WO2000024929A2 - Über lineare amplifikation vermittelte pcr (=lam pcr) - Google Patents

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WO2000024929A2
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Christof Von Kalle
Manfred Schmidt
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Christof Von Kalle
Manfred Schmidt
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates
    • C12Q1/6855—Ligating adaptors

Definitions

  • the invention relates to a highly sensitive method for identifying and / or sequencing an unknown DNA or RNA sequence which is adjacent to a known DNA or RNA region.
  • PCR method has greatly enriched DNA amplification and analysis. Using this method, it has become possible to duplicate and detect DNA fragments, even if they are only present in small amounts. There are now a large number of variants of the PCR method that are suitable for a wide variety of problems. However, a disadvantage of known methods is that the detection, characterization and definition of unknown DNA regions, which can be of viral, transgenic or genomic origin, can only be carried out to a limited extent.
  • a DNA fragment is split into its two strands, then two primers are added, one of which binds to one end of one strand and the other binds to the other end of the other strand and then becomes the strands are each filled in using a polymerase, double strands being obtained again, which in turn are cleaved and can in turn be used for the propagation.
  • DNA can be expanded exponentially.
  • the two ends of the DNA must be known in order to be able to provide primers for it. However, this is often not the case, especially if you want to demonstrate insertion and integration sites, transposons, transgenic areas and the like.
  • a variant in order to amplify nucleotide fragments, the sequence of which is only partially known, various variants of the PCR have been proposed.
  • a variant called inverse PCR (Silver and Keerikatte, J. Virol 63 (1989), 1924-1928), consists in cutting the DNA with restriction enzymes in such a way that "sticky ends” (sticky ends), which are cyclized into a ring, in which case this ring DNA is amplified.
  • blunty ends blunty ends
  • two primers can be used which are complementary to the known part of the sequence and differ only in their orientation.
  • LM-PCR ligation-mediated PCR; Müller and Wold, Science 246 (1989), 780-786.
  • the DNA is cut with restriction enzymes so that blunt ends are formed.
  • a linker cassette of known sequence is then added to the end of the unknown DNA fragments.
  • linker cassettes are used which consist of two non-phosphorylated oligonucleotides and have only one blunt end due to the different fragment lengths. The ligation is thus directed only between the linker cassette and the unknown end of the target DNA.
  • a primer can be used which is bindable with this linker, and another primer which is bindable with the known part of the DNA sequence.
  • a primer is then added which is complementary to the beginning of the known sequence and is made up to a double strand. Since this primer can only bind to one strand, only one of the two strands is duplicated.
  • the newly synthesized DNA is then used as a template in the subsequent cycles of the PCR reaction, in which case two primers are used, first the primer used in the first stage, which specifically binds with the known DNA, and second a primer that binds to the linker. In this way, the DNA fragment containing the gene sought is duplicated.
  • This method also suffers from the disadvantages that the sensitivity and specificity are low due to preparative losses. Characterization of single or also multiple insertion flanks at the single cell level and / or within a complex DNA mixture is not possible with the known methods.
  • This object is achieved with a method for the detection of a partially known DNA or RNA sequence, in which one
  • step (c) is carried out so that it is not cut within the known part of the target DNA sequence; see for example step (v) in FIG. 1.
  • the principle of the invention is that the target sequence is linearly multiplied with a specific oligonucleotide immediately after the DNA or RNA has been released from one or more cells. Only one phmer is used in this step, which binds to the known part of the nucleotide sequence to be amplified.
  • the selected primer is based on the known DNA or RNA sequence, complementary nucleotide building blocks attach and are linked to one another via a thermostable DNA polymerase.
  • DNA-dependent DNA polymerases e.g. Taq-DNA polymerase, Pfu-DNA polymerase
  • RNA-dependent DNA polymerases e.g. reverse transcriptase
  • This reaction step i.e. the construction of a complementary strand is repeated many times, e.g. 10 to 100 times, especially 30 to 70 times.
  • the sequence of the resulting DNA strands is made up of the known and the subsequent unknown DNA region. Contrary to conventional PCR methods for exponential
  • Multiplication of nucleic acids in the method according to the invention in the first stage only one primer is used. After these linear PCR steps have been carried out, the reaction mixture is purified to enable the next preparative step.
  • This purification can be carried out in a manner known per se, e.g. by shepherd extraction, precipitation with EtOH, application of a silica matrix or glass balls or by concentration steps.
  • one or more DNA fragments or RNA fragments are subjected to one or more linear PCR steps using one or more primers, the primer (s) being provided with a partner of a specifically binding pair,
  • step (d) is carried out so that it is not cut within the known part of the target DNA sequence; see for example step (v) in FIG. 1.
  • a primer which has one partner of a specific binding pair, the other partner of the specific binding pair being used to then separate the strands from the reaction solution.
  • the strand provided with a partner of a specific binding pair is then separated by adding the other partner of the specific binding pair, the second partner used for the separation preferably on balls, a column matrix or the surface coating of Tube is immobilized.
  • Specific binding pairs are well known in the field of biotechnology. The best known and most commonly used pair is the combination of biotin and avidin or streptavidin.
  • the primer is therefore biotinylated and avidin or streptavidin immobilized on beads or on the surface of the tube.
  • the beads which have the avidin or streptavidin immobilized are magnetic, so that they can be separated from the solution even more easily.
  • the strand carrying the biotinylated primer is removed from the reaction mixture and freed from the unreacted compounds.
  • several washing steps are carried out in the usual way.
  • the target DNA immobilized via the specifically binding pair can then be further bound to the solid phase in order to ultimately be able to carry out an exponential PCR for detection or detection.
  • the strands are first filled into double strands. This can be done by hexanucleotide priming. A mixture of different hexanucleotides differing in the nucleotide composition is used, which attach to complementary sequences of the target nucleotide sequence. The double strand is completed by a polymerase (eg Klenow polymerase).
  • a possible alternative to hexanucleotide priming is the direct application of degenerate primers, a mixture of primers differing in the nucleotide sequence (eg 20'mers).
  • the target DNA is now delimited by the known, uncut end and the unknown, cut end.
  • a linker cassette of known sequence can then be added to the cut end of the target DNA.
  • Another option is to perform polynucleotide tailing. In this step, the same nucleotides are strung together at the 3 'end of the target DNA using a specific enzyme (e.g. poly (A) tailing).
  • the double strand thus obtained, i.e. the target DNA modified in this way can then be amplified in a conventional PCR method. It has a known sequence on both sides, for which primers can then be provided.
  • the double strands containing the target DNA are provided at one end or at both ends with a double-stranded oligonucleotide, the nucleotide sequence of which is known.
  • suitable oligonucleotides are linker cassettes.
  • poly (A, T, G or C) tailing can also be carried out.
  • the strands are denatured in a manner known per se, i.e. split into single strands, and then performed a first exponential multiplication of the DNA strands.
  • at least two primers are used, one of which binds with the known part of the target DNA, while the other is complementary to the oligonucleotide with a known sequence.
  • the method according to the invention it is possible to achieve a sensitivity and specificity not previously achieved.
  • the method according to the invention is excellently suitable for duplicating and analyzing DNA fragments, of which only a part of the sequence is known.
  • the LAM-PCR method provided according to the invention can be transferred to any target sequence, be it transgenic, viral, retroviral or genomic origin, simply by selecting specific primers. Due to the high resolution, rapid screening of multiple insertion edges within a sample with the smallest amount of DNA is possible. Labeling and gene therapy studies are also possible with the method according to the invention. Not only clonality analyzes can be carried out, but also pure snapshots, e.g. in the case of hematopoietic repopulation after a transplant, a competition between retroviral marked cells of the transplant and cells remaining in the body and cell rows and cell generations can be followed, for example in hematopoiesis. Furthermore, an analysis of preferred integration sites of retro and lentivation ("target site selection”) is possible. The method according to the invention is also suitable as a selection method for finding transcriptionally active areas and for analyzing various substances with regard to the promotion or inhibition of retroviral integration.
  • transposons in insertion mutagenesis and for "bacterial strain typing" e.g. the procedure can be used for Mykobacterium tuberculosis.
  • Transgenic plants and animals can also be examined. The method is suitable for resistance gene localization in crop plants and transgene analysis in young animals without subsequent mortality.
  • genomic DNA from HeLa cell clones was analyzed, which were transduced with the vector pLN derived from murine leukemia virus. 10 pg of genomic DNA per transduced HeLa clone within a mixture of 1 ⁇ g of non-transduced genomic DNA, equivalent to a DNA amount of 1.5 cells with a diploid genome, were sufficient to detect the existing retroviral integration flanks. This corresponds to a resolution of more than 0.001%.
  • the invention is further illustrated by the following examples, which represent the results of in vivo clonality analyzes (characterization of the retroviral integration sites) of the peripheral blood carried out with the LAM-PCR method according to the invention.
  • the figures show:
  • High-resolution gel electrophoresis (Spreadexgel EL 1200) of an in vivo clonality analysis from the peripheral blood of a rhesus monkey (Example 2) LAM-PCR analysis of 10 ng and 100 ng DNA from granulocytes and mononuclear cells 180 days after transplantation. ( * ): 40 ⁇ ⁇ concentrated (80%) analysis product. G: granulocytes. MNC: mononuclear cells. M: 100 bp ladder.
  • Rhesus monkey model DNA sequence analysis of retroviral 5'LTR
  • Example 1 Clonal analysis of transduced human hematopoietic stem cells by characterization of the retroviral integration sites.
  • a retroviral integration analysis of transduced hematopoietic cells was carried out in the course of a clinical gene labeling study.
  • Peripheral blood stem cells (PBS) from a CML patient chronic myeloid leukemia
  • PBS peripheral blood stem cells
  • pLN Miller and Rosmann, Biotechniques 7 (1989), 980-982
  • MLV Moloney Murine Leukemia
  • the target sequences were linearly multiplied (linear PCR) immediately after the DNA was released from the cells with specific, biotinylated oligonucleotides; see also the diagram in FIG. 1.
  • the amplification step was repeated 50 times. In contrast to normal PCR, only one primer was used. Because the primer is biotinylated, the amplified DNA sequences bound to paramagnetic beads that were coupled with streptavidin. The strand complementary to the DNA strand coupled to the beads was constructed using hexanucleotide priming. The now double-stranded DNA was cut with the restriction enzyme Sse9l, which creates cohesive ends. A so-called linker cassette was attached to this target DNA and connected by means of a ligase reaction. The linker cassette is a partially double-stranded oligonucleotide. The 11
  • Target DNA was then denatured and amplified using the PCR reaction.
  • a primer was chosen so that it attaches to the already known DNA region.
  • the other primer attaches to the linker cassette.
  • 10% of the product formed in this way was subjected to a 1st PCR with 28 cycles, a primer used from the known DNA region likewise being added in biotinylated form.
  • This first PCR product was separated using "Magnetic Capture”.
  • Heia cells -K control with water
  • Example 2 Klonaie analysis of transduced hematopoietic stem cells by characterizing the retroviral integration sites in the rhesus monkey model.
  • the experiments were carried out as indicated in Example 1, but with the following differences:
  • the retroviral integration analysis was carried out on the rhesus monkey model.
  • the clonality product obtained was not detected by Southern blot, but rather separated in a high-resolution plastic gel, photographically documented using UV light after EtBr staining (FIG. 3), and the DNA fragments isolated and sequenced from the gel (FIG. 4).
  • FIG. 4 shows the retroviral integration sites in a total of 45 different samples.

