DE60123481T2 - Verfahren zur durchführung einer subtraktiven hybridisierung - Google Patents

Verfahren zur durchführung einer subtraktiven hybridisierung Download PDF

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6809—Methods for determination or identification of nucleic acids involving differential detection

Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Technisches Gebiet
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Verbesserungen der Nucleinsäureisolierung, und insbesondere Modifikationen des Verfahrens der subtraktiven Hybridisierung und von Reaktionsmitteln, wie beispielsweise Oligonucleotiden, die für die Durchführung des Verfahrens nützlich sind.
  • Hintergrundinformation
  • Veränderungen der Anwesenheit, der Menge oder Sequenz einer spezifischen Nucleinsäure können einen signifikanten Effekt auf den Wirt haben, in dem die Nucleinsäure vorliegt. Die Identifizierung und Isolierung solcher Nucleinsäuresequenzen ist für deren Analyse und Verständnis unerlässlich. Zu diesem Zweck wurden genetische Annäherungen, Infektiositätsuntersuchungen, vergleichendes Nucleinsäure-Fingerprinting sowie die subtraktive Hybridisierung verwendet.
  • Die subtraktive Hybridisierungsverfahren reichern Nucleinsäruresequenzen an, die in einer Probe vorliegen, jedoch in einer ansonsten identischen Probe fehlen, in verminderter Zahl vorliegen oder verändert sind. Vergleiche O. D. Ermolaeva et al., Genetic Anal.: Biomol. Engl. 13: 49–58 (1996). Ein "gewünschtes Ergebnis" solcher Verfahren stellt die Anreicherung eines Satzes von Nucleinsäuren dar. Bei "Tester und Treiber" handelt es sich um nahezu identische Nucleinsäureproben, die vorzugsweise nur durch das Vorliegen oder die Abwesenheit einer Zielsequenz (Zielsequenzen) voneinander abweichen.
  • Im Allgemeinen wird im Zuge einer subtraktiven Hybridisierung die Treiber- und Testernucleinsäure aus den Proben isoliert; anschließend wird cDNS hergestellt, falls es sich bei der zu untersuchenden Nucleinsäure um RNS handelt; die Treiber-DNS und Tester-DNS wird fragmentiert und eine von beiden modifiziert, um eine darauf folgende Anreicherung zu ermöglichen; zu guter Letzt wird eine Mischung der fragmentierten DNS hitzedenaturiert, wobei der Treiber in beträchtlichem Überschuss gegenüber dem Tester vorliegt, und die komplementären Einzelsträngen können wieder verschmelzen. Durch den Überschuss an Treiber gegenüber Tester wird ein Hauptanteil der Testersequenzen, der Gemeinsamkeiten mit dem Treiber besitzt, in Form von Tester/Treiber-Hybriden vorliegen. Spezies, welche Sequenzen enthalten, die im Treiber und Tester auftreten, werden mittels der beschriebenen Modifikation entfernt, wodurch eine reine Testerpopulation zurückbleibt, die mit Zielsequenzen angereichert ist. Falls eine darüber hinaus gehende Anreicherung gefordert sein sollte, können zusätzliche Runden der Subtraktion durchgeführt werden. Letzten Endes werden individuelle Fragmente, die aus den Subtraktionsprodukten kloniert wurden, auf Zielsequenzen hin untersucht (das heißt solche Sequenzen, die im Tester vorliegen, jedoch im Treiber nicht vorliegen oder signifikant vermindert sind) (O. D. Ermolaeva et al., supra).
  • Die Repräsentationale Unterscheidungsanalyse (RDA) umfasst, so wie andere herkömmliche Verfahren der subtraktiven Hybridisierung, die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) als integralen Bestandteil des Verfahrens (U.S. Patent Nr. 4,683,195; Saiki et al., Science 230: 1350–1354 (1985)). Der Erfolg der PCR-basierten subtraktiven Hybridisierung hängt teilweise von der ursprünglichen Amplikonkomplexität und/oder dem relativen Überschuss der Zielsequenz innerhalb des Amplikons ab. (Ein Amplikon kann als die Einheit definiert werden, die den Satz an Nucleinsäuresequenzen umfasst, der durch die PCR amplifiziert wurde.) Falls die Komplexität zu groß sein sollte, oder falls die Zielsequenzkonzentration zu gering ausfallen sollte, verhindert die Kinetik der Hybridisierung eine wirksame Anreicherung und das Verfahren scheitert.
