ES2231822T3 - Deteccion del virus de la hepatitis gb mediante acidos nucleicos. - Google Patents
Deteccion del virus de la hepatitis gb mediante acidos nucleicos.Info
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Abstract
SONDAS OLIGOMERICAS DE ACIDO NUCLEICO UTILES PARA LA DETECCION DE HGBV EN MUESTRAS A ENSAYAR. SE PROPORCIONAN ASIMISMO ENSAYOS QUE UTILIZAN DICHAS SONDAS Y KITS DE ENSAYO QUE CONTIENEN ESTAS SONDAS OLIGOMERICAS.
Description
Detección del virus de la hepatitis GB mediante
ácidos nucleicos.
Esta invención se refiere de manera general al
virus de la hepatitis GB, y más particularmente, se refiere a sondas
de ácido nucleico y a un par de cebadores útiles para la detección
del virus de la hepatitis GB-C
(VHGB-C).
Varias líneas de evidencia epidemiológica y de
laboratorio han sugerido la existencia de más de un agente causante
de hepatitis no A, no B (NANB) transmitida parenteralmente,
incluyendo múltiples ataques de HNANB aguda en usuarios de drogas
intravenosas, distintos periodos de incubación de pacientes que
adquieren HNANB después de una transfusión, el resultado de
experimentos de desafío cruzado en chimpancés, la patología hepática
ultraestructural de chimpancés infectados y la resistencia
diferencial de los supuestos agentes al cloroformo. J.L. Dienstag,
Gastroenterology 85:439-462 (1983); J.L.
Dienstag, Gastroenterology 85:743-768 (1983);
F.B. Hollinger y col., J. Infect. Dis.
142:400-407 (1980); D.W. Bradley en F. Chisari, ed.,
Advances in Hepatitis Research, Masson, New York, pp.
268-280 (1984) y D.W. Bradley y col., J. Infect.
Dis. 148:254-265 (1983).
La detección de anticuerpos hacia el virus de la
hepatitis C (VHC) en muestras de donantes elimina actualmente del 70
al 80% de la sangre infectada con HNANB en el sistema de suministro
de sangre. Por tanto, la detección del VHC no ha impedido totalmente
la transmisión de la hepatitis debida a agentes de hepatitis NANB.
H. Alter y col., New Eng. J. Med.
321:1494-1500 (1989). Publicaciones recientes han
cuestionado también si agentes de la hepatitis adicionales podrían
ser responsables de la hepatitis post-transfusión
(HPT) y de la hepatitis aguda y/o crónica adquirida en la comunidad
que no está asociada con la HPT. Por ejemplo, de 181 pacientes
monitorizados en un estudio clínico prospectivo realizado en Francia
de 1988 a 1990, los investigadores observaron un total de 18 casos
de HPT. Trece de estos 18 pacientes resultaron negativos en los
análisis para detectar anticuerpos anti-VHC, el
antígeno de superficie del virus de la hepatitis B (HBsAg), ácidos
nucleicos del virus de la hepatitis B (VHB) y del VHC. Los autores
especularon sobre la potencial importancia de un agente no A, no B,
no C, causante de HPT. V. Thiers y col., J. Hepatology
18:34-39 (1993). Además, de 1.476 pacientes
monitorizados en otro estudio llevado a cabo en Alemania desde 1985
hasta 1988, 22 casos de los casos de HPT documentados no estaban
relacionados con una infección por VHB o VHC. T. Peters y col.,
J. Med. Virol. 39:139-145 (1993).
Recientemente, se ha informado de una nueva
familia de flavivirus detectados en pacientes con hepatitis
diagnosticada clínicamente. Esta nueva familia de virus ha sido
denominada virus "GB", por las iniciales del paciente infectado
por vez primera con el virus. Estos virus han sido descritos por
J.N. Simons y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
92:3401-3405 (1995) y J.N. Simons y col., Nature
Medicine 1(6):564-569 (1995). Actualmente
hay estudios en marcha para determinar el significado clínico y
epidemiológico de estos virus.
El genoma completo del VHGB-B ha
sido descrito el 12 de Abril de 1995 en la base de datos GenBank, Nº
de Acceso U22304. Simons, J.N. y col. The Lancet, vol. 345,
nº 8963, 10 de Junio de 1995, páginas 1453-54,
discuten los nuevos virus de la hepatitis GB. Muerhoff, A.S. y col.,
Journal of Virology, vol. 69, nº 9, Septiembre de 1995,
páginas 5621-30, describen la organización genómica
de los virus GB A y B. EP-A-0 745
129, que fue registrada el 14 de Febrero de 1995 y publicada el 17
de Agosto de 1995, describe secuencias de ácido nucleico y de
aminoácidos del virus de la hepatitis GB útiles para una variedad de
aplicaciones diagnósticas y terapéuticas.
EP-A-0 763 114, que fue registrada
el 19 de Mayo de 1995 y publicada el 30 de Noviembre de 1995, se
refiere a la caracterización y aislamiento del recién descubierto
virus de la hepatitis G y describe una familia de réplicas de ADNc
de porciones del genoma del virus de la hepatitis G.
La detección de VHGB en muestras de ensayo puede
ser incrementada por la utilización de ensayos de hibridación de ADN
que utilizan oligómeros de ADN como cebadores y sondas de detección.
Como la cantidad de ácido nucleico diana ADN presente en una muestra
de ensayo puede ser mínima, el ADN diana es normalmente amplificado
y detectado posteriormente. Los métodos para amplificar y detectar
una secuencia de ácido nucleico diana que pueda estar presente en
una muestra de ensayo son bien conocidos en el oficio. Tales métodos
incluyen la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) descrita en
las Patentes de EE.UU. 4.683.195 y 4.683.202, la reacción en cadena
de la ligasa (LCR), descrita en
EP-A-320 308, la LCR con huecos
(GLCR), descrita en la Solicitud de Patente Europea
EP-A-439 182 y en la Patente de
EE.UU. Nº 5.427.930, la LCR multiplex descrita en la Solicitud de
Patente Internacional Nº WO 93/20227, y similares. Estos métodos han
encontrado una aplicación muy difundida en el campo del diagnóstico
médico así como en los campos de la genética, la biología molecular
y la
bioquímica.
bioquímica.
Sería ventajoso proporcionar sondas oligoméricas
de ADN derivadas del VHGB y kits de diagnóstico y ensayo que
utilicen estas sondas. Tales sondas podrían incrementar enormemente
la capacidad de la comunidad médica para diagnosticar con más
precisión una hepatitis vírica aguda y/o crónica y podrían
proporcionar un suministro de sangre y de órganos más seguro
mediante la detección de hepatitis no A, no B y no C en estas
donaciones de sangre y
órganos.
órganos.
La presente invención proporciona nuevas sondas y
cebadores oligoméricos de ADN del virus de la hepatitis GB C
(VHGB-C). Las sondas de la invención, que son
específicas para 5' NTR del virus de la hepatitis GB C
(VHGB-C), son seleccionadas del grupo que consta de
la SECUENCIA ID Nº 3, la SECUENCIA ID Nº 4 y la SECUENCIA ID Nº 5.
La presente invención proporciona también una composición que
contiene un par de cebadores específicos para 5' NTR del
VHGB-C que consta de la SECUENCIA ID Nº 1 y de la
SECUENCIA ID Nº 2. Un ensayo de acuerdo con la invención para
detectar la presencia de nucleótidos diana del
VHGB-C en una muestra de ensayo,
comprende:
comprende:
a. la puesta en contacto de una muestra de ensayo
sospechosa de contener una secuencia de nucleótidos del
VHGB-C diana con el par de cebadores del
VHGB-C compuesto por la SECUENCIA ID Nº 1 y la
SECUENCIA ID Nº 2 para formar una mezcla;
b. la puesta en contacto de dicha mezcla de
reacción con al menos una sonda del VHGB-C
seleccionada del grupo que consta de la SECUENCIA ID Nº 3, la
SECUENCIA ID Nº 4 y la SECUENCIA ID Nº 5;
c. la detección de la presencia del nucleótido
diana del VHGB-C en la muestra de ensayo.
