EP0809711A1 - Amplifikation von nukleinsäuren und nachweis eines neuen hepatitis-nona/nonb/nonc/nond/none-virus - Google Patents

Amplifikation von nukleinsäuren und nachweis eines neuen hepatitis-nona/nonb/nonc/nond/none-virus

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Publication number
EP0809711A1
EP0809711A1 EP96939857A EP96939857A EP0809711A1 EP 0809711 A1 EP0809711 A1 EP 0809711A1 EP 96939857 A EP96939857 A EP 96939857A EP 96939857 A EP96939857 A EP 96939857A EP 0809711 A1 EP0809711 A1 EP 0809711A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
hgv
primers
sequence
seq
amplification
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP96939857A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Volker SCHLÜTER
Alfred Engel
Georg Hess
Beatus OFENLOCH-HÄHNLE
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Roche Diagnostics GmbH
Original Assignee
Roche Diagnostics GmbH
Boehringer Mannheim GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Roche Diagnostics GmbH, Boehringer Mannheim GmbH filed Critical Roche Diagnostics GmbH
Publication of EP0809711A1 publication Critical patent/EP0809711A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/706—Specific hybridization probes for hepatitis
    • C12Q1/707—Specific hybridization probes for hepatitis non-A, non-B Hepatitis, excluding hepatitis D
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage

Definitions

  • the invention relates to a reagent for the amplification of nucleic acids of a virus associated with NonA / NonB / NonC / NonD / NonE (N-ABCDE) hepatitis and methods for detection using this reagent.
  • hepatitis A virus HAV
  • hepatitis B virus HB V
  • HAV hepatitis A virus
  • HB V hepatitis B virus
  • HAV hepatitis C virus
  • WO 94/18217 also describes a virus which cannot be assigned to the five groups mentioned.
  • the nucleotide sequences used in the present invention are not similar to the sequences described in WO 94/18217.
  • WO 95/21922 also describes a hepatitis reagent which does not have to be assigned to any of the five groups mentioned above.
  • the group of hepatitis-associated viruses defined in the present invention is referred to as HGV.
  • the information available so far from HGV suggests that HGV belongs to the Flaviviridiae family.
  • the invention relates to a reagent for the amplification of HGV-specific nucleoside sequences, HGV being defined as a virus, the genome of which consists of RNA which contains a nucleoside sequence at the 5 'end which contains at least 80%, preferably at least 90 % is homologous to the nucleotides of SEQ ID NO 1, containing two HGV-specific primers, each with an extendable end, one of which contains a sequence of 15 to 30 bases, which is more than 80%, preferably at least 90% complementary to successive bases of the nucleotides of SEQ.ID NO 1, and of which the other contains a sequence of 15 to 30 bases which is more than 80%, preferably at least 90% homologous to successive bases of the nucleotides of SEQ. ID. NO. 1, the extendable ends of the primers being chosen so that in the case of the extension of each primer, each primer can hybridize with the extension product of the other primer and the respective extension products can serve as a template for the extension of the other primer.
  • amplification is understood to mean a method for producing a large number of copies of a base sequence.
  • Known methods are available for this, for example: B the polymerase chain reaction as described in US-A-4,683,202
  • a primer is understood to mean a molecule which has a number of nucleobases on a backbone.
  • a backbone is a basic polymer structure.
  • the sugar-phosphate backbone is particularly well known, as occurs, for example, in nucleic acids such as DNA and RNA.
  • Heterocyclic compounds which are capable of forming hydrogen bonds with complementary heterocycles are covalently bound to it.
  • the best known are the naturally occurring bases adenine, guanine, cytosine, thymine and uracil. However, there are other bases in nature. The sequence of these bases is chosen so that they become successive bases of the nucleo- tide sequence are more than 90% complementary.
  • This molecule has at least one extendable end.
  • Extension is understood to mean in particular enzyme-catalyzed coupling of base units with the aid of mononucleoside triphosphates or oligonucleotides.
  • a DNA polymerase is preferably used as the enzyme.
  • the nucleic acid which contains nucleotide sequences which are to be amplified serves as a template or template for the specific incorporation of bases.
  • the sequence of the template determines the sequence of the bases attached to the primer
  • Molecules with between 15 and 30 bases are expediently used as primers, since these can be synthesized in a relatively simple manner by chemical synthesis
  • the 3 'end is preferably used as the extendable end.
  • reverse transcriptase RNA-dependent DNA- Polymerase
  • reverse transcriptase also has DNA-dependent DNA polymerase activity, a large number of other DNAs are formed from the cDNA initially formed.
  • another DNA-dependent DNA polymerase can also be used, eg. B from E coli or Thermus aquaticus
  • RT-PCR reverse transcriptase
  • a nucleic acid is formed, the length of which is determined by the ends of the two primers, which are preferably non-extendable from each other, and in principle the length of these nucleic acids, which are also referred to as ampiificates who- that contain the entire area of SEQJD.NO 1, ie be up to 348 bases long.
  • the length of the amplificates is preferably> 100 bases.
  • the amphficate length is particularly preferably between 150 and 200 nucleotides (nt).
  • the amplificate contains an area which was newly formed by incorporating mononucleoside tri-phosphates or polynucleotides
  • the primers according to the invention preferably do not hybridize with members from other hepatitis-associated virus groups, in particular not with hepatitis A, B, C, D or E viruses. Furthermore, they preferably do not hybridize with other nucleic acids occurring in human blood
  • Primers that are completely complementary or homologous to a partial sequence of SEQ ID NO 1 are particularly preferred. However, it has been found that in some cases it is possible to select a few nucleotides so that they have a mismatch with respect to the sequence of SEQ ID NO 1. This mismatch is then preferably not at the 3 'end of the primer
  • HGV-specific nucleotide sequence is understood to mean a sequence that only occurs in HGV, but not in other viruses and eukaryotes
  • HGV subtype-specific nucleotide sequence is understood to mean an HGV-specific sequence which does not occur in all HGV subtypes.
  • a HGV subtype is understood to be a virus which has all the phenotypic properties of HGV, but whose nucleotide sequence differs from that of other HGVs. This deviation , preferably within nucleotides 64-348 of SEQ ID No. 1 However, at least 10%. It has been found that the subtypes of HGV differ from one another, particularly in the nucleotide regions 74-92, 186-223, 255-283 and 303-306, and particularly preferably from SEQ ID.NO 1.
