KR100247215B1 - 신규한 non-a, non-b, non-c, non-d, non-e 간염 바이러스의 핵 산증폭 및 검출 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 간염 G 바이러스(HGV)의 검출용 역전사효소-폴리머라아제 사슬 반응(RT-PCT)을 수행하기 위한 프라이머에 관한 것이다.

Description

신규한 Non-A, Non-B, Non-C, Non-D, Non-E 간염 바이러스의 핵산증폭 및 검출
본 발명의 과제는 Non-A/Non-B/Non-C/Non-D/Non-E(N-ABCDE) 간염-관련 바이러스 핵산의 증폭시약 및 상기 시약을 이용한 그의 검출방법이다.
공지된 또한 그의 특성이 밝혀진 간염 A 바이러스(HAV) 및 간염 B 바이러스(HBV)와 더불어, 간염과 관련되었으나 독립적인 바이러스군을 형성하는, 수개의 다른 바이러스의 특성이 최근에 밝혀졌다. 상기 군은 일반적으로 군의 이름을 연속적인 대문자와 관련시키는 방식으로 특징지워진다. 각각의 신규 발견된 간염-관련 바이러스는 우선적으로 공지된 바이러스군에 속하지 않는다는 점에서 기존의 바이러스와 구별된다. 이것이 또한 간염 C 바이러스(HCV)가 Non-A/Non-B 간염 바이러스로 칭해져 왔던 이유이다. 본 발명은 명백하게 HAV, HBV, HCV, HDV 및 HEV 바이러스와 관련될 수 없는 바이러스에 관한 것이다.
또한, WO 94/18217은 상기-기재된 5군중 어느 하나와도 관련이 없는 바이러스를 기재한다. 그러나, 본 발명에서 언급한 염기서열은 WO 94/18217에 기재된 서열과 아무런 유사성을 갖지 않는다.
또한, WO 95/21922는 상기 기재된 5군중 어느 하나와도 관련이 없는 간염시약을 개시한다.
하기 명세서에서, 본 발명에서 정의된 간염-관련 바이러스의 군을 HGV라 칭한다. 현재까지 HGV에 관하여 얻을 수 있는 정보는 상기 바이러스가 플라비비리디아에 (flaviviridiae) 군에 속한다는 것이다.
본 발명의 과제는 HGV-특이적 염기서열의 증폭시약으로, HGV는, 그의 게놈이 5'-말단에 있어서 서열번호 1과 80% 이상에 이르기까지, 바람직하게는 90% 이상에 이르는 동질성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 함유하고; 각각 신장가능 말단을 갖는 2개의 프라이머를 함유하는 RNA로 구성되는 바이러스로 정의되는데, 이중 한 프라이머는 서열번호 1의 뉴클레오티드의 연속적인 염기와 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상에 이르기까지 상보적인 15 내지 30개의 염기의 서열을 함유하며, 다른 프라이머는 서열번호 1의 연속적인 염기와 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상 유사한 15 내지 30개의 염기의 서열을 함유한다. 프라이머의 신장가능 말단은, 프라이머가 신장될 때, 각 프라이머가 각각의 다른 프라이머의 신장생성물과 혼성화될 수 있도록 선택되고, 각각의 신장생성물이 각각의 다른 프라이머의 신장용 주형으로 제공될 수 있다.
본 발명에서 이해되어지는 증폭방법은 많은 수의 염기서열 카피의 제조방법이다. 이는 US-A-4,683,202에 기재된 폴리머라아제 연쇄반응과 같은 공지된 방법으로 달성될 수 있다.
프라이머는 그의 백본(backbone)에 다수의 뉴클레오염기를 갖는 분자로 이해되어진다. 백본은 중합체 골조이다. DNA 및 RNA와 같은 핵산의 슈가 포스페이트 백본이 특히 잘 알려져 있다. 상보적인 이형고리와 수소결합을 형성할 수 있는 이형고리 화합물이 상기 백본에 공유결합한다. 자연생성된 염기인 아데닌, 구아닌, 시토신, 티민, 및 우라실이 일반적으로 알려져 있다. 그러나, 자연적으로 생성되는 다른 염기도 있다. 상기 염기들의 순서는 증폭될 뉴클레오티드의 연속적인 염기와 90% 이상 상보적이 되도록 선택된다. 상기 각각의 분자들은 하나 이상의 신장가능 말단을 갖는다. 신장은 특히 모노뉴클레오시드 트리포스페이트 또는 올리고뉴클레오티드를 이용하는 효소적으로 촉매된 염기 단위의 첨가로 이해되어진다. 신장이 모노뉴클레오시드 트리포스페이트 단위로 달성되어질 때, 바람직한 효소는 DNA 폴리머라아제이다. 증폭되어질 염기서열을 포함하는 핵산은 염기의 특이적 편입을 위한 주형으로 작용한다. 주형서열은 프라이머에 부착되어 있는 염기의 서열을 결정한다.
