EP1124993A2 - Neue primer und sonden zum nachweis von hiv - Google Patents

Neue primer und sonden zum nachweis von hiv

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Publication number
EP1124993A2
EP1124993A2 EP99969965A EP99969965A EP1124993A2 EP 1124993 A2 EP1124993 A2 EP 1124993A2 EP 99969965 A EP99969965 A EP 99969965A EP 99969965 A EP99969965 A EP 99969965A EP 1124993 A2 EP1124993 A2 EP 1124993A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
hiv
oligonucleotides
subtypes
oligonucleotide
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP99969965A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Gerd Haberhausen
Pia Kasper
Christoph Kessler
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Roche Diagnostics GmbH
Original Assignee
Roche Diagnostics GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Roche Diagnostics GmbH filed Critical Roche Diagnostics GmbH
Publication of EP1124993A2 publication Critical patent/EP1124993A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/702—Specific hybridization probes for retroviruses
    • C12Q1/703—Viruses associated with AIDS

Definitions

  • the invention relates to a method for the subtype and / or cross-species detection of HI viruses in a sample as well as suitable oligonucleotides.
  • HIV is of great importance in analytical diagnostics.
  • detection methods which are based on the immunological detection of HIV-specific antibodies, HIV-specific proteins, for example reverse transcriptase, or of HIV-specific nucleic acids.
  • PCR polymerase chain reaction
  • PCR or polymerase chain reaction allows the amplification of nucleic acid sections with the help of oligonucleotides, so-called primers, which hybridize specifically with the nucleic acids to be detected. This results in amplification products, which in turn can be detected with further specific oligonucleotides, so-called probes.
  • a prerequisite for a successful PCR for the detection of HIV is, on the one hand, the most exact possible match of the complementary base sequence of the primers used with that of the nucleic acid to be detected so that the hybridization is as specific as possible. On the other hand, however, it is also advantageous to be able to amplify as many variants of HIV as possible with the same primers.
  • subtypes The different types of HIV-1 are commonly referred to as subtypes. At least 9 subtypes are currently known, which are referred to as subtypes A to H and O (Human Retroviruses and AIDS, Los Alamos, Natl. Laboratory, Los Alamos, New Mexico, 1994; editor G. Meyers et al., IA-1) . So far no primers or probes have been developed with which all known subtypes of HIV-1 can be recognized. It would also be advantageous to also be able to recognize HIV-2 and its subtypes with the same primers and probes. Subtypes A, B, C and D are currently known from HIV-2.
  • WO96 / 02557 describes general uses of oligonucleotides to inhibit HIV propagation and to detect the virus. However, there are no indications of suitability for cross-species or cross-type detection.
  • primers and probes are described, each with base sequences from conserved regions of the gag, vpr and po / genes of the HIV-1 isolates Bru, Mal and Eli and hybridize with the corresponding regions of HIV-2 ROD and SIV Mac. Furthermore, primers and probes are disclosed, each of which hybridizes with sections from the env, nef ⁇ , vif and vpr genes of HIV-1 Bru, Mal and Eli, and those which with sections from the nefl, vifl and Hybridize vpx genes from HIV-2 ROD and SIV Mac. Although some of these oligonucleotides apparently hybridize across species, nothing is said about which subtypes of the individual viruses are recognized.
  • EP 839 917 in which, however, only subtypes of HIV-1 can be detected
  • EP 887 427, WO99 / 07898 and WO98 / 58086 discloses primers and probes which amplify a sequence section from the o / gene of HIV-1 and can thereby recognize five subtypes of HIV-1.
  • EP 0 617 132 also discloses primers and probes for the detection of HIV-1 which are able to differentiate between HIV-1 and its phylogenetically closest relatives, such as HTLV-II or HIV-2.
  • the oligonucleotides selected there hybridize with a number of regions from the HIV genome, including the LTR and most structural genes. However, there is no evidence of suitability for cross-subtype detection.
  • oligonucleotides for purification by means of hybridization with target oligos, e.g. WO98 / 27425.
  • target oligos e.g. WO98 / 27425.
  • oligos are not suitable for cross-subtype detection of HIV.
  • WO90 / 01069 discloses oligonucleotide pairs for the detection of HIV, these pairs are not used as primers for an enzymatic Amplification used, but they hybridize on the same strand and represent the sequence sought even after their linkage.
  • the object of the present invention was therefore to provide a method for the subtype and / or cross-species detection of HI viruses in a sample.
  • This object is achieved according to the invention by a method for the detection of nucleic acids of HI viruses in a sample across and between species
  • This object is preferably achieved by a method for the subtype and / or cross-species detection of nucleic acids of HI viruses in a sample Hybridization of nucleic acids with one
  • Oligonucleotide combination comprising two or more oligonucleotides hybridizing specifically with HIV nucleic acids, each of at least 10 consecutive nucleotides from (i) a highly conserved region of the LTR region, the gra ⁇ gene or the p ⁇ gene of HIV, represented by one of those in SEQ
  • ID NO: 1 to 13 specified sequences, (ii) a corresponding region of another HI virus isolate, (iii) a corresponding region of a consensus sequence derived from a number of HI virus isolates, or sequences complementary thereto, and carrying out an amplification step.
  • the method according to the invention enables the detection of more subtypes of HIV-1 and HIV-2 (cross-subtype detection) than was possible in the prior art.
  • Cross-subtype detection means that at least 2 subtypes of a particular species can be detected with a single probe or a single oligonucleotide combination.
  • the method according to the invention now makes it possible to recognize at least 7 of 9 subtypes of HIV-1, in particular including subtype O in conjunction with other subtypes, with the aid of particularly fewer and in the best case with the same oligonucleotides.
  • all 9 subtypes known so far can be recognized.
  • At least 2, preferably at least 3 and most preferably, all subtypes A, B, C and D of HIV-2 can be identified by the cross-subtype detection of HIV-2.
  • nucleic acids from HIV-1 and HIV-2 can also be detected across species.
  • Cross-species means that different species of immunodeficiency viruses are recognized with the same oligonucleotides, e.g. HIV-1 and HIV-2.
  • At least 7 of the currently known 9 subtypes of HIV-1 and further of the currently known subtypes of HIV-2 are preferably detected.
  • all 9 subtypes of HIV-1 plus further subtypes of HIV-2, particularly preferably plus all currently known subtypes of HIV-2 can be detected.
  • the method according to the invention is based on an amplification of nucleic acid sections of HI viruses with the aid of specific oligonucleotides which can act as primers or as probes.
  • oligonucleotide is a single-stranded linear nucleic acid molecule.
  • oligonucleotides have 10 to 100 bases.
  • the oligonucleotides according to the invention are preferably 10 to 80, particularly preferably 10 to 60, even more preferably 10 to 30 and most preferably 20 to 30 nucleotides long.
  • nucleic acids a distinction is made between oligodeoxyribonucleotides and oligoribonucleotides, but oligoribonucleotides also include compounds in which the hydrogen of the hydroxyl group is replaced by organic radicals, for example an allyl group. Such connections have long been known to the person skilled in the art.
  • oligonucleotide may also include, for example, molecules in which the sugar phosphate backbone is replaced by a peptide backbone. This group of compounds is called PNA. All oligonucleotides have in common that they have bases on the backbone which are capable of hydrogen bonds with bases which are complementary thereto.
  • the bases include the natural bases A, G, C, T and U, but also artificial bases, such as Deaza-G.
  • An oligonucleotide primer is an oligonucleotide which can hybridize with a second, likewise single-stranded nucleic acid and subsequently can be supplemented with a suitable enzyme, for example a DNA polymerase along the second nucleic acid serving as template with nucleoside triphosphates, so that a double-stranded nucleic acid is formed.
  • a suitable enzyme for example a DNA polymerase along the second nucleic acid serving as template with nucleoside triphosphates, so that a double-stranded nucleic acid is formed.
  • the primer has a hydroxyl group at its 3 'end, ie at the end at which nucleotide building blocks are attached, at the 3' C atom of the sugar.
  • An oligonucleotide combination comprises several oligonucleotides, preferably it comprises a pair of primers or a combination of primers and probes, such as a pair of primers and a probe.
  • a pair of primers consists of two oligonucleotide primers, which allow the preferential enzymatic amplification of a certain section of a nucleic acid.
  • the two primers of the pair of primers preferably hybridize with different strands of the original nucleic acid in such a way that the respective extension products overlap one another. This then leads to the fact that each of the primers can hybridize with the extension product of the respective other primer and a section which lies between the two primers is multiplied as the amplification product.
  • probes are also single-stranded oligonucleotides, which can also act as primers, but are primarily intended to specifically hybridize with already amplified nucleic acid sections in order to enable nucleic acid detection.
  • oligonucleotide thus includes the terms primer and probe, which differ only in their function.
  • the oligonucleotides used in the method according to the invention can also contain labeling groups, such as radioactive labels or fluorescent labels. In particular, it is the probes that have markings.
  • Amplification is understood to mean the duplication of nucleic acids or nucleic acid sections.
  • a well-known amplification method is the PCR mentioned at the beginning. In this method, a normally double-stranded DNA molecule is first denatured, ie into its Single strands split. The amplification primers are then added under conditions that allow the primers to hybridize with the target DNA sequence. The primers are then supplemented along the nucleic acid matrix with the aid of a polymerase enzyme and nucleotide building blocks. The newly formed double-stranded nucleic acids are then denatured again and a new polymerase cycle begins. Conventional PCR methods typically use between 25 and 40 cycles. An amplification in the sense of the invention can therefore also include necessary preparatory steps for nucleic acid amplification, such as denaturing the double-stranded DNA.