  • SEQ ID. No 1 represents a first subtype of HGV
  • a subtype 2a and a subtype 2b can be defined on the basis of the alignment shown in FIG. 1. Only the nucleotides in which the sequences of the sequence in SEQ. Distinguish ID No 1
  • a primer HGV subtype can be selected specifically and another HGV subtype-specifically
  • FIG. 1 shows the nucleotides of HGV from different persons which correspond to nucleotides 64-348 of SEQ ID No. 1. It can be seen that, according to the above definition, the first-mentioned HGV (Sa 1134 and Sa 1172) belong to a first subtype (2a) , while the remaining HGV belong to their own subtype (2b). The occurrence of a deletion in pos 255 is remarkable compared to SEQ No 1. The conserved or variable regions can also be clearly seen from FIG. 1
  • HGV subtype-unspecific sequences are understood to mean HGV-specific sequences which can hybridize with all known HGV subtypes. These are contained in particular in the conserved regions of SEQ ID NO 1, preferably between 92 and 186 and 223 and 255 and 315 and 348
  • a detection of HGV is understood to mean a method in which it is determined whether HGV is contained in a sample.
  • This sample is preferably a blood sample.
  • a method for detecting an HGV subtype can be a method for determining the subtype on the one hand, but also act as such from HGV
  • the primers according to the invention can also contain nucleotide sequences which are neither HGV-specific nor can hybridize with nucleic acids which are usually present in the sample. These are preferably at the non-extendable end of the primer of the amplificates are used
  • the primers can also be modified further, for example by attaching a detectable or immobilizable group.
  • groups can be, for example, directly or indirectly detectable groups, for example radioactive, colored or fluorescent groups.
  • Haptens as described in EP-B-0 324 474 (digoxigenin), are particularly preferred.
  • Biotin for example, has proven to be an immobilizable group, since it can be immobilized on surfaces which are coated with avidin or streptavidin This enables the amplificates to be captured on a solid phase and the removal of sample components or detection of disruptive components of the amplification reaction
  • Particularly preferred numbers are those which contain a sequence of 6 successive bases which are contained in the sequences of SEQ.ID NO 2 or 3 or 5 to 20, or a sequence which is complementary thereto. Primers as described in SEQ ID NOS 2 or 3 or 5 to 20 are particularly preferred
  • nucleotides Y and R appear in the SEQ ID, this should be understood to mean that the primers described are a mixture corresponding to the meaning of the letters Y and R.
  • Another object of the invention is a reagent kit for the specific detection of HGV containing a reagent according to one of Claims 1 to 4 and a probe which contains a base sequence which lies within the extension product of the amplification reaction, ie between the extended ends of the primers
  • a probe is understood to be a molecule which, like the primers, has a number of nucleobases on a backbone. However, the probe does not have to have an extendable end.
  • the probe is characterized in that it contains a recognizable group. Such a recognizable group can be a detectable group or an immobilized or immobilizable group.
  • the probe has an immobilizable residue, ie a residue which is in a subsequent or simultaneous reaction to a solid phase, a solid can be bound.
  • the immobilizable group is a biotin residue
  • the solid phase can be, for example, a surface of a microtiter plate or a tube coated with streptavidin or avidin.
  • the reagent kit preferably contains the primers and the probe in separate containers.
  • the reagent kit may contain other components required for amplification and detection or / and useful, e.g. B. a reverse transcriptase, mononucleoside triphosphates, preferably detectably labeled, a solid phase for trapping the hybrids from probe and amplificates and buffer substances.
  • Another object of the invention is therefore a method for the detection of HGV in a sample, characterized by the formation of cDNA from part of the HGV RNA and amplification of the cDNA using a reagent according to one of claims 1 to 4, contacting the amplification products with a Probe containing a base sequence located between the extended ends of the primers and determining the formation of hybrids of the probe with the amplification products as a sign of the presence of HGV in the sample.
  • the present invention has the advantage of providing a specific method for the detection of HGV, which is nevertheless reliable in samples from different HGV-positive people and in which HCV is not also detected. Furthermore, it is possible to detect HGV with high sensitivity using the method according to the invention. The specificity in the Southern blot is high.
  • the detection according to the method according to the invention can be combined with an RNA detection at another location in the HGV genome, in particular with an RT-PCR in the region which codes for non-structural proteins of the HGV .
  • the sequence of the non-structure areas can be determined according to the method described in EP-B-0 318 216. For this, starting from sequence SEQJD.NO. 1 a primer extension in the 3 'direction of the genome carried out, and the sequence of the extension product determined. This sequence is in turn used to prepare a primer which is used in a renewed extension reaction in the 3 'direction of the genome, etc. The statement that at least one of the two amplification reactions was successful is then a sign of the presence of the HGV.
  • RNA isolation Three separate work stations should be used for RNA isolation, preparation of the reverse transcriptions and amplification reactions as well as their implementation and detection of the amplification products.
  • the reagents should be made fresh daily.
  • the pipettes should be regularly contaminated.
  • Fresh gloves should be used at every work station.
  • RNA manufacturing processes such as Chomczynski acid phenol extraction or with guanidinium isothiocyanate, can also be used.
  • a separate work station and a separate set of pipettes are used to produce the reverse transcription and amplification mixtures.
  • the reagents used are shown in the table below.
  • reaction vessels 40 ⁇ l of the amplification mixture are placed in reaction vessels. 10 ⁇ l of the solution from the cDNA synthesis are pipetted in. The mixture is briefly mixed and centrifuged in a vortex mixer. The reaction vessels are then transferred to a Perkin-Elmer thermal cycler (PE9600). 40 thermal cycles were carried out (15 seconds at 94 ° C, 30 seconds at 55 ° C. and 30 seconds at 72 ° C.) The reaction mixture was then stored at 4 ° C. until detection. The mixture should be kept at ⁇ 20 ° C. for longer storage Detection of the amplification products
  • the digoxigenin-labeled amplification products were carried out using the enzyme detection DNA detection (on the ES devices, Boehringer Mannheim) or using the PCR-ELISA test (on microtiter plates, Boehringer Mannheim).
  • the third work station is used for pipetting the amplification products and detection.
  • the solution is briefly centrifuged before opening the reaction vessels.