그들의 화학적 합성이 용이하게 완수되어질 때, 프라이머로서 15 내지 30 염기의 분자를 사용하는 것이 편리하다.
DNA 폴리머라아제가 사용되는 경우, 신장가능 말단으로는 3'-말단이 사용되는 것이 바람직하다. 염기서열 증폭제가 HGV의 게놈 RNA로부터 직접 취해질 수 있을 때, 역전사효소(RNA-의존성 DNA 폴리머라아제)를 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 역전사효소도 DNA-의존성 DNA 폴리머라아제 활성을 갖고 있기 때문에, 상기 수득된 CDNA로부터 다수의 DNA가 일차로 형성된다. DNA의 형성후, 다른 DNA-의존성 DNA 폴리머라아제, 예를 들어 이. 콜리(E. coli) 또는 더무스 아쿠아티스(Thermus aquaticus)의 DNA 폴리머라제를 사용하는 것도 가능하다.
역전사효소를 이용한 PCR 원리(RT-PCR)에 따른 염기서열 증폭방법이, 예를 들어, US-A-5,310,652 또는 WO 91/09944에 공지되어 있다. 반응조건의 정의에 대해서는, 본 명세서의 일부분으로 간주될 수 있는 상기 특허출원을 참조하라.
염기서열의 다른 가닥에 상보적인 2개의 프라이머가 바람직하게는 신장가능이 아닌 2개의 프라이머의 두 반대편 말단에 의해 그 길이가 결정되는 핵산을 형성하기 위해 사용된다. 기본적으로, 증폭자로 칭해질 수도 있는 상기 핵산의 길이는 서열번호 1의 전체지역, 즉 길이로 348 이하의 염기를 포함할 수 있다. 증폭자의 길이는 100 염기 이상인 것이 바람직하다. 특히 바람직한 종류로는, 증폭자의 길이가 150 내지 200 뉴클레오티드 (nt)의 범위이다. 프라이머의 서열에 추가하여, 증폭자 또한 모노뉴클레오시드 트리포스페이트 또는 폴리뉴클레오티드의 편입의 결과로 새로이 형성된 지역을 포함한다. 본 발명에 따른 프라이머는 다른 간염-관련 바이러스군의 구성원, 특히 간염 A, B, C, D, 또는 E 바이러스와 혼성화되지 않는 것이 바람직하다. 더욱이, 그들은 인간의 혈액에서 발견되는 다른 핵산과 혼성화되지 않는 것이 바람직하다.
바람직한 프라이머는 서열번호 1의 부분서열과 완전히 상보적인 또는 동질성인 것들이다. 그러나, 경험적으로, 약간의 경우에서, 서열번호 1의 서열과 관련하여 미스매취(mismatch)를 갖고 있는 몇몇 뉴클레오티드를 선택하는 것이 가능하다. 그러나, 상기 미스매취가 프라이머의 3'-말단에 위치하는 것은 바람직하지 않다.
HGV 특이적 뉴클레오티드 서열은 HGV에서는 발견될 수 있으나 다른 바이러스 및 진핵세포에서는 발견될 수 없는 서열로 이해되어진다.
HGV-아종-특이적 뉴클레오티드 서열은 모든 HGV 아종에서 발견될 수 없는 HGV-특이적 서열로 이해되어진다. HGV 아종은 HGV의 모든 표현형적 성질은 가지나 그의 뉴클레오티드 서열이 다른 HGV와는 다른 바이러스를 의미한다. 상기 편차는 총 10% 이상이며, 서열번호 1의 뉴클레오티드 64-348에 위치하는 것이 바람직하다. 본 발명자들은 상기 HGV 아종들이 특히 뉴클레오티드 지역 74-92, 186-223, 255-283, 및 303-306, 보다 특별히 서열번호 1과 서로 다르다는 것을 발견하였다. 아종-특이적 검출에서, 하나 이상의 프라이머 또는 심지어 탐침자는 상기 서열이 상기 지역중 하나와 완전히 또는 부분적으로 커버할 수 있도록 선택되어진다.