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Abstract

Es wird ein hochsensitives Verfahren zur Identifikation und/oder Sequenzierung einer unbekannten DNA- oder RNA-Sequenz beschrieben, die an eine bekannte DNA- oder RNA-Region angrenzt, bei dem man (a) in einer ersten Stufe ein oder mehrere DNA- oder RNA-Fragmente einer oder mehrerer linearen PCR-Stufen unter Verwendung eines oder mehrerer Primer unterzieht (b) die erhaltenen Einzelstränge zu Doppelsträngen auffüllt (c) die Doppelstränge mit einem oder mehreren Restriktionsenzymen schneidet, um glatte und/oder kohäsive Enden zu erzeugen (d) an die geschnittenen Enden ein Oligonukleotid bekannter Sequenz anfügt und (e) die erhaltenen DNA-Fragmente vermehrt und nachweist.

Description

ÜBER LINEARE AMPLIFIKATION VERMITTELTE PCR (=LAM PCR)
Die Erfindung betrifft ein hochsensitives Verfahren zur Identifikation und/oder Sequenzierung einer unbekannten DNA oder RNA-Sequenz, die an eine bekannte DNA- oder RNA-Region angrenzt.
Die Einführung des PCR-Verfahrens hat die DNA-Amplifikation und DNA-Analytik sehr bereichert. Unter Anwendung dieses Verfahrens ist es möglich geworden, DNA- Fragmente, auch wenn sie nur in geringer Menge vorliegen, zu vervielfältigen und nachzuweisen. Inzwischen gibt es eine Vielzahl von Varianten des PCR-Verfahrens, die für verschiedenste Problemstellungen geeignet sind. Allerdings ist ein Nachteil bekannter Verfahren, daß der Nachweis, die Charakterisierung und die Definition unbekannter DNA-Regionen, die viralen, transgenen oder genomischen Ursprungs sein können, nur begrenzt durchzuführen ist.
Bei dem PCR-Verfahren in seiner allgemeinsten Form wird ein DNA-Fragment aufgespalten in seine beiden Stränge, dann werden zwei Primer zugegeben, von denen einer an das eine Ende des einen Strangs und der andere an das andere Ende des anderen Strangs bindet und dann werden unter Verwendung einer Polymerase die Stränge jeweils aufgefüllt, wobei wieder Doppelstränge erhalten werden, die wiederum gespalten werden und wiederum für die Vermehrung eingesetzt werden können. Auf diese Weise kann DNA exponentiell vermehrt werden. Um jedoch diese Reaktion durchführen zu können, müssen die beiden Enden der DNA bekannt sein, um Primer dafür bereitstellen zu können. Dies ist jedoch häufig nicht der Fall, insbesondere, wenn man Insertions- und Integrationsstellen, Transposons Transgenbereiche und ähnliches nachweisen will.
Um Nucleotidfragmente zu amplifizieren, deren Sequenz nur zum Teil bekannt ist, wurden verschiedene Varianten der PCR vorgeschlagen. Eine Variante, als inverse PCR (Silver and Keerikatte, J. Virol 63 (1989), 1924-1928) bezeichnet, besteht darin, die DNA mit Restriktionsenzymen so zu schneiden, daß "klebrige Enden" (sticky ends) entstehen, die zu einem Ring cyclisiert werden, wobei dann diese Ring-DNA amplifiziert wird. In diesem Fall können zwei Primer verwendet werden, die zu dem bekannten Teil der Sequenz komplementär sind und sich nur in der Orientierung unterscheiden.
Eine weitere Variante für die Amplifikation von DNA-Bruchstücken, deren Sequenz man nur teilweise kennt, ist eine LM-PCR (Ligations-vermittelte PCR; Müller und Wold, Science 246 (1989), 780-786). Die DNA wird mit Restriktionsenzymen so geschnitten, daß stumpfe Enden entstehen. An das Ende der unbekannten DNA- Fragmente wird dann eine Linker-Kassette bekannter Sequenz angefügt. Für diese Methode werden Linker-Kassetten verwendet, die aus zwei nicht phosphorylierten Oligonukleotiden bestehen und durch unterschiedliche Fragmentlänge nur ein stumpfes Ende aufweisen. Die Ligation erfolgt so gerichtet nur zwischen Linker- Kassette und dem unbekannten Ende der Ziel-DNA. Für die PCR kann ein Primer verwendet werden, der mit diesem Linker bindefähig ist, und ein weiterer Primer, der mit dem bekannten Teil der DNA-Sequenz bindefähig ist.
Ein derartiges Verfahren wird beispielsweise von Guy Prod'hom et al. in "A Reliable Amplification Technique for the Characterization of Genomic DNA Sequences Flanking Insertion Sequences", FEMS Microbiology, Letters, 158 (1998) 75 bis 81 beschrieben. Dazu wird vor Durchführung des PCR-Verfahrens DNA, die ein zu amplifizierendes Gen enthält, geschnitten, dann an die Schnittstellen ein doppelsträngiger Linker in solcher Weise ligiert, daß der Linker unter den Ligierungsbedingungen stabil bleibt, aber unter den Bedingungen der PCR nach der Spaltung des Doppelstrangs bei jedem der beiden Einzelstränge jeweils an einem Ende der Linker abgespalten wird und auch nicht wieder religiert wird. Man setzt dann einen Primer zu, der komplementär ist zu dem Beginn der bekannten Sequenz und läßt zu einem Doppelstrang auffüllen. Da dieser Primer nur an einen Strang binden kann, wird nur einer der beiden Stränge dupliziert. Die neu synthetisierte DNA wird dann als Matrize in den nachfolgenden Zyklen der PCR-Reaktion verwendet, wobei dann zwei Primer eingesetzt werden, und zwar einmal der Primer, der in der ersten Stufe verwendet wurde, der spezifisch mit der bekannten DNA bindet, und als zweites ein Primer, der mit dem Linker bindet. Auf diese Weise wird das DNA-Fragment vervielfältigt, das das gesuchte Gen enthält.
Auch dieses Verfahren leidet noch unter den Nachteilen, daß aufgrund präparativer Verluste die Sensitivität und Spezifität gering sind. Eine Charakterisierung von einzelnen oder auch multiplen Insertionsflanken auf Einzelzellniveau und/oder innerhalb eines komplexen DNA-Gemisches ist mit den bekannten Verfahren nicht möglich.
Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein hochempfindliches Verfahren zum Nachweis, zur Charakterisierung und Definition unbekannter DNA- und RNA-Regionen, die viralen, transgenen oder genomischen Ursprungs sein können, die an bekannte Sequenzen angrenzen, bis auf Einzelzellniveau bereitzustellen.
Diese Aufgabe wird gelöst mit einem Verfahren zum Nachweis einer nur zum Teil bekannten DNA- oder RNA-Sequenz, bei dem man
(a) in einer ersten Stufe ein oder mehrere DNA- oder RNA-Fragmente einer oder mehrerer linearen PCR-Stufen unter Verwendung eines oder mehrerer Primer unterzieht,
(b) die erhaltenen Einzelstränge zu Doppelsträngen auffüllt,
(c) die Doppelstränge mit einem oder mehreren Restriktionsenzymen schneidet, um glatte und/oder kohäsive Enden zu erzeugen,
(d) an die geschnittenen Enden ein einzel- oder doppelsträngiges Oligonukleotid bekannter Sequenz anfügt, und