La sonda del VHGB puede ser conjugada a un
compuesto generador de una señal o a un hapteno. Este compuesto
generador de una señal es seleccionado del grupo que consta de un
compuesto quimioluminiscente, un compuesto de fluoresceína y un
enzima. El hapteno es seleccionado del grupo que consta de
adamantano, carbazol, fluoresceína y biotina. La reacción puede ser
llevada a cabo en una fase sólida. La sonda y el cebador pueden
estar unidos cada uno a un hapteno diferente tal como adamantano y
carbazol, y la unión puede tener lugar en el extremo 5', en el
extremo 3' o en ambos extremos 5' y 3'; o más de un hapteno puede
estar unido en o cerca del extremo 5' o del extremo 3'. Además, la
reacción puede ser amplificada mediante la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR).
Se proporciona también un kit de ensayo para
detectar un nucleótido del VHGB-C diana en una
muestra de ensayo, que comprende:
a. un recipiente conteniendo un par de cebadores
específicos para una nucleótido diana del VHGB-C, en
el que dicho par de cebadores está formado por la SECUENCIA ID Nº 1
y la SECUENCIA ID Nº 2;
b. un recipiente conteniendo al menos una sonda
específica para el VHGB-C, en el que dicha sonda del
VHGB-C es seleccionada del grupo que consta de la
SECUENCIA ID Nº 3, la SECUENCIA ID Nº 4 y la SECUENCIA ID Nº 5.
La sonda del VHGB puede ser conjugada a un
hapteno o un compuesto generador de una señal. Este compuesto
generador de una señal es seleccionado del grupo que consta de un
compuesto quimioluminiscente, un compuesto de fluoresceína y un
enzima. El hapteno es seleccionado del grupo que consta de
adamantano, carbazol, fluoresceína y biotina. La reacción puede ser
llevada a cabo en una fase sólida. La reacción puede ser amplificada
mediante un proceso de amplificación tal como PCR. La sonda y el
cebador pueden estar unidos cada uno a un hapteno diferente tal como
adamantano y cabazol, y la unión puede tener lugar en el extremo 5',
en el extremo 3' o en ambos extremos 5' y 3'; o más de un hapteno
puede estar unido en o cerca del extremo 5' o del extremo 3'.
La Figura 1 es un diagrama que describe las
etapas del método de ensayo preferido de la invención.
La Figura 2 es un diagrama del complejo de
reacción.
La presente invención proporciona sondas y un par
de cebadores oligoméricos de ADN, métodos para determinar la
presencia de secuencias de nucleótidos diana del VHGB utilizando
estas sondas y el par de cebadores y kits de ensayo que son útiles
para tal método según se describió anteriormente.
La presente invención proporciona kits de ensayo
conteniendo reactivos que pueden ser utilizados para la detección de
la presencia y/o de la cantidad de polinucleótidos derivados de
VHGB-C. Estos reactivos empleados para el ensayo
pueden ser proporcionados en forma de un kit de ensayo con uno o más
recipientes tales como viales o botellas, conteniendo cada
recipiente un reactivo separado tal como una sonda de ácido nucleico
o un cóctel de las sondas de ácido nucleico empleadas en el ensayo.
En tales kits de ensayo pueden estar incluidos otros componentes
tales como tampones, controles y similares, conocidos por aquellas
personas con experiencia habitual en la técnica.
El término "Virus de la Hepatitis GB" o
"VHGB", según se utiliza en la presente, indica colectivamente
una especie vírica que causa hepatitis no A, no B, no C, no D, no E
o posiblemente otras enfermedades en mamíferos tales como el hombre,
y cepas atenuadas o partículas defectuosas que perjudiciales
derivadas de los mismos. Esto puede incluir hepatitis vírica aguda
transmitida por alimentos contaminados, agua de bebida contaminada y
similares; hepatitis debida a VHGB transmitida a través de contacto
persona a persona (incluyendo transmisión sexual, vías respiratoria
y parenteral) o través de la utilización de drogas intravenosas. Los
métodos descritos en la presente permitirán la identificación de
individuos que hayan adquirido el VHGB. Individualmente, los
aislados del VHGB son referidos específicamente como
"VHGB-A", "VHGB-B" y
"VHGB-C". Según se describe en la presente, el
genoma del VHGB está compuesto por ARN. El análisis de la secuencia
de nucleótidos y de la secuencia de aminoácidos deducida del VHGB
revela que los virus de este grupo tienen una organización del
genoma similar a la de la familia Flaviviridae. Basado
primariamente, pero no exclusivamente, en similitudes de la
organización del genoma, el Comité Internacional sobre la Taxonomía
de los Virus ha recomendado que esta familia esté compuesta por tres
géneros: Flavivirus, Pestivirus y el grupo de la hepatitis C.
Búsquedas similares a nivel de aminoácidos revelaron que subclones
del virus de la hepatitis GB tienen cierta similitud de secuencias,
aunque baja, con el virus de la hepatitis C. Actualmente ya se ha
demostrado que el VHGB-C no es un genotipo del VHC.
Ver, por ejemplo, EP-A-
0 736 601.
0 736 601.
Los términos "similitud" y/o
"identidad" son utilizados en la presente para describir el
grado de relación entre dos secuencias de polinucleótidos o
polipéptidos. Las técnicas para determinar la "similitud" y/o
la "identidad" de secuencias de aminoácidos son bien conocidas
en el oficio e incluyen, por ejemplo, la determinación directa de la
secuencia de aminoácidos y la comparación de la misma con las
secuencias proporcionadas en la presente; la determinación de la
secuencia de nucleótidos del material genómico del supuesto VHGB
(normalmente a través de un ADNc intermedio), y la determinación de
la secuencia de aminoácidos codificada en el mismo, y la comparación
de las regiones correspondientes. En general, por "identidad"
se indica la coincidencia exacta de la secuencia de nucleótidos del
VHGB y la de otra(s) cepa(s) o de la secuencia de
aminoácidos del VHGB y la de otra(s) cepa(s) en el
lugar apropiado de cada genoma. Además, en general, se entiende por
"similitud" la coincidencia exacta de la secuencia de
aminoácidos del VHGB y la de otra(s) cepa(s) en la
posición apropiada, en la que los aminoácidos son idénticos o poseen
propiedades químicas y/o físicas similares tales como la carga o la
hidrofobicidad. Los programas disponibles en el Wisconsin Sequence
Analysis Package, Versión 8 (disponible en el Genetics Computer
Group, Madison, Wisconsin, 53711), por ejemplo, el programa GAP, son
capaces de calcular la identidad y la similitud entre dos secuencias
de polinucleótidos o entre dos secuencias de polipéptidos. Se
conocen en la técnica otros programas para calcular la identidad y
la similitud entre dos secuencias.
Un polinucleótido derivado de la secuencia de
nucleótidos del VHGB-C no derivará necesariamente
físicamente de la secuencia de nucleótidos del VHGB, sino que puede
ser generado de cualquier manera, incluyendo pero sin limitarse a,
síntesis química, replicación o transcripción inversa o
transcripción, que se basan en la información proporcionada por la
secuencia de bases de la(s) región(es) de la(s)
que deriva el polinucleótido.
Los términos "polinucleótido",
"oligómero" y "oligonucleótido" son utilizados
indistintamente en la presente.
El término "polinucleótido", según se
utiliza en la presente, indica una forma polimérica de nucleótidos
de cualquier longitud, ya sean ribonucleótidos o
desoxirribonucleótidos. Este término se refiere solamente a la
estructura primaria de la molécula. Por tanto, el término incluye
ADN de doble hebra y de hebra sencilla, así como ARN de doble hebra
y de hebra sencilla. Incluye también modificaciones, por metilación
y/o por la formación de casquetes, y formas no modificadas del
polinucleótido.
El término "individuo", según se utiliza en
la presente, se refiere a vertebrados, particularmente miembros de
la especie mamífero e incluye, pero no se limita a, animales
domésticos, animales para deporte, primates y humanos; más
particularmente el término se refiere a tamarinos y humanos.
El término "muestra de ensayo" se refiere a
un componente del organismo de un individuo que es la fuente del
analito. Estos componentes son bien conocidos en la técnica. Estas
muestras de ensayo incluyen muestras biológicas que pueden ser
analizadas por los métodos de la presente invención aquí descritos e
incluyen fluidos corporales humanos y animales tales como sangre
completa, suero, plasma, fluido cerebroespinal, orina, fluidos
linfáticos y varias secreciones externas de los tractos
respiratorio, intestinal y genitourinario, lágrimas, saliva, leche,
glóbulos blancos sanguíneos, mielomas y similares; fluidos
biológicos tales como sobrenadantes de cultivos celulares;
especímenes de tejido fijados y especímenes celulares fijados.