서열번호 1이 HGV의 첫 번째 아종이라 가정하면, 아종 2a 및 2b는 도 1내 정렬을 기초로 하여 정의될 수 있다. 도 1 은 상기 서열이 서열번호 1의 서열과 다른 뉴클레오티드만을 나타낸다.
아종-특이적 검출방법에서, HGV-아종 특이적인 하나의 프라이머 및 HGV 아종-비특이적인 다른 하나의 프라이머를 선택할 수 있다.
도 1 은 서열번호 1의 뉴클레오티드 64-348에 해당하는 다른 과제의 HGV 뉴클레오티드를 나타낸다. 상기 주어진 정의에 따라, 첫 번째 HGV(Sa 1134 및 Sa 1172)는 첫 번째 아종(2a)에 속하는 반면에 나머지 HGV는 그 자신의 아종의 일부분인 것을 알 수 있다. 서열번호 1과 비교할 때, 255번 위치에 결실이 존재한다는 것을 주목하라. 도 1 은 또한 보존 및 변이지역을 보여준다.
HGV-아종 비특이적 서열은 모든 공지된 HGV 아종들과 혼성화될 수 있는 HGV-특이적 서열이다. 이들은 특히 서열번호 1의 보존지역, 바람직하게는 92 내지 186, 223 내지 255 및 315 내지 348을 포함한다.
HGV 검출은 시료내에 HGV의 존재를 확인하는 방법으로 이해되어진다. 바람직한 시료는 혈액시료이다. HGV 아종의 확인 방법은 아종 또는 본질적으로 HGV의 확인방법일 수 있다.
HGV-특이적 염기서열에 추가하여, 본 발명의 프라이머는 또한 HGV-비특이적이거나 시료내에서 통상적으로 발견되는 핵산과 혼성화될 수 없는 염기서열을 포함할 수도 있다. 이들은 프라이머의 비-신장가능 말단에서 발견되는 것이 바람직하다.
상기 부가적인 염기서열은 증폭자를 포착하기 위해 사용될 수 있다.
또한, 예를 들어, 검출기 또는 고정기를 부착시킴으로써 프라이머를 더 개질할 수도 있다. 상기 기로는, 예를 들어, 방사성, 염색된 또는 형광성 기와 같은 직접 또는 간접 검출기가 있다. 간접 검출기로는 햅텐 또는 효소와같은 면역학적 또는 효소학적 활성 화합물이 있다. 이들은 이후의 반응 또는 반응순서에서 검출된다. EP-B-O 324 474에 기재된 바와 같은 햅텐(디그옥시제닌:digoxigenin)이 특히 바람직하다. 바이오틴 또한 아비딘 또는 스트렙트아비딘으로 코팅된 표면상에 잘 고정되기 때문에 고정기로서 잘 검증되어 있다. 이는 증폭자를 고형상상에 포획하고 시료 구성원을 제거하거나 또는 증촉반응을 방해할 수 있는 물질의 검출을 가능하게 한다.
특히 바람직한 프라이머로는 서열번호 2 또는 3 또는 5 내지 20의 서열 또는 거기에 상보적인 서열에 포함되어 있는 6개의 연속적인 염기의 서열을 포함하는 것들이다. 특히 바람직한 것은 서열번호 2 또는 3 또는 5-20에 기재된 바와 같은 프라이머이다.
서열식별상에 나타날 수 있는 뉴클레오티드 Y 및 R은 기재된 프라이머가 문자 Y 및 R의 의미에 해당하는 혼합물을 표시함을 의미한다.
본 발명의 또 다른 주제는 청구항 1 내지 4 중 하나에 따른 시약 및 증폭반응에서 생성된 신장생성물내에 위치한, 즉 프라이머의 신장된 발단 사이에 위치한 염기서열을 포함하는 탐침자로 이루어진 HGV의 특이적 검출용 시약 키트이다. 탐침자는 프라이머와 마찬가지로 백본에 다수의 뉴클레오염기를 갖는 분자로 이해되어진다. 그러나, 상기 탐침자가 반드시 신장가능 말단을 가질 필요는 없다. 탐침자는 인식기를 포함한다는 것으로 특징지워진다. 이러한 인식기는 검출기 또는 고정된 또는 고정기일 수 있다. 상기 기들의 정의는 프라이머는 언급하는 부분에서 이미 나타내었다. 특히 바람직한 방식으로, 탐침자는 고정잔기, 즉 이후의 또는 동시적인 반응에서 고형상에 결합될 수 있는 잔기를 갖는다.