(e) die erhaltenen DNA-Fragmente mit bekannten Verfahren vermehrt und nachweist.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird also unter Verwendung eines PCR-Verfahrens durchgeführt. Vorzugsweise wird Schritt (c) so durchgeführt, daß nicht innerhalb des bekannten Teils der Ziel-DNA-Sequenz geschnitten wird; siehe beispielsweise Schritt (v) in Figur 1.
Das Prinzip der Erfindung besteht darin, daß die Zielsequenz unmittelbar nach Freisetzung der DNA oder RNA aus einer oder mehreren Zellen mit einem spezifischen Oligonukleotid linear vervielfacht wird. In dieser Stufe wird nur ein Phmer eingesetzt, der an den bekannten Teil der zu amplifizierenden Nucleotidsequenz bindet.
Der ausgewählte Primer setzt an der bekannten DNA- bzw. RNA-Sequenz an, komplementäre Nucleotidbausteine lagern sich an und werden über eine thermostabile DNA-Polymerase miteinander verknüpft. Für DNA-Sequenzen verwendet man DNA-abhängige DNA-Polymerasen (z.B. Taq-DNA-Polymerase, Pfu- DNA-Polymerase), für RNA-Sequenzen RNA-abhängige DNA-Polymerasen (z.B. Reverse Transkriptase). Dieser Reaktionsschritt, d.h. der Aufbau eines komplementären Stranges, wird vielfach wiederholt, z.B. 10- bis 100-fach, insbesondere 30- bis 70-fach. Die Sequenz der so entstandenen DNA-Stränge setzt sich aus der bekannten und der sich anschließenden unbekannten DNA-Region zusammen. Entgegen herkömmlichen PCR-Verfahren zur exponentiellen
Vervielfachung von Nucleinsäuren wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren in der ersten Stufe nur ein Primer verwendet. Nach der Durchführung dieser linearen PCR- Stufen wird das Reaktionsgemisch aufgereinigt, um den nächsten präparativen Schritt zu ermöglichen.
Diese Aufreinigung kann in an sich bekannter Weise erfolgen, z.B. durch Hirt- Extraktion, Ausfällung mit EtOH, Anwendung einer Silika-Matrix oder von Glaskugeln oder durch Konzentrierungsschritte.
Um jedoch die Sensitivität und Spezifität des Verfahrens zu erhöhen, wird bevorzugt die Abtrennung mit Hilfe eines spezifisch bindenden Paares durchgeführt, wobei der in der ersten Stufe verwendete Primer einen Partner eines spezifisch bindenden Paares gebunden trägt und nach Durchführung der linearen PCR mit Hilfe des zweiten spezifisch bindenden Partners die Einzelstränge (= Ziel-DNA) abgetrennt werden.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens werden daher
(a) in einer ersten Stufe ein oder mehrere DNA-Fragmente oder RNA-Fragmente einer oder mehreren linearen PCR-Stufen unter Verwendung eines oder mehrerer Primer unterworfen, wobei der oder die Primer mit einem Partner eines spezifisch bindenden Paares versehen ist,
(b) mit Hilfe des zweiten Partners des spezifisch bindenden Paares solche Einzelstrangfragmente, die den ersten bindenden Partner tragen, aus der Reaktionsmischung abtrennt,
(c) die erhaltenen Einzelstränge zu Doppelsträngen auffüllt,
(d) die Doppelstränge mit einem oder mehreren Restriktionsenzymen schneidet, um glatte und/oder kohäsive Enden zu erzeugen,
(e) an die geschnittenen Enden ein einzel- oder doppelsträngiges Oligonukleotid bekannter Sequenz anfügt, und
(f) die erhaltenen DNA-Fragmente mit bekannten Verfahren vermehrt und nachweist.
Vorzugsweise wird Schritt (d) so durchgeführt, daß nicht innerhalb des bekannten Teils der Ziel-DNA-Sequenz geschnitten wird; siehe beispielsweise Schritt (v) in Figur 1.
Für diese bevorzugte Ausführungsform wird ein Primer eingesetzt, der einen Partner eines spezifisch bindenden Paares aufweist, wobei der andere Partner des spezifisch bindenden Paares dazu verwendet wird, die Stränge dann aus der Reaktionslösung abzutrennen.
Nach der linearen Vervielfältigung der Zielsequenz wird dann der mit einem Partner eines spezifisch bindenden Paares versehene Strang durch Zugabe des anderen Partners des spezifisch bindenden Paares abgetrennt, wobei der zweite Partner, der zum Abtrennen verwendet wird, bevorzugt an Kugeln, eine Säulenmatrix oder der Oberflächenbeschichtung von Röhrchen immobilisiert ist. Spezifisch bindende Paare sind auf dem Gebiet der Biotechnologie weithin bekannt. Das bekannteste und am häufigsten eingesetzte Paar ist die Kombination aus Biotin und Avidin bzw. Streptavidin. In einer bevorzugten Ausführungsform wird daher der Primer biotinyliert und Avidin oder Streptavidin immobilisiert an Kügelchen oder der Oberfläche des Röhrchens eingesetzt. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind die Kügelchen, die das Avidin oder Streptavidin immobilisiert aufweisen, magnetisch, so daß sie noch leichter aus der Lösung abgetrennt werden können.
Mit Hilfe des immobilisierten Partners wird der den biotinylierten Primer tragende Strang aus der Reaktionsmischung entfernt und von den nicht umgesetzten Verbindungen befreit. Bevorzugt werden in üblicher Weise mehrere Waschschritte durchgeführt.
Die über das spezifisch bindende Paar immobilisierte Ziel-DNA kann dann festphasengebunden weiterbehandelt werden, um letztendlich eine exponentielle PCR durchführen zu können zum Nachweis bzw. zur Detektion. Dazu werden zuerst die Stränge aufgefüllt zu Doppelsträngen. Dies kann durch Hexanukleotidpriming erfolgen. Dabei wird ein Gemisch von verschiedenen, sich in der Nukleotidzusammensetzung unterscheidenden Hexanukleotiden verwendet, die sich an komplementäre Sequenzen der Ziel-Nukleotidsequenz anlagern. Durch eine Polymerase (z.B. Klenow-Polymerase) wird der Doppelstrang vervollständigt. Eine mögliche Alternative zum Hexanukleotidpriming besteht in der direkten Anwendung von degenerierten Primern, einem Gemisch von sich in der Nukleotidsequenz unterscheidenden Primern (z.B. 20'mere). Der Vervollständigung der Doppelstränge folgt der Verdau der Nukleotidsequenzen mit passenden Restriktionsenzymen, um glatte und/oder kohäsive Enden zu erzeugen. Die Restriktionsenzyme werden vorzugsweise so ausgewählt, daß sie nicht innerhalb des bekannten Teils der Ziel- DNA-Sequenz schneiden. Bevorzugt verwendet man Restriktionsenzyme mit einer Erkennungs- und Schnittsequenz von 4 Basenpaaren ("four cutter"). Diese Enzyme gewährleisten eine relativ kurze Fragmentlänge, da sie theoretisch alle 44 = 256 Basenpaare im Genom schneiden. Eine kurze DNA-Fragmentlänge gestaltet die nachfolgenden Reaktionsschritte effizienter.