  • hybridization here means the combination of two complementary single nucleic acid strands into a double strand.
  • the single strands do not have to be 100% complementary, but can have deviations in the base sequence.
  • the single strands in this case the oligonucleotides, must be sufficiently specific under the prevailing hybridization conditions.
  • the oligonucleotides used must meet at least two conditions. On the one hand, they have to be specific enough to hybridize exclusively with nucleic acids derived from HI viruses. On the other hand, these viruses vary greatly in some genome regions, ie there are relatively large differences in the base sequence. Because of these differences, a distinction is made between HIV-1 and HIV-2 as well as between so-called subtypes, which are relatively closely related strains of the same virus.
  • oligonucleotides of the present invention In relation to the oligonucleotides of the present invention, this means that they must also be able to recognize not only a specific virus or a specific subtype, but they must have a base sequence that hybridizes with as many or as possible allowed even all known subtypes of HIV-1 or HIV-2 or even both.
  • oligonucleotides For this purpose, one normally selects the oligonucleotides from relatively conserved regions of the genome of the viruses to be detected and then uses the respective complementary sequence. From the state of the
  • oligonucleotides have now been found in the present invention which enable both cross-type detection and cross-species detection of HIV. These oligonucleotides hybridize to newly discovered, highly conserved regions of HIV. These are located in the LTR region, the gag and po / genes. These regions are relatively small, but with an average length of 50 to 100 nucleotides they allow hybridization with one or more oligonucleotides. The determination of the regions of the HIV genome is based here, as in most of the cited prior art documents, on the numbering of the HIV-1 isolate HXB2, as published in: Wong-Staal et al., Nature 313, 277- 284 (1985).
  • sequences of these new highly conserved areas are in SEQ ID NO. 1 to 13 indicated, the sequences of which refer to the sequence of HIV-1 HXB2, accession number K03455 from the HIV Sequence Database (http: //HIV-web.lanl. Gov./).
  • the location of the highly conserved sequences is as follows:
  • SEQ ID NO. 1 LTR region, position 504-565, length 62 nucleotides
  • SEQ ID NO. 2 gag gene, position 761-822, length 62 nucleotides
  • SEQ ID NO. 3 gag gene, position 1786-1847, length 62 nucleotides
  • SEQ ID NO. 4 po / region, position 2307-2360, length 54 nucleotides
  • SEQ ID NO. 5 pol gene, position 2376-2434, length 59 nucleotides
  • SEQ ID NO. 6 po / gene, position 2568-2632, length 65 nucleotides
  • SEQ ID NO. 7 po / gene, position 3093-3145, length 53 nucleotides
  • SEQ ID NO. 8 pol gene, position 4131-4207, length 77 nucleotides
  • SEQ ID NO. 9 po / gene, position 4333-4399, length 67 nucleotides
  • SEQ ID NO. 10 pol gene, position 4638-4696, length 59 nucleotides
  • SEQ ID NO. 1 1 p ⁇ / gene, position 4884-4984, length 101 nucleotides
  • SEQ ID NO. 12 po / gene, position 5034-5095, length 62 nucleotides
  • SEQ ID NO. 13 pol gene, position 4410-4506, length 97 nucleotides.
  • oligonucleotides suitable according to the invention preferably have base sequences which lie within the highly conserved regions mentioned above or their complementary sequences.
  • overlap is to be understood here so that the oligonucleotides according to the invention each overlap with at least 10 successive bases from one of the highly conserved regions.
  • the oligonucleotides preferably overlap with one of the regions with SEQ ID NO: 4, 5, 9, 1 0 and 1 3, preferably 4, 5, 9 and 10.
  • the oligonucleotides each overlap with one of the regions SEQ ID NO: 6, 8, 10, 1 1 and 1 3.
  • Oligonucleotide sequences suitable according to the invention can also have a base sequence which is a consensus sequence from highly conserved regions of several HIV virus isolates or strains. That that, for example, a base sequence of several bases corresponds to one HIV virus isolate and another base sequence in the same oligonucleotide corresponds to another HIV virus isolate.
  • the oligonucleotide then contains heterologous base sequences.
  • the oligonucleotides preferably each comprise at least 10 consecutive nucleotides from one of the regions mentioned above. More preferably, they contain 15 to 30 such nucleotides.
  • the method according to the invention comprises at least the following steps:
  • an amplification step is preferably carried out.
  • the subtype and / or cross-species detection of HIV viral nucleic acids is made possible by using at least two oligonucleotides according to the invention.
  • These oligonucleotides are preferably used as amplification primers in such a way that they hybridize, for example, in each case close to one end of one of the highly conserved regions and thus produce an amplification product (preferably PCR) which corresponds to a section of the highly conserved region in question.
  • This amplification product and thus the HIV-specific nucleic acid can then be detected with the aid of a probe which is either one of the oligonucleotides used as primer or an additional oligonucleotide which hybridizes within the amplified sequence.
  • a probe which is either one of the oligonucleotides used as primer or an additional oligonucleotide which hybridizes within the amplified sequence.
  • DNA-binding reagents such as a DNA-binding dye (e.g. Sybergreen) can also be used in the detection (WO97 / 46707).
  • oligonucleotide combinations or primer pairs are used, each of which only one oligonucleotide primer lies within one of the conserved regions, while the other primer lies outside, so that the amplification product thus produced only partially from a base sequence from one of the highly conserved ones Regions.
  • the latter primer is preferably subtype-specific and / or species-specific, so that subtypes or the species can be specifically detected with such a combination.
  • two or more pairs of primers are preferably used as the oligonucleotide combination, at least two oligonucleotides each containing at least 10 consecutive nucleotides from a sequence (i), (ii), (iii) or sequences complementary thereto, as described above.
  • the entirety of the primer combinations thus allows sub-type and / or cross-species detection of HI viruses.
  • an oligonucleotide combination suitable for the method according to the invention comprises at least two, preferably three oligonucleotides (e.g. a primer pair or a primer pair plus probe), each of which consists of at least 10 nucleotides
  • (iii) contain a corresponding region of a consensus sequence derived from a number of HIV virus isolates, or sequences complementary thereto.
  • the at least one and preferably the at least two oligonucleotide (s) are preferably selected so that they enable cross-subtype detection of HIV-1, i.e. that nucleic acids of at least 7 of subtypes A, B, C, D, E, F, G, H and O of HIV-1, preferably of all subtypes, are recognized.
  • At least one and preferably at least two oligonucleotide (s) are used for cross-subtype detection, each of which contains at least 10 consecutive nucleotides from (i) a highly conserved region of the LTR, gag gene or pol gene of HIV, represented by one of the in SEQ ID NO: 1, 2,
  • oligonucleotide For sub-type and / or cross-species detection of HIV-1 and HIV-2, preference is given to using at least one and preferably at least two oligonucleotide (s) which each comprise at least 10 consecutive nucleotides
  • oligonucleotides are particularly suitable for the method according to the invention. These oligonucleotides are shown in the sequences given in SEQ ID NO: 14 to 25. As already mentioned at the beginning, these oligonucleotides can consist of natural or synthetic nucleic acid building blocks, or even the PNA already mentioned. At least one of the oligonucleotides used in the method according to the invention preferably carries one or more labels. Fluorescence markers or radioactive markers, such as [ 32 P] -labelled nucleotides, are suitable as labels.
  • Another object of the invention is an oligonucleotide which contains at least 10 consecutive nucleotides from (i) a highly conserved region of the po / gene of HIV, represented by one of those given in SEQ ID NO: 4, 5, 9 or 10
  • the oligonucleotide according to the invention preferably comprises or is one of those shown in SEQ ID NO. 14 to 25 oligonucleotides shown.
  • the length of the oligonucleotide according to the invention is preferably 10 to 80 nucleotides. It particularly preferably comprises approximately 20 to 30 bases and has a GC content of between 40 and 60%. It is also advantageous if the oligonucleotides have no self-complementarity at the 3 'end and, moreover, do not have a CG run at the 3' end.
  • a GC run is a base sequence that consists predominantly or exclusively of bases C and G. Furthermore, the oligonucleotides should not contain any palindromes.
  • the oligonucleotides according to the invention preferably have a maximum of 2 mismatches with the corresponding sequences of the same positions of all subtypes which hybridize with them.
  • An oligonucleotide according to the invention preferably has no mismatches with nucleotide acids of subtypes A, B, C, D, E, F, G, H and O of HIV-1 and / or of subtypes A, B, C and C at its 3 'end from HIV-2 to.
  • the primers are chosen such that the 5 'ends of the primers are positioned at a maximum of 80 bases from one another, based on the regions in which the primers hybridize to the nucleic acid to be detected.
  • Particularly preferred primer pairs are those in which a further HIV-specific sequence lies within this range that can be amplified by the primers. This sequence can then preferably be used to detect the amplification products with the aid of a probe specific for it.
  • the oligonucleotides according to the invention are preferably provided with at least one of the labeling groups mentioned above.
  • a further aspect of the present invention is thus also a combination of two or more oligonucleotides, both of which have the above-mentioned properties according to the invention and which in their entirety are suitable for the detection of HIV viruses across subtypes and / or species.
  • the invention further comprises combinations of oligonucleotides. Combinations of at least two oligonucleotides are preferred, each comprising at least 10 consecutive nucleotides from (i) the same highly conserved region of the LTR region, the gag
  • the gene or the po / gene of HIV represented by one of the sequences given in SEQ ID NO: 1 to 1 3, (ii) a corresponding region of another HIV virus isolate, (iii) a corresponding region of one of several HIV virus isolates derived consensus sequence, or sequences complementary thereto.