  • the solutions are diluted 1 • 10 with the denaturing solution from the above-mentioned kits.
  • the concentration of the capture probe was preferably 75 ng / ml in the hybridization solution
  • the primers of SEQ ID NO 5, 6, 7, 8 and 9 have also proven effective in the sense of the invention, in particular in the combinations 5/6, 5/7 and 2/9
  • Certain pairs are used as primers (SEQ ID NO / SEQ ID NO), the results given in Table 1 having been obtained. For values (extinctions) of more than 100, detection was considered positive. It can be seen that the individual Certain pairs are used as primers (SEQ.ID.NO./SEQ.ID.NO.), The results given in Table 1 being obtained. In the case of values (extinctions) of more than 100, proof was assessed as positive. It can be seen that the individual subtypes can be specifically identified by selecting specific primer pairs (e.g. 2/14, 2/15 and 2/16).
  • NAME OF THE INVENTION Reagent and method for the detection of NonA, NonB, NonC, NonD, NonE virus
  • MOLECULE TYPE Genomic RNA

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Abstract

Primer zur Durchführung einer RT-PCR für den Nachweis von Hepatitis G Virus (HGV).

Description

Amplifikation von Nukleinsäuren und Nachweis eines neuen Hepatitis- NonA/NonB/NonC/NonD/NonE- Virus
Gegenstand der Erfindung ist ein Reagenz zur Amplifikation von Nukleinsäuren eines NonA/NonB/NonC/NonD/ NonE (N-ABCDE)-Hepatitis assoziierten Virus sowie Verfah¬ ren zum Nachweis unter Verwendung dieses Reagenzes.
Neben Hepatitis A- Virus (HAV) und Hepatitis B-Virus (HB V), die schon seit geraumer Zeit bekannt und charakterisiert waren, wurden in jüngerer Zeit einige Viren charakterisiert, die zwar mit Hepatitis assoziiert sind, jedoch eigenständige Gruppen von Viren darstellen. Diese Gruppen werden üblicherweise so benannt, daß den Gruppen ein fortlaufender großer Buchstabe zugeordnet wird. Jeder neu gefundene Hepatitis-assoziierte Virus wird gegen¬ über den vorherigen dadurch abgegrenzt, daß er nicht in die Gruppe der bisher bekannten Viren gehört. So wurde Hepatitis C-Virus (HCV) auch als NonA/NonB-Hepatitis- Virus bezeichnet. Die vorliegende Erfindung bezieht sich nun auf einen Virus, der offensichtlich nicht in die Gruppe der HAV-, HBV-, HCV-, HDV- und HEV- Viren eingeordnet werden kann.
In WO 94/18217 ist ebenfalls ein Virus beschrieben, der nicht den genannten fünf Gruppen zuzuordnen ist. Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Nukleotidsequenzen weisen jedoch keine Ähnlichkeit mit den in WO 94/18217 beschriebenen Sequenzen auf.
In WO 95/21922 ist ebenfalls ein Hepatitis-Reagenz beschrieben, das keiner der oben ge¬ nannten fünf Gruppen zugeschrieben werden muß. Im Folgenden wird die in der vorliegenden Erfindung definierte Gruppe von Hepatitis¬ assoziierten Viren als HGV bezeichnet. Die bislang über HGV erhältlichen Informationen legen es nahe, daß HGV zur Familie der Flaviviridiae gehört.
Gegenstand der Erfindung ist ein Reagenz zum Amplifikation von HGV-spezifischen Nukleosidsequenzen, wobei HGV definiert ist als ein Virus, dessen Genom aus RNS be¬ steht, die am 5'-Ende eine Nukleosidsequenz enthalt, die zu mindestens 80 %, bevorzugt zu mindestens 90 % homolog ist zu den Nukleotiden der SEQ ID NO 1, enthaltend zwei HGV-spezifische Primer mit jeweils einem verlangerbaren Ende, von denen einer eine Sequenz von 15 bis 30 Basen enthalt, die zu mehr als 80 %, bevorzugt zu mindestens 90 % komplementär zu aufeinanderfolgenden Basen der Nukleotide der SEQ.ID NO 1 ist, und von denen der andere eine Sequenz von 15 bis 30 Basen enthalt, die zu mehr als 80 %, be¬ vorzugt zu mindestens 90 % homolog zu aufeinanderfolgenden Basen der Nukleotide der SEQ. ID. NO. 1 ist, wobei die verlangerbaren Enden der Primer so gewählt werden, daß im Fall der Verlängerung eines jeden Primers jeder Primer mit dem Verlangerungsprodukt des jeweils anderen Primers hybridisieren kann und die jeweiligen Verlangerungsprodukte als Matrize für die Verlängerung des jeweils anderen Primers dienen können.
