vitro 실험을 하였다. 먼저 동물세포를 이용하여 A형 간염바이러스를 감염시킨 후 동시에 재조합 캡시드항원 VP1에 대한 항체를 처리한 결과 감염억제를 나타내었다.(실시예 7 참조).

이하, 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 다음의 실시 예는 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니며, 본 발명의 기술적 사상의 범위 내에서 당업자에 의한 통상적인 변화가 가능하다.

실시예 1

A형 간염바이러스의 분리

항원으로 사용할 A형 간염바이러스를 준비하기 위하여 원통형 통에 단층이 형성된 Vero E6 세포에 환자로부터 얻어진 검체를 이용하여 병변현상이 있을 때 까지 계대배양을 하였다. 병변현상이 나타나면 해동 동결을 반복하여 바이러스를 회수하여 -70 ℃에 저장하였다.

실시예 2

A형 간염바이러스 캡시드 항원 VP1 유전자의 증폭

단층이 형성된 Vero E6 세포에 바이러스를 감염시킨 후 병변효과가 나타날 때까지 배양하였다. 병변효과가 나타나면 상등액을 제외한 세포를 수거하여 Trizol(1ml)을 가하여 세포를 녹이고, 그 용액에 Chloroform(0.2 ml)를 가하여 세차게 흔든 후 3분간 정치하였다. 원심 분리하여 RNA침전물을 회수하고 건조하여 RNase free 증류수에 녹여 RNA를 분리하였다.

A형 간염바이러스 캡시드 단백질을 지배하는 cDNA합성을 위하여 바이러스 RNA 7ul, 3ul 30%DMSO, 2 ul antisense primer(VP1 : 5'-ACGAGTCCCTTTCTCAACAGT- 3') 를 넣고 95 ℃에서 10분간 가열하였다. 여기에 5x 1ST STRAND BUFFER 4 ul, 0.1M DTT 2ul, 10 mM dNTPs 1 ul , 1 ul Supercript II 1 ul를 가하여 42 ℃에서 1시간 반응하여 cDNA를 합성하였다.

합성한 cDNA 1 ul, 2.5 ul sense primer(VP1 : 5'-ATGGATGTTACCACACAG-3')와 2,5 ul antisnese primer, 10mM dNTPs 1ul, 50 mM MgCl2 1.5 ul, 10X PCR buffer 5ul, Tag polymerase 0.3 ul 물 36.2 ul를 넣고 강하게 혼합하였다. 혼합액을 94℃에서 5분 열처리 후 94℃ 30초, 52℃ 30초 ,72 ℃ 1분간 연속적으로30회 처리하였고, 마지막으로 72 ℃에서 7분간 처리하여 유전자를 증폭하였다. 증폭산물은 1% agarose gel에 주입하여 전기영동한 후 ethidium bromide로 염색하여 자외선 하에서 촬영 판독하였다(도1).

실시예 3

증폭 항원 유전자의 전이

증폭된 유전자를 BamH1 제한효소로 자르고, 클로닝 벡터 True Blue vector에 클로닝하였다. 이 벡터는 E. coli DH5α에 전이시켰고 , X-gal, ampicilin이 함유된 LB 고형배지에서 도말하여 균락을 형성시켰다. 특징적인 군락을 선발하여 플라스미드를 분리하고, 제한효소 BamH1으로 절단하여 삽입된 유전자가 원하는 항원 유전자인가를 확인하였다. 확인된 클론을 동 액체 배지에서 배양한 후에 플라스미드를 분리하고, BamH1효소로 절단하여 원하는 항원 유전자를 순수 정제한 후 발현 벡터pCH433 BamH1 제한효소 절단 부위에 클론시킨다. 이 벡터는 E. coli DH5α에 전 이시켰고, 앰피실린이 함유된 LB고형 배지에 자란 군락을 선발하여 플라스미드를 분리하였다. 분리된 플라스미드를 제한 효소로 절단하여 삽입된 유전자가 원하는 크기의 유전자인가를 확인하고, 유전자가 정상적인 방향으로 들어갔는가를 확인하였다. 확인된 균주의 플라스미드를 분리하여 삽입된 유전자의 염기서열을 분석하여 최종적으로 유전자 전이를 확인하였다.

서열목록1에 A형 간염바이러스 캡시드항원 VP1 유전자 염기서열을, 서열목록2에 A형 간염바이러스 캡시드항원 VP1 아미노산서열을 각 나타낸다.