  • Yet another aspect of the present invention is a combination of several oligonucleotides, at least two oligonucleotides according to the invention being present, as well as further oligonucleotides, each of which contains a sequence specific for a single subtype of HIV-1 and / or HIV-2, the total of the Oligonucleotides in the oligonucleotide combination allow sub-type and / or cross-species detection of HI viruses.
  • a further object of the present invention is to provide a reagent kit which contains at least one oligonucleotide according to the invention or an oligonucleotide combination according to the invention as a primer or as probes for the detection of HI viruses or their nucleic acids, and for carrying out a hybridization and amplification of nucleic acids in a sample includes.
  • the invention relates to the use of oligonucleotides or oligonucleotide combinations as primers and / or probes for the detection of HI viruses, in particular for the detection of subtypes and / or species.
  • Sample preparation First 420 ⁇ l plasma was mixed with 80 ⁇ l Proteinase K (25 mg / ml) and vortexed for a few seconds. Then 500 ⁇ l lysis buffer (5.4 M guanidinium thiocyanate, 10 mM urea, 10 mM Tris-HCl, 20% Triton X100, pH 4.4) were added, which contained 1 ⁇ g carrier RNA (polyA / ml). The mixture was vortexed and then shaken for 10 minutes at room temperature. Then 500 ⁇ l of isopropanol-MGP were added (6 mg of magnetic glass particles in isopropanol). The mixture was vortexed again and then for 20 minutes Shaken at room temperature.
  • lysis buffer 5.4 M guanidinium thiocyanate, 10 mM urea, 10 mM Tris-HCl, 20% Triton X100, pH 4.4
  • the MGPs were separated from the solution by magnetic separation. The supernatant was removed and discarded. 750 ul wash buffer (20mM NaCl, 20mM Tris-HCl, pH 7.5, 70% ethanol) was added, the MGPs were resuspended by vortexing, and magnetic separation was performed again. The washing process was repeated 5 times in total and finally 100 ⁇ l of DEMC water was added for the elution. The mixture was shaken for 15 minutes at 80 ° C. and then a further magnetic separation was carried out. 10 ⁇ l of the eluate were used for an RT-PCR.
  • Table 1 shows the primers and probes used, as well as their associated highly conserved region, position in the genome and the amplification product produced with primer pairs.
  • This primer sn ewe s pu certe rmer un on en by ⁇ c e are new primers from the po / region of the HIV genome in accordance with the highly conserved areas listed in Table 1.
  • Amplification mix and thermal cycler protocol for the RT-PCR Master mix: Final reagent concentration in the master mix
  • the entire detection reaction was fully automated using an Elecsys ® 1010 automated analyzer.
  • the signals of the new primers show a similar sensitivity to the references. There is a very good signal gradation within the dilution series.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum subtyp- und/oder speziesübergreifenden Nachweis von HI-Viren in einer Probe unter Verwendung mindestens eines Oligonukleotids, welches mindestens 10 aufeinanderfolgende Nukleotide aus (i) einer hochkonservierten Region der LTR-Region, des gag-Gens oder des pol-Gens von HIV, (ii) einer entsprechenden Region eines anderen HI-Virusisolats, (iii) einer entsprechenden Region einer aus mehreren HI-Virusisolaten stammenden Konsensussequenz, oder dazu komplementären Sequenzen enthält.

Description

Neue Primer und Sonden zum Nachweis von HIV
Beschreibung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum subtyp- oder/und speziesübergreifenden Nachweis von HI-Viren in einer Probe sowie dazu geeignete Oligonukleotide.
Der Nachweis von HIV ist von großer Bedeutung in der analytischen Diagnostik. Es existiert eine Anzahl von Nachweisverfahren, die auf der immunologischen Detektion von HIV-spezifischen Antikörpern, HIV-eigenen Proteinen, beispielsweise der Reversen Transkriptase, oder von HIV- spezifischen Nukleinsäuren beruhen.
Da HIV und dessen genetisches Material nur in sehr geringen Konzentrationen in Körperflüssigkeiten vorkommen, ist die Sensitivität der Nachweisverfahren ein wichtiger Faktor für die Verwendbarkeit solcher Verfahren.
Aus diesem Grund wird derzeit die PCR (Polymerase Chain Reaction), die auf einer Amplifikation der nachzuweisenden Nukleinsäuren beruht, in zunehmendem Maße verwendet. Anwendungen dieses Verfahrens zum direkten Nachweis von HIV sind beispielsweise in EP-B-0 200 362 und EP- B-0 201 184 beschrieben.
Die PCR oder Polymerase-Kettenreaktion erlaubt die Amplifikation von Nukleinsäureabschnitten mit Hilfe von Oligonukleotiden, sogenannten Primern, die spezifisch mit den nachzuweisenden Nukleinsäuren hybridisieren. Dabei entstehen Amplifikationsprodukte, welche wiederum mit weiteren spezifischen Oligonukleotiden, sogenannten Sonden, detektiert werden können. Voraussetzungen für eine erfolgreiche PCR zum Nachweis von HIV ist einerseits eine möglichst genaue Übereinstimmung der komplementären Basenfolge der verwendeten Primer mit derjenigen der nachzuweisenden Nukleinsäure, damit die Hybridisierung möglichst spezifisch ist. Andererseits ist es jedoch auch vorteilhaft, möglichst viele Varianten von HIV mit denselben Primern amplifizieren zu können.
Seit der Entdeckung des HIV-1 wurde festgestellt, dass die Nukleinsäuresequenzen von HI-Viren unterschiedlicher Provenienz sich unterscheiden. Die unterschiedlichen Typen von HIV-1 werden üblicherweise als Subtypen bezeichnet. Derzeit sind mindestens 9 Subtypen bekannt, die als Subtypen A bis H und O bezeichnet werden (Human Retroviruses and AIDS, Los Alamos, Natl. Laboratory, Los Alamos, New Mexico, 1994; Herausgeber G. Meyers et al., I-A-1 ). Bisher wurden noch keine Primer oder Sonden entwickelt, mit denen sämtliche bekannten Subtypen von HIV-1 erkannt werden können. Weiterhin wäre es von Vorteil, zusätzlich auch HIV-2 und dessen Subtypen mit denselben Primern und Sonden erkennen zu können. Von HIV-2 sind derzeit die Subtypen A,B,C und D bekannt.
In einigen Patentanmeldungen werden Oligonukleotidprimer und/oder Sonden offenbart, die jedoch nicht von der vorliegenden Anmeldung umfaßt werden.
WO96/02557 beschreibt allgemeine Verwendungen von Oligonukleotiden zur Hemmung der HIV-Propagierung und zum Nachweis des Virus. Hinweise auf eine Eignung für einen spezies- oder subtypübergreifenden Nachweis finden sich allerdings nicht.
In der europäischen Patentanmeldung EP 0 403 333 werden Primer und Sonden beschrieben, die jeweils mit Basensequenzen aus konservierten Regionen der gag-,vpr- und po/-Gene der HIV-1 -lsolate Bru, Mal und Eli sowie mit den entsprechenden Regionen von HIV-2 ROD und SIV Mac hybridisieren. Weiterhin werden Primer und Sonden offenbart, die jeweils mit Abschnitten aus den env-, nefλ -, vif - und vpr-Genen von HIV-1 Bru, Mal und Eli hybridisieren, sowie solche, die mit Abschnitten aus den nefl-, vifl- und vpx-Genen von HIV-2 ROD und SIV Mac hybridisieren. Obwohl einige dieser Oligonukleotide offenbar speziesübergreifend hybridisieren, ist nichts darüber ausgesagt, welche Subtypen der einzelnen Viren erkannt werden.
Weitere Nachweisverfahren für HIV offenbaren z.B. EP 839 917, bei der jedoch nur Subtypen von HIV-1 nachgewiesen werden können, sowie die nachveröffentlichten Anmeldungen EP 887 427, WO99/07898 und WO98/58086. In der europäischen Patentanmeldung EP 727 497 sind Primer und Sonden offenbart, die einen Sequenzabschnitt aus dem o/-Gen von HIV-1 amplifizieren und dadurch fünf Subtypen von HIV-1 erkennen können.
EP 0 617 132 offenbart ebenfalls Primer und Sonden zum Nachweis von HIV-1 , die in der Lage sind, zwischen HIV-1 und seinen phylogenetisch nächsten Verwandten zu unterscheiden, wie etwa HTLV-II oder HIV-2. Die dort ausgewählten Oligonukleotide hybridisieren mit einer Reihe von Regionen aus dem HIV-Genom, einschließlich des LTR und der meisten Strukturgene. Hinweise auf eine Eignung für einen subtypübergreifenden Nachweis finden sich allerdings nicht.
Weiterhin gibt es im Stand der Technik Verfahren, welche Oligonukleotide für eine Aufreinigung mittels Hybridisierung mit Zieloligos verwenden, z.B. WO98/27425. Solche Oligos sind für einen subtypübergreifenden Nachweis von HIV allerdings nicht geeignet.
WO90/01069 offenbart zwar Oligonukleotidpaare zum Nachweis von HIV, jedoch werden diese Paare nicht als Primer für eine enzymatische Amplifikation verwendet, sondern sie hybridisieren am selben Strang und stellen selbst nach ihrer Verknüpfung die gesuchte Sequenz dar.