  • Die Amplikonkomplexität wird im RDA-Verfahren mittels Amplifikation nur eines repräsentativen Teilsatzes aller möglichen Fragmente des Treibers und des Testers vermindert. Solche Teilsätze werden mittels selektiver Amplifikation von Nucleinsäurefragmenten, basierend auf deren Größe, erzielt. Alternativ dazu kann die Ausgangsnucleinsäure vor der Subtraktion für Zielsequenzen durch partielle Aufreinigung angereichert werden, was mittels Durchleitung der Probe durch einen Zwei-Mikron-Filter vor Extraktion erfolgen kann, wodurch ein Großteil der in der Probe vorliegenden zellulären Nucleinsäure eliminiert wird, und die Notwendigkeit zur Verminderung der Amplikonkomplexität verringert wird (Simons et al., Proc. Natl. Aca. Sci. USA 92: 3401–3405 (1995)).
  • Darüber hinaus können andere Faktoren leicht den Erfolg dieses Verfahrens beeinflussen. Beispielsweise führen Unterschiede der Reassoziierungsgeschwindigkeit und PCR-Effizienz der einzelnen Fragmente zu einer starken Selektion für solche Produkte, die am leichtesten gebildet werden, unabhängig davon, ob diese Sequenz spezifisch für den Tester ist oder nicht. Falls solch eine Sequenz nicht spezifisch ist, könnte es die subtraktive Kapazität des Treibers insbesondere in späteren Runden überlagern, wodurch Sequenzen isoliert werden, die nicht spezifisch für oder gehäuft in Tester-versus-Treiber vorkommen. Unabhängig von ihrer Quelle tendieren solche "bevorzugten" Sequenzen dazu, die angereicherte Fragmentpopulation zu dominieren und Tester-spezifische Produkte zu verdrängen, die weniger effizient gebildet werden, wodurch die Bestimmung des Tester-spezifischen Produkts erschwert wird. Eine Lösung dieses Problems wurde vor kurzem angestrebt, mittels Isolierung der Hauptanreicherungsprodukte, die nach einer Reihe von Subtraktionen erhalten wurden und individuelle Rückführung dieser zum Treiber, wodurch eine Verstärkung der subtraktiven Fähigkeit für diese Sequenzen erreicht wurde (Ushijima et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 2284–2289 (1997) und Hubank et al., Nucleic Acids Res. 22: 5640–5648 (1994)). Es muss dann jedoch eine zweite Serie von Subtraktionen durchgeführt werden, um Tester-spezifische Sequenzen zu isolieren, die zuvor nicht erhalten wurden, wie beispielsweise Sequenzen mit geringer Kopienzahl oder solche, die relativ schlecht amplifiziert werden.
  • Bisher wurden Probleme, die mit einer hohen Amplikonkomplexität und geringer Anzahl an Kopien im Tester assoziiert sind, noch nicht vollständig gelöst. Diese Faktoren können durch die Verminderung der Empfindlichkeit des Subtraktionsverfahrens die Isolierung von Sequenzen negativ beeinflussen.
  • In Anbetracht der oben angeführten Diskussion wäre es sicherlich von Vorteil, Modifikationen für das subtraktive Hybridiserungsverfahren vorzusehen, eingeschlossen RDA, welche in der Lage sind die, mit einer hohen Amplikonkomplexität und geringer Kopienzahl im Tester assoziierten, Probleme zu lösen.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein modifiziertes subtraktives Hybridisierungsverfahren bereit, unter dem Begriff Selektiv geprimte (primed) Adaptive Treiber-RDA ("SPAD-RDA"), das eine Treiber-versus-Treiber-Subtraktionskontrolle verwendet, die parallel mit dem Treiber-versus-Tester-Subtraktionsschritt durchgeführt wird. Die Produkte der Treiberkontrollsubtraktion aus jeder Runde können als die Treiber für die darauf folgenden Runden verwendet werden.