Unter Amplifikation wird im Sinne der Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Viel¬ zahl von Kopien einer Basensequenz verstanden Hierfür stehen bekannte Verfahren zur Verfügung, z. B die Polymerase-Kettenreaktion, wie sie in US-A-4,683,202 beschrieben ist
Unter einem Primer wird ein Molekül verstanden, das an einem Backbone eine Anzahl von Nukleobasen aufweist. Ein Backbone ist ein polymeres Grundgerust. Besonders bekannt ist das Zucker-Phosphat-Grundgerüst, wie es beispielsweise in den Nukleinsäuren, wie DNS und RNS vorkommt. Daran sind heterocylische Verbindungen, die zur Wasserstoff- brückenbildung mit komplementären Heterocyclen befähigt sind, kovalent gebunden. Die bekanntesten sind die natürlich vorkommenden Basen Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin und Uracil. Es kommen jedoch auch andere Basen in der Natur vor. Die Sequenz dieser Basen wird so gewählt, daß sie zu aufeinanderfolgenden Basen der zu amplifizierenden Nukleo- tidsequenz zu mehr als 90 % komplementär sind. Dieses Molekül besitzt jeweils mindestens em verlangerbares Ende. Unter Verlängerung wird insbesondere enzymkatalysierte An¬ koppelung von Baseneinheiten mit Hilfe von Mononukleosid-Triphosphaten oder Oligo- nukleotiden verstanden Im Falle der Verlängerung um Mononukleosid-Triphosphat-Ein- heiten wird als Enzym bevorzugt eine DNS-Polymerase eingesetzt. Die Nukleinsäure, die Nukleotidsequenzen enthalt, welche amplifiziert werden sollen, dient hierbei als Matrize oder Templat für den spezifischen Einbau von Basen Die Sequenz der Matrize bestimmt die Sequenz der an den Primer angehängten Basen
Als Primer werden zweckmaßigerweise Moleküle mit zwischen 15 und 30 Basen ver¬ wendet, da diese durch chemische Synthese auf relativ einfache Weise synthetisiert werden können
Als verlangerbares Ende dient im Falle einer DNS-Polymerase bevorzugt das 3'-Ende Für den Fall, daß das Reagenz zur Amplifikation von Nukleotidsequenzen direkt aus der ge¬ nomischen RNS des HGV verwendet werden soll, wird bevorzugterweise reverse Transkriptase (RNS-abhangige DNS-Polymerase) eingesetzt Da reverse Transkriptase auch DNS-abhangige DNS-Polymerase- Aktivität aufweist, wird aus der zunächst gebildeten cDNS eine Vielzahl von weiteren DNS gebildet Nach der Bildung von DNS kann jedoch auch eine andere DNS-abhangige DNS-Polymerase verwendet werden, z. B aus E coli oder Thermus aquaticus
Verfahren zum Amplifizieren von Nukleotidsequenzen nach dem Prinzip der PCR unter Verwendung von reverser Transkriptase (RT-PCR) sind beispielsweise in US-A-5, 310,652 oder WO 91/09944 beschrieben Zum Zwecke der Definition der Reaktionsbedingungen soll der Inhalt dieser Patentanmeldungen an dieser Stelle inkorporiert sein
Mit Hilfe der beiden Primer, die zu unterschiedlichen Strängen der Nukleotidsequenz komplementär sind, wird eine Nukleinsäure gebildet, deren Lange sich aus den voneinander entfernt liegenden, bevorzugt nicht verlangerbaren, Enden der beiden Primer bestimmt Prinzipiell kann die Lange dieser Nukleinsäuren, die auch als Ampiifikate bezeichnet wer- den, den gesamten Bereich des SEQJD.NO 1 enthalten, d h bis zu 348 Basen lang sein Bevorzugt ist die Länge der Amplifikate > 100 Basen. Besonders bevorzugt liegt die Amphfikatlänge jedoch zwischen 150 und 200 Nukleotiden (nt) Neben den Sequenzen der Primer enthalt das Amplifikat einen Bereich, der durch Einbau von Mononukleosid-Tri- phosphaten oder Polynukleotiden neugebildet wurden
Die erfindungsgemaßen Primer hybridisieren bevorzugt nicht mit Mitgliedern aus anderen Hepatitis-assoziierten Virusgruppen, insbesondere nicht mit HepatitisA-, B-, C-, D- oder E- Viren Darüber hinaus hybridisieren sie bevorzugt nicht mit anderen, im menschlichen Blut vorkommenden Nukleinsäuren
Besonders bevorzugt sind Primer, die vollständig komplementär oder homolog zu einer Teilsequenz der SEQ ID NO 1 ist. Es hat sich jedoch herausgestellt, daß es in manchen Fallen möglich ist, wenige Nukleotide so zu wählen, daß sie ein Mismatch gegenüber der Sequenz der SEQ ID NO 1 haben Dieser Mismatch liegt dann bevorzugt jedoch nicht am 3 '-Ende des Primers
Unter einer HGV-spezifischen Nukleotidsequenz wird eine Sequenz verstanden, die nur in HGV vorkommt, nicht jedoch in anderen Viren und Eukaryonten
Unter einer HGV- subtyp spezifischen Nukleotidsequenz wird eine HGV-spezifische Sequenz verstanden, die nicht in allen HGV-Subtypen vorkommt Als HGV-Subtyp wird ein Virus verstanden, der alle phanotypischen Eigenschaften von HGV hat, dessen Nukleotidsequenz jedoch von der anderer HGV abweicht Diese Abweichung betragt, bevorzugt innerhalb der Nukleotide 64-348 von SEQ ID No. 1 Jedoch mindestens 10 %. Es hat sich herausgestellt, daß sich die Subtypen von HGV insbesondere in den Nukleotidbereichen 74- 92, 186-223, 255-283 und 303-306 voneinander, und besonders bevorzugt von SEQ ID.NO 1, unterscheiden Bei subtypspezifischem Nachweis wird daher bevorzugt mindestens einer der Primer oder aber die Sonde so ausgewählt, daß die Sequenz einen dieser Bereich ganz oder teilweise überspannt Wenn man davon ausgeht, daß SEQ ID. No 1 einen ersten Subtyp von HGV darstellt, so kann anhand des in Fig. 1 gezeigten Alignements ein Subtyp 2a und ein Subtyp 2b definiert werden In Fig. 1 sind nur die Nukleotide angegeben, in denen die Sequenzen von der Sequenz in SEQ. ID No 1 unterscheiden
Bei subtyp spezifischen Nachweisen kann beispielsweise ein Primer HGV-Subtypen spezifisch und ein weiterer HGV subtypspezifisch gewählt werden
In Fig 1 sind die den Nukleotiden 64-348 von SEQ ID No 1 entsprechenden Nukleotiden von HGV aus unterschiedlichen Personen aufgeführt Es ist erkennbar, daß nach der oben genannten Definition die erstgenannten HGV (Sa 1134 und Sa 1172) einem ersten Subtyp (2a) angehören, wahrend die restlichen HGV einem eigenen Subtyp (2b) angehören Bemerkenswert ist das Vorkommen einer Deletion in Pos 255 verglichen mit SEQ No 1 Aus Fig 1 sind auch die konservierten bzw variablen Regionen gut zu erkennen
Unter HGV-subtypunspezifischen Sequenzen werden HGV-spezifische Sequenzen verstanden, die mit allen bekannten HGV-Subtypen hybridisieren können Diese sind insbesondere in den konservierten Bereichen von SEQ ID NO 1 enthalten, bevorzugt zwischen 92 und 186 und 223 und 255 sowie 315 und 348
