KR20040018589A

KR20040018589A - 로타바이러스 항체 및 이를 함유하는 면역난황/면역란,그리고 이들의 생산 방법

Info

Publication number: KR20040018589A
Application number: KR1020020049962A
Authority: KR
Inventors: 이정준; 허철성; 백영진; 오호경; 심재중
Original assignee: 주식회사 한국야쿠르트
Priority date: 2002-08-23
Filing date: 2002-08-23
Publication date: 2004-03-04

Abstract

본 발명은 로타바이러스에 대한 재조합 항원을 생산하고 이를 이용하여 항 로타바이러스 항체 조성물과 이를 함유하는 면역난황/면역란 및 이들의 생산방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로는 한국인 유아로부터 분리한 로타바이러스로부터 VP8과 VP5 유전자를 얻어 이를 대장균에 재조합함으로써 VP8과 VP5 단백질을 대량으로 생산하고, 이를 항원으로 사용하여 산란계로부터 항 로타바이러스 항체 및 로타바이러스 항체가 함유된 면역난황/면역란을 생산하여, 유아의 설사 원인인 로타바이러스에 대한 예방의학적 기능성 소재를 생산하는 방법에 관한 것이다.

이러한 본 발명은, 한국형 로타바이러스 재조합 항원을 생산, 2가지 이상의 항원으로 조합 백신을 제조하여 광범위, 고역가의 항 로타바이러스 난황 항체를 생산하였고, 이를 이용하여 로타바이러스를 억제 할 수 있는 식품을 제조할 수 있는 효과가 있다.

Description

로타바이러스 항체 및 이를 함유하는 면역난황/면역란, 그리고 이들의 생산 방법{ANTI-ROTAVIRUS and IgY/EGG CONTAINING ANTI-ROTAVIRUS, and METHOD OF PREPARING IgY/EGG CONTAINING ANTI-ROTAVIRUS}

로타바이러스는 1973년 설사를 하는 어린이의 소장으로부터 전자현미경을 사용하여 처음 발견된 수레바퀴모양의 바이러스로서 유아, 어린이뿐 아니라 많은 포유동물과 조류 등의 어린 동물의 바이러스성 설사의 주요한 원인 바이러스로 알려져 있다.

로타바이러스 감염은 온대지방의 동절기에 많이 발생하고 감염증상으로는 설사와 구토를 하고, 발열, 호흡기도 염증 과 탈수증상을 보인다. 전세계를 살펴 볼 때 어린이가 3 - 5세에 이를 때까지 약 95%이상이 로타바이러스에 의한 설사를 경험하는데 2세 미만의 어린이가 가장 높은 발병율을 보이고, 그중 약 80만 명의 어린이가 사망하는 것으로 추정된다(Nat. Med. 1997. 3:10-11). 따라서 로타바이러스의 퇴치는 세계 보건기구의 퇴치질병 목표의 하나이다. 국내에서는 종합 병원에 입원하는 2세미만의 소아군의 약 70%가 로타바이러스 감염이 보고되었고(J.clinical microbiology.1990. 28:2279 - 2284), 신생아실에서 폭발적인 감염양태도 보고되었다(한양의대 학술지.1994. 14:29-45).

로타바이러스는 리오바이러스과 (Reoviridae)에 속하는 비외막 바이러스(non-enveloped virus) 인데 외막이 없기 때문에 클로로포름 같은 유기 용매에 안정하고, 보통 낮은 산도(pH 2-3) 에서도 안정한데 따라서 위장의 낮은 산도(pH)에서도 불활화 되지 않고 쉽게 소장에 도달한다. 바이러스 입자는 세 개의 층으로 이루어진 단백질로 구성되는데 가장 내부 층에 있는 핵 (core) 에는 11개의 염색체가 있으며, 로타 바이러스의 염색체는 이중 나선의 RNA (double stranded RNA)의 형태로 되어있다. 각각의 염색체는 총 6개의 구조 단백질 (VP1, VP2, VP3,VP4, VP6, VP7)과, 5개의 비구조 단백질(NSP1, 2, 3, 4, 5) 을 합성하는 유전 암호를 가지고 있는데, 11개의 염색체 segment는 각각 서로 다른 종류의 로타 바이러스가 동시 감염되었을 때 서로 염색체를 교환하여 가짐으로 (genomic segment reassortment) 새로운 형태의 바이러스가 생겨나는 주원인이 된다.

최근의 한국 통계에 의하면 (Pediatrics international. 2000. 42:406-410), 과거 20년간의 급성 위장염의 임상 자료를 토대로 하여 그 타입을 조사하였는바. 급성 위장염으로 병원에 입원한 어린이 중 46%가 로타바이러스에 의한 위장염이었으며, 이중 84%는 2세 미만 6개월 이상의 유아에서 발생한 것으로 나타났다. 과거 10년간의 로타바이러스의 타입을 조사한 바에 의하면 G1 타입이 81%를 차지하며, G1-G4의 4가지 타입이 원인 바이러스의 95%를 점하고 있다.