Demnach wird die Ziel-DNA nun von dem bekannten, nicht geschnittenen Ende und dem unbekannten, geschnittenen Ende begrenzt. An das geschnittene Ende der Ziel-DNA kann dann eine Linkerkassette bekannter Sequenz angefügt werden. Eine weitere Möglichkeit ist die Durchführung eines Polynukleotid-Tailings. Bei diesem Schritt werden mit Hilfe eines spezifischen Enzyms gleiche Nukleotide an das 3'-Ende der Ziel-DNA aneinandergereiht (z. B. Poly(A)-Tailing). Der so erhaltene Doppelstrang, d.h. die so modifizierte Ziel-DNA, kann dann in einem PCR-Verfahren in üblicher Weise amplifiziert werden. Er weist auf beiden Seiten eine bekannte Sequenz auf, für die dann Primer bereitgestellt werden können.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die die Ziel-DNA enthaltenden Doppelstränge an einem Ende oder beiden Enden mit einem doppelsträngigen Oligonukleotid, dessen Nucleotidsequenz bekannt ist, versehen. Beispiele für geeignete Oligonukleotide sind Linker-Kassetten. Anstelle der Anknüpfung von Oligonukleotiden kann auch ein Poly(A, T, G oder C)-Tailing durchgeführt werden. Dann werden die Stränge in an sich bekannter Weise denaturiert, d.h. in Einzelstränge aufgespalten, und dann eine erste exponentielle Vervielfachung der DNA-Stränge durchgeführt. Hierzu werden mindestens zwei Primer verwendet, von denen einer mit dem bekannten Teil der Ziel-DNA bindet, während der andere komplementär zu dem Oligonucleotid mit bekannter Sequenz ist.
Im Anschluß an diese Amplifizierung können entweder noch weitere exponentielle PCR-Stufen, gegebenenfalls unter Verwendung anderer Primer durchgeführt werden, oder die DNA kann mit an sich bekannten Diagnoseverfahren untersucht werden. Für weitere exponentielle PCR-Stufen werden bevorzugt geschachtelte ("nested") Primer eingesetzt, die, bezogen auf die Lage der Primer der vorhergehenden PCR, innerhalb der DNA-Sequenz des ersten PCR-Produkts binden. Bevorzugt wird die DNA durch Gelelektrophorese, Sequenzierung oder Blotting-Verfahren weiter untersucht. Diese Verfahren sind dem Fachmann bekannt und bedürfen hier keiner näheren Erläuterung.
Es wurde gefunden, daß der Einsatz einer linearen Vervielfältigung im ersten Reaktionsschritt zur Vervielfachung des Ausgangsmaterials führt und auftretende Verluste in den nachfolgenden präparativen Schritten kompensiert. Bei einer 50- fachen Vervielfachung der Zielsequenz können bereits 98% der nachfolgend auftretenden Verluste ausgeglichen werden. Durch das erfindungsgemäße Verfahren kann überraschend eine unerwartet hohe Sensitivität und Spezifität erzielt werden, die durch eine Kombination der einzelnen Schritte nicht hätte erwartet werden können. Auch die in der bevorzugten Ausführungsform in der zweiten Stufe durchgeführte spezifische Abtrennung der Ziel-DNA führt zu einer weiteren Steigerung der Empfindlichkeit und Selektivität des erfindungsgemäßen Verfahrens, da durch das Abtrennen über spezifisch bindende Paare das Hintergrundrauschen sehr stark vermindert werden kann.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es möglich, eine bisher nicht erreichte Sensitivität und Spezifität zu erzielen. Darüber hinaus ist das erfindungsgemäße Verfahren ausgezeichnet geeignet, um DNA-Fragmente, von denen nur ein Teil der Sequenz bekannt ist, zu vervielfältigen und zu analysieren.
Durch die Kombination von linearer Amplifikation, spezifischen Selektions- und Amplifikationsschritten wird eine mit anderen Methoden nicht erreichbare Sensitivität und Spezifität erzielt. Außerdem ergibt sich infolge der Möglichkeit eines simultanen Nachweises multipler Insertionsflanken innerhalb eines Reaktionsgemisches eine enorme Kosten- und Zeitersparnis.
Das erfindungsgemäß bereitgestellte LAM-PCR-Verfahren kann einfach durch die Auswahl spezifischer Primer auf eine beliebige Zielsequenz, sei sie transgenen, viralen, retroviralen oder genomischen Ursprungs - übertragen werden. Aufgrund des hohen Auflösungsvermögens ist ein schnelles Screening multipler Insertionsflanken innerhalb einer Probe mit geringsten Mengen an DNA möglich. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren sind auch Markierungs- und Gentherapiestudien möglich. Es können nicht nur Klonalitätsanalysen, sondern auch reine Momentaufnahmen durchgeführt werden, z.B. bei der hämatopoietischen Repopulation nach einer Transplantation, einer Kompetition zwischen retroviralen markierten Zellen des Transplantats und im Körper verbliebenen Zellen und es können Zellreihen und Zellgenerationen verfolgt werden, z.B. bei der Hämatopoiese. Weiterhin ist eine Analyse von bevorzugten Integrationsstellen von Retro- und Lentivieren ("Target Site Selection") möglich. Das erfindungsgemäße Verfahren ist auch geeignet als Selektionsmethode zum Auffinden transkriptionell aktiver Bereiche und zur Analyse verschiedener Substanzen bezüglich der Förderung oder Hemmung der retroviralen Integration.
Auch zur Untersuchung von Transposons bei der Insertionsmutagenese und für ein "bacterial strain typing", z.B. bei Mykobacterium tuberkulosis ist das Verfahren anwendbar. Transgene Pflanzen und Tiere können ebenfalls untersucht werden. Das Verfahren eignet sich für eine Resistenz-Genlokalisation bei Kulturpflanzen und eine Transgenanalytik bei jungen Tieren ohne nachfolgende Mortalisierung.
Das erfindungsgemäße Verfahren wurde in den nachstehenden Beispielen zur simultanen Charakterisierung multipler retroviraler Integrationsflanken durchgeführt. Zunächst wurde genomische DNA aus HeLa-Zellklonen analysiert, die mit dem von murinem Leukämievirus abgeleiteten Vektor pLN transduziert wurden. 10 pg genomischer DNA pro transduziertem HeLa-Klon innerhalb eines Gemisches von 1 μg nicht transduzierter genomischer DNA, äquivalent einer DNA Menge von 1 ,5 Zellen mit diploidem Genom, waren ausreichend, um die vorhandenen retroviralen Integrationsflanken nachzuweisen. Dies entspricht einem Auflösungsvermögen von mehr als 0,001 %.
Die Erfindung wird weiter durch die folgenden Beispiele erläutert, die Ergebnisse von mit dem erfindungsgemäßen LAM-PCR-Verfahren durchgeführten in vivo Klonalitätsanalysen (Charakterisierung der retroviralen Integrationsstellen) des peripheren Bluts darstellen. Die Figuren zeigen:
Figur 1
Schematische Darstellung einer bevorzugten Ausführunqsform der erfindungs- gemäßen LAM-PCR
[i] Lineare PCR mit einem biotinylierten, vektorspezifischen Oligonukleotid. [ii] "Magnetic Capture". [iii] Festphasen-Hexanukleotidpriming. [iv] Festphasen- Restriktionsverdau. [v] Festphasen-Ligation gefolgt von alkalischer Denaturierung, [vi] 1. und 2. exponentielle PCR des nicht-biotinylierten DNA-Stranges, beispielsweise über "nested" PCR. LTRI: Primer für lineare PCR, der an bekannte Sequenz bindet, beispielsweise eine retrovirale LTR; LC: Linker- Kassetten; LC1 , LC2, LTRII, LTRIII: Primer für "nested" PCR.