[서열목록1]

ATGGATGTTACCACACAGGTTGGAGACGATTCAGGGGGTTTTTCAACAACAGTTTCTACAGAGCAGAATGTTCCTGATCCCCAAGTCGGCATAATAACCATGAGGGACCTAAAAGGGAAAGCCAATAGGGGGAAGATGGATGTTTCAGGAGTGCAAGCACCTGTGGGAGCTATTACAACAATTGAGGATCCAGTTTTAGCAAAGAAAGTGCCTGAGACATTTCCTGAATTGAAGCCTGGAGAGTCCAGACATACATCAGATCACATGTCTATTTATAAATTCATGGGAAGGTCTCATTTTCTGTGTACTTTTATCTTCAATTCAAATAATAAAGAGTACACATTTCCAATAACTTTGTCTTCAACTTCTAATCCTCCTCATGGTTTACCATCAACATTAAGGTGGTTTTTCAATTTGTTTCAGTTGTATAGAGGACCATTGGATTTGACAATTATTATCACAGGAGCCACTGATGTAGATGGTATGGCCTGGTTTACTCCAGTAGGCCTTGCTGTCGACACCCCTTGGGTGGAAAAGGAGTCAGCTTTGTCTATTGATTATAAAACTGCCCTTGGAGCTGTTAGATTTAATACAAGAAGAACAGGGAACATTCAGATTAGATTGCCATGGTATTCTTATTTGTATGCCGTGTCTGGAGCGTTGGATGGCTTGGGAGATAAGACAGATTCCACATTTGGATTGGTTTCTATTCAGATTGCAAATTACAATCATTCTGATGAATATTTGTCCTTTAGTTGTTACTTGTCTGTCACAGAACAATCAGAGTTTTATTTTCCTAGAGCTCCATTGAATTCAAATGCTATGTTGTCCACTGAGTCTATGATGAGTAGAATTGCAGCTGGAGACTTGGAGTCATCAGTGGATGATCCTAGATCAGAGGAGGACAGAAGATTTGAG AGTCATATAGAATGTAGGAAACCATACAAAGAATTGAGATTGGAGGTTGGGAAACAAAGACTCAAATATGCTCAGGAAGAGTTGTCA

[서열목록2]

M D V T T Q V G D D S G G F S T T V S T E Q N V P D P Q V G I I T M R D L K G K A N R G K M D V S G V Q A P V G A I T T I E D P V L A K K V P E T F P E L K P G E S R H T S D H M S I Y K F M G R S H F L C T F I F N S N N K E Y T F P I T L S S T S N P P H G L P S T L R W F F N L F Q L Y R G P L D L T I I I T G A T D V D G M A W F T P V G L A V D T P W V E K E S A L S I D Y K T A L G A V R F N T R R T G N I Q I R L P W Y S Y L Y A V S G A L D G L G D K T D S T F G L V S I Q I A N Y N H S D E Y L S F S C Y L S V T E Q S E F Y F P R A P L N S N A M L S T E S M M S R I A A G D L E S S V D D P R S E E D R R F E S H I E C R K P Y K E L R L E V G K Q R L K Y A Q E E L S

실시예4

대장균에서 캡시드항원 단백질의 생산

항원 유전자를 함유한 벡터가 전이된 대장균을 LB 배지(yeast extract 5g, tryptone peptone 10g, NaCl 10g/1L)에서 하루 밤 배양하고, 대량의 동 배지에 1% 접종하였다. 동 배양액의 흡광도(600 nm)가 0.5 에 달했을 때 아이피티지(isopropyl-b-D-thiogalatoside)를 최종 농도 0.5 mM이 되게 첨가하고 진탕배양을 4시간 계속하였다. 배양액을 원심 분리하여 미생물 균체을 수거한 후 증류수에 희 석하여, 전기영동 loading buffer와 혼합하여 95 ℃에서 5분 가열한 다음 전기영동하여 발현된 항원 단백질을 확인하였다.

부분 정제는 상기와 같이 제조된 균체를 25% Sucrose, 50 mM Tris, pH 8.0 에 현탁시킨 후 10 mg의 라이소자임을 첨가한 후 냉장상태에서 10-15분 유지한다. 그 다음 2XRIPA-TET 완충 용액을 첨가하고 5분 후 초음파 파쇄하였다. 이 용액을 원심분리(15000 g, 20분)하여 상등액을 항원으로 하였다. 상등액중 일부를 SDS-PAGE sample buffer와 혼합후 끓여서 gel에 loading하여 전기영동 후 Coomassive staining을 통해 단백질 발현을 확인하였다.

도2에 대장균에서 발현된 캡시드항원 VP1 단백질사진을 나타낸다.