로타바이러스의 항원에는 VP6, VP7과 VP4가 있으며, VP4 단백질은 로타바이러스의 표면에 수직으로 돌출 되어 있는 구조 단백질로서, 로타바이러스의 P타입을 결정한다. 제4번 염색체에 의하여 합성되는 VP4 단백질은 바이러스 입자의 구성 비율로 볼 때 불과 1.5%에 불과 하지만 중요한 단백질이다. 사람에 감염되는 로타바이러스를 P 타입으로 분류해 볼 때 8 내지 20가지의 타입이 있는데, 그 중 P8 타입이 가장 빈번하고 P4, P6, P9의 4가지 타입이 또한 빈번하게 발생한다. VP4 단백질도 VP7과 함께 중화 항체를 형성하는데 이 단백질은 효소에 의하여 VP8과 VP5 두 개의 소단위 단백질로 분해되며 이 분해에 의하여 바이러스의 감염도가 결정된다. 로타바이러스는 VP4 단백질에 의하여 P타입을 결정한다. P8 타입의 로타바이러스가 80%이상을 차지하며, 가장 병원성이 강하다고 알려져 있다. 즉 P8 타입을 예방하면가장 효과적으로 소아 설사를 예방할 수 있다.

로타바이러스에 감염되면, 바이러스는 경구 위장을 통과하면서도 불활화 되지 않은 상태에서 소장의 상부 2/3 정도의 융모 표면 세포에 흡착한 후 세포 내에서 증식을 시작한다. 이 과정을 거치며 복제되는 바이러스는 세포 외로 분비되면서 소장의 다른 부분으로 2차 감염이 시작된다. 증식이 계속되면서 융모 표면 세포가 파괴되고 따라서 융모의 길이가 짧아 지면서 소장내의 정상적인 흡수기능이 마비되어 설사가 유발된다. 이때 감염 부위는 대체적으로 소장의 점막세포로 국한되는데, 따라서 감염이 전신적으로 전파되지는 않고 소장내 국소 감염으로 끝나게 된다. 이때 바이러스 감염으로 인한 국소적 장내 점막 면역 반응이나 전신 면역이 형성되는데, 동물 실험 결과에 의하면 혈액중에 형성된 전신 면역항체는 추후에 감염될 로타바이러스에 예방 효과는 없는 것으로 알려진 반면, 장 점막에 형성된 국소 면역항체가 바이러스감염을 저지시키고 위장염을 예방하는데 직접 관련되는 것으로 알려져 있다.

어린이가 로타바이러스에 감염되었을 때 형성되는 주요 중화항체는 G 타입 단백질 즉 VP7 단백질에 특이적으로 형성된다. 물론 사람에 있어서 생후 3개월 미만의 유아에서는 출생 전 태반을 통하여 모체로부터 이행되는 항체가 있을 테지만 이렇게 이행되는 혈중 항체가 실제로 로타바이러스의 예방에 얼마나 영향을 미치는지는 잘 알려져 있지 않다. 반면, 출생 후 어머니로부터 모유를 통하여 유아의 소장 내로 유입되는 중화 항체는 바이러스 감염의 효과가 있다는 보고가 있다. 로타바이러스의 항체를 포함한 소의 초유와 우유를 경구 투여했을 때 이에 함유된 항체가 바이러스 감염 방지에 효과가 있다는 실험결과는 수동 면역으로 로타바이러스의 감염을 방지할 수 있을지도 모른다는 가능성을 엿보게 해준다 (Lancet. 1983. 2:1029 -1030 ; Journal infectious and disease. 1987. 156:158 -166). 항체의 1 회적 경구 투여로 병원에 입원한 어린이의 위장염을 경감시킨 효과가 있는 것으로 보건대, 수동면역이 접근이 가능한 것이다 신생아가 로타바이러스에 대한 면역을 가지고는 있지만 그 항체의 수명은 아주 짧은데, 생후 4개월의 유아에서 설사 빈도가 높은 것으로 보아 항체의 수명이 4개월을 넘지는 않는 것 같다. 모유를 섭취할 때 부분 예방이 되며, 특히 초유에서 처럼 함유된 IgA 항체 농도가 높을 때 예방 효과는 더욱 크지만 6개월 이상 가지는 않을 것이다.

따라서 능동 점막 면역을 유도시키기 위한 십 수년의 연구결과, 로타 바이러스 백신이 드디어 개발되어, 1997년 12월 미국 식품의약청은 Wyeth-Lederle 의 경구용 4가 생독 백신을 허가하였고, 1998년 최종 허가를 획득함으로써 시중 판매가 시작되었다. 이 백신은 원숭이 로타 바이러스 와 사람 로타 바이러스를 감염시킴으로써 G타입을 방지하고자 한 생독 백신이었다. 경구 투여한 생독 백신은 소장 점막에 도달한 후 점막세포에서 중식함으로써 소장 점막내에 IgA 항체를 형성시켜 이 IgA 항체로 하여금 침입하는 바이러스를 중화시겨 감염을 방지하고자한 것이다. 그러나 이 백신은 판매가 시작된 지 불과 3개월만에 판매를 중지하게 되는데, 이 백신을 투여한 유아 15명에게서 장 중첩 현상이 일어나 Weyth 는 결국 허가 획득 11개월 만인 1999년 7월 철수함으로써 현재 로타바이러스 백신은 없는 상태이다.