Figur 2
Southern Blot einer in vivo Klonalitätsanalyse aus dem peripheren Blut eines CML Patienten (Beispiel 1 )
LAM-PCR-Analyse von jeweils 1 μg DNA zu verschiedenen Zeitpunkten nach Reinfusion. d8, d13, ..., d124: 8, 13, ..., 124 Tage nach Transplantation. d-7:7 Tage vor Reinfusion (negative Patientenkontrolle). +K: 20 pg DNA HeLa Klon 8 + 1 μg nicht transduzierte HeLa DNA (Positivkontrolle). M:DIG Marker VIII.
Figur 3
Hochauflösende Gelelektrophorese (Spreadexgel EL 1200) einer in vivo Klonalitätsanalyse aus dem peripheren Blut eines Rhesusaffen (Beispiel 2) LAM-PCR-Analyse von jeweils 10 ng und 100 ng DNA aus Granulozyten und mononukleären Zellen 180 Tage nach Transplantation. (*): 40 μ\ aufkonzentriertes (80 %) Analysenprodukt. G: Granulozyten. MNC: mononukleäre Zellen. M: 100 bp Leiter.
Figur 4
Rhesusaffenmodell: DNA-Sequenzanalyse retroviraler 5'LTR-
Integrationsflanken
Darstellung von 40 Nucleotiden der 5'LTR genomisch-proviralen Fusionssequenz. Die DNA-Sequenz der in 5'-3'-Richtung gelesenen ersten 10 Nukleotide der 5'LTR-Region der proviralen DNA ist unterstrichen abgebildet. G: Granulozyten, MNC: mononukleäre Zellen. 10
Beispiel 1 : Klonale Analyse von transduzierten humanen hämatopoietischen Stamm-Zellen durch Charakterisierung der retroviralen Integrationsstelien.
Es wurde eine retrovirale Integrationsanalyse von transduzierten hämatopoietischen Zellen im Laufe einer klinischen Genmarkierungsstudie durchgeführt. Periphere Blutstammzellen (PBS) eines CML-Patienten (chronische myeloische Leukämie) wurden transduziert mit einem retroviralen Vektor (pLN; Miller und Rosmann, Biotechniques 7 (1989), 980-982)), der auf MLV (Moloney Murine Leukemia) basiert. Nach Reinfusion der markierten Zellen wurde jeweils eine Fraktion des peripheren Blutes zu verschiedenen Zeiten analysiert im Hinblick auf das Vorhandensein von retroviralen Integrationsstellen.
Durch Southern Blot-Analyse konnte die Identität der aufgefundenen DNA-Fragmente bestätigt werden. Mit bisher bekannten Methoden können derartige Untersuchungen nicht durchgeführt werden. Eine weitere Analyse und Sequenzierung ermöglicht die Identifizierung von einzelnen gutartigen und bösartigen Stammzellklonen. Für die Analyse wurde folgendermaßen vorgegangen:
Zunächst erfolgte eine lineare Vervielfachung (lineare PCR) der Ziel-Sequenzen unmittelbar nach Freisetzung der DNA aus den Zellen mit spezifischen, biotinylierten Oligonukleotiden; siehe dazu auch das Schema der Figur 1.
Nach Zugabe der Primer, der Nukleotide und der Taq-Polymerase wurde der Amplifikationsschritt 50 Mal wiederholt. Im Unterschied zu der normalen PCR wurde nur ein Primer verwendet. Da der Primer biotinyliert ist, banden die amplifizierten DNA-Sequenzen an paramagnetische Kügelchen, die mit Streptavidin gekoppelt waren. Der zu dem an die Kügelchen gekoppelten DNA-Strang komplementäre Strang wurde mit Hilfe des Hexanukleotid-Primings aufgebaut. Die nun doppelsträngige DNA wurde mit dem Restriktionsenzym Sse9l geschnitten, wodurch kohäsive Enden entstehen. An diese Ziel-DNA wurde eine sogenannte Linker- Kassette angelagert und mit Hilfe einer Ligasereaktion verbunden. Bei der Linker-Kasette handelt es sich um ein teilweise doppelsträngiges Oligonukleotid. Die 11
Ziel-DNA wurde anschließend denaturiert und mit Hilfe der PCR-Reaktion amplifiziert. Hierbei wurde ein Primer so gewählt, daß er sich an die bereits bekannte DNA-Region anlagert. Der andere Primer lagert sich an die Linker-Kassette an. Bei der Amplifikation wurden zunächst 10% des so entstandenen Produkts einer 1. PCR mit 28 Zyklen unterzogen, wobei ein verwendeter Primer aus dem bekannten DNA-Bereich ebenfalls in biotinylierter Form zugegeben wurde. Dieses erste PCR- Produkt wurde mittels "Magnetic Capture" abgetrennt. Mit 10% des so entstandenen Produkts wurde eine 2. PCR (= nested PCR) mit 28 Zyklen durchgeführt. 20% dieses 2. PCR-Produkts wurden über Gelelektrophorese (2%ige Agarose) aufgetrennt, auf eine Nylonmembran geblottet, mit einer zu der bekannten DNA-Sequenz homologen Digoxigenin-markierten Sonde hybridisiert und über Chemilumineszenz detektiert. Die Ergebnisse sind in Figur 2 dargestellt. Die Überschriften über den einzelnen Gelspuren haben die folgende Bedeutung:
M: Digoxygenin-markierter Molekulargewichtsstandard dδ: 8 Tage nach Reinfusion d 13: 13 Tage nach Reinfusion d14: 14 Tage nach Reinfusion d15: 15 Tage nach Reinfusion d21 : 21 Tage nach Reinfusion d124: 124 Tage nach Reinfusion d7: 7 Tage vor Reinfusion (negative Kontrolle)
+K: 20 pg von transduzierter und 1 μg von nicht transduzierter DNA von
Heiazellen -K: Kontrolle mit Wasser
Nach der ersten Amplifikation wurden alle Reaktionsschritte an Festphase durchgeführt. Die Aufreinigung zwischen den einzelnen Schritten erfolgte per Magnet. Das "verbrauchte" Reaktionsgemisch wurde einfach per Pipette abgezogen. Es wurde dann einmal mit Wasser nachgewaschen und dann das für den nächsten Reaktionsschritt benötigte Reaktionsgemisch in das Gefäß zugegeben. Das bedeutet, 12
daß alle Reaktionsschritte bis hin zum ersten exponentiellen Vervielfachungsschritt (1. PCR) in einem Reaktionsgefäß durchgeführt wurden.
Verwendete Primer:
LC1 : 5'>GACCCGGGAGATCTGAATTC<3'
LC2: 5'>GATCTGAATTCAGTGGCACAG<3'
LTRI: 5'>AGCTGTTCCATCTGTTCCTGACCTT<3' (am 5' Ende biotinyliert)
LTRII: 5'>GGCCTTGATCTGAACTTCTC<3'
LTRIII: 5'>TTCATGCCTTGCAAAATGGC<3'
Beispiel 2: Klonaie Analyse von transduzierten hämatopoetischen Stamm-Zellen durch Charakterisierung der retroviralen Integrationsstellen im Rhesusaffenmodell.
Die Experimente wurden wie in Beispiel 1 angegeben durchgeführt, jedoch mit folgenden Unterschieden: Die retrovirale Integrationsanalyse wurde am Rhesusaffenmodell durchgeführt. Das erzielte Klonalitätsprodukt wurde nicht über Southern Blot detektiert, sondern in einem hochauflösenden Kunststoffgel aufgetrennt, über UV-Licht nach EtBr-Färbung fotografisch dokumentiert (Figur 3), die DNA-Fragmente aus dem Gel isoliert und sequenziert (Figur 4). Figur 4 zeigt die retroviralen Integrationsstellen in insgesamt 45 unterschiedlichen Proben.
Es wurden dieselben Primer wie im vorstehendem Beispiel 1 angegeben verwendet.