고정기가 바이오틴 잔기일 경우, 고형상은 마이크로리터 플레이트 또는 튜브의 스트렙트아비딘 또는 아비딘-코팅된 표면일 수 있다.
바람직한 방법으로, 상기 시약 키트는 분리된 용기내에 프라이머 및 탐침자를 포함한다. 더욱이, 상기 키트는 필요하거나 증폭 및 검출을 지원하는 다른 구성성분, 즉 검출될 수 있도록 바람직하게는 표지되어 있는 역전사효소, 모노뉴클레오시드 트리포스페이트; 그 때에는 탐침자 및 증폭자로 구성된 혼성물을 포착할 수 있는 고형상과 완충 물질을 포함할 수 있다.
그러므로, 본 발명의 또 다른 주제는, HGV RNA의 일부로부터 cDNA를 형성하고 청구범위 1 내지 4 중 하나에 따른 시약에 의한 cDNA의 증폭; 프라이머의 연장성 말단 사이에 위치하고 있는 염기서열을 포함하는 탐침자와 전기 증폭 생성물의 접촉; 및, 시료 내의 HGV의 존재를 증명할 수 있도록 탐침자 및 증폭 생성물의 혼성물 형성의 결정을 특징으로 하는 시료 내의 HGV의 검출방법이다.
본 발명은 HGV 아종중 하나에 대해 양성이고 HCV가 나타나지 않는 환자의 시료를 분석할 때에도 여전히 믿을 수 있는 HGV 검출에 대한 특이적 방법을 편리하게 제공한다. 더욱이, 본 발명의 방법으로 고도로 민감하에 HGV를 검출할 수 있다. 서던 블럿에서의 특이성 또한 높다.
게다가, 확실한 진단을 원한다면, HGV 게놈의 또다른 위치에서의 RNA 검출; 특히, 비구조성 HGV 단백질들을 암호화하는 영역에서의 RT-PCR과 본 발명의 방법에 따른 검출을 결합하는 것도 가능하다. 비구조성 영역의 서열은 EP-B-O 318 216에 명시되어 있는 방법에 따라 결정될 수 있다. 이를 실행하기 위해, 서열번호 1의 서열로 시작하는 게놈의 3'-방향으로 프라이머가 연장된다; 이후 연장 생성물의 서열이 결정된다. 이후, 전기 서열은, 게놈의 3'-방향으로 또다른 연장 반응에 사용되어지는 프라이머 등을 수득하는 데에 사용된다. 이후 두 증폭 반응 중 하나 이상의 성공적인 완수가 HGV의 존재를 확인시켜 준다.
다음 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다:
HGV-특이적 검출
[시약]
- QlAamp, HCV 키트(QlAgen 카탈로그 번호 29504)
- M-MuLV-역전사효소(베링거 만하임, 1062603)
- PCR 뉴클레오티드 혼합물(베링거 만하임, 1581295)
-헥사머 랜덤 혼합물(베링거 만하임, 1277081)
- RNase 저해제(베링거 만하임, 799017)
- 살균 2차 증류수
- 프라이머 1(서열번호 2)
- 프라이머 2(서열번호 3)
- 아미노 링커(어플라이드 바이오시스템사)를 통해 수득된 바이오틴화된 탐침자 핵산(서열번호 4)
- PCR ELISA (DIG 표지 키트, 베링거 만하임, 1636120)(또는 단일 시약 PCR-DIG 표지 혼합물(베링거 만하임, 1585550) 및 Taq-DNA 폴리머라아제(베링거 만하임, 1146165))
- Enzymun-시험 DNA 검출(베링거 만하임, 1447777)
[일반적 권장사항]
전체적인 공정은 3개의 다른 작업 지역, 즉 RNA 분리 장소, 역전사 준비, 증폭반응 및 수행을 위한 장소, 증폭생성물의 검출 장소에서 수행되어야만 한다. 각각의 작업 장소는 분리된 피펫 세트를 구비하여야만 한다. 오염을 방지하기 위하여, 밀본된 에어로졸-형 피펫 팁 또는 PCR 피펫을 사용한다. 매일 신선한 시약을 준비하고 규칙적인 기초에서 모든 피펫을 탈오염시킨다. 또한, 매작업 장소에서 새로운 장갑을 사용한다.