최근에 계란을 이용한 항체(IgY) 생산 기술이 개발되어 있으며 그 이용 분야는 충치균, 대장균, 살모넬라균, 헬리코박터균 등의 박테리아에 집중되고 있고, 바이러스 항체 생산이 시도되고 있다. 이 응용분야의 중요한 분야는 값싼 항원을 생산하는 것이다. 미생물의 경우에는 항원 생산이 문제가 없으나 바이러스는 항원 생산이 중요한 기술적 과제이다.

국내공개특허 2001-0016599와 2001-0016600에서는 한국인으로부터 로타바이러스를 type별로 분리, 혼합하고 불활화하여 백신을 제조하였으며, 이를 면역하여 얻어진 난황항체를 로타바이러스 예방과 치료보조제로 제시하고 있다. 그러나 이렇게 바이러스 자체를 type별로 분리, 혼합하여 백신을 제조하는 방법은 바이러스 대량에 많은 비용이 들고, 항원의 양도 적어 경제성이 떨어지는 문제점이 있었다.

본 발명자들은 로타바이러스의 VP4 단백질이 VP7과 함께 중화 항체를 형성하고, 이 단백질은 소장내에서 효소(tripsin, 소장에 분비되는 소화효소)에 의하여 VP8과 VP5 두 개의 소단위 단백질로 분해된다는 것에 착안하여 본 연구를 진행하게 되었다.

본 발명은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 항 로타바이러스 난황 항체를 생산함에 있어서, 로타바이러스를 type별로 배양하여 면역하는 기존의 방법과 달리, 한국 어린이로부터 로타바이러스를 분리하고 그 항원 유전자 염기서열을 분석하고, VP8단백질을 포함하는 2개 이상의 특이적 재조합 항원 및바이러스 항원을 대량으로 생산하여, 적정 비율로 혼합된 항원을 이용하여 고역가, 광범위 항체 조성물 및 이를 포함하는 면역난황/면역란을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 고역가, 광범위 항체 조성물 및 이를 포함하는 면역난황/면역란의 생산방법을 제공하는데 있다.

도1은 항원 VP8, VP5 유전자 증폭사진(1 : Size marker, 2 : 증폭된 VP8 유전자, 3 : 증폭된 VP5 유전자).

도2는 항원 VP8, VP5가 연결된 VP4 유전자 증폭 사진(1 : Size marker, 2 : 증폭된 VP4 유전자).

도3은 항원 단백질 VP8, VP5유전자 대장균 삽입 사진.

도4는 대장균에 의해 발현된 재조합 로타바이러스 VP8항원단백질 사진(1 : IPTG 처리 정방향 삽입 대장균, 2 : IPTG 비처리 정방향 삽입 대장균, 3 : IPTG 처리 역방향 삽입 대장균, 4 : IPTG 비처리 역방향 삽입 대장균).

도5는 대장균에 의해 발현된 재조합 로타바이러스 VP5항원단백질 사진(1 : IPTG 처리 정방향 삽입 대장균, 2 : IPTG 비처리 정방향 삽입 대장균, 3 : IPTG 처리 역방향 삽입 대장균, 4 : IPTG 비처리 역방향 삽입 대장균).

도6은 His tagged VP8 유전자 증폭사진.

도7은 His tagged VP8 유전자 대장균 삽입 사진.

도8은 대장균에 의해서 생산된 His tagged VP8 단백질 사진.

도9는 Ni-column system을 이용하여 분리한 His tagged VP8 단백질 사진.

도10은 재조합 로타바이러스 백신에 의해 면역란의 난황에 생성된 항체의 역가 그래프.

서열1은 항원 단백질 Vp5의 유전자 염기서열.

서열2는 항원 단백질 Vp5의 아미노산 서열.

서열3은 항원 단백질 Vp8의 유전자 염기서열.

서열4는 항원 단백질 Vp8의 아미노산 서열.

본 발명자들은 한국 유아 설사환자로부터 로타바이러스를 분리하고, 그 바이러스의 VP4를 구성하는 항원 유전자 염기서열(VP5, VP8)을 분석하였다. 항원 유전자를 대장균에 전이시켜 재조합 항원 유전자 단백질을 대량으로 생산하였고, 상기 재조합 항원 단백질 및 로타 바이러스를 혼합 면역함으로써 고역가 광범위 난황항체를 생산하였다.

본 발명에 의한 로타바이러스 항체 조성물은 로타바이러스의 VP8항원에 대하여 특이성을 갖는다.