"VHGB purificado" se refiere a una
preparación de VHGB que ha sido aislada de los constituyentes
celulares con los que está asociado el virus normalmente, y de otros
tipos de virus que puedan estar presentes en el tejido infectado.
Las técnicas para aislar virus son conocidas por las personas
expertas en el oficio e incluyen, por ejemplo, centrifugación y
cromatografía de afinidad.
"PNA" indica un "ácido péptido
nucleico" que puede ser utilizado en un procedimiento tal como un
ensayo descrito en la presente para determinar la presencia de una
diana. Los PNAs son restos cargados neutralmente que pueden ser
dirigidos contra dianas de ARN o ADN. Las sondas de PNA utilizadas
en ensayos en lugar de, por ejemplo, las sondas de ADN de la
presente invención, ofrecen ventajas que no se consiguen cuando se
utilizan sondas de ADN. Estas ventajas incluyen la facilidad de
preparación, el marcaje a gran escala, la reproducibilidad, la
estabilidad, la insensibilidad a cambios de la fuerza iónica y
resistencia a la degradación enzimática que está presente en los
métodos que utilizan ADN o ARN. Estos PNAs pueden ser marcados con
compuestos generadores de señal tales como fluoresceína,
radionucleótidos, compuestos quimioluminiscentes y similares. Los
PNAs u otros análogos de ácido nucleico tales como los compuestos de
morfolino pueden ser utilizados por tanto en métodos de ensayo en
lugar de ADN o ARN. Aunque en la presente se describen ensayos que
utilizan sondas de ADN, está dentro del ámbito del trabajador
rutinario el que el ARN o el ADN puedan ser sustituidos por PNAs o
por compuestos de morfolino con los cambios apropiados, si se
necesitan o según se necesiten, en los reactivos del
ensayo.
ensayo.
Las "fases sólidas" ("soportes
sólidos") son bien conocidas por las personas del oficio e
incluyen las paredes de los pocillos de una placa de reacción, tubos
de ensayo, esferas de poliestireno, esferas magnéticas, tiras de
nitrocelulosa, membranas, micropartículas tales como partículas de
látex, glóbulos rojos sanguíneos de carnero (o de otro animal),
duracitas y otros. La "fase sólida" no es crítica y puede ser
seleccionada por una persona experta en la técnica. Así, partículas
de látex, micropartículas, esferas magnéticas o no magnéticas,
membranas, tubos de plástico, las paredes de pocillos de
microvaloración, chips de vidrio o silicona, glóbulos rojos
sanguíneos de carnero (o de otro animal adecuado) y duracitas, son
todos ejemplos adecuados. Los métodos adecuados para inmovilizar
sondas sobre fases sólidas incluyen interacciones iónicas,
hidrofóbicas, covalentes y similares. Una "fase sólida", según
se utiliza en la presente, se refiere a cualquier material que sea
insoluble o que puede hacerse insoluble por una reacción posterior.
La fase sólida puede ser elegida por su capacidad intrínseca para
atraer e inmovilizar al reactivo de captura. Alternativamente, la
fase sólida puede retener un receptor adicional que tenga la
capacidad de atraer e inmovilizar al reactivo de captura. El
receptor adicional puede incluir una sustancia cargada que esté
cargada de manera opuesta con respecto al propio reactivo de
captura, o con respecto a una sustancia cargada conjugada al
reactivo de captura. Como otra alternativa más, la molécula del
receptor puede ser cualquier miembro de unión específica que esté
inmovilizado sobre (unido a) la fase sólida y que tenga la capacidad
de inmovilizar al reactivo de captura mediante una reacción de unión
específica. La molécula del receptor permite la unión indirecta del
reactivo de captura a un material de fase sólida antes de la
realización del ensayo o durante la realización del ensayo. La fase
sólida puede ser por tanto un plástico, un plástico derivatizado, un
metal magnético o no magnético, la superficie de vidrio o silicona
de un tubo de ensayo, un pocillo de microvaloración, una lámina, una
esfera, una micropartícula, un chip, glóbulos rojos sanguíneos de
carnero (o de otro animal adecuado), duracitas y otras
configuraciones conocidas por aquellas personas con experiencia
habitual en la técnica.
Se contempla, y está dentro del ámbito de la
invención, el que la fase sólida pueda comprender también cualquier
material poroso adecuado con porosidad suficiente para permitir el
acceso a los anticuerpos de detección y una afinidad adecuada en la
superficie para unirse a antígenos. Las estructuras microporosas son
generalmente preferidas, pero pueden utilizarse también materiales
con estructura de gel en estado hidratado. Tales soportes sólidos
útiles incluyen, pero no se limitan a, carbohidratos poliméricos
naturales y sus derivados modificados sintéticamente, entrecruzados
o sustituidos tales como agar, agarosa, ácido algínico entrecruzado,
gomas guar sustituidas y entrecruzadas, ésteres de celulosa,
especialmente con ácido nítrico y ácidos carboxílicos, ésteres de
celulosa mixtos y éteres de celulosa; polímeros naturales
conteniendo nitrógeno; polímeros sintéticos que pueden ser
preparados con estructuras idóneamente porosas, tales como polímeros
de vinilo; materiales inorgánicos porosos tales como sulfatos o
carbonatos de metales alcalinotérreos y magnesio, incluyendo sulfato
de bario, sulfato de calcio, carbonato de calcio, silicatos de
metales alcalinos y alcalinotérreos, aluminio y magnesio; y óxidos o
hidratos de aluminio o silicona tales como arcillas, alúmina, talco,
caolín, zeolita, gel de sílice o vidrio (estos materiales pueden ser
utilizados como filtros con los materiales poliméricos anteriores);
y mezclas o copolímeros de las clases anteriores tales como
copolímeros por injerto obtenidos iniciando la polimerización de los
polímeros sintéticos sobre un polímero natural preexistente. Todos
estos materiales pueden ser utilizados en las formas adecuadas,
tales como películas, láminas o placas, o pueden ser revestidos
sobre, o unidos a, o laminados en, vehículos inertes apropiados
tales como papel, vidrio, películas de plástico
o tejidos.
o tejidos.
La estructura porosa de la nitrocelulosa tiene
excelentes cualidades de absorción y adsorción para una amplia
variedad de reactivos. El nailon posee también características
similares y es también adecuado. Se contempla que tales soportes
sólidos porosos descritos en la presente anteriormente estén
preferiblemente en forma de láminas con un espesor de 0,01 a 0,5 mm
aproximadamente, preferiblemente de 0,1 mm aproximadamente. El
tamaño de poro puede variar dentro de amplios límites, y es
preferiblemente de 0,025 a 15 \mum aproximadamente, especialmente
de 0,15 a 15 \mum aproximadamente. Las superficies de tales
soportes pueden ser activadas por procesos químicos que produzcan la
unión covalente del antígeno o el anticuerpo al soporte. La unión
irreversible del antígeno o del anticuerpo se obtiene, sin embargo,
en general, por adsorción sobre el material poroso mediante fuerzas
hidrofóbicas poco conocidas. En la Patente de EE.UU. 5.281.540 se
describen también soportes sólidos adecua-
dos.
dos.
El "reactivo indicador" comprende un
"compuesto generador de señal" (denominado también
"marca") que es capaz de generar, y genera, una señal medible
detectable por un medio externo conjugado (unido) a un miembro de
unión específica para el VHGB. Un "miembro de unión
específica", según se utiliza en la presente, significa un
miembro de un par de unión específica. Esto es, dos moléculas
diferentes donde una de las moléculas se une específicamente a la
segunda molécula por medios químicos o físicos. Además de ser un
miembro anticuerpo de un par de unión específica para el VHGB, el
reactivo indicador puede ser también un miembro de cualquier par de
unión específica, incluyendo sistemas
hapteno-anti-hapteno tales como
biotina o anti-biotina, avidina o biotina, un
carbohidrato o una lectina, una secuencia de nucleótidos
complementaria, una molécula efectora o receptora, un cofactor
enzimático y un enzima, un inhibidor enzimático o un enzima, y
similares. Además, los pares de unión específica pueden incluir
miembros que sean análogos de los miembros de unión específica
originales, por un ejemplo un análogo de un analito. Un miembro de
unión específica inmunorreactivo puede ser un anticuerpo o un
fragmento del mismo, un antígeno o un fragmento del mismo o un
complejo anticuerpo/antígeno incluyendo los formados por moléculas
de ADN recombinante que sea capaz de unirse al VHGB como en un
ensayo de sándwich, al reactivo de captura como en un ensayo
competitivo o al miembro de unión específica auxiliar como en un
ensayo indirecto.