[시료 준비]
제조사의 지시에 따라 인간의 혈청으로부터 총 RNA를 제조하기 위하여 QIAamp HCV 키트를 사용하였다. 또한, 콤친스키(Chomczynski)에 따른 산 페놀 추출법 또는 구아니디움 이소티오시아네의 사용과 같은 다른 RNA 제조법을 사용할 수도 있다.
[cDNA 합성(역전사)]
역전사 및 증폭 혼합물의 준비는 분리된 장소에서 다른 세트의 피펫을 사용하여 수행된다. 본 반응에 사용된 시약을 하기 표에 기재한다.
Figure kpo00001
10㎕의 RT 혼합물을 PCR 반응 용기에 피펫한다. 이어서, 10㎕의 RNA 용액을 첨가한다. 상기 혼합물을 볼텍스 혼합기에서 간단히 처리하고, 원심분리한 후, 상온에서 10분간, 42℃에서 30분간, 및 95℃에서 5분간 항온배양한다. 이후, 상기 반응혼합물을 이후의 처리를 수행할 때까지 4℃에 보관한다.
[표지반응]
증폭 혼합물의 제조는 분리된 작업장소에서 분리된 세트의 피펫을 사용하여 수행된다. 증폭혼합물을 얼음상에서 피펫할 필요는 없다. 사용된 시약을 하기 표에 기재한다.
Figure kpo00002
40㎕의 증폭혼합물을 반응용기내에서 제조한다. cDNA 합성으로부터 10㎕의 용액을 첨가한다. 이후, 상기 혼합물을 볼텍스 혼합기에서 간단히 혼합하고, 원심분리한다. 이후, 반응용기를 퍼킨-엘머(Perkin-Elmer) 더모싸이클러(thermocycler)(PE9600)에 위치시키고, 40회(94℃에서 15초, 55℃에서 30초, 및 72℃에서 30초)를 수행한다. 이후, 상기 반응혼합물을 검출반응이 수행될 때까지 4℃에서 보관한다. 상기 혼합물이 오랜 기간동안 보관되어야 할 경우, -20℃에서 보관되어야 한다.
[증폭생성물의 검출]
디그옥시제닌-표지된 증폭생성물의 검출은 Enzymun-시험 DNA 검출법(베링거 만하임 ES 장치상에서)을 이용하여, 또는 PCR ELISA 시험법(베링거 만하임 마이크로리터 플레이트상에서)수행된다. 증폭생성물의 피펫팅 및 그의 검출은 제3의 작업장소에서 수행된다. 반응용기를 개봉하기전에, 용액을 간단히 원심분리한다. 상기-기재된 키트중 하나의 풀림 용액을 사용하여 상기 용액을 1:10으로 희석한다. 포획 탐침자의 농도는 혼성화 용액내에서 75ng/ml인 것이 바람직하다.
증폭생성물을 검출하기 위한 자세한 프로토콜은 ES 반응계(ES 300, ES 600, ES 700)용으로는 상기 키트내에, 또한 마이크로리터 플레이트 포맷용으로는 PCR ELISA 내에 주어져 있다.
[다른 선택가능한 프라이머]
서열번호 5, 6, 7, 8, 및 9의 프라이머 또한, 특히 5/6, 5/7, 및 2/9로 조합할 때, 본 발명에 따라 효과적임이 밝혀졌다.
프라이머 조합 2/8을 사용하여, 3개의 다른 유전자형을 검출할 수 있었으며, 따라서 이것이 HGV-아종-특이적 검출법이다.
[실시예 2]
HGV 아종분류
프라이머를 제외하고, 실시예 1에 기재된 모든 조건들을 적용한다.
프라이머로서 특정 쌍(서열번호/서열번호)이 사용되며, 결과는 표 1에 주어진 것들이다. 100을 초과하는 값(흡광도)를 양성 시험 결과로 생각하였다. 이는 특정 프라이머 쌍을 선택함으로써 각각의 아종을 선별적으로 검출할 수 있다는 것을 보여준다.