Claims

13Patentansprüche
1. Verfahren zur Identifikation und/oder Sequenzierung einer unbekannten DNA- oder RNA-Sequenz, die an eine bekannte DNA- oder RNA-Region angrenzt, bei dem man
(a) in einer ersten Stufe ein oder mehrere DNA- oder RNA Fragmente einer oder mehreren linearen PCR-Stufen unter Verwendung eines oder mehrerer Primer unterzieht,
(b) die erhaltenen Einzelstränge zu Doppelsträngen auffüllt,
(c) die Doppelstränge mit einem oder mehreren Restriktionsenzymen schneidet, um glatte und/oder kohäsive Enden zu erzeugen,
(d) an die geschnittenen Enden ein Oligonukleotid bekannter Sequenz anfügt, und
(e) die erhaltenen DNA-Fragmente mit bekannten Verfahren vermehrt und nachweist.
2. Verfahren zur Identifikation und/oder Sequenzierung einer DNA- oder RNA- Sequenz nach Anspruch 1 , bei dem man
(a) in einer ersten Stufe ein oder mehrere DNA- oder RNA-Fragente einer oder mehreren linearen PCR-Stufen unter Verwendung eines oder mehrerer Primer durchführt, wobei der oder die Primer mit einem Partner eines spezifisch bindenden Paares versehen ist;
(b) mit Hilfe des zweiten Partners des spezifisch bindenden Paares solche Einzelstrangfragmente, die den ersten bindenden Partner tragen, aus der Reaktionsmischung abtrennt;
(c) die erhaltenen Einzelstränge zu Doppelsträngen auffüllt;
(d) die Doppelstränge mit einem oder mehreren Restriktionsenzymen schneidet, um glatte und/oder kohäsive Enden zu erzeugen;
(e) an die geschnittenen Enden ein Oligonukleotid bekannter Sequenz anfügt, und
(f) die erhaltenen DNA-Fragmente mit bekannten Verfahren vermehrt und nachweist. 14
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als spezifisch bindendes Paar Biotin und Avidin bzw. Streptavidin verwendet.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man in Stufe a) einen oder mehrere mit Biotin markierte Primer verwendet und diese(n) unmittelbar nachfolgend durch spezifische Bindung an Avidin oder Streptavidin aus der Reaktionsmischung abtrennt.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man den zweiten Partner des spezifisch bindenden Paares an Kugeln oder beschichteten Röhrchen immobilisiert.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man zum Aufbau des komplementären DNA-Strangs in Schritt 1(b) oder 2(c) Hexanukleotid-Priming verwendet.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man zum Aufbau des komplementären DNA-Strangs in Schritt 1 (b) oder 2(c) degenerierte Primer verwendet.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die in Stufe 1a) und 2b) erhaltenen DNA-Fragmente an Festphase zu Doppelsträngen komplettiert.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die Stuten 1 c) und 2 d) an Festphase durchführt.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die Stufe 1d) und 2e) an Festphase durchführt und die Ziel-DNA somit entsprechend einer "Festphasen-LM-PCR" unmittelbar nachfolgend vermehrt. 15
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß man in den Stufen 1d) und 2e) als Oligonukleotid eine Linker-Kassette ligiert.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß man in den Stufen 1d) und 2e) ein Poly (A, T, G oder C)-Tailing durchführt.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß man nach Schritt 1d) oder 2e) die Ziel-DNA denaturiert und mit einem PCR- Verfahren amplifiziert, wobei für das PCR-Verfahren ein Primer verwendet wird, der zu dem Linker komplementär ist und ein zweiter Primer verwendet wird, der zu dem bekannten Teil der DNA-Region komplementär ist.
14. Verfahren nach Anspruch 13 dadurch gekennzeichnet, daß die mit dem ersten PCR-Verfahren gewonnene Ziel-DNA einer zweiten Vervielfachung unter Verwendung eines Nested-PCR-Verfahrens unterzogen wird.
15. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14 dadurch gekennzeichnet, daß im Anschluß an die Amplifikation die Ziel-DNA mit Gelelektrophorese, durch Blotting-Verfahren oder Sequenzierung nachgewiesen wird.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß Schritt 1c) so durchgeführt wird, daß nicht innerhalb des bekannten Teils der Ziel-DNA-Sequenz geschnitten wird.
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß nur an das geschnittene Ende ein Oligonukleotid angefügt wird.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß die genomische Lokalisierung von Transposons, retroviralen Integrationsereignissen, retroviralen Vektoren, transkriptioneil aktiven Bereichen, Resistenzgenen und/oder Transgenen nachgewiesen, vervielfältigt, identifiziert und/oder sequenziert werden.
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Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001079485A2 (en) * 2000-03-24 2001-10-25 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Direct isolation of transposon insertions tagging transcribed portions of genes
US6777187B2 (en) 2001-05-02 2004-08-17 Rubicon Genomics, Inc. Genome walking by selective amplification of nick-translate DNA library and amplification from complex mixtures of templates
WO2004099446A1 (ja) * 2003-05-07 2004-11-18 Takara Bio Inc. 遺伝子導入部位の解析方法
US6828098B2 (en) 2000-05-20 2004-12-07 The Regents Of The University Of Michigan Method of producing a DNA library using positional amplification based on the use of adaptors and nick translation
WO2011086118A1 (en) 2010-01-14 2011-07-21 Deutsches Krebsforschungszentrum In vivo determination of the lokalization of dna double-stand breaks and application thereof