Unter einem Nachweis von HGV wird ein Verfahren verstanden, bei dem ermittelt wird, ob HGV in einer Probe enthalten ist Diese Probe ist bevorzugt eine Blutprobe Bei einem Verfahren zum Nachweis eines HGV-Subtyps kann es sich einerseits um ein Verfahren zur Ermittlung des Subtyps, aber auch von HGV als solches handeln
Die erfindungsgemaßen Primer können neben den HGV-spezifischen Nukleotidsequenzen jedoch auch noch Nukleotidsequenzen enthalten, die weder HGV-spezifisch sind noch mit üblicherweise in der Probe vorkommenden Nukleinsäuren hybπdisieren können Diese sind bevorzugt am nicht verlangerbaren Ende des Primers Solche zusatzlichen Nukleotid¬ sequenzen können beispielsweise zum Abfangen der Amplifikate eingesetzt werden Die Primer können jedoch auch weiter modifiziert sein, z B durch Anbringen einer nach¬ weisbaren oder immobilisierbaren Gruppe Solche Gruppen können z B direkt oder in¬ direkt nachweisbare Gruppen sein, z B radioaktive, farbige oder fluoreszierende Gruppen Indirekt nachweisbare Gruppen sind z. B immunologisch oder enzymatisch wirksame Ver¬ bindungen, wie Haptene oder Enzyme Diese werden in einer nachfolgenden Reaktion oder Reaktionssequenz detektiert. Besonders bevorzugt sind Haptene, wie sie in der EP-B-0 324 474 beschrieben sind (Digoxigenin) Als immobilisierbare Gruppe hat sich beispielsweise Biotin bewahrt, da es in bewahrter Weise an Oberflachen immobilisiert wer¬ den kann, welche mit Avidin oder Streptavidin überzogen sind Hierdurch ist ein Abfangen der Amplifikate an einer festen Phase und die Entfernung von Probenbestandteilen oder einen Nachweis störenden Bestandteilen der Amplifikationsreaktion möglich
Besonders bevorzugte Pnmer sind solche, die eine Sequenz von 6 aufeinanderfolgenden Ba¬ sen, die in den Sequenzen der SEQ.ID NO 2 oder3 oder 5 bis 20 enthalten sind, oder eine hierzu komplementäre Sequenz enthalt. Besonders bevorzugt sind Primer, wie sie in SEQ ID NOS 2 oder 3 oder 5 bis 20 beschrieben sind
Sofern in den SEQ ID die Nukleotide Y und R erscheinen, soll dies so zu verstehen sein, daß es sich bei den beschriebenen Primern um ein Gemisch entsprechend der Bedeutung der Buchstaben Y und R handelt
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist em Reagenzkit zum spezifischen Nachweis von HGV enthaltend ein Reagenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 sowie eine Sonde, die eine Basensequenz enthalt, die innerhalb des gebildeten Verlangerungsproduk.es der Amplifikationsreaktion liegt, d h zwischen den verlängerten Enden der Primer Unter einer Sonde wird ein Molekül verstanden, das wie die Primer eine Anzahl von Nukleobasen an einem Backbone aufweist. Die Sonde muß jedoch kein verlangerbares Ende haben Dafür ist die Sonde dadurch gekennzeichnet, daß sie eine erkennbare Gruppe enthalt Eine solche erkennbare Gruppe kann ein detektierbare Gruppe oder eine immobilisierte oder immobili¬ sierbare Gruppe sein Solche Gruppen wurden bereits unter den Primern definiert Be¬ sonders bevorzugt weist die Sonde einen immobilisierbaren Rest auf, d h einen Rest, der in einer nachfolgenden oder simultanen Reaktion an eine feste Phase, einen Festkörper gebun¬ den werden kann. Im Fall, daß die immobilisierbare Gruppe ein Biotinrest ist, kann die feste Phase zum Beispiel eine mit Streptavidin oder Avidin überzogene Oberfläche einer Mikro- titerplatte oder eines Tubes sein.
Bevorzugt enthält das Reagenzkit die Primer und die Sonde in getrennten Behältern. Darüber hinaus kann das Reagenzkit noch weitere, für die Amplifikation und den Nachweis erforderliche oder/ und nützliche Bestandteile enthalten, z. B. eine Reverse Transkriptase, Mononukleosidtriphosphate, bevorzugt nachweisbar markiert, eine feste Phase zum Ab¬ fangen der Hybride aus Sonde und Amplifikaten und Puffersubstanzen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zum Nachweis von HGV in einer Probe, gekennzeichnet durch Bildung von cDNS aus einem Teil der HGV-RNS und Amplifikation der cDNS unter Verwendung eines Reagenzes gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, Inkontakbringen der Amplifikationsprodukte mit einer Sonde, die eine Basensequenz enthält, die zwischen den verlängerten Enden der Primer liegt, und Feststellung der Bildung von Hybriden der Sonde mit den Amplifikationsprodukten als Zeichen der Anwesenheit von HGV in der Probe.
Die vorliegende Erfindung hat den Vorteil, ein spezifisches Verfahren zum Nachweis von HGV zur Verfügung zu stellen, welches dennoch bei Proben unterschiedlicher HGV-posi- tiver Personen zuverlässig ist und bei dem HCV nicht mit nachgewiesen wird. Darüber hinaus ist es möglich, mit dem erfindungsgemäßen Verfahren HGV mit hoher Sensitivität nachzuweisen. Die Spezifität im Southern Blot ist hoch.
Falls darüber hinaus eine noch sicherere Diagnose erwünscht ist, kann der Nachweis gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren mit einem RNS-Nachweis an einer anderen Stelle des HGV-Genoms kombiniert werden, insbesondere mit einer RT-PCR im Bereich, welcher für Nicht-Strukturproteine des HGV kodiert. Die Sequenz der Nichtstrukturbereiche kann ge¬ mäß dem in EP-B-0 318 216 geschilderten Verfahren ermittelt werden. Hierzu wird, aus¬ gehend von Sequenz SEQJD.NO. 1 eine Primerverlängerung in 3'-Richtung des Genoms durchgeführt, und die Sequenz des Verlängerungsproduktes ermittelt. Diese Sequenz wird wiederum zur Herstellung eines Primers benutzt, der in eine erneute Verlängerungsreaktion in 3'- Richtung des Genoms eingesetzt wird, usw. Die Aussage, wenn mindestens eine der beiden Amplifikationsreaktionen erfolgreich war, ist dann ein Zeichen der Anwesenheit des HGV.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern:
Beispiel 1 :
HGV-spezifischer Nachweis
Reagenzien
- QIAamp, HCV-Kit (QIAgen Kat. -Nr. 29504)
- M-MuLV-reverse Transkriptase (Boehringer Mannheim, 1062603)
- PCR Nukleotid-Mix (Boehringer Mannheim, 1581295)
- Hexamer Zufallsgemisch (Boehringer Mannheim, 1277081)
- RNase-Inhibitor (Boehringer Mannheim, 799017)
- Sterilisiertes bidestilliertes Wasser
- Primer 1 (SEQ.ID.NO. 2)
- Primer 2 (SEQ.ID.NO. 3)
- Biotinylierte Sondennukleinsäure (SEQ.ID.NO. 4), biotinyiiert über Aminolinker (Applied Biosystems Inc.)