Los diferentes "compuestos generadores de
señal" (marcas) contemplados incluyen cromógenos, catalizadores
tales como enzimas, compuestos luminiscentes tales como fluoresceína
y rodamina, compuestos quimioluminiscentes tales como dioxetanos,
acridinios, fenantridinios y luminol, elementos radioactivos y
marcas visuales directas. Ejemplos de enzimas incluyen fosfatasa
alcalina, peroxidasa de rábano picante,
beta-galactosidasa y similares. La selección de una
marca particular no es crítica, pero será capaz de producir una
señal por sí misma o en conjunción con una o más sustancias
adicionales.
El término "marca de detección" se refiere a
una molécula o a un resto que tiene una propiedad o una
característica que es capaz de ser detectada. Una marca de detección
puede ser detectable directamente como es el caso de, por ejemplo,
los radioisótopos, fluoróforos, quimioluminóforos, enzimas,
partículas coloidales, micropartículas fluorescentes y similares; o
una marca puede ser detectable indirectamente como ocurre con, por
ejemplo, los miembros de unión específica. Se comprenderá que las
marcas directas pueden requerir componentes adicionales tales como,
por ejemplo, sustratos, reactivos activadores, luz y similares para
permitir la detección de la marca. Cuando se utilizan para la
detección marcas indirectas, éstas son utilizadas típicamente en
combinación con un conjugado. Un "conjugado" es típicamente un
miembro de unión específica que ha sido unido o acoplado a una marca
detectable directamente. De manera similar a la síntesis de
reactivos en fase sólida, la química de acoplamiento para sintetizar
un conjugado es bien conocida en la técnica y puede incluir, por
ejemplo, cualquier medio químico y/o cualquier medio físico que no
destruya la propiedad de unión específica del miembro de unión
específica ni la propiedad detectable de la marca.
El término "hapteno", según se utiliza en la
presente, se refiere a un antígeno parcial o a un miembro de unión
no proteico que es capaz de unirse a un anticuerpo, pero que no es
capaz de inducir la formación de anticuerpos a no ser que esté
acoplado a una proteína transportadora. Ejemplos de haptenos
incluyen biotina, avidina, adamantano, fluoresceína y carbazol.
"Analito", según se utiliza en la presente,
es la sustancia a detectar que puede estar presente en la muestra de
ensayo.
Pueden emplearse de acuerdo con la presente
invención realizaciones que utilicen procedimientos de captura
iónica para inmovilizar un complejo de reacción inmovilizable con un
polímero cargado negativamente, descritas en
EP-A-0 326 100 y
EP-A-0 406 473, para llevar a cabo
una reacción inmunoquímica en fase de solución rápida. Un complejo
inmune inmovilizable es separado del resto de la mezcla de reacción
por interacciones iónicas entre el polianión cargado
negativamente/complejo inmune y la matriz porosa cargada
positivamente, previamente tratada, y detectado mediante la
utilización de varios sistemas generadores de señal previamente
descritos, incluyendo los descritos en las medidas de señales
quimioluminiscentes según está descrito en
EP-A-0 273 115.
Además, los métodos de la presente invención
pueden ser adaptados para ser utilizados en sistemas que utilizan
tecnología de micropartículas, incluyendo sistemas automatizados y
semiautomatizados en los cuales la fase sólida comprende una
micropartícula (magnética o no magnética). Tales sistemas incluyen
los descritos en EP-A-0 425 633 y
EP-A-0 424 634.
Los reactivos y métodos de la presente invención
son posibles por el suministro de una familia de secuencias de
nucleótidos estrechamente relacionadas presentes en el plasma, en el
suero o en un homogenado de hígado de un individuo infectado con
VHGB, tamarino o humano. Esta familia de secuencias de nucleótidos
no es de origen humano ni de tamarino, puesto que no hibrida con ADN
genómico humano ni de tamarino procedente de individuos infectados,
puesto que los nucleótidos de esta familia de secuencias están
presentes solamente en hígado (o en homogenados de hígado), plasma o
suero de individuos infectados con VHGB, y puesto que la secuencia
no está presente en el GenBank®. Además, la familia de secuencias no
presenta identidad significativa a nivel de ácido nucleico con
secuencias contenidas en el genoma de VHA, VHB, VHC, VHD y VHE, y
presenta un bajo nivel de identidad, considerado no significativo,
con los productos de traducción. El suero, el plasma o los
homogenados hepáticos infecciosos procedentes de humanos infectados
con el VHGB contienen estas secuencias de polinucleótidos, mientras
que el suero, el plasma o los homogenados hepáticos de humanos no
infectados no contienen estas secuencias. El análisis de
transferencia Northern de un hígado infectado con algunas de estas
secuencias de polinucleótidos demuestra que derivan de un transcrito
de ARN grande similar en tamaño a un genoma vírico. El suero, el
plasma o los homogenados hepáticos de humanos infectados con VHGB
contienen anticuerpos que se unen a este polipéptido, mientras que
el suero, el plasma o los homogenados hepáticos de humanos no
infectados no contienen anticuerpos hacia este polipéptido; estos
anticuerpos se inducen en los individuos después de una infección
aguda de hepatitis no A, no B, no C, no D y no E. Por estos
criterios, se cree que la secuencia es una secuencia vírica, donde
el virus causa o está asociado con hepatitis no A, no B, no C, no D
y no E.
Cuando se utilizan como reactivos de diagnóstico,
la muestra de ensayo a analizar, tal como sangre o suero, puede ser
tratada para extraer los ácidos nucleicos en ella contenidos. El
ácido nucleico de la muestra resultante puede ser sometido a
electroforesis en gel o a otras técnicas de separación por tamaños;
o, la muestra de ácido nucleico puede ser sometida a una
transferencia de manchas sin separación por tamaños. Posteriormente
se marcan las sondas. Las marcas y métodos adecuados para unir
marcas a sondas son conocidos en la técnica e incluyen, pero no se
limitan a, marcas radioactivas incorporadas mediante traducción con
muescas o tratamiento con quinasas, sondas con biotina,
fluorescentes y quimioluminiscentes. En la presente se describen
ejemplos de muchas de estas marcas. Los ácidos nucleicos extraídos
de la muestra son luego tratados con la sonda marcada bajo
condiciones de hibridación de rigurosidad adecuada.
Las sondas pueden ser construidas totalmente
complementarias al genoma del VHGB. Por tanto, son deseables
normalmente condiciones de alta rigurosidad con el fin de impedir la
aparición de falsos positivos. Sin embargo, las condiciones de alta
rigurosidad deben ser utilizadas solamente si las sondas son
complementarias a regiones del genoma del VHGB que carecen de
heterogeneidad. La rigurosidad de la hibridación está determinada
por varios factores durante el procedimiento de lavado, incluyendo
la temperatura, la fuerza iónica, la duración del proceso y la
concentración de formamida. Ver, por ejemplo, J. Sambrook
(supra). La hibridación puede ser llevada a cabo mediante
varias técnicas diferentes. La amplificación puede ser realizada,
por ejemplo, mediante la Reacción en Cadena de la Ligasa (LCR), la
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), la replicasa
Q-beta, NASBA, etc.
Se contempla que pueden estar presentes
secuencias del genoma del VHGB en el suero de individuos infectados
a niveles relativamente bajos, por ejemplo
10^{2}-10^{3} secuencias por ml aproximadamente.