  • Dieses Verfahren zur Durchführung einer subtraktiven Hybridisierung benutzt eine Testerprobe und eine Treiberprobe, um die Anwesenheit eines Unterschieds in der Nucleinsäuresequenz in der Testerprobe zu bestimmen. Im Detail umfasst das Verfahren die Schritte: (a) Getrennte Isolierung von Gesamtnucleinsäure aus der Testerprobe und der Treiberprobe, Erzeugung doppelsträngiger cDNS/DNS aus Gesamtnucleinsäure aus der Testerprobe und der Treiberprobe; (b) Verdau der doppelsträngigen cDNS/DNS, die aus der Testerprobe und der Treiberprobe in Schritt (a) gebildet wurde, mittels einer Restriktionsendonuclease, um einen Satz von Restriktionsfragmenten für jede Probe zu erzeugen; (c) Ligation der Treiber- und Tester-Restriktionsfragmente jedes Satzes aus Schritt (b) zu einem Oligonucleotid-Adaptersatz 1 und Amplifikation des sich ergebenden Produkts mit selektiven Primern, so dass ein Teilsatz der Restriktionsfragmente aus Schritt (b) amplifiziert wird; (d) Entfernen der selektiven Primersequenzen mittels Restriktionsendonuclease-Verdau, um Tester- und Treiber-Amplikons zu erzeugen, Ligation der 5'-Enden der Treiber- und Tester-Amplikons zu einem Oligonucleotid-Adaptersatz 2, um Treiber-Kontrolle und Tester zu bilden, Mischen der Treiber-Kontrolle und des Testers getrennt voneinander mit einem Überschuss an nichtligiertem Treiber-Amplikon jeweils, Denaturieren der sich ergebenden Mischungen und Hybridisierung der denaturierten Nucleinsäurestränge innerhalb jeder Mischung; (e) Auffüllen der 3'-Enden des wieder verschmolzenen Treibers/Testers und des/der wiederverschmolzenen Treibers/Treiberkontrolle unter Verwendung einer thermostabilen DNS-Polymersase und Amplifikation der sich ergebenden Sequenzen; (f) Entfernen von noch vorhandener einzelsträngiger DNS mittels Verdau mit einer Einzelstrang-DNS-Nuclease und Amplifikation; (g) Amplifikation noch vorhandener doppelsträngiger DNS nach Nucleaseverdau; und (h) Beschneiden der Subtraktionsprodukte des Treibers/Testers und des/der Treibers/Treiberkontrolle mittels einer Restriktionsendonuclease, um Oligonucleotid-Adapter zu entfernen, und Wiederholung der Schritte (c) bis (h), worin die Schritte (c) bis (h) einen Oligonucleotid-Adaptersatz verwenden, der in keiner der vorherigen Runden der RDA angewendet wurde, wobei eine Runde aus der Durchführung der RDA-Schritte (c) bis (h) besteht, und Verwendung des Restriktionsendonuclease-geschnittenen Produkts der Treiber/Treiberkontrollsubtraktion aus den unmittelbar vorangehenden Schritten (c) bis (h) als Treiber für eine jeweilige neue Runde der RDA. (Die Schritte (c) bis (h) können beliebig oft wiederholt werden.) In diesem Verfahren kann die Restriktionsendonuclease aus Schritt (b) und/oder Schritt (h) eine 4–6 Basenpaar große Erkennungsstelle (mit einem überhängenden 5'-Ende, vorzugsweise eine 4 Basenpaar Erkennungsstelle) besitzen. Die Restriktionsendonuclease kann beispielsweise Sau3AI sein. Obwohl weniger bevorzugt, kann jedes Restriktionsenzym mit einer palindromen Tetra- oder Hexanucleotid-Erkennungssequenz verwendet werden. Die Auswahl des Enzyms beeinflusst gleichermaßen die Amplikonkomplexität und das Design der Oligonucleotid-Adapter. Die Amplikonkomplexität erhöht sich, wenn eine Restriktionsendonuclease mit einer 4 Bp-Erkennungsstelle verwendet wird, relativ im Vergleich zur Komplexität, die mit einer Restriktionsendonuclease mit einer 6 Bp großen Erkennungsstelle erhalten wird. Dies ist bedingt durch die größere Anzahl amplifizierbarer Sequenzen die durch die zuerst genannte versus die zuletzt genannte Restriktionsendonuclease entstehen. Darüber hinaus beeinflusst die Auswahl der Restriktionsendonuclease das Oligonucleotid-Adapterdesign, da der Adapter kompatibel mit der Sequenz und der Struktur sein muss, die an den Enden der durch Restriktionsendonuclease verdauten DNS vorliegen, um zu einer effizienten Ligation zu führen.