Da es bisher noch kein einziges Primerpaar gibt, welches für einen subtyp- oder/und speziesübergreifenden Nachweis geeignet ist, werden derzeit häufig mehrere Primerpaare zur Amplifikation eingesetzt. Dies führt jedoch einerseits zu erhöhten Reagenzkosten und andererseits zu einer erheblich komplexeren PCR.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war daher die Bereitstellung eines Verfahrens zum subtyp- oder/und speziesübergreifenden Nachweis von HI- Viren in einer Probe. Insbesondere war es eine Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem mehr Subtypen von HIV-1 und/oder HIV- 2 detektiert werden können, als es bisher möglich war.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zum subtyp- und/oder speziesübergreifenden Nachweis von Nukleinsäuren von HI-Viren in einer Probe durch
Hybridisierung der Nukleinsäuren mit mindestens einem mit HIV- Nukleinsäuren spezifisch hybridisierenden Oligonukleotid, welches mindestens 10 aufeinanderfolgende Nukleotide aus (i) einer hochkonservierten Region der LTR-Region, des gag-Gens oder des poΛGens von HIV, dargestellt durch eine der in SEQ ID NO: 1 bis 13 angegebenen Sequenzen, (ii) einer entsprechenden Region eines anderen Hl-Virusisolats,
(iii) einer entsprechenden Region einer Konsensussequenz aus mehreren Hl-Virusisolaten, oder dazu komplementären Sequenzen enthält.
Bevorzugt wird diese Aufgabe gelöst durch ein Verfahren zum subtyp- und/oder speziesübergreifenden Nachweis von Nukleinsäuren von HI-Viren in einer Probe durch H y b r i d i s i e r u n g d e r N u k l e i n s ä u r e n m it e i n e r
Oligonukleotidkombination, umfassend zwei oder mehr mit HIV- Nukleinsäuren spezifisch hybridisierende Oligonukleotide, die jeweils mindestens 10 aufeinanderfolgende Nukleotide aus (i) einer hochkonservierten Region der LTR-Region, des gra^-Gens oder des pσΛGens von HIV, dargestellt durch eine der in SEQ
ID NO: 1 bis 13 angegebenen Sequenzen, (ii) einer entsprechenden Region eines anderen Hl-Virusisolats, (iii) einer entsprechenden Region einer aus mehreren Hl- Virusisolaten abgeleiteten Konsensussequenz, oder dazu komplementären Sequenzen enthalten, und Durchführung eines Amplifikationsschrittes.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht den Nachweis von mehr Subtypen von HIV-1 und HIV-2 (subtypübergreifender Nachweis) als es im bisherigen Stand der Technik möglich war. Der subtypübergreifende Nachweis bedeutet, daß mindestens 2 Subtypen einer jeweiligen Spezies mit einer einzigen Sonde oder einer einzigen Oligonukleotidkombination detektiert werden können. Wie bereits oben erwähnt, ist es bisher nicht möglich gewesen, mit herkömmlichen Nachweisverfahren die Subtypen A, B, C, D, E, F, G, H und O von H1V-1 mit einer einzigen Sonde oder einem einzigen Amplifikationsprimerpaar bestehend aus zwei Oligonukleotiden zu detektieren. Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird es nun möglich, mindestens 7 von 9 Subtypen von HIV-1 , insbesondere einschließlich Subtyp O in Verbindung mit anderen Subtypen mit Hilfe besonders weniger und im besten Fall mit denselben Oligonukleotiden zu erkennen. In einer bevorzugten Ausführungsform können alle bisher bekannten 9 Subtypen erkannt werden. Von HIV-2 können mit dem subtypübergreifenden Nachweis mindestens 2, bevorzugt mindestens 3 und am meisten bevorzugt alle Subtypen A, B, C und D von HIV-2 erkannt werden. Zusätzlich zum subtypübergreifenden Nachweis können auch Nukleinsäuren von HIV-1 und HIV-2 speziesübergreifend detektiert werden. Speziesübergreifend bedeutet, daß verschiedene Spezies von Immunodefizienzviren mit denselben Oligonukleotiden erkannt werden, z.B. HIV-1 und HIV-2. Bevorzugt werden mindestens 7 der derzeit bekannten 9 Subtypen von HIV-1 , sowie weitere der derzeit bekannten Subtypen von HIV-2 detektiert. Besonders bevorzugt können alle 9 Subtypen von HIV-1 plus weitere Subtypen von HIV-2, besonders bevorzugt plus alle derzeit bekannten Subtypen von HIV-2 detektiert werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren beruht auf einer Amplifikation von Nukleinsäureabschnitten von HI-Viren mit Hilfe von spezifischen Oligonukleotiden, die als Primer oder als Sonden fungieren können.
Ein Oligonukleotid ist ein einsträngiges lineares Nukleinsäuremolekül. Im Allgemeinen weisen Oligonukleotide 10 bis 100 Basen auf. Die erfindungsgemäßen Oligonukleotide sind bevorzugt 10 bis 80, besonders bevorzugt 10 bis 60, noch stärker bevorzugt 10 bis 30 und am meisten bevorzugt 20 bis 30 Nukleotide lang. Wie bei Nukleinsäuren unterscheidet man auch hier zwischen Oligodesoxyribonukleotiden und Oligoribonukleotiden, zu den Oligoribonukleotiden zählt man jedoch auch Verbindungen, bei denen der Wasserstoff der Hydroxygruppe durch organische Reste, beispielsweise eine Allylgruppe, ersetzt ist. Solche Verbindungen sind dem Fachmann seit längerem bekannt. Weiterhin können durch den Begriff "Oligonukleotid" beispielsweise auch Moleküle umfaßt sein, bei denen das Zuckerphosphatrückgrat durch ein Peptidrückgrat ersetzt ist. Diese Gruppe von Verbindungen wird PNA genannt. Allen Oligonukleotiden ist gemeinsam, dass sie am Rückgrat Basen aufweisen, welche zu Wasserstoffbrückenbindungen mit hierzu komplementären Basen in der Lage sind. Zu den Basen gehören die natürlichen Basen A, G, C, T und U, jedoch auch künstliche Basen, wie etwa Deaza-G.
Ein Oligonukleotidprimer ist ein Oligonukleotid, welches mit einer zweiten, ebenfalls einsträngigen Nukleinsäure hybridisieren kann und anschließend durch ein geeignetes Enzym, z.B. eine DNA-Polymerase entlang der als Matrize dienenden zweiten Nukleinsäure mit Nukleosidtriphosphaten ergänzt werden kann, sodass eine doppelsträngige Nukleinsäure entsteht. Normalerweise besitzt der Primer daher an seinem 3'-Ende, d.h. an dem Ende, an dem Nukleotidbausteine angesetzt werden, am 3'-C-Atom des Zuckers eine Hydroxylgruppe.
Eine Oligonukleotidkombination umfaßt mehrere Oligonukleotide, bevorzugt umfaßt sie ein Primerpaar oder eine Kombination aus Primern und Sonden, wie etwa ein Primerpaar und eine Sonde. Ein Primerpaar besteht aus zwei Oligonukleotidprimern, welche die bevorzugt enzymatische Amplifikation eines bestimmten Abschnittes einer Nukleinsäure erlauben. Bevorzugt hybridisieren die beiden Primer des Primerpaares mit unterschiedlichen Strängen der Ursprungsnukleinsäure dergestalt, dass die jeweiligen Verlängerungsprodukte einander überlappen. Dies führt dann dazu, dass jeder der Primer mit dem Verlängerungsprodukt des jeweils anderen Primers hybridisieren kann und ein Abschnitt, der zwischen den beiden Primern liegt, als Amplifikationsprodukt vervielfacht wird. Sogenannte Sonden sind ebenfalls einsträngige Oligonukleotide, die zwar auch als Primer fungieren können, aber hauptsächlich dafür vorgesehen sind, mit bereits amplifizierten Nukleinsäureabschnitten spezifisch zu hybridisieren, um somit einen Nukleinsäurenachweis zu ermöglichen. Die Bezeichnung "Oligonukleotid" umfasst somit die Begriffe Primer und Sonde, die sich lediglich ihrer Funktion nach unterscheiden. Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Oligonukleotide können auch Markierungsgruppen enthalten, wie etwa radioaktive Marker oder Fluoreszenzmarker. Insbesondere sind es die Sonden, die Markierungen aufweisen.
Unter Amplifikation wird die Vervielfältigung von Nukleinsäuren oder Nukleinsäureabschnitten verstanden. Ein bekanntes Amplifikationsverfahren ist die eingangs erwähnte PCR. Bei diesem Verfahren wird zunächst ein normalerweise doppelsträngiges DNA-Molekül denaturiert, d.h. in seine Einzelstränge aufgespalten. Dann werden die Amplifikationsprimer unter Bedingungen hinzugegeben, die eine Hybridisierung der Primer mit der Ziel- DNA-Sequenz erlauben. Mit Hilfe eines Polymeraseenzyms sowie Nu kleotidbausteinen werden dann die Primer entlang der Nukleinsäurematrize ergänzt. Anschließend werden die neugebildeten doppelsträngigen Nukleinsäuren wieder denaturiert und es beginnt ein neuer Polymerasezyklus. Herkömmliche PCR-Verfahren verwenden typischerweise zwischen 25 und 40 Zyklen. Eine Amplifikation im Sinne der Erfindung kann also auch nötige Vorbereitungsschritte zur Nukleinsäureamplifikation miteinschließen, wie z.B. das Denaturieren der doppelsträngigen DNA.