- PCR ELISA (DIG-Labeling Kit, Boehringer Mannheim, 1636120)(Oder Einzelreagen¬ zien PCR-DIG-Labeling-Mix (Boehringer Mannheim, 1585550) und Taq-DNS-Poly- merase (Boehringer Mannheim, 1146165))
- Enzymun®-Test DNS-Detektion (Boehringer Mannheim, 1447777)
Allgemeine Empfehlungen
Es sollten drei getrennte Arbeitsplätze für RNS-Isolierung, Herstellung der reverse Transkriptionen und Amplifikationsreaktionen sowie deren Durchführung und Detektion der Amplifikationsprodukte benutzt werden. An jedem Arbeitsplatz sollten getrennte Sets von Pipetten bereitstehen. Es sollten verschlossene aerosoldichte Pipettenspitzen oder spezielle PCR-Pipetten zur Vermeidung von Kontaminationen verwendet werden. Die Reagenzien sollten täglich frisch hergestellt werden. Die Pipetten sollten regelmäßig de¬ kontaminiert werden. Es sollten an jedem Arbeitsplatz frische Handschuhe eingesetzt wer¬ den.
Probenvorbereitung
Für die Herstellung von Gesamt-RNS aus humanen Seren wurde der QIAamp HCV-Kit nach den Herstellerangaben verwendet. Andere RNS-Herstellungsverfahren, wie saure Phenolextraktion nach Chomczynski oder mit Guanidiniumisothiocyanat sind ebenfalls verwendbar.
cDNS-Synthese (reverse Transkription)
Zur Herstellung der reverse Transkriptions- und Amplifikations-Gemische wird ein getrenn¬ ter Arbeitsplatz und ein getrenntes Set von Pipetten verwendet. Die eingesetzten Reagen¬ zien sind der nachfolgenden Tabelle zu entnehmen.
Tabelle 1
10 μl des RT-Mixes werden in PCR-Reaktionsgefäße pipettiert. Anschließend werden 10 μl der RNS-Lösung zugegeben. Es wird kurz im Vortex-Mischer behandelt und zentrifugiert Es wird 10 Minuten bei Raumtemperatur, 30 Minuten bei 42 °C und 5 Minuten bei 95 °C inkubiert. Danach wird die Reaktionsmischung bis zur Weiterverarbeitung bei 4 °C aufbe¬ wahrt
Markierungsreaktion
Zur Herstellung des Amplifikationsgemisches wird ein weiterer Arbeitsplatz und ein ge¬ trenntes Set von Pipetten verwendet. Es ist nicht erforderlich, das Amplifikationsgemisch auf Eis zu pipettieren. Die verwendeten Reagenzien sind in nachfolgender Tabelle angege¬ ben Tabelle 2
40 μl des Amplifikationsgemisches werden in Reaktionsgefaße vorgelegt. 10 μl der Losung aus der cDNS-Synthese werden zupipettiert Es wird kurz in einem Vortex-Mischer ge¬ mischt und zentrifugiert Danach wurden die Reaktionsgefaße in einen Perkin-Elmer- Thermalcycler (PE9600) überfuhrt Es wurden 40 Thermozyklen durchgeführt (15 Sekunden bei 94 °C, 30 Sekunden bei 55 °C und 30 Sekunden bei 72 °C) Anschließend wurde das Reaktionsgemisch bis zur Detektion bei 4 °C aufbewahrt Für längere Aufbe¬ wahrung sollte das Gemisch bei - 20 °C gehalten werden Detektion der Amplifikationsprodukte
Die Digoxigenin-markierten Amplifikationsprodukte wurden mit Hilfe des Enzymun-Tests DNS-Detektion (auf den ES-Geraten, Boehringer Mannheim) oder mit Hilfe des PCR- ELISA-Tests (auf Mikrotiter-Platten, Boehringer Mannheim) durchgeführt. Zur Pipettie- rung der Amplifikationsprodukte und Detektion wird der dritte Arbeitsplatz verwendet Vor Öffnung der Reaktionsgefaße wird die Losung kurz zentrifugiert Die Losungen werden 1 • 10 mit dem Denaturierungslosung aus den oben genannten Kits verdünnt Die Konzentration der Fangsonde betrug bevorzugt 75 ng/ml in der Hybridisierungslosung
Die detaillierten Protokolle für die Detektion von Amplifikationsprodukten sind in den oben genannten Kits (Enzymun-Test DNS-Detektion) für das ES-System (ES 300, ES 600, ES 700) und PCR-Elisa für das Mikrotiterplattenformat angegeben Mit den Primerpaaren 2/3 und 2/8 wurde eine untere Nachweisgrenze von weniger als 10 bis 30 Kopien/ Ansatz erreicht
Alternative Primer
Ebenfalls wirksam im Sinne der Erfindung haben sich die Primer der SEQ ID NO 5, 6, 7, 8 und 9 erwiesen, insbesondere in den Kombinationen 5/6, 5/7 und 2/9
Mit der Primerkombination 2/8 konnten 3 verschiedene Genotypen nachgewiesen werden, es handelte sich also um einen HGV-subtypunspezifischen Nachweis
Beispiel 2
HGV-Subtypisierung
Mit Ausnahme der Primer wurden die in Beispiel 1 geschilderten Bedingungen angewandt
Als Primer finden bestimmte Paare Verwendung (SEQ ID NO /SEQ ID NO ), wobei die in der Tabelle 1 angegebenen Ergebnisse erhalten wurden Bei Werten (Extinktionen) von mehr als 100 wurde ein Nachweis als positiv gewertet Es ist erkennbar, daß die einzelnen Als Primer finden bestimmte Paare Verwendung (SEQ.ID.NO./SEQ.ID.NO.), wobei die in der Tabelle 1 angegebenen Ergebnisse erhalten wurden. Bei Werten (Extinktionen) von mehr als 100 wurde ein Nachweis als positiv gewertet. Es ist erkennbar, daß die einzelnen Subtypen durch Auswahl bestimmter Primerpaare gezielt nachgewiesen werden können (z. B. 2/14, 2/15 und 2/16 ).