Este nivel puede requerir que sean utilizadas técnicas de
amplificación en los ensayos de hibridación, tal como la LCR o la
PCR. Tales técnicas son conocidas en el oficio. Por ejemplo, el
sistema "Bio-Bridge" utiliza desoxinucleótido
transferasa terminal para añadir colas
3'-poli-dT no modificadas a una
sonda de ácido nucleico (Enzo Biochem. Corp.). La sonda con la cola
de poli-dT es hibridada a la secuencia de
nucleótidos diana y posteriormente a una poli-A
modificada con biotina. Además, en EP 124221 se describe un ensayo
de hibridación de ADN en el que el analito se hibrida a una sonda de
ADN de hebra sencilla que es complementaria a un oligonucleótido
marcado con un enzima, y el dúplex con cola resultante se hibrida a
un oligonucleótido marcado con un enzima. EP 204510 describe un
ensayo de hibridación de ADN en el que el ADN analito es puesto en
contacto con una sonda que tiene una cola, tal como una cola de
poli-dT, una hebra amplificadora que tiene una
secuencia que hibrida con la cola de la sonda, tal como una
secuencia de poli-A, y que es capaz de unirse a una
pluralidad de hebras marcadas. La técnica puede implicar
primeramente la amplificación de las secuencias del VHGB diana en el
suero hasta 10^{6} secuencias/ml aproximadamente. Esto puede ser
realizado siguiendo los métodos descritos por Saiki y col.,
Nature 324:163 (1986). La(s) secuencia(s)
amplificada(s) puede(n) ser detectada(s)
posteriormente utilizando un ensayo de hibridación tal como los
conocidos en la técnica. Las sondas pueden estar empaquetadas en
kits de diagnóstico que incluyan la secuencia de ácido nucleico de
la sonda, secuencia que puede estar marcada; alternativamente, la
sonda puede no estar marcada y los ingredientes para el marcaje
podrían estar incluidos en el kit. El kit puede contener también
otros reactivos y materiales envasados adecuadamente necesarios o
deseables para el protocolo de hibridación particular, por ejemplo,
estándares así como instrucciones para llevar a cabo el ensayo.
Otros métodos de amplificación conocidos que
pueden ser utilizados en la presente incluyen, pero no se limitan a,
la técnica denominada "NASBA" o "3SR" descrita en PNAS
USA 87:1874-1878 (1990) y discutida también en
Nature 350 (Nº 6313):91-92 (1991) y la
replicasa Q-beta.
Pueden prepararse oligonucleótidos sintéticos
utilizando un sintetizador de oligonucleótidos automatizado tal como
el descrito por Warner, DNA 3:401 (1984). Si se desea, las
hebras sintéticas pueden ser marcadas con ^{32}P mediante
tratamiento con polinucleótido quinasa en presencia de
^{32}P-ATP, utilizando condiciones estándar para
la reacción. Las secuencias de ADN, incluyendo las aisladas de
bibliotecas genómicas o de ADNc, pueden ser modificadas mediante
métodos conocidos que incluyen la mutagénesis dirigida a un sitio,
según está descrito por Zoller, Nucleic Acids Res. 10:6487
(1982). Brevemente, el ADN que va a ser modificado es empaquetado en
un fago como una secuencia de hebra sencilla y convertido en ADN de
doble hebra con ADN polimerasa utilizando, como cebador, un
oligonucleótido sintético complementario a la porción del ADN a
modificar, y que tiene la modificación deseada incluida en su propia
secuencia. El cultivo de las bacterias transformadas, que contienen
replicaciones de cada hebra del fago, es sembrado en agar para
obtener placas. Teóricamente, el 50% de las nuevas placas contendrá
fago con la secuencia mutada, y el 50% restante tendrá la secuencia
original. Replicados de las placas son hibridados con una sonda
sintética marcada a temperatura y condiciones adecuadas para la
hibridación con la hebra correcta, pero no con la secuencia sin
modificar. Las secuencias que han sido identificadas por la
hibridación son recuperadas y clonadas.
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la
reacción en cadena de la ligasa (LCR) son técnicas para amplificar
cualquier secuencia de ácido nucleico deseada (diana) contenida en
un ácido nucleico o en una mezcla de los mismos. En la PCR, se
utiliza un par de cebadores en exceso para hibridar con los extremos
externos de las hebras complementarias del ácido nucleico diana. Los
cebadores son extendidos cada uno por una polimerasa que utiliza
como molde el ácido nucleico diana. Los productos de extensión se
convierten ellos mismos en secuencias diana después de la
disociación de la hebra diana original. Nuevos cebadores son luego
hibridados y extendidos por una polimerasa y se repite el ciclo para
incrementar geométricamente el número de moléculas de la secuencia
diana. La PCR está descrita en las Patentes de EE.UU. 4.683.195 y
4.683.202.
La LCR es un mecanismo alternativo para la
amplificación de una diana. En la LCR se emplean dos sondas sentido
(primera y segunda) y dos sondas antisentido (tercera y cuarta) en
exceso sobre la diana. La primera sonda hibrida con un primer
segmento de la hebra diana y la segunda sonda hibrida con un segundo
segmento de la hebra diana, estando situados el primer y el segundo
segmento de tal manera que las sondas primarias puedan ser ligadas
dando un producto fusionado. Posteriormente, una tercera sonda
(secundaria) puede hibridar con una porción de la primera sonda y
una cuarta sonda (secundaria) puede hibridar con una porción de la
segunda sonda de manera ligable similar. Si la diana es inicialmente
de doble hebra, las sondas secundarias hibridarán también con el
complemento de la diana en primer lugar. Una vez que la hebra
fusionada de las sondas sentido y antisentido se ha separado de la
hebra diana, hibridará con la tercera y con la cuarta sonda que
pueden ser ligadas para formar un producto fusionado secundario
complementario. Los productos fusionados son funcionalmente
equivalentes a la diana o a su complemento. Mediante ciclos
repetidos de hibridación y ligadura, se consigue la amplificación de
la secuencia diana. Esta técnica está descrita en
EP-A-320 308. Otros aspectos de la
técnica de LCR están descritos en
EP-A-439 182.
En una realización, la presente invención
comprende generalmente las etapas de poner en contacto una muestra
de ensayo sospechosa de contener una secuencia de nucleótidos del
VHGB-C diana con reactivos para una reacción de
amplificación que comprenden un par de cebadores de amplificación
como los descritos anteriormente, y una sonda de detección según se
describió anteriormente que puede hibridar con una región interna de
las secuencias del amplicón. Las sondas y los cebadores empleados de
acuerdo con el método aquí proporcionado son marcados con marcas de
captura y detección, donde las sondas son marcadas con un tipo de
marca y los cebadores son marcados con el otro tipo de marca.
Adicionalmente, los cebadores y las sondas son seleccionados de tal
manera que la secuencia de la sonda tenga una temperatura de fusión
más baja que la de las secuencias de los cebadores. Los reactivos de
amplificación, los reactivos de detección y la muestra de ensayo son
colocados bajo condiciones de amplificación mediante las cuales, en
presencia de la secuencia diana, se producen copias de la secuencia
diana (un amplicón). En el caso habitual, el amplicón es de doble
hebra ya que se proporcionan cebadores para amplificar una secuencia
diana y su hebra complementaria. El amplicón de doble hebra es
posteriormente desnaturalizado térmicamente para producir miembros
del amplicón de hebra sencilla. Después de la formación de los
miembros del amplicón de hebra sencilla, la mezcla es enfriada para
permitir la formación de complejos entre las sondas y los miembros
del amplicón de hebra sencilla.
Sorprendentemente, cuando las secuencias del
amplicón de hebra sencilla y las secuencias de la sonda se
enfriaron, las secuencias de la sonda se unieron preferencialmente a
los miembros del amplicón de hebra sencilla. Por consiguiente, la
temperatura de fusión del amplicón producido por los cebadores debe
ser también una temperatura de fusión más elevada que la de las
sondas. Así, se esperaría la formación de nuevo del amplicón de
doble hebra al enfriar la mezcla. Sin embargo, según se indicó
previamente, éste no es el caso. Se encontró que las sondas se unían
preferencialmente a los miembros del amplicón de hebra sencilla.
Además, esta preferencia de unión sonda/amplicón de hebra sencilla
existe incluso cuando las secuencias de cebadores son añadidas en
exceso sobre las sondas.