VP8항원에 대하여만 특이성을 갖는 로타바이러스 항체 조성물은, 하나의 항원으로만 항체를 형성시키는 경우에 가장 높은 항체역가를 형성하거나 가장 높은 로타바이러스 감염억제율을 나타내지만, 최고의 항체역가를 형성하거나 최고의 감염억제율을 나타내지는 못한다. 따라서, 상기 로타바이러스 항체 조성물은 로타바이러스의 VP4항원, 로타바이러스의 VP5항원, 로타바이러스의 VP7항원, 로타바이러스중 어느 하나 또는 둘이상에 대한 특이성을 추가로 갖는 것이 바람직하다. 특히, VP8항원과 VP5항원에 대한 특이성을 기본으로 가지며, 로타바이러스의 VP4항원, 로타바이러스의 VP7항원, 로타바이러스중 어느하나 또는 둘이상에 대한 특이성을 추가로 갖는 것이 더 바람직하다.

로타바이러스는 다양한 변이가 있으나, 항원들은 유사하므로, 본 발명은 모든 로타바이러스에 적용가능하다. 그러나, 다른 로타바이러스에 대한 실험에서는 가장 높은 항체역가의 생성기간이나 감염억제율이 약간씩 다를 수 있으므로, 상기 로타바이러스는 로타바이러스 케이알브이01(기탁기관:한국미생물보존센터, 기탁일자:2002년 8월 20일, 수탁번호:KFCC-11313)인 것이 바람직하다.

상기 로타바이러스 항체 조성물은, 본 발명에 의한 생산된 로타바이러스 항체 조성물을 포함하는 면역난황/면역란으로부터 통상의 방법으로 로타바이러스 항체 조성물을 추출한다.

한편 본 발명에 의한 면역난황/면역란 생산방법은,

로타바이러스를 배양하는 배양단계와; 로타바이러스 RNA로부터 VP8항원에 대응되는 cDNA를 생성하는 cDNA생성단계와; 상기 cDNA로부터 dsDNA(double stranded DNA)를 생성하는 dsDNA생성단계와; 상기 dsDNA를 절단하여 플라스미드에 삽입하는 플라스미드 제작단계와; 상기 플라스미드를 대장균에 삽입하여 번식시키는 번식단계와; 상기 플라스미드에 포함된 항원유전자를 발현시켜 항원을 생산하는 발현단계와; 생산된 항원을 산란계에 주사하여 면역시키는 면역단계와; 상기 산란계로부터 면역난황 및/또는 면역란을 수득하는 수득단계;를 갖는다.

VP8항원에 대하여만 특이성을 갖는 로타바이러스 면역난황/면역란은, 하나의 항원으로만 항체를 형성시키는 경우에 가장 높은 항체역가를 형성하거나 가장 높은 로타바이러스 감염억제율을 나타내지만, 최고의 항체역가를 형성하거나 최고의 감염억제율을 나타내지는 못한다. 따라서, 상기 cDNA생성단계는 로타바이러스의 VP4항원, 로타바이러스의 VP5항원, 로타바이러스의 VP7항원, 로타바이러스중 어느 하나 또는 둘이상에 대응되는 cDNA를 추가로 생성하는 것이 바람직하다. 특히, VP8항원과 VP5항원에 대응되는 cDNA를 기본으로 생성하며, 로타바이러스의 VP4항원, 로타바이러스의 VP7항원, 로타바이러스 중 어느 하나 또는 둘 이상에 대응되는 cDNA를 추가로 생성하는 것이 더 바람직하다.

로타바이러스는 다양한 변이가 있으나, 항원들은 서로 유사하므로, 본 발명은 모든 로타바이러스에 적용가능하다. 그러나, 다른 로타바이러스에 대한 실험에서는 가장 높은 항체역가의 생성기간이나 감염억제율이 약간씩 다를 수 있으므로, 상기 로타바이러스는 로타바이러스 케이알브이01(기탁기관:한국미생물보존센터, 기탁일자:2002년 8월 20일, 수탁번호:KFCC-11313)인 것이 바람직하다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 예시적인 목적일 뿐 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

[실시예1] 한국형 로타바이러스의 분리

로타바이러스가 감염된 유아 설사환자의 분변을 멸균된 용기에 채취하여 인산완충용액에 10%로 희석한 후 원심분리, 여과하여(0.22 ㎛), 판크레아틴 0.5%를첨가하여 활성시킨 후 단층이 형성된 MA104 세포(아프리카원숭이 신장 주화세포)에 감염시킨 후 병변현상이 나타날 때까지 배양하였다. 배양된 세포를 수거하여 동결, 해동을 3회 반복하고, 저속 원심 분리하여 상등액을 여과하여 소량 분주한 후 -70 ℃에 저장하여 시료로 사용하였다. 한국인 설사 유아 환자로부터 채취된 2개의 시료 중 1개의 시료로부터 병변현상을 관찰하여 바이러스를 분리할 수 있었으며, 이 로타바이러스를 KRV01로 명명하고, 한국미생물보존센터에 기탁하였다.