Tabelle 3
Bei den unterlegten Werten wurden vom Erwarteten abweichende Werte gefunden, die jedoch bei Wiederholung der Experimente unter besser angepassten Stringenz-Bedingungen korrekt erhalten werden (2/12 negativ und 2/20 positiv). Die Primersequenzen und ihre individuelle HGV-Spezifität ist in Tabelle 4 angegeben.
Tabelle 4
SEQUENZPROTOKOLL
(1) ALLGEMEINE ANGABEN:
(i) ANMELDER:
(A) NAME: Boehringer Mannheim GmbH
(B) STRASSE: Sandhoferstr. 116
(C) ORT: Mannheim
(E) LAND: DE
(F) POSTLEITZAHL: 68305
(G) TELEFON: 0621 759 4348 (H) TELEFAX: 0621 759 4457
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Reagenz und Verfahren zum Nachweis von NonA,NonB,NonC,NonD,NonE- Virus
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 20
(iv) COMPUTER-LESBARE FASSUNG:
(A) DATENTRÄGER: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version #1.30 (EPA)
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1 :
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 348 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid (C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-RNA
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTISENSE: JA
(viii) POSITION IM GENOM:
(A) CHROMOSOM/SEGMENT: nichttranslatierte Region
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:
ACGTGGGGGA GTTGATCCCC CCCCCCCGGC ACTGGGTGCA AGCCCCAGAA ACCGACGCCT 60
ATCTAAGTAG ACGCAATGAC TCGGCGCCGA CTCGGCGACC GGCCAAAAGG TGGTGGATGG 120
GTGATGACAG GGTTGGTAGG TCGTAAATCC CGGTCACCTT GGTAGCCACT ATAGGTGGGT 180
CTTAAGAGAA GGTTAAGATT CCTCTTGTGC CTGCGGCGAG ACCGCGCACG GTCCACAGGT 240 GTTGGCCCTA CCGGTGGGAA TAAGGGCCCG ACGTCAGGCT CGTCGTTAAA CCGAGCCCGT 300
TACCCACCTG GGCAAACGAC GCCCACGTAC GGTCCACGTC GCCCTTCA 348
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Sonstige Nucleinsäure
(A) BESCHREIBUNG: /desc = "Oligodesoxyribonukleotid"
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:
CGGCCAAAAG GTGGTGGATG 20
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 19 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid (C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Sonstige Nucleinsäure
(A) BESCHREIBUNG: /desc = "Oligodesoxyribonukleotid"
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:
CGACGAGCCT GACGTCGGG 19
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 4:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 19 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Sonstige Nucleinsäure
(A) BESCHREIBUNG: /desc = "Oligodesoxyribonukleotid"
(üi) HYPOTHETISCH: NEIN
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: miscjeature (B) LAGE:!.19
(D) SONSTIGE ANGABEN:/note= "G am 5'-Ende ist ueber Aminolink kovalent mit Biotin verbunden"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:
GGTAGCCACT ATAGGTGGG 19
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 5:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 19 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Sonstige Nucleinsäure
(A) BESCHREIBUNG: /desc = "Oligodesoxyribonukleotid"
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5:
CCAGAAACCG ACGCCTATC 19
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 6: (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Sonstige Nucleinsäure
(A) BESCHREIBUNG: /desc = "Oligodesoxyribonukleotid"
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6:
CTTATTCCCA CCGGTAGGGC 20
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 7:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM. Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Sonstige Nucleinsäure
(A) BESCHREIBUNG: /desc = "Oligodesoxyribonukleotid"
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7:
CAAGAGAGAC ATTGAAGGGC 20
(2) ANGABEN ZU SEQ LD NO: 8:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 19 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Sonstige Nucleinsäure
(A) BESCHREIBUNG: /desc = "Oligodesoxyribonukleotid"
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 8:
AACACCTGTG GACCGTGCG 19
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 9:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Sonstige Nucleinsäure
(A) BESCHREIBUNG: /desc = "Oligodesoxyribonukleotid"
(iii)HYPOTHETISCH:NEIN
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQIDNO: 9:
CCACTGGTCCTTGTCAACTC 20
(2)ANGABENZUSEQIDNO: 10:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 18 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Sonstige Nucleinsäure
(A) BESCHREIBUNG: /desc = "Oligodesoxyribonukleotid"
(iii)HYPOTHETISCH:NEIN
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQIDNO: 10:
CAATGACTCGGCGCCGAC 18 (2)ANGABENZUSEQIDNO: 11:
(i)SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 18 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Sonstige Nucleinsäure
(A) BESCHREIBUNG: /desc = "Oligodesoxyribonukleotid"
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 11:
TGATGGCCCY GCGCCRAA 18
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 12:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Sonstige Nucleinsäure
(A) BESCHREIBUNG: /desc = "Oligodesoxyribonukleotid" (iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 12:
AGAGGAATCT TAACCTTCTC 20
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 13 :
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 19 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Sonstige Nucleinsäure
(A) BESCHREIBUNG: /desc = "Oligodesoxyribonukleotid"
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 13:
AGAGGGACCG TAGCCTCCC 19
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 14:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: 18 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Sonstige Nucleinsäure
(A) BESCHREIBUNG, /desc = "Oligodesoxyribonukleotid"
(iii)HYPOTHETISCH:NEIN
(xi)SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQIDNO: 14:
GGTCTCGCCGCAGGCACA 18
(2)ANGABENZUSEQIDNO: 15:
(i)SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 19 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Sonstige Nucleinsäure
(A) BESCHREIBUNG: /desc = "Oligodesoxyribonukleotid"
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 15: CGTTCTCGCC ACGGGCATT 19