Der Begriff "Hybridisierung" bedeuted hierin die Vereinigung zweier komplentärer Nukleinsäureeinzelstränge zu einem Doppelstrang. Dazu müssen die Einzelstränge nicht 100 % komplementär sein, sondern können Abweichungen in der Basenfolge aufweisen. Um eine für das erfindungsgemäße Verfahren geeignete Hybridiserung zu erreichen, müssen die Einzelstränge, in diesem Fall die Oligonukleotide, unter den herrschenden Hybridisierungsbedingungen jedoch hinreichend spezifisch sein.
Um die eingangs genannten Vorteile des hier beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahrens zu gewährleisten, müssen die verwendeten Oligonukleotide zumindest zwei Bedingungen erfüllen. Sie müssen einerseits spezifisch genug sein, um ausschließlich mit Nukleinsäuren zu hybridisieren, die von HI-Viren stammen. Andererseits variieren gerade diese Viren in einigen Genomregionen sehr stark, d.h. dass relativ große Unterschiede in der Basensequenz vorliegen. Aufgrund dieser Unterschiede unterscheidet man einerseits zwischen HIV-1 und HIV-2 als auch zwischen sogenannten Subtypen, die relativ eng verwandte Stämme desselben Virus darstellen. Bezogen auf die Oligonukleotide der vorliegenden Erfindung bedeutet dies, dass diese außerdem in der Lage sein müssen, nicht nur ein bestimmtes Virus oder einen bestimmten Subtyp zu erkennen, sondern sie müssen eine Basensequenz aufweisen, die eine Hybridisierung mit möglichst vielen oder sogar allen bekannten Subtypen von HIV-1 oder von HIV-2 oder sogar von beiden erlaubt.
Zu diesem Zweck wählt man normalerweise die Oligonukleotide aus relativ konservierten Regionen des Genoms der nachzuweisenden Viren aus und verwendet dann die jeweilige Komplementärsequenz. Aus dem Stand der
Technik sind bereits einige hochkonservierte Regionen bekannt (siehe oben) .
Konservierte Regionen sind Nukleinsäureabschnitte auf dem Genom von
HIV, die im Vergleich zum Rest des Genoms nur sehr geringe Unterschiede in der Basensequenz aufweisen. In diesem Zusammenhang spricht man auch von Basenidentität, die in Prozent ausgedrückt wird, oder von
Homologie.
Überraschenderweise wurden nun in der vorliegenden Erfindung Oligonukleotide gefunden, die sowohl einen subtypübergreifenden Nachweis als auch einen speziesübergreifenden Nachweis von HIV ermöglichen. Diese Oligonukleotide hybridisieren mit neu entdeckten hochkonservierten Regionen von HIV. Diese befinden sich in der LTR-Region, dem gag- und dem po/-Gen. Diese Regionen sind relativ klein, sie erlauben mit einer durchschnittlichen Länge von 50 bis 100 Nukleotiden jedoch die Hybridisierung mit einem oder mehreren Oligonukleotiden. Die Festlegung der Regionen des HIV-Genoms basiert hierin, wie auch in den meisten zitierten Dokumenten des Stands der Technik, auf der Nummerierung des HIV-1 -lsolats HXB2, wie veröffentlicht in: Wong-Staal et al., Nature 313, 277-284 (1985). Die Sequenzen dieser neuen hochkonservierten Bereiche sind jeweils in den SEQ ID NO. 1 bis 13 angegeben, deren Sequenzen sich auf die Sequenz von HIV-1 HXB2, Zugangsnummer K03455 der HIV Sequence Data Base (http://HIV-web.lanl. gov./) beziehen. Die Lage der hochkonservierten Sequenzen ist wie folgt:
SEQ ID NO. 1 : LTR-Region, Position 504 - 565, Länge 62 Nukleotide SEQ ID NO. 2: gag-Gen, Position 761 - 822, Länge 62 Nukleotide
SEQ ID NO. 3: gag-Gen, Position 1786 - 1847, Länge 62 Nukleotide
SEQ ID NO. 4: po/-Region, Position 2307 - 2360, Länge 54 Nukleotide
SEQ ID NO. 5: pol-Gen, Position 2376 - 2434, Länge 59 Nukleotide
SEQ ID NO. 6: po/-Gen, Position 2568 -2632, Länge 65 Nukleotide
SEQ ID NO. 7: po/-Gen, Position 3093 - 3145, Länge 53 Nukleotide
SEQ ID NO. 8: pol-Gen, Position 4131 - 4207, Länge 77 Nukleotide
SEQ ID NO. 9: po/-Gen, Position 4333 -4399, Länge 67 Nukleotide
SEQ ID NO. 10: pol-Gen, Position 4638 - 4696, Länge 59 Nukleotide
SEQ ID NO. 1 1 : pσ/-Gen, Position 4884 - 4984, Länge 101 Nukleotide
SEQ ID NO. 12: po/-Gen, Position 5034 - 5095, Länge 62 Nukleotide
SEQ ID NO. 13: pol-Gen, Position 4410 - 4506, Länge 97 Nukleotide.
Die erfindungsgemäß geeigneten Oligonukleotide weisen bevorzugt Basensequenzen auf, die innerhalb der oben genannten hochkonservierten Regionen oder deren Komplementärsequenzen liegen.
Der Begriff "überlappen" soll hierin so verstanden werden, daß die erfindungsgemäßen Oligonukleotide jeweils mit mindestens 10 aufeinanderfolgenden Basen aus einer der hochkonservierten Regionen überlappen. Bevorzugt überlappen die Oligonukleotide mit jeweils einer der Regionen mit den SEQ ID NO: 4, 5, 9, 1 0 und 1 3, bevorzugt 4, 5, 9 und 10. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform überlappen die Oligonukleotide mit jeweils einer der Regionen mit den SEQ ID NO: 6, 8, 10, 1 1 und 1 3.
Obwohl die hochkonservierten Regionen in Bezug auf ein einziges HIV-1 - Virusisolat angegeben sind, weist natürlich der Begriff "hochkonservierte Region" über eine einzige spezifische Sequenz hinaus und umfasst somit alle entsprechenden Regionen von verschiedenen HIV-Stämmen oder -Isolaten, die mit HIV-1 oder mit HIV-2 verwandt sind. Erfindungsgemäß geeignete Oligonukleotidsequenzen können auch eine Basensequenz aufweisen, die eine Konsensussequenz aus hochkonservierten Regionen von mehreren Hl- Virusisolaten oder -stammen darstellt. D.h. dass beispielsweise eine Basenabfolge von mehreren Basen einem Hl-Virusisolat entspricht und eine weitere Basenabfolge im selben Oligonukleotid einem anderen Hl-Virusisolat entspricht. Das Oligonukleotid enthält dann heterologe Basenfolgen. Bevorzugt umfassen die Oligonukleotide jeweils mindestens 10 aufeinanderfolgende Nukleotide aus einer der zuvor genannten Regionen. Stärker bevorzugt enthalten sie 1 5 bis 30 solcher Nukleotide.
Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst mindestens die folgenden Schritte:
(a) Inkontaktbringen einer Probe mit dem/den Oligonukleotid(en) unter Bedingungen, bei denen eine Hγbridisierung des/der Oligonukleotide(s) mit in der Probe vorhandenen HIV-Nukleinsäuren, ausgewählt aus HIV-1 oder/und HIV-2, erfolgt,
(b) Bestimmen des Vorhandenseins oder/und der Menge von HIV- Nukleinsäuren in der Probe.
In Schritt (b) wird bevorzugt ein Amplifikationsschritt durchgeführt. In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäß der Erfindung wird der subtyp- oder/und speziesübergreifende Nachweis von Hl- Virusnukleinsäuren dadurch ermöglicht, dass mindestens zwei erfindungsgemäße Oligonukleotide verwendet werden. Bevorzugt werden diese Oligonukleotide als Amplifikationsprimer eingesetzt dergestalt, dass sie beispielsweise jeweils nahe an einem Ende einer der hochkonservierten Regionen hybridisieren und somit bei der Amplifikation (bevorzugt PCR) ein Amplifikationsprodukt erzeugen, welches einem Abschnitt der betreffenden hochkonservierten Region entspricht. Der Nachweis dieses Amplifikationsproduktes und somit der HIV-spezifischen Nukleinsäure kann dann mit Hilfe einer Sonde erfolgen, die entweder eines der als Primer verwendeten Oligonukleotide ist oder ein zusätzliches Oligonukleotid, welches innerhalb der amplifizierten Sequenz hybridisiert. Der Vorteil dieser bevorzugten Ausführungsform ist, dass ein einziges Oligonukleotid oder Primerpaar ausreicht, um subtyp- oder/und speziesübergreifend HI-Viren nachzuweisen.
Statt der Verwendung einer Sonde zum Nachweis des Amplifikationsprodukts können auch beispielsweise DNA-bindende Reagenzien, wie etwa ein DNA-bindender Farbstoff (z.B. Sybergreen) bei der Detektion verwendet werden (WO97/46707).