Una vez formados los híbridos sonda/miembro del
amplicón de hebra sencilla, son detectados. Los formatos de ensayo
heterogéneos estándar son adecuados para detectar los híbridos
utilizando las marcas de detección y las marcas de captura presentes
en los cebadores y en las sondas. Los híbridos pueden ser unidos a
un reactivo de fase sólida en virtud de la marca de captura y
detectados en virtud de la marca de detección. En los casos en los
que la marca de detección es detectable directamente, la presencia
de los híbridos en la fase sólida puede ser detectada haciendo que
la marca produzca una señal detectable, si es necesario, y
detectando la señal. En los casos en los que la marca no es
detectable directamente, los híbridos capturados pueden ser puestos
en contacto con un conjugado que contiene generalmente un miembro de
unión unido a una marca detectable directamente. El conjugado
resulta unido a los complejos y la presencia de los conjugados sobre
los complejos puede ser detectada con la marca detectable
directamente. Así, puede determinarse la presencia de los híbridos
sobre el reactivo de fase sólida. Las personas expertas en la
técnica reconocerán qué etapas de lavado pueden ser empleadas para
eliminar mediante lavado el amplicón o la sonda no hibridados así
como el conjugado no unido.
Una muestra de ensayo es típicamente cualquier
cosa sospechosa de contener una secuencia diana. Las muestras de
ensayo pueden ser preparadas utilizando metodologías bien conocidas
en la técnica, tal como mediante la obtención de un espécimen de un
individuo y, si es necesario, la ruptura de las células contenidas
en el mismo para liberar los ácidos nucleicos diana. Aunque la
secuencia diana se describe como de hebra sencilla, se contempla
también la inclusión del caso en el que la secuencia diana sea
realmente de doble hebra pero sea separada meramente de su
complemento antes de la hibridación con las secuencias de los
cebadores para la amplificación. En el caso en el que se emplee PCR
en el método preferido, se conocen normalmente los extremos de las
secuencias diana. En los casos en los que se emplee LCR o una
modificación de la misma en el método preferido, se conoce
normalmente la secuencia diana completa. Típicamente, la secuencia
diana es una secuencia de ácido nucleico tal como por ejemplo ARN o
ADN.
El método proporcionado en la presente puede ser
utilizado en reacciones de amplificación bien conocidas que emplean
mezclas de reacción con ciclos térmicos, particularmente en PCR y
GLCR. Las reacciones de amplificación utilizan típicamente cebadores
para generar repetidamente copias de una secuencia de ácido nucleico
diana, secuencia diana que es normalmente una región pequeña de una
secuencia de ácido nucleico mucho mayor. Los cebadores son ellos
mismos secuencias de ácido nucleico que son complementarias a
regiones de una secuencia diana. Bajo condiciones de amplificación,
estos cebadores hibridan o se unen a las regiones complementarias de
la secuencia diana. Se generan típicamente copias de la secuencia
diana mediante el proceso de extensión y/o ligadura de los cebadores
que utiliza enzimas con actividad polimerasa o ligasa, separadamente
o en combinación, para añadir nucleótidos a los cebadores hibridados
y/o para ligar pares de sondas adyacentes. Los nucleótidos que son
añadidos a los cebadores o a las sondas, como monómeros u oligómeros
preformados, son también complementarios a la secuencia diana. Una
vez que los cebadores o las sondas han sido suficientemente
extendidos y/o ligados, son separados de la secuencia diana
mediante, por ejemplo, calentamiento de la mezcla de reacción hasta
una "temperatura de fusión" que es una temperatura a la cual se
disocian las hebras complementarias del ácido nucleico. De este
modo, se forma una secuencia complementaria a la secuencia
diana.
Puede tener lugar entonces un nuevo ciclo de
amplificación para amplificar adicionalmente el número de secuencias
diana, separando las secuencias de doble hebra, permitiendo a los
cebadores o las sondas hibridar con sus dianas respectivas,
extendiendo y/o ligando los cebadores o las sondas hibridados y
separando de nuevo. Las secuencias complementarias que se generan en
los ciclos de amplificación pueden servir como moldes para la
extensión de los cebadores o para rellenar el hueco de dos sondas
para amplificar posteriormente el número de secuencias diana.
Típicamente, una mezcla de reacción es sometida al ciclo entre 20 y
100 veces, más típicamente una mezcla de reacción es sometida al
ciclo entre 25 y 50 veces. El número de ciclos puede ser determinado
por el experimentador de rutina. De esta manera, se producen
múltiples copias de la secuencia diana y de su secuencia
complementaria. Por tanto, los cebadores inician la amplificación de
la secuencia diana cuando está presente bajo condiciones de
amplificación.
Generalmente, se emplean en la PCR dos cebadores
que son complementarios a una porción de una hebra diana y su
complemento. Para la LCR, se emplean generalmente cuatro sondas, dos
de las cuales son complementarias a una secuencia diana y dos de las
cuales son complementarias de manera similar al complemento de las
dianas. Además de los conjuntos de cebadores y de los enzimas
previamente mencionados, una mezcla de una reacción de amplificación
de un ácido nucleico puede contener también otros reactivos que son
bien conocidos y que incluyen, pero no se limitan a: cofactores
enzimáticos tales como manganeso; magnesio; sales; dinucleótido de
nicotinamida adenina (NAD) y desoxinucleótidos trifosfato (dNTPs)
tales como por ejemplo desoxiadenina trifosfato, desoxiguanina
trifosfato, desoxicitosina trifosfato y desoxitimina trifosfato.
Mientras que los cebadores para la amplificación
inician la amplificación de la secuencia diana, la sonda de
detección (o hibridación) no está implicada en la amplificación. Las
sondas de detección son generalmente secuencias de ácido nucleico o
análogos de ácido nucleico no cargados tales como, por ejemplo,
ácidos péptido nucleicos que están descritos en la Solicitud de
Patente Internacional WO 92/20702; análogos de morfolino que están
descritos en las Patentes de EE.UU. Numeradas 5.185.444, 5.034.506 y
5.142.047, y similares. Dependiendo del tipo de marca llevada por la
sonda, la sonda se emplea para capturar o detectar el amplicón
generado por la reacción de amplificación. La sonda no está
implicada en la amplificación de la secuencia diana y por tanto
puede tener que ser convertida en "no extensible", en cuanto a
que no puedan añadirse a la sonda dNTPs adicionales. Los propios
análogos son normalmente no extensibles y las sondas de ácido
nucleico pueden ser convertidas en no extensibles modificando el
extremo 3' de la sonda de tal manera que el grupo hidroxilo no sea
ya capaz de participar en la elongación. Por ejemplo, el extremo 3'
de la sonda puede ser funcionalizado con la marca de captura o de
detección con el fin de utilizar así, o de bloquear de otro modo, el
grupo hidroxilo. Alternativamente, el grupo hidroxilo 3' puede ser
sencillamente cortado, sustituido o modificado. WO 94/24311 describe
modificaciones que pueden ser utilizadas para convertir una sonda en
no extensible.
Por consiguiente, la proporción de cebadores
respecto a sondas no es importante. Así, las sondas o los cebadores
pueden ser añadidos a la mezcla de reacción en exceso, por lo que la
concentración de uno sería mayor que la concentración del otro.
Alternativamente, los cebadores y las sondas pueden ser utilizados
en concentraciones equivalentes. Preferiblemente, sin embargo, los
cebadores son añadidos a la mezcla de reacción en exceso respecto a
las sondas. Así, se prefieren proporciones de cebadores respecto a
sondas de, por ejemplo, 5:1 y 20:1.
Aunque la longitud de los cebadores y las sondas
puede variar, las secuencias de las sondas son seleccionadas de tal
manera que tengan una temperatura de fusión más baja que las
secuencias de cebadores. Por tanto, las secuencias de los cebadores
son generalmente más largas que las secuencias de las sondas.
Típicamente, las secuencias de los cebadores están en el rango de
entre 20 y 50 nucleótidos de longitud, más típicamente en el rango
de entre 20 y 30 nucleótidos de longitud. La sonda típica está en el
rango de entre 10 y 25 nucleótidos de largo.
Varios métodos para sintetizar cebadores y sondas
son bien conocidos en la técnica. De manera similar, son también
bien conocidos en la técnica métodos para unir marcas a cebadores o
sondas. Por ejemplo, es cuestión de rutina el sintetizar cebadores o
sondas de ácidos nucleicos deseados utilizando la química
convencional de las nucleótido fosforamiditas e instrumentos
disponibles en Applied Biosystems, Inc., (Foster City, CA), Dupont
(Wilmington, DE) o Milligen (Bedford, MA). Se han descrito muchos
métodos para marcar oligonucleótidos tales como los cebadores o las
sondas de la presente invención. Enzo Biochemical (New York, NY) y
Clontech (Palo Alto, CA) han descrito y comercializado ambos
técnicas para el marcaje de sondas. Por ejemplo, una amina primaria
puede ser unida al extremo 3' de un oligo utilizando
3'-Amine-ON CPG™ (Clontech, Palo
Alto, CA). De manera similar, una amina primaria puede ser unida a
un extremo 5' de un oligo utilizando Aminomodifier II® (Clontech).