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 16:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 19 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Sonstige Nucleinsäure
(A) BESCHREIBUNG: /desc = "Oligodesoxyribonukleotid"
(iii)HYPOTHETISCH:NEIN
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQIDNO: 16:
CTTTCYCTCCRTAAGCGCG 19
(2)ANGABENZUSEQIDNO: 17
(i)SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 19 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear 2B
(ii) ART DES MOLEKÜLS Sonstige Nucleinsäure
(A) BESCHREIBUNG /desc = "Oligodesoxyribonukleotid"
(iii) HYPOTHETISCH NEIN
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG SEQ ID NO 17
TCGGGCCCTT ATTCACACC 19
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 18
(i) SEQUENZKENNZEICHEN
(A) LANGE. 18 Basenpaare
(B) ART. Nucleotid
(C) STRANGFORM- Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS Sonstige Nucleinsäure
(A) BESCHREIBUNG /desc = "Oligodesoxynbonukleotid"
(iii) HYPOTHETISCH NEIN
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG SEQ ID NO 18
CCGGGYCCTT ATTACACC 18
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 19 (i) SEQUENZKENNZEICHEN
(A) LANGE 19 Basenpaare
(B) ART Nucleotid
(C) STRANGFORM Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS Sonstige Nuclemsaure
(A) BESCHREIBUNG /desc = "Ohgodesoxynbonukleotid"
(iii) HYPOTHETISCH NEIN
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG SEQ ID NO 19
TAACGACGAG CCTGACGTC 19
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 20
(l) SEQUENZKENNZEICHEN
(A) LANGE 19 Basenpaare
(B) ART Nucleotid
(C) STRANGFORM Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS Sonstige Nucleinsäure
(A) BESCHREIBUNG /desc = "Oligodesoxyribonukleotid"
(iii) HYPOTHETISCH NEIN (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 20:
TAACGGCGTG CCTAGCGCC 19

Claims

PATENTANSPRÜCHE
Reagenz zur Amplifikation von HGV-spezifischen Nukleotidsequenzen, wobei HGV definiert ist als ein Virus, dessen Genom aus RNS besteht, die am 5'-Ende eine Nukleosidsequenz enthalt, die zu mindestens 80 % homolog ist zu SEQ ID NO 1, enthaltend zwei HGV-spezifische Primer mit jeweils einem verlangerbaren Ende, von denen einer eine Sequenz von 15 bis 30 Basen enthalt, die zu mehr als 80 % komple¬ mentär zu aufeinanderfolgenden Basen der SEQ ID NO 1 ist, und von denen der andere eine Sequenz von 15 bis 30 Basen enthalt, die zu mehr als 80 % homolog zu aufeinanderfolgenden Basen der SEQ ID NO. 1 ist, wobei die verlangerbaren Enden der Primer so gewählt werden, daß im Fall der Verlängerung eines jeden Primers jeder Primer mit dem Verlangerungsprodukt des jeweils anderen Primers hybridisieren kann und die jeweiligen Verlangerungsprodukte als Matrize für die Verlängerung des jeweils anderen Primers dienen können.
Reagenz gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens einer der Primer eine Sequenz von 6 aufeinanderfolgenden Basen, die in den Sequenzen der
SEQ.ID NO 1 enthalten sind, oder eine hierzu komplementäre Sequenz enthält
Reagenz gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens einer der Primer eine Sequenz der SEQ ID NO 2 oder 3 oder 5 bis 20 ent¬ halt
Reagenz gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens einer der Primer nachweisbar markiert ist
Reagenz gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß einer oder mehr der Primer HGV-subtypunspezifisch sind
Reagenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß einer oder mehr der Primer HGV-subtypspezifisch sind 7. Reagenz gemäß einem der Ansprüche 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß ein Primer HGV-subtypunspezifisch und ein weiterer HGV-subtypspezifisch ist.
8. Reagenzkit zum spezifischen Nachweis von HGV enthaltend ein Reagenz gemäß einem der vorangehenden Ansprüche sowie eine Sonde, die eine Basensequenz enthält, die in dem gebildeten Verlängerungsprodukt zwischen den verlängerten Enden der Primer liegt.
9. Reagenzkit gemäß Anspruch 8, dadurch charakterisiert, daß die Basensequenz mindestens 6 aufeinanderfolgende Basen, die in den Sequenzen der SEQ.ID.NO. 2 bis 20 enthalten sind, oder eine hierzu komplementäre Sequenz enthält.
lO.Reagenzkit zum spezifischen Nachweis von HGV enthaltend ein Reagenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 sowie ein weiteres Reagenz enthaltend weitere Primer zur Amplifikation von HGV-Nukleotidsequenzen.
11. Reagenzkit gemäß Anspruch 10 enthaltend für jedes Primerpaar jeweils eine Sonde zum Nachweis der Verlängerungsprodukte.
12. Verfahren zum Nachweis von HGV in einer Probe, gekennzeichnet durch Bildung von cDNS aus einem Teil der HGV-RNS und Amplifikation der cDNS unter Verlängerung der Primer eines Reagenzes gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 unter Bildung von Amplifikationsprodukten, Inkontaktbringen der Amplifikationsprodukte mit einer Sonde, die eine Basensequenz enthält, die zwischen den verlängerten Enden der Primer liegt, und Feststellung der Bildung von Hybriden der Sonde mit Amplifikations¬ produkten als Zeichen der Anwesenheit von HGV in der Probe.
13. Verfahren zum Nachweis von HGV in einer Probe gekennzeichnet durch
- Bildung von cDNS aus zwei oder mehr Teilen der HGV-RNS und Amplifikation der cDNS unter Verwendung eines Reagenzes gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 und unter Verwendung eines anderen Primerpaares, das HGV- spezifisch ist, - Inkontaktbringen der Amplifikationsprodukte mit einer Sonde pro amplifiziertem Teil,
- Feststellung der Bildung von Hybriden der Sonden mit den Amplifikationsprodukten und
- Auswertung der Hybridbildung zwischen den Sonden und Amplifikationsprodukten, wobei die Feststellung der Hybridbildung jeweils eines Amplifikationsproduktes als Zeichen der Anwesenheit von HGV in der Probe gewertet wird.
EP96939857A 1995-11-21 1996-11-20 Amplifikation von nukleinsäuren und nachweis eines neuen hepatitis-nona/nonb/nonc/nond/none-virus Withdrawn EP0809711A1 (de)

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DE19543328 1995-11-21
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