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung werden Oligonukleotidkombinationen oder Primerpaare verwendet, von denen jeweils nur ein Oligonukleotidprimer innerhalb einer der konservierten Regionen liegt, während der andere Primer außerhalb liegt, so daß das so erzeugte Amplifikationsprodukt nur teilweise aus einer Basensequenz aus einer der hochkonservierten Regionen besteht. Der letztere Primer ist bevorzugt subtypspezifisch und/oder speziesspezifisch, so daß mit einer derartigen Kombination Subtypen oder die Spezies gezielt nachgewiesen werden können. In diesem Fall werden bevorzugt zwei oder mehr Primerpaare als Oligonukleotidkombination verwendet, wobei mindestens zwei Oligonukleotide jeweils mindestens 10 aufeinanderfolgende Nukleotide aus einer Sequenz (i), (ii), (iii) oder dazu komplementären Sequenzen, wie oben beschrieben, enthalten. Die Gesamtheit der Primerkombinationen erlaubt somit einen subtyp- oder/und speziesübergreifenden Nachweis von HI-Viren.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfaßt eine für das erfindungsgemäße Verfahren geeignete Oligonukleotidkombindation mindestens zwei, bevorzugt drei Oligonukleotide (z.B. ein Primerpaar oder ein Primerpaar plus Sonde), die jeweils mindestens 1 0 Nukleotide aus
(i) derselben hochkonservierten Region, des gag-Gens oder des po/-Gens von HIV, dargestellt durch eine der in SEQ ID NO: 1 bis 1 3 angegebenen Sequenzen, (ii) einer entsprechenden Region eines anderen Hl-Virusisolats,
(iii) einer entsprechenden Region einer aus mehreren Hl- Virusisolaten abgeleiteten Konsensussequenz, oder dazu komplementären Sequenzen enthalten.
Bevorzugt werden das mindestens eine und bevorzugt die mindestens zwei Oligonukleotid(e) so ausgewählt, dass sie einen subtypübergreifenden Nachweis von HIV-1 ermöglichen, d.h. dass Nukleinsäuren von mindestens 7 der Subtypen A, B, C, D, E, F, G, H und O von HIV-1 , bevorzugt von allen Subtypen erkannt werden.
Bevorzugt werden für den subtypübergreifenden Nachweis mindestens mindestens ein und bevorzugt mindestens zwei Oligonukleotid(e) verwendet, die jeweils mindestens 10 aufeinanderfolgende Nukleotide aus (i) einer hochkonservierten Region des LTR, gag-Gens oder pol- Gens von HIV, dargestellt durch eine der in SEQ ID NO: 1 , 2,
3, 4, 5, 6, 8, 9, 1 0, 1 2 und 1 3 angegebenen Sequenzen, (ii) einer entsprechenden Region eines anderen Hl-Virusisolats, (iii) einer entsprechenden Region einer aus mehreren Hl- Virusisolaten stammende Konsensussequenz, oder dazu komplementären Sequenzen enthalten.
Bevorzugt werden zum subtyp- oder/und speziesübergreifenden Nachweis von HIV-1 und HIV-2 mindestens ein und bevorzugt mindestens zwei Oligonukleotid(e) verwendet, diejeweils mindestens l Oaufeinanderfolgende Nukleotide aus
(i) einer hochkonservierten Region des LTR, gag-Gens oder poAGens von HIV, dargestellt durch eine der in SEQ ID NO: 1 , 2, 3, 4, 5, 7, 9, 10 und 1 3 angegebenen Sequenzen, (ii) einer entsprechenden Region eines anderen Hl-Virusisolats, (iii) einer entsprechenden Region einer aus mehreren Hl-Virusisolaten stammenden Konsensussequenz, oder dazu komplementären Sequenzen enthalten.
Es hat sich überraschenderweise gezeigt, dass ganz bestimmte Oligonukleotide besonders für das erfindungsgemäße Verfahren geeignet sind. Diese Oligonukleotide sind in den in SEQ ID NO: 14 bis 25 angegebenen Sequenzen dargestellt. Wie bereits eingangs erwähnt, können diese Oligonukleotide aus natürlichen oder synthetischen Nukleinsäurebausteinen bestehen, oder sogar aus der bereits genannten PNA. Bevorzugt trägt mindestens eines der in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Oligonukleotide eine oder mehrere Markierungen. Als Markierungen eignen sich Fluoreszenzmarker oder radioaktive Marker, wie z.B. [32P]-markierte Nukleotide.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Oligonukleotid, welches mindestens 10 aufeinanderfolgende Nukleotide aus (i) einer hochkonservierten Region des po/-Gens von HIV, dargestellt durch eine der in SEQ ID NO: 4, 5, 9 oder 10 angegebenen
Sequenzen, (ii) einer entsprechenden Region eines anderen Hl-Virusisolats, (iii) einer entsprechenden Region einer aus mehreren Hl-Virusisolaten stammenden Konsensussequenz, oder dazu komplementären Sequenzen, oder eine der in SEQ ID NO: 14 bis 25 dargestellten Sequenzen enthält.
Bevorzugt umfaßt oder ist das erfindungsgemäße Oligonukleotid eines der in den SEQ ID NO. 14 bis 25 dargestellten Oligonukleotide. Die Länge des erfindungsgemäßen Oligonukleotids beträgt bevorzugt 10 bis 80 Nukleotide. Besonders bevorzugt umfasst es ungefähr 20 bis 30 Basen und weist einen GC-Gehalt von zwischen 40 und 60 % auf. Außerdem ist es vorteilhaft, wenn die Oligonukleotide keine Selbstkomplementarität am 3'-Ende aufweisen und darüber hinaus keinen CG-Run am 3'-Ende besitzen. Ein GC- Run ist eine Basenabfolge, die vorwiegend oder ausschließlich aus den Basen C und G besteht. Weiterhin sollten die Oligonukleotide keine Palindrome beinhalten. Die erfindungsgemäßen Oligonukleotide weisen bevorzugt maximal 2 Mismatches zu den entsprechenden mit ihnen hybridisierenden Sequenzen der gleichen Positionen aller Subtypen auf. Bevorzugt weist ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid an seinem 3'-Ende keine Mismatches mit Nukleotidsäuren der Subtypen A, B, C, D, E, F, G, H und O von HIV-1 und/oder der Subtypen A, B, C und C von HIV-2 auf.
Bei Primerpaaren werden die Primer jeweils so gewählt, dass die 5'-Enden der Primer maximal 80 Basen voneinander entfernt positioniert sind, bezogen auf die Regionen, in denen die Primer auf der nachzuweisenden Nukleinsäure hybridisieren. Besonders bevorzugte Primerpaare sind solche, bei denen innerhalb dieses von den Primern amplifizierbaren Bereiches eine weitere HIV-spezifische Sequenz liegt. Diese Sequenz kann dann bevorzugt verwendet werden, um mit Hilfe einer für sie spezifischen Sonde die Amplifikationsprodukte nachzuweisen . Die erfindungsgemäßen Oligonukleotide sind bevorzugt mit mindestens einer der oben genannten Markierungsgruppen versehen. Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist somit auch eine Kombination von zwei oder mehr Oligonukleotiden, welche beide die oben genannten erfindungsgemäßen Eigenschaften aufweisen und die in ihrer Gesamtheit für den subtyp-und/oder speziesübergreifenden Nachweis von HI-Viren geeignet sind.
Weiterhin umfaßt die Erfindung Kombinationen von Oligonukleotiden. Bevorzugt sind Kombinationen aus mindestens zwei Oligonukleotiden, die jeweils mindestens 10 aufeinander folgende Nukleotide aus (i) derselben hochkonservierten Region der LTR-Region, des gag-
Gens oder des po/-Gens von HIV, dargestellt durch eine der in SEQ ID NO: 1 bis 1 3 angegebenen Sequenzen, (ii) einer entsprechenden Region eines anderen Hl-Virusisolats, (iii) einer entsprechenden Region einer aus mehreren Hl- Virusisolaten abgeleiteten Konsensussequenz, oder dazu komplementären Sequenzen enthalten.
Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine Kombination von mehreren Oligonukleotiden, wobei mindestens zwei erfindungsgemäße Oligonukleotide vorliegen, sowie weitere Oligonukleotide, welche jeweils eine für einen einzigen Subtyp von HIV-1 oder/und HIV-2 spezifische Sequenz enthalten, wobei die Gesamtheit der Oligonukleotide in der Oligonukleotidkombination einen subtyp- oder/und speziesübergreifenden Nachweis von HI-Viren erlaubt.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Reagenzienkits, der mindestens ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid oder eine erfindungsgemäße Oligonukleotidkombination als Primer oder als Sonden zum Nachweis von HI-Viren oder deren Nukleinsäuren, sowie zur Durchführung einer Hybridisierung und Amplifikation von Nukleinsäuren in einer Probe geeignete Mittel umfasst. Außerdem betrifft die Erfindung die Verwendung von Oligonukleotiden oder Oligonukleotidkombinationen als Primer oder/und Sonden zum Nachweis von HI-Viren, insbesondere zum subtyp- und/oder speziesübergreifenden Nachweis.
Die nachfolgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung in veranschaulichender, aber keinesfalls erschöpfender Weise erläutern.
Beispiele
Beispiel 1
Sensitivität, Spezifität und dynamischer Messbereich anhand einer HIV-
Plasma-Verdünnunosreihe
Zur Untersuchung von Blutproben wurde RNA aus HIV-positivem Plasma mit einer Ausgangskonzentration von 1 5.000 Genomäquivalenten (geq) HIV pro ml isoliert. Dieses Plasma wurde sukzessive um den Faktor 10 in negativem
Plasma verdünnt und nach Probenvorbereitung jeweils in
Doppelbestimmungen mitden entsprechenden Primerpaaren amplifiziert. Als
Kontrollen dienten ein HIV-negatives Plasma und Wasser. Zur Bestimmung der Spezifität wurde zusätzlich ein HBV- und ein HCV-positives Plasma mitprozessiert. Nach Amplifikation wurden alle Proben gemessen (ECL-
Detektion, Elecsys® 1010) .