  • Die vorliegende Erfindung schließt weiterhin ein Verfahren zur visuellen Identifizierung spezifischer Testersequenzen ein, umfassend die Schritte: (a) Getrennte Isolierung von Gesamtnucleinsäure aus einer Testerprobe und einer Treiberprobe und Erzeugung doppelsträngiger cDNS/DNS aus der Gesamtnucleinsäure aus der Testerprobe und der Treiberprobe; (b) Verdau der doppelsträngigen cDNS/DNS, die aus der Testerprobe und der Treiberprobe in Schritt (a) erzeugt wurde, mittels einer Restriktionsendonuclease, um einen Satz Restriktionsfragmenten für jede Probe zu erzeugen; (c) Ligation der Treiber- und Tester-Restriktionsfragmente aus Schritt (b) zu einem Oligonucleotid-Adaptersatz 1 und Amplifikation des sich ergebenden Produkts mit selektiven Primern, so dass ein Teilsatz der Restriktionsfragmente aus Schritt (b) amplifiziert wird; (d) Entfernen der selektiven Primersequenzen mittels Restriktionsendonuclease-Verdau, um Tester- und Treiber-Amplikons zu erzeugen, Ligation der 5'-Enden der Treiber- und Tester-Amplikons zu einem Oligonucleotid-Adaptersatz 2, um Treiberkontrolle und Tester zu erzeugen, Mischen der Treiberkontrolle und Tester getrennt voneinander mit einem Überschuss an nicht-legiertem Treiber-Amplikon jeweils, Denaturierung der genannten sich ergebenden Mischungen und Hybridisierung der denaturierten Nucleinsäurestränge in jeder Mischung; (e) Auffüllen der 3'-Enden des wiederverschmolzenen Treibers/Testers und wiederverschmolzenen Treibers/Treiberkontrolle unter Verwendung einer thermostabile DNS-Polymerase und Amplifikation der sich ergebenden Sequenzen; (f) Entfernen noch vorhandener einzelsträngiger DNS mittels Verdau mit einer einzelsträngigen DNS-Nuclease und Amplifikation; (g) Aufbringen der Treiber-Tester und Treiber-Kontrollprodukte auf einem festen Substrat; und (h) visuelle Identifizierung der Treiber-Testerbanden, die nicht in den Treiber-Kontrollbanden vorkommen.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 zeigt den Vergleich der RDA-Amplikonerzeugung durch das herkömmlichen Verfahren nach Lisitsyn et al. (Science 259: 946–951 (1993)) und durch selektives Priming, wie es in vorliegender Erfindung beschrieben wird.
  • Darüber hinaus illustriert 1A erstmals SEQ ID NR. 1 und 19 vom 5'- bis 3'- und 3'- bis 5'-Ende, respektive; 1B zeigt SEQ ID NR. 20 und 21 vom 5'- bis zum 3'- und 3'- bis zum 5'-Ende, respektive.
  • 2 zeigt ein Diagramm des erfindungsgemäßen SPAD-RDA-Verfahrens.
  • 3 zeigt Southern Blots, welche die Anreicherung für HCV-Sequenzen mittels eines herkömmlichen RDA-Verfahrens nach Lisitsyn et al. (Science 259: 946–951 (1993)) im Vergleich zum erfindungsgemäßen SPAD-RDA-Verfahren verdeutlichen.
  • 4 zeigt ein Diagramm der bei der Identifizierung einer Zielsequenz mittels differenzieller Hybridisierung, wie beschrieben in Beispiel 9, durchgeführten Schritte.