실시예 5

캡시드항원 단백질의 백신제조 및 면역

실시예 4 에서 제조한 재조합 항원을 이용하여 10% Aluminum hydroxide gel을 이용한 백신을 생산하였으며, 출산예정 두달전 젖소에 면역을 실시하였다. 출산 후 일짜별로 수집하여 각각 보관하였으며 ELISA방법을 통해 역가실험 후 그중 고역가 수치를 나타내는 1일차부터 3일차까지를 수집하였다. 또한 산란계의 경우, 아주반트는 미네랄 오일의 일종인 드라케올(Drakeol)과 유화제를 혼합하여 사용하고, 유화제로는 스판 85(Span 85) 및 트윈 85 (Tween 85)를 54:46의 비율로 혼합하여 사용하였다. 드라케올, 유화제, 항원을 9 : 1 : 8의 비율로 혼합하여 유화시킨 후 충분한 항체가가 얻어질 때까지 2주 간격으로 4회 근육 주사하였다.

실시예 6

항 A형 간염바이러스 캡시드항원 항체 역가 비교

실시예 5와 같이 면역 후 출산한 젖소들로부터 수집된 초유를 날짜별로 수집하였다. 또한 충분한 역가가 상승한 돼지, 산란계에서 수집된 돈혈 및 난황을 수집하였다. A형 간염바이러스에 대한 항체가는 ELISA법에 의해 다음과 같이 측정하였다. 얻어진 항체는 인산완충액(PBS, pH 7.4)로 2ⁿ배 연속 희석하여 검액으로 하였다. 항체의 역가확인을 위하여 A형 간염바이러스 캡시드 단백질 VP1을 coating buffer에 현탁하여 96well plate에 100㎕씩 분주하여 4℃에서 밤새 부착시켰다. 부착된 항원을 PBST(50mM PBS, 0.05% tween 20)으로 세척하고 항체 용액을 1:10부터 연속적으로 2배 희석하여 100㎕씩 분주하여 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응완료 후 PBST로 세척한 뒤 goat-anti-bovine IgG HRP, goat-anti-pig IgG HRP, goat-anti-chicken IgY를 각각 1:1,000으로 희석하여 100㎕씩 분주하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응완료 후 PBST로 세척한 후 substrate solution (OPD peroxidase substrate, Sigma) 100㎕씩 분주하여 37℃에서 반응시킨 후 1M H₂SO₄를 가하여 반응을 정지시켰다. 반응이 정지된 후 ELISA reader를 이용하여 반응 값을 확인하여 항체의 역가(O.D._490nm>1.0)를 측정하였다. 결과적으로 처음 나온 초유에서 가장 큰 역가를 보였으며 시간의 추이에 따라 감소하는 경향을 나타내었다. 3일차이후에는 급격한 역가의 감소를 보였다. 또한 초유의 냉각, 해동, 균질, 살균, 동 결건조의 일련의 공정에서의 초유역가 또한 안정성을 보였다. 또한 돈혈 및 난황에서도 마찬가지로 높은 역가가 나타났다.

실시예 7

In vitro에서의 바이러스 감염억제 효과

실시예 10에서 확인한 항체를 이용하여 A형 간염바이러스 감염억제효과를 확인하고자 동물세포를 이용하여 다음과 같은 실험을 하였다. 먼저 Vero E6 세포를 monolayer되게끔 키운후 A형 간염바이러스를 감염시켰다. 이때 실험하고자하는 항체(1:100)를 첨가후 그다음날 배지를 제거하고 PBS로 Washing후 10% formalin을 첨가한후 30분간 고정하였다. 다시 PBS로 Washing한 다음 0.5% triton X-100/PBS를 첨가한후 5분간 정치하고 anti-Hepatitis A virus antibody (1:250)/PBS/1%BSA 용액을 첨가한후 상온에서 30분간 정치하였다. PBA (1% BSA/PBS)로 2번 Washing한후 HRP-conjugated goat anti-mouse IgG(1:500)/PBA를 첨가한후 상온에서 30분간 정치하였다. 마지막으로 1ml N,N-dimethylformamide에 4mg의 3-amino-9ethylcarbazole을 녹인용액과 0.05M sodium acetate buffer와 hydrogen peroxide를 각각 1.5ml, 3.5ml, 그리고 5㎕를 섞은 혼합물을 처리한후 현미경을 이용하여 염색된 감염세포를 확인하였다. 결과적으로 재조합 융합항원에 대한 항체를 처리함으로써 A형 간염바이러스로부터의 감염을 억제하는 것으로 나타났다.

도3은 항체를 통한 in vitro 동물세포실험에서의 A형 간염바이러스 감염억제 효과를 나타낸 것으로, 도3a는 non-infection, 도3b는 virus infection, 도3c는 virus + 항체이다.