Figure kpo00003
회색ㅇ로 칠해진 값들은 기대치와는 다른 것들이나, 개정된 스트린전시 조건하에서 실험이 반복될 경우 일치하였다(2/12 음성; 2/20 양성).
표 4는 프라이머 서열 및 그들의 HGV 특이성의 목록이다.
Figure kpo00004
[서열표]
(1) 일반정보
(i) 출원인:
(A) 명칭: 베링거 만하임 게엠베하
(B) 거리: 잔트호퍼스트라쎄 116
(C) 도시명: 만하임
(E) 국가명: DE
(F) 우편번호(ZIP): 68305
(G) 전화번호: 0621 759 4348
(H) 팩스번호: 0621 759 4457
(ii) 발명의 명칭: 신규한 A/Non-B/Non-C/Non-D/Non-E 간염 바이러스의 핵산증폭 및 검출
(iii) 서열의 수: 20
(iv) 컴퓨터 판독가능 형태:
(A) 미디엄 유형: 플로피 디스크
(B) 컴퓨터: IBM PC 호환기종
(C) 작동 시스템: PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어: PatentIn 배포 #1.0, 버전 #1.30 (EPO)
(2) 서열번호 1에 대한 정보
(i) 서열의 특징:
(A) 서열의 길이: 348 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 사슬의 수:단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 서열의 종류: RNA (게놈)
(iii) 하이포테티칼: 무
(iv) 안티-센스: YES
(viii) 게놈내에서의 위치:
(A) 염색체/세그먼트: 비번역 지역
(xi) 서열기재: 서열번호 1:
[서열 1]
Figure kpo00005
(2) 서열번호 2에 대한 정보
(i) 서열의 특징:
(A) 서열의 길이: 20 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 사슬의 수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 서열의 종류: 다른 핵산
(A) 기재: /desc="올리고뉴클레오티드"
(iii) 하이포테티칼: 무
(xi) 서열기재: 서열번호 2:
[서열 2]
Figure kpo00006
(2) 서열번호 3에 대한 정보
(i) 서열의 특징:
(A) 서열의 길이: 19 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 사슬의 수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 서열의 종류: 다른 핵산
(A) 기재: /desc="올리고뉴클레오티드"
(iii) 하이포테티칼: 무
(xi) 서열기재: 서열번호 3:
[서열 3]
Figure kpo00007
(2) 서열번호 4에 대한 정보
(i) 서열의 특징:
(A) 서열의 길이: 19 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 사슬의 수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 서열의 종류: 다른 핵산
(A) 기재: /desc="올리고뉴클레오티드"
(iii) 하이포테티칼: 무
(ix) 서열의 특징:
(A) 특징을 나타낸기호: misc_feature
(B) 존재위치: 1..19
(D) 그외의 정보:/note="5'-말단의 G는 바이오틴으로 아미노링크로 공유결합되어 있다"
(xi) 서열기재: 서열번호 4:
[서열 4]
Figure kpo00008
(2) 서열번호 5에 대한 정보
(i) 서열의 특징:
(A) 서열의 길이: 19 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 사슬의 수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 서열의 종류: 다른 핵산
(A) 기재: /desc="올리고뉴클레오티드"
(iii) 하이포테티칼: 무
(xi) 서열기재: 서열번호 5:
[서열 5]
Figure kpo00009
(2) 서열번호 6에 대한 정보:
(i) 서열의 특징:
(A) 서열의 길이: 20 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 사슬의 수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 서열의 종류: 다른 핵산
(A) 기재: /desc="올리고뉴클레오티드"
(iii) 하이포테티칼: 무
(xi) 서열기재: 서열번호 6:
[서열 6]
Figure kpo00010
(2) 서열번호 7에 대한 정보:
(i) 서열의 특징:
(A) 서열의 길이: 20 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 사슬의 수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 서열의 종류: 다른 핵산
(A) 기재: /desc="올리고뉴클레오티드"
(iii) 하이포테티칼: 무
(xi) 서열기재: 서열번호 7:
[서열 7]
Figure kpo00011
(2) 서열번호 8에 대한 정보:
(i) 서열의 특징:
(A) 서열의 길이: 19 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 사슬의 수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 서열의 종류: 다른 핵산
(A) 기재: /desc="올리고뉴클레오티드"
(iii) 하이포테티칼: 무
(xi) 서열기재: 서열번호 8:
[서열 8]
Figure kpo00012
(2) 서열번호 9에 대한 정보:
(i) 서열의 특징:
(A) 서열의 길이: 20 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 사슬의 수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 서열의 종류: 다른 핵산
(A) 기재: /desc="올리고뉴클레오티드"
(iii) 하이포테티칼: 무
(xi) 서열기재: 서열번호 9:
[서열 9]
Figure kpo00013
(2) 서열번호 10에 대한 정보:
(i) 서열의 특징:
(A) 서열의 길이: 18 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 사슬의 수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 서열의 종류: 다른 핵산