1 . Probenvorbereitung: Zunächst wurden 420 μl Plasma mit 80 μl Proteinase K (25 mg/ml) gemischt und einige Sekunden gevortext. Dann wurden 500 μl Lysepuffer (5, 4M Guanidinium-Thiocyanat, 10 mM Harnstoff, 10 mM Tris-HCI, 20 % Triton X100, pH 4,4) hinzugegeben, der 1 μg Carrier-RNA (PolyA/ml) enthielt. Die Mischung wurde gevortext und anschließend für 10 Minuten bei Raumtemperatur geschüttelt. Dann wurden 500 μl Isopropanol-MGP hinzugegeben (6 mg magnetische Glaspartikel in Isopropanol). Das Gemisch wurde wieder gevortext und anschließend für 20 Minuten bei Raumtemperatur geschüttelt. Die MGPs wurden mittels Magnetseparation von der Lösung getrennt. Der Überstand wurde abgenommen und verworfen. 750 μl Waschpuffer (20 mM NaCI, 20 mM Tris-HCI, pH 7,5, 70 % Ethanol) wurden hinzugegeben, die MGPs wurden durch Vortexen resuspendiert, und es wurde eine erneute Magnetseparation durchgeführt. Der Waschvorgang wurde insgesamt 5 x wiederholt, und schließlich wurden 100 μl DEMC-Wasser zur Elution hinzugegeben. Es wurde 1 5 Minuten bei 80°C geschüttelt und dann eine weitere Magnetseparation durchgeführt. 10 μl des Eluats wurden für eine RT-PCR eingesetzt.
2. Verwendete Primer und Sonden:
In der nachfolgenden Tabelle 1 sind die verwendeten Primer und Sonden dargestellt sowie deren zugehörige hochkonservierte Region, Position im Genom und das mit Primerpaaren hergestellte Amplifikationsprodukt.
Tabelle 1
iese Primer sn ewe s pu zerte rmer un on en von öc e Diese Primer sind neue Primer aus der po/-Region des HIV-Genoms entsprechend den in Tabelle 1 genannten hochkonservierten Bereichen.
3. Amplifikationsmix und Thermocycler-Protokoll für die RT-PCR: Mastermix: Reagenzien Endkonzentration im Mastermix
5x Bicin-Puffer 1 x
MnOAc 2,5 mM dNTPs (einschließlich dUTP) 200 μM/600 μM
Vorwärtsprimer 0,3 μM
Rückwärtsprimer 0,3 μM
(biotinyliert)
Tth-Polymerase 10 Einheiten
UNG 2 Einheiten
Gesamtvolumen: 100 μl
Cycler:
10 Minuten, 37°C: UNG-Dekontaminierung
30 Minuten, 60°C, Reverse Transkription
30 Sekunden, 95°C: Denaturierung
5 Zyklen 1 5 Sekunden, 95°C: Denturierung
20 Sekunden, 50°C: Hybridisieren/Elongation
30 Zyklen 15 Sekunden, 94°C: Denaturierung 20 Sekunden, 60°C: Hybridisierung/Elongation 7 Minuten, 72°C: endgültige Elongation Halten bei 50°C
4. Detektion:
Die gesamte Detektionsreaktion erfolgte voll automatisiert mit Hilfe eines Elecsys® 1010-Analyse-Automaten.
Zunächst wurden 10 μl Amplifikat und 35 μl Denaturierungslösung (BM-ID- Nr. 1469053, Boehringer Mannheim) entnommen. In einem Reaktionsgefäß wurde für 5 Minuten bei 37°C inkubiert, und dann wurden 120 μl Hybridisierungslösung (BM-ID-Nr. 1469045, Boehringer Mannheim versetzt mit 25 ng/ml Ruthenium-markierter Sonde) hinzugegeben. Es wurde wiederum für 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Dann wurden 35 μl einer Elecsys® SA Magnetbeadlösung hinzugegeben (BM-ID-Nr. 1 71 9556, Boehringer Mannheim). Die Lösung wurde für 10 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Elektrochemilumineszenz von 1 20 μl des Reaktionsgemisches wurde in der Elecsys® 1 010-Messzelle gemessen. Zur Hybridisierung wurden die entsprechenden Ruthenium-markierten Sonden laut Tabelle 1 verwendet.
5. Ergebnisse
Ergebnis (ECL-counts x 100) :
Die Signale der neuen Primer zeigen gegenüber den Referenzen eine ähnliche Sensitivität. Es erfolgt eine sehr gute Signalabstufung innerhalb der Verdünnungsreihe.
Der erhöhte Background bei den Primerpaaren SK und GH-A3 ist vermutlich auf ein nicht optimales Amplifikationsprotokoll zurückzuführen. SEQUENZPROTOKOL
(1) ALLGEMEINE ANGABEN:
(i) ANMELDER:
(A) NAME : Boehringer Mannheim GmbH
(B) STRASSE: Sandhofer Strasse 112-132
(C) ORT: Mannheim-Waldhof (E) LAND: DE
(F) POSTLEITZAHL: 68305
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Neue Primer und Sonden zum Nachweis von HIV
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 25 .
(iv) COMPUTER-LESBARE FASSUNG:
(A) DATENTRÄGER: Floppy disk (B) COMPUTER: IBM PC co patible
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version #1.30 (EPA)
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 1:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 62 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid (C) STRANGFORM: beides
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 1: AGGGAACCCA CTGCTTAAGC CTCAATAAAG CTTGCCTTGA GTGCTTCAAG TAGTGTGTGC 60
CC 62
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 2:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 62 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: beides (D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 2: TTTGACTAGC GGAGGCTAGA AGGAGAGAGA TGGGTGCGAG AGCGTCAGTA TTAAGCGGGG 60
GA 62
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 62 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: beides (D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 3: ATTTTAAAAG CATTGGGACC AGCGGCTACA CTAGAAGAAA TGATGACAGC ATGTCAGGGA 60 GT 62 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 4:
(i) SEQUENZ-KENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 54 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: beides
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 4: CTAAAGGAAG CTCTATTAGA TACAGGAGCA GATGATACAG TATTAGAAGA AATG 54
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 5: (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 59 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: beides
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 5: TGGAAACCAA AAATGATAGG GGGAATTGGA GGTTTTATCA AAGTAAGACA GTATGATCA 59 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 6:
(i) SEQUENZKENNZEICHΞN:
(A) LÄNGE: 65 Basenpaare (B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: beides
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) ΞEQUENZBESCHREIBUNG : SEQ ID NO: 6:
ACTGTACCAG TAAAATTAAA GCCAGGAATG GATGGCCCAA AAGTTAAACA ATGGCCATTG 60 ACAGA 65
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 7:
(i) SEQUΞNZKENNZEICHEN :
(A) LÄNGE: 53 Basenpaare (B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: beides
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7:
CAATACATGG ATGATTTGTA TGTAGGATCT GACTTAGAAA TAGGGCAGCA TAG 53
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 8:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 77 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: beides (D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 8: AAGGAAAAGG TCTATCTGGC ATGGGTACCA GCACACAAAG GAATTGGAGG AAATGAACAA 60 GTAGATAAAT TAGTCAG 77 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 9:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 67 Basenpaare (B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: beides
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 9:
AAATAGTAGC CAGCTGTGAT AAATGTCAGC TAAAAGGAGA AGCCATGCAT GGACAAGTAG 60 ACTGTAG 67
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 10:
(i) SΞQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 59 Basenpaare (B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: beides
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 10:
CAGGAATTTG GAATTCCCTA CAATCCCCAA AGTCAAGGAG TAGTAGAATC TATGAATAA 59
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 11:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 101 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: beides (D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 11: AAAATTCAAA ATTTTCGGGT TTATTACAGG GACAGCAGAA ATCCACTTTG GAAAGGACCA 60
GCAAAGCTCC TCTGGAAAGG TGAAGGGGCA GTAGTAATAC A 101
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 12:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 62 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: beides (D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 12: AGGGATTATG GAAAACAGAT GGCAGGTGAT GATTGTGTGG CAAGTAGACA GGATGAGGAT 60
TA 62
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 13:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 97 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: beides (D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 13:
TGGCAACTAG ATTGTACACA TTTAGAAGGA AAAGTTATCC TGGTAGCAGT TCATGTAGCC 60 AGTGGATATA TAGAAGCAGA AGTTATTCCA GCAGAAA 97
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 14:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 14:
TACCTGGCAT GGGTACCAGC 20 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 15:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 26 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid (C) STRANGFORM: EinzelStrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 15: GACTAATTTA TCTACTTGTT CATTTC 26
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 16: (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 18 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 16:
CACACAAAGG AATTGGAG 18
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 17:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare (B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE : linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 17:
TTTGGAATTC CCTACAATCC 20
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 18:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 26 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 18: AATTCTTTAT TCATAGATTC TACTAC 26 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 19:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 15 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid (C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 19:
CCCAAAGTCA AGGAG 15
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 20: (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 24 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 20:
TCAAAATTTT CGGGTTTATT ACAG 24
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 21:
( i ) SEQUENZKENNZEICHEN :
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare (B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 21:
AGCTTTGCTG GTCCTTTCCA 20
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 22:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 19 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SΞQUENZBΞSCHREIBUNG : SEQ ID NO: 22: GGACAGCAGA AATCCACTT 19
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 23:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: 26 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 23: GCAACTAGAT TGTACACATT TAGAAG 26 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 24:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 25 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid (C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 24:
CTTCTATATA TCCACTGGCT ACATG 25
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 25: (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 23 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 25:
GAAAAGTTAT CCTGGTAGCA GTT 23

Claims

Ansprüche
1 . Verfahren zum subtyp- und/oder speziesübergreifenden Nachweis von Nukleinsäuren von HI-Viren in einer Probe durch
Hybridisierung der Nukleinsäuren mit einer Oligonukleotidkombination, umfassend zwei oder mehr mit HIV-Nukleinsäuren spezifisch hybridisierende Oligonukleotide, die jeweils 10 bis 80 aufeinanderfolgende Nukleotide aus (i) derselben hochkonservierten Region der LTR-Region, des gag-
Gens oder des po/-Gens von HIV, dargestellt durch eine der in SEQ ID NO: 1 bis 13 angegebenen Sequenzen, (ii) einer entsprechenden Region eines anderen Hl-Virusisolats, (iii) einer entsprechenden Region einer aus mehreren Hl- Virusisolaten abgeleiteten Konsensussequenz, oder dazu komplementären Sequenzen umfassen, und Durchführung eines enzymatischen Amplifikationsschritr.es.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß es die Schritte umfaßt:
(a) Inkontaktbringen einer Probe mit den Oligonukleotiden unter Bedingungen, bei denen eine Hybridisierung der Oligonukleotide mit in der Probe vorhandenen HIV- Nukleinsäuren aus HIV-1 oder/und HIV-2, erfolgt,
(b) Bestimmen des Vorhandenseins und/oder der Menge von HIV- Nukleinsäuren in der Probe.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß eine einzige Oligonukleotidkombination verwendet wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß zum subtypübergreifenen Nachweis die Oligonukleotide so ausgewählt werden, daß mindestens 7 der Subtypen von HIV-1 , ausgewählt aus den Subtypen A, B, C, D, E, F, G, H und O mindestens 2 der Subtypen von HIV-2, ausgewählt aus den Subtypen A, B, C und D detektiert werden.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß zum speziesübergreifenden Nachweis die Oligonukleotide so ausgewählt werden, daß mindestens 7 der Subtypen von HIV-1 , ausgewählt aus den Subtypen A, B, C, D, E, F, G, H und O, sowie zusätzlich mindestens einer der Subtypen von HIV-2, ausgewählt aus den Subtypen A, B, C und D detektiert werden.