Las aminas pueden hacerse reaccionar con varios haptenos utilizando
la química de activación y unión convencional. Además,
EP-A-0 562 014 y
EP-A-0 563 287 describen métodos
para el marcaje de sondas en sus extremos 5' y 3', respectivamente.
Las publicaciones WO 92/10505, publicada el 25 de Junio de 1992 y WO
92/11388 publicada el 9 de Julio de 1992, describen métodos para el
marcaje de sondas en sus extremos 5' y 3', respectivamente. De
acuerdo con un método conocido para marcar un oligonucleótido, se
prepara un reactivo marca-fosforamidita y se utiliza
para añadir la marca al oligonucleótido durante su síntesis. Ver,
por ejemplo, N.T. Thuong y col., Tet. Letters
29(46):5905-5908 (1988); o J.S. Cohen y col.,
Solicitud de Patente de EE.UU. publicada 07/246.688 (NTIS Nº DE
ORDEN
PAT-APPL-7-246.688)
(1989) que corresponde a EP-A-0 436
582. Preferiblemente, las sondas son marcadas en sus extremos
3' y 5'.
3' y 5'.
Las marcas de captura son llevadas por los
cebadores o sondas y pueden ser un miembro de unión específica que
forme un par de unión con el miembro de unión específica del
reactivo de fase sólida. Se comprenderá, por supuesto, que el propio
cebador o la propia sonda pueden servir como marca de captura. Por
ejemplo, en el caso en el que un miembro de unión del reactivo de
fase sólida sea una secuencia de ácido nucleico, ésta puede ser
seleccionada de tal manera que se una a una porción complementaria
del cebador o de la sonda para inmovilizar de este modo el cebador o
la sonda en la fase sólida. En los casos en los que la propia sonda
sirve como miembro de unión, las personas expertas en la técnica
reconocerán que la sonda contendrá una secuencia o "cola" que
no es complementaria a los miembros del amplicón de hebra sencilla.
En el caso en el que el propio cebador sirve como marca de captura,
al menos una porción del cebador estará libre para hibridar con un
ácido nucleico sobre una fase sólida, ya que la sonda es
seleccionada de tal manera que no sea totalmente complementaria a la
secuencia del cebador.
Generalmente, los complejos sonda/miembro del
amplicón de hebra sencilla pueden ser detectados utilizando técnicas
comúnmente empleadas para realizar inmunoensayos heterogéneos.
Preferiblemente, en esta realización, la detección se lleva a cabo
de acuerdo con los protocolos utilizados por la instrumentación LCx®
de Abbott comercialmente disponible (Abbott Laboratories; Abbott
Park, IL).
La Figura 1(a)-Figura
1(f) proporciona un diagrama de un formato de ensayo de la
invención. Según se muestra en la Figura 1(a), una muestra de
ensayo conteniendo la secuencia diana 10, reactivos de amplificación
que contienen cebadores 20 y sondas de detección 30 son añadidas al
vaso 40 para formar una mezcla de reacción. Después de la adición de
los reactivos, la mezcla de reacción es sometida a condiciones de
amplificación de tal manera que se produce una copia de la hebra
diana 60 según se muestra en la Figura 1(b). La mezcla de la
Figura 1(b) puede ser calentada posteriormente con el fin de
disociar térmicamente el amplicón de doble hebra según se muestra en
la Figura 1(c) que ilustra los miembros del amplicón de hebra
sencilla 70. La mezcla de la Figura 1(c) es luego enfriada y
las sondas 30 se unen a los miembros del amplicón de hebra sencilla
70 para formar los complejos sonda/miembro del amplicón de hebra
sencilla 80 mostrados en la Figura 1(d). La Figura
1(e) ilustra un método para detectar los complejos 80. Según
se muestra en la Figura 1(e), los complejos 80 son
inmovilizados en un reactivo de fase sólida 90 y el conjugado 100 es
inmovilizado en los complejos. La presencia de los complejos sobre
el reactivo de fase sólida puede ser detectada posteriormente como
indicación de la presencia de la secuencia diana en la muestra de
ensayo. La Figura 2 muestra un diagrama del complejo de reacción en
el que el círculo sin rellenar grande representa una fase sólida,
Y___Y representa la secuencia de una sonda a la que está unido un
hapteno (Y) en ambos extremos, anti-Y representa un
anticuerpo anti-hapteno Y, X representa un hapteno
diferente, anti-X representa un anticuerpo contra el
hapteno X y (*) representa un compuesto generador de una señal
detectable. Debe observarse que la sonda y el cebador pueden estar
unidos cada uno a un hapteno diferente, tal como adamantano y
carbazol, y la unión puede ocurrir en el extremo 5', en el extremo
3', en ambos extremos 5' y 3'; o, más de un hapteno puede estar
unido en o cerca del extremo 5' o 3'. En los ejemplos siguientes,
las SECUENCIAS ID N^{os} 1, 2, 6, 7, 16, 18, 19, 21, 22, 25, 26 y
27 tenían adamantano unido en posición 1 de cada extremo 5' a no ser
que se indique de otro modo; las SECUENCIAS ID N^{os} 3, 4, 5, 8,
9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 30 y 31 tenían carbazol unido al
nucleótido en posición final en cada extremo 3' a no ser que se
indique de otro modo; y las SECUENCIAS ID N^{os} 17, 20, 23, 24,
28 y 29 tenían cada una carbazol unido en la posición 1 del extremo
5' y en el nucleótido en posición final del extremo 3', a no ser que
se indique de otro modo.
Los cebadores y las sondas descritos en la
presente son útiles en ensayos típicos de PCR, en los que la muestra
de ensayo es puesta en contacto con un par de cebadores, se realiza
la amplificación, se añade la sonda de hibridación y se lleva a cabo
la detección.
La presente invención será descrita a
continuación por medio de ejemplos, los cuales están destinados a
ilustrar, pero no a limitar, la invención.
Se diseñaron sondas de detección de cebadores
específicos de una diana con el fin de detectar la secuencia diana
anterior mediante PCR con hibridación de oligonucleótidos. Estos
cebadores eran la SECUENCIA ID Nº 1 y la SECUENCIA ID Nº 2.
Las secuencias diana fueron amplificadas
utilizando el conjunto de cebadores de NTR (SECUENCIA ID Nº 1 y
SECUENCIA ID Nº 2) y haptenadas con adamantano en su extremo 5'
utilizando la química estándar de acoplamiento de cianoetil
fosforamiditas.
El producto amplificado fue detectado
posteriormente utilizando diferentes sondas de hibridación según se
muestra en la TABLA 1. La especificidad fue determinada utilizando
ADN placentario humano (ADNph; Sigma, St. Louis, MO). La reactividad
fue determinada utilizando ADN plasmídico que contenía la secuencia
NTR.
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\begin{minipage}[t]{160mm} * El plásmido NTR (Clon
pHGBV-C clon #1) fue depositado en la American Type
Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852
el 8 de Noviembre de 1994, bajo los términos del Tratado de
Budapest, y será mantenido durante un periodo de treinta (30) años a
partir de la fecha de depósito, o durante cinco (5) años después de
la última solicitud del depósito, o durante el periodo de validez de
la patente de EE.UU., cualquiera que sea su duración. Los depósitos
y cualquier otro material depositado descrito en la presente se
proporcionan solamente por comodidad, y no se requieren para
practicar la presente invención a la vista de las descripciones
proporcionadas en la presente. Al pHGBV-C clon #1 se
le otorgó el Nº de Depósito de la A.T.C.C.