(A) 기재: /desc="올리고뉴클레오티드"
(iii) 하이포테티칼: 무
(xi) 서열기재: 서열번호 10:
[서열 10]
Figure kpo00014
(2) 서열번호 11에 대한 정보:
(i) 서열의 특징:
(A) 서열의 길이: 18 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 사슬의 수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 서열의 종류: 다른 핵산
(A) 기재: /desc="올리고뉴클레오티드"
(iii) 하이포테티칼: 무
(xi) 서열기재: 서열번호 11:
[서열 11]
Figure kpo00015
(2) 서열번호 12에 대한 정보:
(i) 서열의 특징:
(A) 서열의 길이: 20 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 사슬의 수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 서열의 종류: 다른 핵산
(A) 기재: /desc="올리고뉴클레오티드"
(iii) 하이포테티칼: 무
(xi) 서열기재: 서열번호 12:
[서열 12]
Figure kpo00016
(2) 서열번호 13에 대한 정보:
(i) 서열의 특징:
(A) 서열의 길이: 19 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 사슬의 수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 서열의 종류: 다른 핵산
(A) 기재: /desc="올리고뉴클레오티드"
(iii) 하이포테티칼: 무
(xi) 서열기재: 서열번호 13:
[서열 13]
Figure kpo00017
(2) 서열번호 14에 대한 정보:
(i) 서열의 특징:
(A) 서열의 길이: 18 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 사슬의 수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 서열의 종류: 다른 핵산
(A) 기재: /desc="올리고뉴클레오티드"
(iii) 하이포테티칼: 무
(xi) 서열기재: 서열번호 14:
[서열 14]
Figure kpo00018
(2) 서열번호 15에 대한 정보:
(i) 서열의 특징:
(A) 서열의 길이: 19 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 사슬의 수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 서열의 종류: 다른 핵산
(A) 기재: /desc="올리고뉴클레오티드"
(iii) 하이포테티칼: 무
(xi) 서열기재: 서열번호 15:
[서열 15]
Figure kpo00019
(2) 서열번호 16에 대한 정보:
(i) 서열의 특징:
(A) 서열의 길이: 19 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 사슬의 수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 서열의 종류: 다른 핵산
(A) 기재: /desc="올리고뉴클레오티드"
(iii) 하이포테티칼: 무
(xi) 서열기재: 서열번호 16:
[서열 16]
Figure kpo00020
(2) 서열번호 17에 대한 정보:
(i) 서열의 특징:
(A) 서열의 길이: 19 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 사슬의 수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 서열의 종류: 다른 핵산
(A) 기재: /desc="올리고뉴클레오티드"
(iii) 하이포테티칼: 무
(xi) 서열기재: 서열번호 17:
[서열 17]
Figure kpo00021
(2) 서열번호 18에 대한 정보:
(i) 서열의 특징:
(A) 서열의 길이: 18 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 사슬의 수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 서열의 종류: 다른 핵산
(A) 기재: /desc="올리고뉴클레오티드"
(iii) 하이포테티칼: 무
(xi) 서열기재: 서열번호 18:
[서열 18]
Figure kpo00022
(2) 서열번호 19에 대한 정보:
(i) 서열의 특징:
(A) 서열의 길이: 19 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 사슬의 수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 서열의 종류: 다른 핵산
(A) 기재: /desc="올리고뉴클레오티드"
(iii) 하이포테티칼: 무
(xi) 서열기재: 서열번호 19:
[서열 19]
Figure kpo00023
(2) 서열번호 20에 대한 정보:
(i) 서열의 특징:
(A) 서열의 길이: 19 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 사슬의 수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 서열의 종류: 다른 핵산
(A) 기재: /desc="올리고뉴클레오티드"
(iii) 하이포테티칼: 무
(xi) 서열기재: 서열번호 20:
[서열 20]
Figure kpo00024

Claims (14)

  1. HGV는, 그의 게놈이 5'-말단에 있어서 서열번호 1과 80% 이상의 동질성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 함유하고, 각각 신장가능 말단을 갖는 2개의 HGV-특이적 프라이머를 함유하는 RNA로 구성되는 바이러스로 정의되는데, 이중, 한 프라이머는 서열번호 1의 뉴클레오티드의 연속적인 염기와 80% 이상 상보적인 15 내지 30개의 염기의 서열을 함유하며, 및 다른 프라이머는 서열번호 1의 연속적인 염기와 80% 이상 유사한 15 내지 30개의 염기의 서열을 함유하고, 그중, 프라이머의 신장가능 말단은, 프라이머가 신장될 때, 각 프라이머가 각각의 다른 프라이머의 신장생성물과 혼성화될 수 있도록 선택되고, 각각의 신장생성물이 각각의 다른 프라이머의 신장용 주형으로 제공되는 것을 특징으로 하는, HGV-특이적 뉴클레오티드 서열의 증폭시약.