  • 5 zeigt ein Diagramm der Schritte der vorgeschlagenen "Einzelhybridisierung" RDA-Modifikation.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung stellt neuartige Modifikationen von subtraktiven Hybridisierungsverfahren und insbesondere des RDA-Verfahrens bereit, die zu einem verbesserten RDA-Verfahren führen, hierin "Selektiv geprimte (primed) adaptive Treiber-RDA" ("SPAD-RDA") genannt. Das vorliegende verbesserte Verfahren integriert mehrere Modifikationen in einem einzelnen Protokoll. Weiterhin wird die verbesserte Verwendbarkeit des SPAD-RDA im Vergleich mit einem unmodifizierten RDA und die effektive Verwendung für nicht gepaarte Treiber und Testerproben in Verbindung mit SPAD-RDA gezeigt.
  • Insbesondere zeigt die vorliegende Erfindung die Verwendung des selektiven Primings, um die Amplikonkomplexität für subtraktive Hybridisierungsverfahren und insbesondere für RDA zu steuern, bei gleichzeitiger Maximierung der Wahrscheinlichkeit, dass eine Zielsequenz im Testeramplikon repräsentiert sein wird. (Beispiele für Oligonucleotid-Primer, die selektive Basen an deren 3'-Enden aufweisen, werden hierin vorgesehen. Solche Primer demonstrieren, dass die Amplikonkomplexität mittels Primerdesign gesteuert werden kann.) Weiterhin wird in der vorliegenden Erfindung ein für jede Runde der RDA-Subtraktion anders gearteter Oligonucleotid-Adaptersatz vorgesehen, zusammen mit spezifischen Beispielen solcher Adaptersätze und deren Verwendung. Zusätzlich dazu wird die Verwendung der Gelfiltrationschromatographie beim RDA-Verfahren gezeigt, gleichzeitig zur Entfernung für kompetitive Primer vor dem selektiven Priming der Amplikons und zur Entfernung von geschnittenen Adaptersequenzen, um deren Beeinflussung der Ligation eines neuen Adaptersatzes zu verhindern. Darüber hinaus wird eine adaptive Treiberstrategie für subtraktive Hybridisierungsverfahren vorgesehen, insbesondere für die RDA, bei der die Produkte einer Treiber versus Treiberkontrollsubtraktion als Treiber für die darauf folgenden Runden verwendet wird. Weiterhin wird die Verwendung der Treiberkontrolle als visuelle Referenz zur erleichterten Identifizierung Tester-spezifischer Fragmente vorgesehen.
  • Darüber hinaus wird die Bedeutung der Produktanalyse durch die Anwendung des Immunoscreenings und differentieller Hybridisierungsstrategien erweitert, um Tester-spezifische Sequenzen in den Subtraktionsprodukten zu bestimmen.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren besitzt mehrere Verwendungsmöglichkeiten. Es kann verwendet werden, um festzustellen, ob ein infektiöser Erreger in einer Testprobe vorliegt, mittels Verwendung einer Präinokulations- (oder Präinfektions-) Probe als Treiber und einer Postinokulations- (oder Postinfektions-) Probe als Tester. Zusätzlich dazu kann das hierin beschriebene Verfahren zur genetischen Untersuchung verwendet werden, um einen Marker zu identifizieren, der mit einer möglichen Prädisposition eines Individuums für eine Erkrankung assoziiert ist, oder um die Abweichung eines Gens festzustellen, wobei die Bestimmung der Abweichung selbst die Diagnose der Erkrankung bedeutet. Bei diesen Bestimmungen dient eine gepoolte Normalprobe als Treiber und die Patientenprobe wird als Tester verwendet.
  • Zahlreiche Testproben können in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, eingeschlossen, jedoch nicht beschränkt auf Körperflüssigkeiten, wie beispielsweise Gesamtblut, Serum, Plasma und Urin. Es können auch andere Proben verwendet werden, wie beispielsweise Gewebe, oder jedwede Probe aus der Nucleinsäure extrahiert werden kann. Weiterhin liegt im Umfang der vorliegenden Erfindung, dass Zellkulturen und/oder Zellüberstände verwendet werden können.
  • Bevor Beispiele, welche die Erfindung beschreiben, gezeigt werden, werden Details in Bezug auf Materialien und Methoden, die in den Beispielen angewendet werden, detailliert beschrieben:
  • Materialien und Methoden
  • Allgemeine Techniken.
  • Bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung werden herkömmliche und bekannte Techniken und Verfahren aus dem Gebiet der Molekularbiologie, Mikrobiologie und rekombinanten DNS-Technologie verwendet, es sei denn anderweitig angeführt. Diese Techniken und Verfahren werden in der Literatur und Standardlehrbüchern erklärt und sind dem Fachmann deshalb bekannt. (Vgl. beispielsweise J. Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989).) Das herkömmliche RDA-Verfahren beschränkt sich auf die Identifizierung und Klonierung von Unterschieden in doppelsträngiger DNS zwischen Komplexen, jedoch sich ähnlichen, DNS-Hintergründen nach Lisitsyn et al., Science 259: 946–951 (1993). Diese Unterschiede können jeden großen DNS-Virus einschließen (beispielsweise > 25.000 Basenpaare ["Bp"] DNS), der in einer Testprobe vorliegt, wie beispielsweise einer Zelllinie, Blut, Plasma oder einer Gewebeprobe. Eine von Simons et al., supra, und Hubank et al., supra, beschriebenen Modifikation der RDA erweiterte das herkömmliche RDA-Verfahren um RNS und/oder einzelsträngige DNS mittels Umwandlung dieser in doppelsträngige DNS und Einarbeitung in den Treiber und Tester. Diese bekannte Modifikation erhöhte außerdem die Komplexität der Nucleinsäuresequenzen, die der RDA unterworfen wurden mittels Fragmentierung der DNS mit einem Restriktionsenzym, das eine 4 Bp große Erkennungsstelle besaß, im Gegensatz zu einem Restriktionsenzym mit einer 6 Bp-Erkennungsstelle, wie sie herkömmlicherweise in der RDA verwendet wurde. Diese Modifikationen erhöhten die Wahrscheinlichkeit einer Detektion/Isolation kleiner viraler Genome (beispielsweise 15.000 Basen), insbesondere von RNS oder einzelsträngiger DNS.
  • Mindestens eine vorveröffentlichte Beschreibung (Lisitsyn et al., supra (1993)) zeigt, dass die gesteigerte Komplexität in einer verminderten Sensitivität für die Detektion von Tester-spezifischen Sequenzen führt, was darauf hinweist, dass eine Sequenz, die in geringer Kopienzahl vorliegt, wie beispielsweise ein Virus mit geringem Titer, schwierig zu detektieren ist. Die vorliegende Erfindung löst die Probleme des herkömmlichen RDA-Verfahrens sowie der Modifikationen durch Simons et al. und Hubank et al., da die Viren mit geringen Titern und Viren mit kleinem Genom in einfacher Weise detektiert werden können.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren wird in 2 verdeutlicht. In einem hierin angeführten Beispiel wurden virale Sequenzen von einer Probe isoliert, die bekanntermaßen Hepatitis C-Virus enthielt (d. h. ein RNS-Virus). Die Isolierung und Klonierung von HCV-Sequenzen wurde mittels Modifikation des herkömmlichen RDA-Verfahrens erzielt, wie beschrieben von Lisitsyn et al., supra (1993).
  • Mit Bezug auf 2 wurden die zwei zu untersuchenden Genome als "Tester" (Postinfektions-Serum, das nachgewiesenermaßen HCV enthielt) und "Treiber" (Präinfektions-Serum aus demselben Individuum ohne HCV) benannt. Zuerst wurde Gesamtnucleinsäure (DNS und RNS) aus der Testerprobe und der Treiberprobe (nicht gezeigt) isoliert unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Kits zur Isolierung von Gesamtnucleinsäure (erhältlich von United States Biochemical [USB], Cleveland, OH). Alternativ dazu kann ein reines DNS- oder ein reines RNS-Extraktionsverfahren verwendet werden, wie es im Stand der Technik bekannt und beschrieben wird.