69711.\end{minipage} \cr}
Se realizó la extensión de la PCR para las
reacciones 1-12 (ver la Tabla 1) según se describe
a continuación utilizando el tampón de PCR 10x (Perkin Elmer, Foster
City, CA) que constaba de Tris-HCl 100 mM, pH 8,3,
KCl 500 mM. La concentración final de MgCl_{2} fue 2 mM y la
concentración final de los nucleótidos fue 200 \muM. Las
condiciones de reacción para la Tabla 1 están mostradas en la Tabla
2.
| Reacciones | Concentración de los cebadores | Concentración de las sondas | Concentración del enzima |
| 1 - 12 | 0,25 \muM | 0,01 \muM | 10 U Taq |
| \begin{minipage}[t]{165mm}* Las reacciones fueron amplificadas según sigue: 95^{o}C durante 2 minutos durante 1 ciclo; 94^{o}C durante 1 minuto/55^{o}C durante 1 minuto/72^{o}C durante 30 ciclos; 95^{o}Cdurante 5 minutos, impregnación a 15^{o}C.\end{minipage} |
Después de la amplificación los productos de la
reacción fueron detectados en el sistema LCx® de Abbott (disponible
en Abbott Laboratories, Abbott Park, IL). Los datos de estos
experimentos están presentados en la TABLA 3. Los datos de TABLA 3
demostraban la amplificación y la detección específicas de la
secuencia diana del VHGB.
"IVDU 300" era una muestra que se sabía que
contenía el agente GB. Fue analizada según se describe en la
presente a continuación. El control negativo fue suero normal.
Las secuencias diana (TABLA 4) fueron
amplificadas por PCR utilizando los cebadores (SEC ID N^{os} 1 y
2) y las sondas de detección (SEC ID N^{os} 3 y 4) según se
describió en el Ejemplo 1. Para este estudio, los cebadores estaban
a una concentración de 0,25 mM (3,0 x 10^{13} moléculas) y las
sondas de detección estaban a una concentración de 0,01 mM (1,2 x
10^{12} moléculas). Además, había 0,025 unidades/ml (5 unidades en
total) de ADN polimerasa rTth y 20 ng en total de ARNr.
La reacción de la transcriptasa inversa fue
realizada a 60ºC durante 30 minutos. El producto fue amplificado por
PCR bajo las condiciones de los ciclos siguientes: 94ºC durante 1
minuto/55ºC durante 1 minuto/72ºC durante 1 minuto durante 40
ciclos. Acontinuación, la etapa de hibridación del oligómero fue a
95ºC durante 5 minutos, impregnación a 15ºC.
Después de la amplificación, los productos de la
reacción fueron detectados en el sistema LCx® de Abbott (disponible
en Abbott Laboratories, Abbott Park, IL). Los datos de estos
experimentos están presentados en la TABLA 4. Los datos de la TABLA
4 demostraban la amplificación y la detección específicas de la
secuencia diana del VHGB.
Se analizó el par de cebadores compuesto por la
SECUENCIA ID Nº 1 y la SECUENCIA ID Nº 2 según se describió en el
Ejemplo 2 de la presente anteriormente con el conjunto de sondas
constituido por la SECUENCIA ID Nº 3, la SECUENCIA ID Nº 6 y la
SECUENCIA ID Nº 7, con el fin de determinar la sensibilidad y la
especificidad. Observar que para la sonda de SECUENCIA ID Nº 3, la
sonda está unida a carbazol en el extremo 5' en posición 1 y en el
extremo 3' en posición 15.
El conjunto de cebadores compuesto por la
SECUENCIAID Nº 1 y la SECUENCIA ID Nº 2 fue analizado según se
describió en el Ejemplo 3 de la presente anteriormente con el
conjunto de sondas formado por la SECUENCIA ID Nº 3 (con carbazol
unido en la posición 1 del extremo 5' y en la posición 15 del
extremo 3') y la SECUENCIA ID Nº 6, con el fin de determinar la
sensibilidad y la especificidad. Los resultados se muestran a
continuación en la TABLA 6.
Las sondas de la presente invención aquí
descritas son por tanto útiles para detectar VHGB en individuos.
Otras utilizaciones o variaciones de la presente invención serán
obvias para aquellas personas con experiencia habitual en la técnica
cuando estudien esta descripción. Por tanto, la presente invención
tiene la intención de estar limitada solamente por las
reivindicaciones adjuntas.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Ronald L. Marshall
\hskip3.9cmCynthia Jou
\hskip3.9cmJohn N. Simons
\hskip3.9cmThomas P. Leary
\hskip3.9cmA. Scott Muerhoff
\hskip3.9cmSuresh M. Desai
\hskip3.9cmIsa K. Mushahwar
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: DETECCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS DEL VIRUS DE LA HEPATITIS GB
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 7
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Abbott Laboratories
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 100 Abbott Park Road
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Abbott Park
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Illinois
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EE.UU.
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- ZIP: 60064-3500
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disco magnético flexible
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA: PatentIn Release 1.0, Versión 1.30
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE REGISTRO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN SOBRE EL REPRESENTANTE/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Priscilla E. Porembski
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 33.207
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 5792.US.01
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: 708/937-0378
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: 708/938-2623
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TÉLEX:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCACTGGGTGC AAGCCCCAGA A
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCACTGGTCCT TGTCAACTCG C
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 15 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGGGTTGGTA GGTCG
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCACGGTCCAC AGGTGTT
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGCAACGACGC CCATGTA
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 15 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTAGGTGGGTC TTAAG
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 15 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACGTCGCCCT TCAAT
\hfill15
Claims (12)
1. Una sonda específica para 5' NTR del virus de
la hepatitis GB C (VHGB-C) seleccionada del grupo
que consta de la SECUENCIA ID Nº 3, la SECUENCIA ID Nº 4 y la
SECUENCIA ID Nº 5.
2. Una composición que contiene un par de
cebadores específicos para 5' NTR del VHGB-C que
consta de la SECUENCIA ID Nº 1 y de la SECUENCIA ID Nº 2.
3. Un ensayo para detectar la presencia de
nucleótidos diana del VHGB-C en una muestra de
ensayo, que comprende:
a. la puesta en contacto de una muestra de ensayo
sospechosa de contener una secuencia de nucleótidos del
VHGB-C diana con el par de cebadores del
VHGB-C formado por laSECUENCIA ID Nº 1 y la
SECUENCIA ID Nº 2 para formar una mezcla;
b. la puesta en contacto de dicha mezcla de
reacción con al menos una sonda del VHGB-C
seleccionada del grupo que consta de la SECUENCIA ID Nº 3, la
SECUENCIA ID Nº 4 yla SECUENCIA ID Nº 5;
c. la detección de la presencia del nucleótido
diana del VHGB-C en la muestra de ensayo.
4. El ensayo de la Reivindicación 3, en el que
dicha sonda del VHGB-C está conjugada a un compuesto
generador de una señal detectable.
5. El ensayo de la Reivindicación 4, en el que
dicho compuesto generador de una señal es seleccionado del grupo que
consta de un compuesto quimioluminiscente, fluoresceína y un
enzima.
6. El ensayo de la Reivindicación 3, en el que
dicha sonda del VHGB-C está conjugada a un
hapteno.
7. El ensayo de la Reivindicación 6, en el que
dicho hapteno es seleccionado del grupo que consta de adamantano,
carbazol, fluoresceína y biotina.
8. Un kit de ensayo para detectar un nucleótido
del VHGB-C diana en una muestra de ensayo, que
contiene:
a. un recipiente conteniendo un par de cebadores
específicos para un nucleótido diana del VHGB-C, en
el que dicho par de cebadores consta de la SECUENCIA ID Nº 1 y de la
SECUENCIA ID Nº 2;
b. un recipiente conteniendo al menos una sonda
específica para el VHGB-C, donde dicha sonda del
VHGB-C es seleccionada del grupo que consta de la
SECUENCIA ID Nº 3, la SECUENCIA ID Nº 4 y la SECUENCIA ID Nº 5.
9. El kit de ensayo de la Reivindicación 8, en el
que dicha sonda del VHGB-C está conjugada a un
compuesto generador de una señal detectable.
10. El kit de ensayo de la Reivindicación 9, en
elque dicho compuesto generador de una señal es seleccionado del
grupo que consta de un compuesto quimioluminiscente, fluoresceína y
un enzima.
11. El kit de ensayo de la Reivindicación 8, en
el que dicha sonda del VHGB-C está conjugada a un
hapteno.
12. El kit de ensayo de la Reivindicación 11, en
el que dicho hapteno es seleccionado del grupo que consta de
adamantano, carbazol, fluoresceína y biotina.
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