EP3221813A4 (de) * 2014-11-20 2018-04-18 Children's Medical Center Corporation Verfahren im zusammenhang mit der erkennung von rezidivierenden und nichtspezifischen doppelsträngigen brüchen im genom
US10508304B2 (en) 2011-07-07 2019-12-17 Children's Medical Center Corporation High throughput genome-wide translocation sequencing

Families Citing this family (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7875440B2 (en) 1998-05-01 2011-01-25 Arizona Board Of Regents Method of determining the nucleotide sequence of oligonucleotides and DNA molecules
US6780591B2 (en) * 1998-05-01 2004-08-24 Arizona Board Of Regents Method of determining the nucleotide sequence of oligonucleotides and DNA molecules
US7501245B2 (en) * 1999-06-28 2009-03-10 Helicos Biosciences Corp. Methods and apparatuses for analyzing polynucleotide sequences
US6818395B1 (en) * 1999-06-28 2004-11-16 California Institute Of Technology Methods and apparatus for analyzing polynucleotide sequences
JP2005529591A (ja) * 2002-04-05 2005-10-06 フィッシュル、リチャード、エー． Ｄｎａ修復経路及び／若しくはレトロウイルス感染を調節する化合物を同定する方法、その化合物、及びそれらの使用。
JP4571936B2 (ja) * 2003-03-28 2010-10-27 ディーエスエム アイピー アセッツ ビー．ブイ． パントラクトンヒドロラーゼ
US20050170367A1 (en) * 2003-06-10 2005-08-04 Quake Stephen R. Fluorescently labeled nucleoside triphosphates and analogs thereof for sequencing nucleic acids
US7169560B2 (en) 2003-11-12 2007-01-30 Helicos Biosciences Corporation Short cycle methods for sequencing polynucleotides
US20060172408A1 (en) * 2003-12-01 2006-08-03 Quake Steven R Device for immobilizing chemical and biochemical species and methods of using same
WO2005080605A2 (en) 2004-02-19 2005-09-01 Helicos Biosciences Corporation Methods and kits for analyzing polynucleotide sequences
US20060046258A1 (en) * 2004-02-27 2006-03-02 Lapidus Stanley N Applications of single molecule sequencing
CA2465396A1 (en) * 2004-04-20 2005-10-20 Shawn Burgess Rapid integration site mapping
US20050239085A1 (en) * 2004-04-23 2005-10-27 Buzby Philip R Methods for nucleic acid sequence determination
US20050260609A1 (en) * 2004-05-24 2005-11-24 Lapidus Stanley N Methods and devices for sequencing nucleic acids
DE602005027700D1 (de) * 2004-05-25 2011-06-09 Helicos Biosciences Corp Verfahren zur nukleinsäureimmobilisierung
US7476734B2 (en) * 2005-12-06 2009-01-13 Helicos Biosciences Corporation Nucleotide analogs
US20070117104A1 (en) * 2005-11-22 2007-05-24 Buzby Philip R Nucleotide analogs
DE102004026071A1 (de) * 2004-05-25 2005-12-22 Micronas Gmbh Verfahren und Vorrichtung zum Verarbeiten empfangener Daten einer Funkschnittstelle
US20070117103A1 (en) * 2005-11-22 2007-05-24 Buzby Philip R Nucleotide analogs
US20060024678A1 (en) * 2004-07-28 2006-02-02 Helicos Biosciences Corporation Use of single-stranded nucleic acid binding proteins in sequencing
US20060118754A1 (en) * 2004-12-08 2006-06-08 Lapen Daniel C Stabilizing a polyelectrolyte multilayer
US7220549B2 (en) * 2004-12-30 2007-05-22 Helicos Biosciences Corporation Stabilizing a nucleic acid for nucleic acid sequencing
US20060172328A1 (en) * 2005-01-05 2006-08-03 Buzby Philip R Methods and compositions for correcting misincorporation in a nucleic acid synthesis reaction
US7482120B2 (en) * 2005-01-28 2009-01-27 Helicos Biosciences Corporation Methods and compositions for improving fidelity in a nucleic acid synthesis reaction
US20060263790A1 (en) * 2005-05-20 2006-11-23 Timothy Harris Methods for improving fidelity in a nucleic acid synthesis reaction
US7666593B2 (en) 2005-08-26 2010-02-23 Helicos Biosciences Corporation Single molecule sequencing of captured nucleic acids
US20070117102A1 (en) * 2005-11-22 2007-05-24 Buzby Philip R Nucleotide analogs
US20070128610A1 (en) * 2005-12-02 2007-06-07 Buzby Philip R Sample preparation method and apparatus for nucleic acid sequencing
ATE514775T1 (de) * 2006-02-08 2011-07-15 Illumina Cambridge Ltd Endenmodifikation zur verhinderung einer überrepräsentierung von fragmenten
BRPI0709282B8 (pt) 2006-03-29 2021-05-25 Merial Ltd vacina contra estreptococos
US7833716B2 (en) * 2006-06-06 2010-11-16 Gen-Probe Incorporated Tagged oligonucleotides and their use in nucleic acid amplification methods
EP3095873B1 (de) 2006-12-21 2018-04-18 Gen-Probe Incorporated Verfahren und zusammensetzungen zur amplifizierung von nukleinsäuren
HUE029914T2 (en) * 2008-04-03 2017-04-28 Cb Biotechnologies Inc Amplicon-saving multiplex polymerase chain reaction for amplification of multiple targets
AU2010266234B2 (en) 2009-07-01 2013-07-25 Gen-Probe Incorporated Methods and compositions for nucleic acid amplification
EP2694682B1 (de) * 2011-04-05 2017-10-25 Dow AgroSciences LLC Analyse von transgenen grenzen mit hohem durchsatz
GB201410646D0 (en) * 2014-06-14 2014-07-30 Illumina Cambridge Ltd Methods of increasing sequencing accuracy
CA3052294A1 (en) * 2017-02-13 2018-08-16 The Children's Medical Center Corporation Methods and compositions relating to detection of recombination and rearrangement events
CN108034695B (zh) * 2017-12-21 2021-06-25 江苏省农业科学院 一种高效获得t-dna插入侧翼序列的方法及其应用
WO2019222688A1 (en) * 2018-05-17 2019-11-21 Illumina, Inc. High-throughput single-cell sequencing with reduced amplification bias
CN110551794B (zh) * 2018-06-04 2023-05-30 完整基因有限公司 对rna分子进行处理的方法及试剂盒和复合体
CN110565174B (zh) * 2019-09-17 2022-09-30 北京博昊云天科技有限公司 一种dna文库构建方法