  2. 제1항에 있어서, 프라이머중 하나 이상이 서열번호 1의 서열에 포함되어 있는 6개의 연속적인 염기의 서열 또는 그와 상보적인 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 시약.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 프라이머중 하나 이상이 서열번호 2 또는 3 또는 5-20의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 시약.
  4. 제1항에 있어서, 프라이머중 하나 이상이 검출가능하게 표지되는 것을 특징으로 하는 시약.
  5. 제1항에 있어서, 프라이머중 하나 이상이 HGV-아종-비특이적인 것을 특징으로 하는 시약.
  6. 제1항에 있어서, 프라이머중 하나 이상이 HGV-아종-특이적인 것을 특징으로 하는 시약.
  7. 제5항에 있어서, 하나의 프라이머는 HGV-아종-비특이적이고 다른 프라이머는 HGV-아종-특이적인 것을 특징으로 하는 시약.
  8. 제1항 내지 제7항중 어느 한 항에 따른 시약 및 프라이머의 신장가능 말단사이에서 형성된 신장생성물내에 위치한 염기서열을 포함하는 탐침자로 이루어진 HGV의 특이적 검출용 시약 키트.
  9. 제8항에 있어서, 상기 염기서열이, 서열번호 2-20의 서열에 포함되어 있는 6개 이상의 연속적인 염기 또는 그와 상보적인 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 시약.
  10. 제1항 내지 제7항중 어느 한 항에 따른 시약 및 HGV 뉴클레오티드 서열의 증폭을 위한 부가적인 프라이머를 함유하는 다른 시약으로 이루어진 HGV의 특이적 검출용 시약 키트.
  11. 제10항에 있어서, 프라이머의 각 쌍에 대하여 신장생성물의 검출을 위한 하나의 탐침자를 포함하는 시약 키트.
  12. HGV-RNA의 일부로부터 cDNA를 형성하고, 제1항 내지 제7항중 어느 한 항에 따른 시약의 프라이머의 신장하에서 cDNA를 증폭시키고, 증폭생성물을 형성하면서, 상기 증폭생성물을 프라이머의 신장가능 말단 사이에 위치하고 있는 염기 서열을 포함하는 탐침자와 접촉시키고, 탐침자 및 증폭 생성물의 혼성화물 형성을 관찰함으로써, 시료내 HGV의 존재를 증명하는 것을 특징으로 하는 HGV 시료의 검출방법.
  13. - HGV-RNA의 2개 이상의 부분으로부터 cDNA를 형성하고, 제1항 내지 제4항중 어느 한 항에 따른 시약 및 부가적인 HGV-특이적 프라이머 쌍을 이용하여 cDNA를 증폭시키고,
    - 증폭 생성물을 증폭된 부분 하나당 하나의 탐침자와 접촉시키고,
    - 탐침자 및 증폭 생성물 사이에서 혼성화물의 형성을 관찰하고, 및
    - 탐침자 및 증폭 생성물 사이에서 혼성화물의 형성을 평가하는 것을 특징으로 하는, 하나의 증폭생성물의 혼성화물 형성이 시료내 HGV의 존재를 확인하는 시료내 HGV의 검출방법.
  14. 제6항에 있어서, 하나의 프라이머는 HGV-아종-비특이적이고 다른 프라이머는 HGV-아종-특이적인 것을 특징으로 하는 시약.
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