6. Verfahren zum subtyp- und/oder speziesübergreifenden Nachweis von Nukleinsäuren von HI-Viren in einer Probe durch Hybridisierung der Nukleinsäuren mit zwei oder mehr Oligonukleotidkombinationen, jede Oligonukleotidkombination umfassend ein erstes Oligonukleotid, das 1 0 bis 80 aufeinanderfolgende Nukleotide
(i) einer hochkonservierten Region der LTR-Region, des gra^-Gens oder des poΛGens von HIV, dargestellt durch eine der in SEQ ID NO: 1 bis 1 3 angegebenen Sequenzen,
(ii) einer entsprechenden Region eines anderen Hl-Virusisolats, (iii) einer entsprechenden Region einer aus mehreren Hl- Virusisolaten abgeleiteten Konsensussequenz, oder dazu komplementären Sequenzen umfaßt, und ein zweites Oligonukleotid, das eine subtyp- und/oder speziesspezifische
Hybridisierung mit HIV-Nukleinsäuren ermöglicht, und Durchführen eines enzymatischen Amplifikationsschrittes, wobei die Gesamtheit der Oligonukleotidkombinationen einen subtyp- und/oder speziesübergreifenden Nachweis von HI-Viren erlaubt.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß zum subtypübergreifenen Nachweis die Oligonukleotide so ausgewählt werden, daß mindestens 7 der Subtypen von HIV-1 , ausgewählt aus den Subtypen A, B, C, D, E, F, G, H und O mindestens 2 der Subtypen von HIV-2, ausgewählt aus den Subtypen A, B, C und D detektiert werden.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß zum Nachweis mindestens zwei Oligonukleotide verwendet werden, die jeweils 1 0 bis 80 aufeinanderfolgende Nukleotide aus
(i) einer hochkonservierten Region des LTR, ^a^-Gens oder pol- Gens von HIV, dargestellt durch eine der in SEQ ID NO: 2, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 1 2 und 1 3 angegebenen Sequenzen, (ii) einer entsprechenden Region eines anderen Hl-Virusisolats, (iii) einer entsprechenden Region einer aus mehreren Hl-
Virusisolaten stammende Konsensussequenz, oder dazu komplementären Sequenzen umfassen.
9. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß zum speziesübergreifenden Nachweis die Oligonukleotide so ausgewählt werden, daß mindestens 7 der Subtypen von HIV-1 , ausgewählt aus den Subtypen A, B, C, D, E, F, G, H und O, sowie zusätzlich mindestens einer der Subtypen von HIV-2, ausgewählt aus den Subtypen A, B, C und D detektiert werden.
0. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß zum Nachweis mindestens zwei Oligonukleotide verwendet werden, die jeweils 10 bis 80 aufeinanderfolgende Nukleotide aus (i) einer hochkonservierten Region des LTR, <7a<7-Gens oder pol-
Gens von HIV, dargestellt durch eine der in SEQ ID NO: 1 , 2, 3, 4, 5, 7, 9, 10 und 13 angegebenen Sequenzen, (ii) einer entsprechenden Region eines anderen Hl-Virusisolats, (iii) einer entsprechenden Region einer aus mehreren Hl- Virusisolaten stammenden Konsensussequenz, oder dazu komplementären Sequenzen umfassen.
1 . Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Oligonukleotide die in SEQ ID NO. 14 bis 25 angegebenen
Sequenzen aufweisen oder enthalten.
2. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Oligonukleotid eine oder mehrere Markierungen aufweist.
3. Oligonukleotid, dadurch gekennzeichnet, daß es 10 bis 80 aufeinanderfolgende Nukleotide aus
(i) einer hochkonservierten Region des poΛGens von HIV, dargestellt durch eine der in SEQ ID NO: 4, 5, 9 oder 10 angegebenen Sequenzen, (ii) einer entsprechenden Region eines anderen Hl-Virusisolats, (iii) einer entsprechenden Region einer aus mehreren Hl-
Virusisolaten stammenden Konsensussequenz, oder dazu komplementären Sequenzen umfaßt, mit der Maßgabe, daß es nicht die Nukieotidsequenz CTACTACTCC TTGACTTTGG GGATTG oder deren Komplementärsequenz umfaßt.
14. Oligonukleotid nach Anspruch 1 3, dadurch gekennzeichnet, daß es 10 bis 80 aufeinanderfolgende Nukleotide aus (i) einer hochkonservierten Region des poΛGens von HIV, dargestellt durch eine der in SEQ ID NO: 4, 5 oder 9 angegebenen Sequenzen,
(ii) einer entsprechenden Region eines anderen Hl-Virusisolats, (iii) einer entsprechenden Region einer aus mehreren Hl- Virusisolaten stammenden Konsensussequenz, oder dazu komplementären Sequenzen umfaßt.
1 5. Oligonukleotid, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens eine der in SEQ ID NO. 14, 1 6, 1 7, 1 8, 20, 22, 23, 24 und 25 dargestellten Sequenzen umfaßt.
1 6. Oligonukleotid nach einem der Ansprüche 1 3 bis 1 5, dadurch gekennzeichnet, daß es an seinem 3'-Ende keine Mismatches mit Nukleinsäuren der Subtypen A, B, C, D, E, F, G, H und O von HIV-1 und der Subtyen A, B, C und D von HIV-2 aufweist.
17. Oligonukleotid nach einem der Ansprüche 1 3 bis 1 6, dadurch gekennzeichnet, daß es eine oder mehrere Markierungen aufweist.
1 8. Kombination von mehreren Oligonukleotiden, umfassend mindestens zwei Oligonukleotide, dadurch gekennzeichnet, daß die mindestens zwei Oligonukleotide jeweils 10 bis 80 aufeinanderfolgende Nukleotide aus
(i) derselben hochkonservierten Region der LTR-Region, des gag- Gens oder des po/-Gens von HIV, dargestellt durch eine der in
SEQ ID NO: 1 bis 13 angegebenen Sequenzen,
(ii) einer entsprechenden Region eines anderen Hl-Virusisolats,
(iii) einer entsprechenden Region einer aus mehreren Hl- Virusisolaten abgeleiteten Konsensussequenz, oder dazu komplementären Sequenzen umfassen und die
Kombination so ausgewählt ist, daß sie eine enzymatische
Amplifikation erlaubt.
19. Kombination von mehreren Oligonukleotiden, umfassend mindestens zwei Oligonukleotide, ausgewählt aus den Oligonukleotiden nach einem der Ansprüche 13 bis 17, und gegebenenfalls weitere Oligonukleotide, welche jeweils eine für einen einzigen Subtyp von HIV-1 und/oder HIV-2 spezifische Sequenz enthalten, wobei die Gesamtheit der Oligonukleotide einen subtyp- und/oder speziesübergreifenden Nachweis von HI-Viren erlaubt.
20. Reagenzienkit umfassend ein Oligonukleotid nach einem der Ansprüche 13 bis 17 oder eine Oligonukleotidkombination nach Anspruch 18 oder 19 als Primer und/oder Sonden zum Nachweis von HI-Viren oder deren Nukleinsäuren, sowie zur Durchführung einer
Hybridisierung und Amplifikation von Nukleinsäuren in einer Probe geeignete Mittel.
21 . Verwendung von Oligonukleotiden oder Oligonukleotidkombinationen nach einem der Ansprüche 13 bis 1 9 als Primer und/oder Sonden zum subtyp- und/oder speziesübergreifenen Nachweis von HI-Viren.
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