[실시예2] 로타바이러스의 배양

항원으로 사용할 로타바이러스를 준비하기 위하여 원통형 통에 단층이 형성된 MA104세포에 활성화된 로타바이러스(실시예1에서 분리된 로타바이러스)를 감염시킨 후 병변현상이 관찰 될 때까지 회전 배양하였다. 병변현상이 나타나면 해동 동결을 반복하여 바이러스를 회수하여 -70 ℃에 저장하였다. 이 로타바이러스는 백신제조의 원료로 사용하거나, 유전자 클론닝, 혼합백신의 원료로 사용하였다.

[실시예3] 로타바이러스 항원 유전자의 증폭

단층이 형성된 MA104 세포에 바이러스를 감염시킨 후 병변현상이 나타날 때까지 배양하였다. 병변현상이 나타나면 상등액을 제외한 세포를 수거하여 Trizol(1ml)을 가하여 세포를 녹이고, 그 용액에 Chloroform(0.2 ml)를 가하여 세차게 흔든 후 3분간 정치하였다. 원심 분리하여 RNA침전물을 회수하고 건조하여 RNase가 제거된 증류수에 녹여 RNA를 분리하였다.

로타바이러스 VP4, VP5, VP8 단백질을 지배하는 cDNA합성을 위하여 바이러스 RNA 7ul, 3ul 30%DMSO, 2 ul antisense primer(VP4, VP5 : 5'-ACAGGATCCTCACAATTT ACATTGTAGTATTAAC-3', VP8 : 5'-ACAGGATCCTCAATACTGTATCGATCTA GATG-3') 를 넣고 95 ℃에서 10분간 가열하였다. 여기에 5x 1ST STRAND BUFFER 4 ul, 0.1M DTT 2ul, 10 mM dNTPs 1 ul , 1 ul Supercript II 1 ul를 가하여 42 ℃에서 1시간 반응하여 cDNA를 합성하였다.

합성한 cDNA 1 ul, 2.5 ul sense primer(VP4, VP8 : 5'-ACAGGATCCAATGGCTTCA CTCTTATAGACAGC-3', VP5: 5'-ACAGGATCCAATGAAGAGAGCACAAGTTAATGA AAG-3')와 2,5 ul antisnese primer, 10mM dNTPs 1ul, 50 mM MgCl2 1.5 ul, 10X PCR buffer 5ul, Tag polymerase 0.3 ul 물 36.2 ul를 넣고 강하게 혼합하였다. 혼합액을 94℃에서 5분 열처리 후 94℃ 30초, 52℃ 30초 ,72 ℃ 3분간 연속적으로35회 처리하였고, 마지막으로 72 ℃에서 7분간 처리하여 유전자를 증폭하였다. 증폭산물은 1% agarose gel에 주입하여 전기영동한 후 ethidium bromide로 염색하여 자외선 하에서 촬영 판독하였다.(도 1, 2)

[실시예4] 증폭 항원 유전자의 전이

증폭된 유전자를 BamHI 제한효소로 자르고, 클론닝 벡터 True Blue vector에 클론닝하였다. 이 벡터는 DH5α대장균에 전이시켰고 , X-gal, ampicilin이 함유된 LB 고형배지에서 도말하여 균락을 형성시켰다. 특징적인 군락을 선발하여 플라스미드를 분리하고, 제한효소 BamHI으로 절단하여 삽입된 유전자가 원하는 항원 유전자인가를 확인하였다. 확인된 클론을 동 액체 배지에서 배양한 후에 플라스미드를 분리하고, BamHI효소로 절단하여 원하는 항원 유전자를 순수 정제한 후, 발현 벡터 pCH433의 BamHI 제한효소 절단 부위에 클론시킨다. 이 벡터는 DH5α대장균에 전이시켰고, 앰피실린이 함유된 LB고형 배지에 자란 군락을 선발하여 플라스미드를 분리하였다. 분리된 플라스미드를 제한 효소로 절단하여 삽입된 유전자가 원하는 크기의 유전자인가를 확인하고, 유전자가 정상적인 방향으로 들어갔는가를 확인하였다(도 3). 확인된 균주의 플라스미드를 분리하여 삽입된 유전자의 염기서열을 분석하여 최종적으로 유전자 전이를 확인하였다.

[실시예5] 항원 유전자의 염기 서열 분석 과 타입결정

로타바이러스의 각 항원 유전자의 염기서열은 자동 분석기(PE 9600 thermocycler and 377 Sequencer, Perkin-Elmer)로 분석하였다(서열목록 참조, 서열1은 항원 단백질 Vp5의 유전자 염기서열, 서열2는 항원 단백질 Vp5의 아미노산 서열, 서열3은 항원 단백질 Vp8의 유전자 염기서열, 서열4는 항원 단백질 Vp8의 아미노산 서열). 상기 유전자 염기서열 분석 결과 한국인에게 가장 많이 발생하는 설사의 원인 바이러스인 P8형으로 분류되었다. 따라서 이형의 바이러스를 이용하면 가장 효과적으로 로타바이러스성 설사를 예방할 수 있다. VP8 염기서열을 분석하여 Gene bank에 보고된 염기서열과 비교한 결과 대만에서 보고된 로타바이러스와 98%의 상동성을 보였다.