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0327429A2 (de) * 1988-01-26 1989-08-09 Applied Biosystems, Inc. Markierung durch gleichzeitige Ligation und Restriktion
EP0356021A2 (de) * 1988-07-28 1990-02-28 Zeneca Limited Verfahren zur Amplifikation von Nucleotidsequenzen
EP0395398A2 (de) * 1989-04-27 1990-10-31 Life Technologies Inc. Verstärkung von Nukleinsäure-Sequenzen unter Verwendung von Stichsequenz-Oligonukleotiden als Primer
WO1991018114A1 (en) * 1990-05-22 1991-11-28 Medical Research Council Polynucleotide amplification
WO1992013104A1 (en) * 1991-01-22 1992-08-06 Board Of Regents, The University Of Texas System 5' and 3' polymerase chain reaction walking from known dna sequences
WO1993009246A1 (en) * 1991-11-01 1993-05-13 University Of Iowa Research Foundation Method for retrieval of unknown flanking dna sequence
WO1993011261A1 (en) * 1991-11-25 1993-06-10 Keygene N.V. A novel pcr method with a single primer for nucleic acid analysis
WO1993012245A1 (en) * 1991-12-11 1993-06-24 Igen, Inc. Method for exponential amplification of nucleic acid by a single unpaired primer
US5599696A (en) * 1989-10-17 1997-02-04 California Institute Of Technology Method of preparing nucleic acids having an undefined nucleotide sequence amplification

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5104792A (en) * 1989-12-21 1992-04-14 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method for amplifying unknown nucleic acid sequences
US5731171A (en) * 1993-07-23 1998-03-24 Arch Development Corp. Sequence independent amplification of DNA
DE19518505A1 (de) * 1995-05-19 1996-11-21 Max Planck Gesellschaft Verfahren zur Genexpressionsanalyse

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0327429A2 (de) * 1988-01-26 1989-08-09 Applied Biosystems, Inc. Markierung durch gleichzeitige Ligation und Restriktion
EP0356021A2 (de) * 1988-07-28 1990-02-28 Zeneca Limited Verfahren zur Amplifikation von Nucleotidsequenzen
EP0395398A2 (de) * 1989-04-27 1990-10-31 Life Technologies Inc. Verstärkung von Nukleinsäure-Sequenzen unter Verwendung von Stichsequenz-Oligonukleotiden als Primer
US5599696A (en) * 1989-10-17 1997-02-04 California Institute Of Technology Method of preparing nucleic acids having an undefined nucleotide sequence amplification
WO1991018114A1 (en) * 1990-05-22 1991-11-28 Medical Research Council Polynucleotide amplification
WO1992013104A1 (en) * 1991-01-22 1992-08-06 Board Of Regents, The University Of Texas System 5' and 3' polymerase chain reaction walking from known dna sequences
WO1993009246A1 (en) * 1991-11-01 1993-05-13 University Of Iowa Research Foundation Method for retrieval of unknown flanking dna sequence
WO1993011261A1 (en) * 1991-11-25 1993-06-10 Keygene N.V. A novel pcr method with a single primer for nucleic acid analysis
WO1993012245A1 (en) * 1991-12-11 1993-06-24 Igen, Inc. Method for exponential amplification of nucleic acid by a single unpaired primer

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001079485A2 (en) * 2000-03-24 2001-10-25 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Direct isolation of transposon insertions tagging transcribed portions of genes
WO2001079485A3 (en) * 2000-03-24 2002-01-31 Max Planck Gesellschaft Direct isolation of transposon insertions tagging transcribed portions of genes
US6828098B2 (en) 2000-05-20 2004-12-07 The Regents Of The University Of Michigan Method of producing a DNA library using positional amplification based on the use of adaptors and nick translation
US6777187B2 (en) 2001-05-02 2004-08-17 Rubicon Genomics, Inc. Genome walking by selective amplification of nick-translate DNA library and amplification from complex mixtures of templates
WO2004099446A1 (ja) * 2003-05-07 2004-11-18 Takara Bio Inc. 遺伝子導入部位の解析方法
JPWO2004099446A1 (ja) * 2003-05-07 2006-07-13 タカラバイオ株式会社 遺伝子導入部位の解析方法
JP4496166B2 (ja) * 2003-05-07 2010-07-07 タカラバイオ株式会社 遺伝子導入部位の解析方法
WO2011086118A1 (en) 2010-01-14 2011-07-21 Deutsches Krebsforschungszentrum In vivo determination of the lokalization of dna double-stand breaks and application thereof
US9493827B2 (en) 2010-01-14 2016-11-15 Deutsches Krebsforschungszentrum Determination of in vivo DNA double-strand break localization and application thereof
US10508304B2 (en) 2011-07-07 2019-12-17 Children's Medical Center Corporation High throughput genome-wide translocation sequencing
EP3221813A4 (de) * 2014-11-20 2018-04-18 Children's Medical Center Corporation Verfahren im zusammenhang mit der erkennung von rezidivierenden und nichtspezifischen doppelsträngigen brüchen im genom
US10640820B2 (en) 2014-11-20 2020-05-05 Children's Medical Center Corporation Methods relating to the detection of recurrent and non-specific double strand breaks in the genome

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