실시예 8

항 A형 바이러스 항체를 이용한 발효유 제조

탈지분유를 이용하여 무지유고형분 함량을 17중량%로 조정한 원료유를 135℃에서 3초간 살균하였다. 살균된 원료유를 37℃온도까지 냉각시킨 후 락토바실러스 애시도필러스 HY 2177과 락토바실러스 카제이 HY 2743을 10⁶ cfu/ml의 농도로 접종하여 pH 4.5가 될 때가지 배양하였다. 배양완료 후 배양액을 냉각시켰다. 한편 항체 0.5중량%, 과즙농축액 1.0중량%, 식이섬유 2.0중량%, 포도당 0.5중량%, 올리고당 1.0중량%, 비타민 0.03중량%를 혼합하고 정제수로 녹여 시럽을 제조하였다. 이렇게 제조된 시럽을 65℃에서 30분간 살균한 후 냉각하여 상기 배양액과 일정비율로 혼합, 교반하여 균질화 시키고 용기에 포장하여 발효유를 제조하였다. 이렇게 제조된 발효유는 관능검사 결과, 캡슐에 의한 이물감을 느낄 수 없었으며 풍미, 물성, 전체적인 맛에 있어서 양호한 결과를 보였다.

실시예 9

항 A형 바이러스 항체를 이용한 건강보조식품 제조

제조된 초유항체를 이용하여 유산균 식품, 정장제 등의 건강보조식품을 제조하였다. 항체20중량%와 락토바실러스 애시도필러스 건조 균말 25중량%에 올리고당 10중량%, 무수포도당 10중량%, 결정과당 5중량%, 비타민 C 2중량%, 과일분말향 8중량%, 알로에 5 중량%, 식이섬유 15중량%를 혼합하여 스틱 또는 병에 일정량 분주하여 포장하였다.

실시예 10

항 A형 간염바이러스 항체를 이용한 특수영양식품 제조

제조된 캡슐 항체를 이용하여 이유식, 조제분유 등의 특수영양식품을 제조하였다. 먼저 탈지유에 단백질, 정제 식물성 지방, 비타민, 당류, 철염 등 약 30여가지의 원재료를 액상상태에서 혼합하여 특수영양식품의 성분에 부합되도록 표준화한다. 약 80℃로 가열한 후 감압 농축기를 이용하여 고형분이 45∼50%가 되도록 농축한다. 이를 분무 건조기에서 열풍건조하고 여기에 항체 5중량%와 비타민, 유당 등 분말 형태의 기타 원재료를 혼합하고, 질소충진하며 can 또는 스틱 포장하였다.

이상 설명한 바와같이, 본 발명에 따른 A형 간염바이러스 캡시드 VP1 항원을 이용한 백신을 제조하여 고도역가의 항 A형 간염바이러스 항체를 생산하고, 이를 이용하여 집단감염의 원인인 A형 간염바이러스를 억제 할 수 있는 식품 및 응용조성물들을 제조할 수 있어, 관련 분야에의 이용 및 응용이 기대된다 하겠다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

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a)A형 간염바이러스의 게놈성 RNA를 주형으로 캡시드 항원의 서열번호1로 특정되는 cDNA를 생성하는 단계; b)상기 단계a)의 생성된 dsDNA를 절단하여 발현벡터 pCH433에 클로닝 한 후 E-coli를 형질전환하여 항원을 생산하는 단계;로 구성되는 A형 간염바이러스 항원의 생산방법으로 생산된 항원을 출산 전 젖소에게 면역주사 함에 의하여 A형 간염바이러스의 활성을 억제하는 고역가 초유 항체를 생산하는 방법.
a)A형 간염바이러스의 게놈성 RNA를 주형으로 캡시드 항원의 서열번호1로 특정되는 cDNA를 생성하는 단계; b)상기 단계a)의 생성된 dsDNA를 절단하여 발현벡터 pCH433에 클로닝 한 후 E-coli를 형질전환하여 항원을 생산하는 단계;로 구성되는 A형 간염바이러스 항원의 생산방법으로 생산된 항원을 산란계에게 면역주사 함에 의하여 A형 간염바이러스의 활성을 억제하는 고역가 계란 항체를 생산하는 방법.
a)A형 간염바이러스의 게놈성 RNA를 주형으로 캡시드 항원의 서열번호1로 특정되는 cDNA를 생성하는 단계; b)상기 단계a)의 생성된 dsDNA를 절단하여 발현벡터 pCH433에 클로닝 한 후 E-coli를 형질전환하여 항원을 생산하는 단계;로 구성되는 A형 간염바이러스 항원의 생산방법으로 생산된 항원을 돼지에게 면역주사 함에 의하여 A형 간염바이러스의 활성을 억제하는 고역가 돈혈 항체를 생산하는 방법.
제2항 내지 제4항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 항체를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 발효유.
제2항 내지 제4항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 항체를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 건강보조식품.
제2항 내지 제4항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 항체를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 특수영양식품.
제2항 내지 제4항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 항체를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 사료 첨가물.
제2항 내지 제4항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 항체를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 A형 간염 치료용 의약품 첨가물.
제2항 내지 제4항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 항체를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 식품 첨가물.