[실시예6] 대장균에서 재조합 항원 단백질의 생산

항원 유전자를 함유한 벡터가 전이된 대장균을 LB 배지(yeast extract 5g, tryptone peptone 10g, NaCl 10g/1L)에서 하루 밤 배양하고, 대량의 동 배지에 1% 접종하였다. 동 배양액의 흡광도(600 nm)가 0.6 에 달했을 때 아이피티지 (isopropyl-b-D-thiogalatoside)를 최종 농도 1mM이 되게 첨가하고 진탕배양을 6시간 동안 실시하였다. 배양액을 원심 분리하여 미생물 균체을 수거한 후 증류수에 희석하여, 전기영동 loading buffer와 혼합하여 95 ℃에서 5분 가열한 다음 전기영동하여 발현된 항원 단백질을 확인하였다(도 4, 5).

항원단백질의 부분 정제는 상기와 같이 제조된 균체를 25% Sucrose, 50 mM Tris, pH 8.0 에 현탁시킨 후 10mg의 라이소자임을 첨가한 후 냉장상태에서 10-15분 유지한다. 그 다음 2XRIPA-TET 완충 용액을 첨가하고 5분 후 초음파 파쇄하였다. 이 용액을 원심분리(12,000rpm, 15분)하여 침전물을 항원단백질 부분 정제물로 하였다. 2XRIP는 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 300mM NaCl, 2% Na-Deoxycholate이며, TET는 100mM Tris-HCl,pH 8.0, 50 mM EDTA, 2% TritonX 100으로 구성되어 있다.

[실시예7] His tagged VP8 유전자의 증폭

6개의 His(Histidine) codon을 삽입시키기위해 sense(5'-GGGAATTCCATATGCAT CATCATCATCATCATGCTTCACTCATATAGACA-3'), antisense (5'-TACAAGCTTTCAATACTGTATCGA TCTATATGA-3')의 primer를 제작하였다. 실시예4 에서 제조한 재조합 플라스미드를 template로하여 완충용액(10×thermo pol buffer), 2.5mM dNTP, 20 pmol primers,Vent polymerase(NEB)를 혼합한후 total volumn 100㎕로하여 첫 번째로 94℃에서 5분을 처리한후 94℃, 30초; 55℃, 30초; 72℃, 1분의 순으로 25회 반복처리하고 마지막으로 72℃에서 5분동안 처리(PCR:polymerase chain reaction)하였다. PCR 산물 10㎕를 1% agarose gel에 주입하여 전기영동한 후 자외선 상에서 사진촬영하여 판독하였다(도 6).

[실시예8] 증폭 His tagged VP8 유전자의 전이

PCR결과물로서 생산된 His tagged VP8 유전자를 1% agarose gel에 주입한후 전기영동하여 자외선상에서 보여지는 약 0.75kbp에 해당하는 band만을 적출하여 filter paper에 agarose fragment를 넣고 원심분리하여 얻은 용액을 동량의 phenol/ chloroform에 섞은후 원심분리하여 상층액을 얻어 0.1배의 3M sodium acetate(pH 5.2)첨가, 동량의 이소프로판올첨가혼합한후 4℃에서 4시간 방치한 후 원심분리하여 얻은 DNA pellet을 70% 에탄올에 세척하고 자연건조시킨후 D.W에 적당량 녹였다. 동시에 클로닝벡터를 제한효소 EcoRV에 37℃, 4시간처리한후 1% agarose gel에 주입한후 전기영동하여 자외선상에서 적출하여 위와 동일한 방법으로 DNA를 얻었다. 얻어진 두 가지의 DNA를 다시 1% agarose gel에 주입한후 전기영동하여 자외선상에서 mol 비율을 계산하여 vector : fragment를 1 : 3으로 하여 완충용액(10×ligation buffer)와 T4 ligase와 혼합하여 16℃, 8시간 ligation을 하였다. 다음으로는 65℃에서 ligase를 불활성화시킨후에 대장균 DH5α로 만든 competent cell에 전이 하여 다음날 생긴 균락중 blue colony를 제외한 whitecolony를 picking하여 LB배지 5ml 배양하여 alkaline lysis방법에 의해 plasmid DNA를 얻어 제한효소 NdeI과 HindIII를 처리하여 1% agarose gel에 주입한후 전기영동하여 자외선상에서 클로닝벡터에 His tagged VP8유전자가 삽입되었음을 확인하였다(도 7). 다음으로는 발현벡터와 클로닝벡터를 제한효소 NdeI과 HindIII로 37℃, 1시간처리하고 gel상에서 발현벡터와 His tagged VP8유전자 크기에 해당하는 band만을 적출하여 His tagged VP8 유전자와 발현벡터를 phenol/ chloroform으로 정제하고 에탄올침전하여 D.W에 녹였다. 다음으로는 동일한 방법으로 각각의 mol 비율을 확인하여 ligation을 진행한후 대장균 DH5α로 만든 competent cell에 전이한후 다음날 생긴 colony를 picking하여 LB배지에 5ml 배양하여 alkaline lysis방법에 의해 다시금 plasmid DNA를 얻어 동일한 제한효소를 처리한후 전기영동하여 자외선상에서 발현벡터에 His tagged VP8 유전자가 들어갔음을 확인하였다(도 8).

[실시예9] Ni-colum system을 이용한 His tagged VP8 단백질의 정제

Ni-NTA Superflow^TMcolumn (Qiagen) 또는 HiTrap^TMChelating column (Amersham Pharmacia Biotech)을 사용하여 His-tagged VP8을 정제하였다.

Ni-NTA Superflow^TM를 사용한 경우, 1 ml resin을 column에 충진한 다음 0.5 ml/min의 유속으로 10 ml Lysis buffer A를 흘려주어 column을 평형시켰다. 280 nm에서 baseline이 안정화된 다음 세포 분해물(cell lysate)를 loading하고 다시 안정화될 때까지 Lysis buffer A를 흘려주었다. 10 ml Washing buffer A (50 mMNaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 80 mM imidazole, pH8.0)로 세척한 다음 안정화되면 Elution buffer A (50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 250mM imidazole, pH8.0)로 용출시켜 His-tagged VP8 분획을 수집하여 15% SDS-PAGE로 분석하였다.

HiTrap^TMChelating column을 사용한 경우에는 먼저 증류수로 1 ml column을 세척하고 resin에 Ni²⁺를 결합하기 위해 0.5 ml의 0.1 M NiSO₄를 loading하였다. 5 ml 증류수로 column을 세척한 후 1 ml/min의 유속으로 10 ml Lysis buffer B로 column을 평형시켰다. 시료를 loading한 후 10 ml의 Lysis buffer B로 column을 세척하였다. 5ml의 Elution buffer B(20 mM Phosphate, 500 mM NaCl, 500 mM imidazole, pH 7.4)로 용출시킨 분획을 1 ml 단위로 수집하여 15% SDS-PAGE로 분석하였다(도 9).

[실시예10] 항원 단백질의 백신제조 및 면역

실시예2, 6에서 제조한 재조합 항원을 이용하여 산란계에 면역을 실시하였다. 항원은 표1과 같이 제조하였으며, 2 종류 이상의 항원을 혼합할 때에는 동일한 단백질량을 사용하였다. 아주반트는 미네랄 오일의 일종인 드라케올(Drakeol)과 유화제를 혼합하여 사용하고, 유화제로는 스판 85(Span 85) 및 트윈 85 (Tween 85)를 54:46의 비율로 혼합하여 사용하였다. 드라케올, 유화제, 항원을 9 : 1 : 8의 비율로 혼합하여 유화시킨 후 충분한 항체가가 얻어질 때까지 2주 간격으로 4회 근육주사하였다.

<표 1> 재조합 항원 단백질을 이용한 백신의 제조

[실시예11] 백신의 종류에 따른 항 로타바이러스 항체 역가 비교

실시예 10과 같이 면역 후 생산된 면역란들으로부터 난황만을 분리하고, 분리된 난황을 균질하여 면역 난황액 시료를 제조하였다. 제조된 면역 난황액 중의 항 로타바이러스 항체가는 마이크로타이터법에 의해 다음과 같이 측정하였다. 난황액 1g과 람다 카라기난 수용액(0.15% w/v) 9ml을 혼합하여 실온에서 30분간 방치 후 10,000×g, 10분간 원심분리를 하여 특이적 항체를 함유하는 난황수용성 단백분획을 얻어 시료액으로 하였다. 시료액을 인산완충액(PBS, pH 7.4)로 2ⁿ배 희석하여 검액으로 하였다.

난황으로부터 분리된 항체의 역가 확인을 위하여 항원을 현탁하여 96well plate에 100㎕씩 분주하여 4℃에서 밤새 부착시켰다. 부착된 항원을 PBST(50mMPBS, 0.05% tween 20)으로 세척하고 항체 용액을 1:100부터 연속적으로 2배 희석하여 100㎕씩 분주하여 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응완료 후 PBST로 세척한 뒤 goat-anti-chicken IgY를 1:1,000으로 희석하여 100㎕씩 분주하여 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응완료 후 PBST로 세척한 후 substrate solution (n-nitrophenyl phosphate, Sigma) 100㎕씩 분주하여 37℃에서 반응시킨 후 3N NaOH를 가하여 반응을 정지시켰다. 반응이 정지된 후 ELISA reader를 이용하여 반응 값을 확인하여 항체의 역가(O.D.405nm >1.0)를 측정하였다.

그 결과는 도 10와 같았으며, VP8과 VP5를 단독 항원으로 사용할 경우에는 항체역가가 늦게 형성되어 VP8의 경우 10주 후에 최고의 항체가를 형성하였으며, VP5의 경우는 10주 후에도 최고의 항체가를 형성하지 못하였다. 그러나 이들을 상호 혼합하거나, 바이러스와 함께 혼합할 경우에는 7∼10주 사이에 항체가 최고로 형성됨을 확인할 수 있었다.

[실시예12] 면역난황의 로타바이러스 감염 억제효과

항 로타바이러스 항체를 함유한 면역난황을 가지고, 로타바이러스 억제효과를 확인하였다. 먼저 실시예 11에서 얻어진 면역란으로부터 난황만을 분리하고, 분리된 난황을 균질하여 면역 난황액 시료를 제조하였다. 제조된 면역 난황액의 로타바이러스 감염 억제효과를 plaque assay를 통해 확인하였다. 먼저 각각의 면역 난황액 0.1, 0.5, 1.0g과 로타바이러스 100pfu(plaque forming unit)를 혼합하여 반응시킨 후, MA104 세포에 접종하여 로타바이러스의 감염 정도를 확인하였다. 이때100pfu의 로타바이러스 만을 접종한 것을 대조군으로 사용하였다. 표 2에서 보는 바와 같이 면역난황의 로타바이러스 감염 억제효과는 VP5의 단독 사용시는 바이러스 단독 사용과 비슷한 결과를 가져왔으나, VP8의 경우는 단독으로 사용할 경우에도 바이러스에 의한 억제효과보다 더 높은 억제율을 나타냈다. 더욱이 VP5, VP8을 바이러스와 혼합하여 백신을 제조할 경우는 매우 높은 로타바이러스 억제율을 나타냈으며, 특히, VP8과 바이러스를 혼합한 경우와 VP8과 VP5를 혼합한 경우 그리고 바이러스와 VP8, VP5를 혼합하여 백신을 제조한 경우에는 농도 의존적으로 항 로타바이러스 효과를 보였다. 따라서 로타바이러스의 type별 배양이 필요없이 VP8과 VP5를 항원으로 사용할 경우에는 높은 역가의 항 로타바이러스 항체를 얻을 수 있고, 아울러 높은 로타바이러스 억제효과를 갖는 면역난황을 얻을 수 있었다.

<표 2> 면역항원별 난황액의 로타바이러스 감염 억제효과

이상과 같이 본 발명에 의하면, 한국형 로타바이러스 재조합 항원을 생산, 2가지 이상의 항원으로 조합 백신을 제조하여 광범위, 고역가의 항 로타바이러스 난황 항체를 생산하였고, 이를 이용하여 로타바이러스를 억제 할 수 있는 식품을 제조할 수 있는 효과가 있다.

Claims

로타바이러스의 VP8항원에 대하여 특이성을 갖는 로타바이러스 항체 조성물.
제1항에 있어서,

로타바이러스의 VP5항원에 대한 특이성을 추가로 갖는 로타바이러스 항체 조성물.
제2항에 있어서,

로타바이러스의 VP4항원, 로타바이러스의 VP7항원, 로타바이러스중 어느 하나 또는 둘이상에 대한 특이성을 추가로 갖는 로타바이러스 항체 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 로타바이러스는 로타바이러스 케이알브이01(기탁기관:한국미생물보존센터, 기탁일자:2002년 8월 20일, 수탁번호:KFCC-11313)인 것을 특징으로 하는 로타바이러스 항체 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 의한 로타바이러스 항체 조성물을 포함하는 면역난황/면역란.
제4항에 의한 로타바이러스 항체 조성물을 포함하는 면역난황/면역란.
면역난황/면역란 생산방법에 있어서,

로타바이러스를 배양하는 배양단계와;

로타바이러스 RNA로부터 VP8항원에 대응되는 cDNA를 생성하는 cDNA생성단계와;

상기 cDNA로부터 dsDNA를 생성하는 dsDNA생성단계와;

상기 dsDNA를 절단하여 플라스미드에 삽입하는 플라스미드 제작단계와;

상기 플라스미드를 대장균에 삽입하여 번식시키는 번식단계와;

상기 플라스미드에 포함된 항원유전자를 발현시켜 항원을 생산하는 발현단계와;

생산된 항원을 산란계에 주사하여 면역시키는 면역단계와;

상기 산란계로부터 면역난황 및/또는 면역란을 수득하는 수득단계;를 갖는 로타바이러스 항체를 포함한 면역난황/면역란 생산방법.
제7항에 있어서,

상기 cDNA생성단계는,

로타바이러스의 VP5항원에 대응되는 cDNA를 추가로 생성하는 것을 특징으로 하는 로타바이러스 항체를 포함한 면역난황/면역란 생산방법.
제7항 또는 제8항에 있어서,

상기 cDNA생성단계는,

로타바이러스의 VP4항원, 로타바이러스의 VP7항원, 로타바이러스중 어느 하나 또는 둘이상의 항원에 대응되는 cDNA를 추가로 생성하는 것을 특징으로 하는 로타바이러스 항체를 포함한 면역난황/면역란 생산방법.
제7항 또는 제8항에 있어서,

상기 로타바이러스는 KRV01인 것을 특징으로 하는 로타바이러스 항체를 포함한 면역난황/면역란 생산방법.
제9항에 있어서,

상기 로타바이러스는 KRV01인 것을 특징으로 하는 로타바이러스 항체를 포함한 면역난황/면역란 생산방법.