  • Beim herkömmlichen RDA-Verfahren werden die Proben des Treibers und Testers aus der gleichen Quelle erhalten, da die Basis des Verfahrens auf einem Vergleich und einer Subtraktion ähnlicher Nucleinsäuren beruht. Jedoch ist es im Gegensatz dazu, in Übereinstimmung mit vorliegender Erfindung möglich, eng verwandtes, jedoch nicht identisches Material als Quelle für die Tester und Treiber-Nucleinsäuren zu verwenden. Mit "eng verwandt, jedoch nicht identisch" ist eine > 95% Sequenzidentität gemeint unter Verwendung von standardisierten Programmen, die im Stand der Technik bekannt sind.
  • Doppelsträngige DNS wurde aus der Gesamtnucleinsäure mittels zufällig geprimter reverser Transkription der RNS erzeugt, gefolgt von einer DNS-Synthese mit Randomprimern. Diese Behandlung wandelte RNS und einzelsträngige DNS in doppelsträngige DNS-Moleküle, die bei der RDA verwendbar sind, um.
  • Anschließend wurde die doppelsträngigen Tester- und Treiber-DNS amplifiziert, um eine ausreichende Menge an Ausgangsmaterial zu erhalten. Dies wurde mittels Schneiden der doppelsträngigen, wie oben beschrieben erzeugten DNS mit einer Restriktionsendonuclease, die eine 4 Bp große Erkennungsstelle aufweist (in diesem Beispiel mit Sau3AI) erreicht. Die DNS-Fragmente (2, oben) wurden zu Oligonucleotid-Adaptern (benannt "Satz #1") ligiert, die Enden aufgefüllt und mittels PCR unter Verwendung selektiver Primer amplifiziert. Das Design der selektiven Primer (d. h. R-Bam 19C und R-Bam 19G) erfolgte so, dass nur ein Teilsatz sämtlicher Restriktionsfragmente die vorlagen, amplifiziert wurde, wodurch sich die Amplikonkomplexität verminderte. 1 zeigt ein Diagramm, das exemplarisch das PCR-Priming eines SAU3AI DNS-Fragments zeigt, welches an den R-Bam-Adaptersatz ligiert wird, mittels (i) Oligonucleotidprimer R-Bam 24 oder mittels (ii) dem selektiven Oligonucleotidprimer R-Bam19N. Die eingerahmten Sequenzen in 1 stellen die 4 Bp großen Sau3AI-Erkennungsstellen dar, (n) steht für irgendeines der 4 Nucleotide und (N) repräsentiert die selektive Base, also das Komplement von (n). In Bezug auf 2 wurde die selektive Primersequenz nach PCR-Amplifikation mittels Restriktionsendonuclease-Verdau (in diesem Beispiel mit Sau3AI) entfernt, der eine große Menge von Tester und Treiber-Nucleinsäure (d. h. Amplikons) freisetzte, welche anschließend in der ersten Runde der subtraktiven Hybridisierung verwendet werden konnten.
  • Die in 2 gezeigten verbleibenden Schritte wurden so ausgelegt, dass eine Anreicherung für DNS-Sequenzen, die spezifisch für den Tester sind, erreicht wurde. Dies wurde mittels Kombination der subtraktiven Hybridisierung und kinetischen Anreicherung in einem einzigen Schritt erreicht. So wurde ein Oligonucleotid-Adaptersatz (benannt "Satz #2") an die 5'-Enden eines Teils des Treibers (im nachfolgenden "Treiber-Kontrolle" genannt) und Testeramplikons ligiert. Mit dem Adaptersatz #2 ligierte Treiber-Kontrolle und Tester wurden anschließend getrennt voneinander mit einem Überschuss von nichtligiertem Treiberamplikon gemischt, denaturiert und unter Standardbedingungen für mindestens 20 Stunden hybridisiert. Es wird angenommen, dass eine große Menge der Sequenzen, die gleichermaßen in den Tester- und den Treiberamplikons vorkommen, während dieser Zeit wieder verschmelzen; die gleiche Annahme wurde in Bezug auf die Treiber/Treiber-Kontrolle Hybridisierungsmischung gemacht. Es wird weiterhin davon ausgegangen, dass Sequenzen, die spezifisch für das Testeramplikon sind, wieder verschmelzen.
  • Die 3'-Enden der wiederverschmolzenen Treiber/Tester-DNA-Hybridisierung sowie der wiederverschmolzenen Treiber/Treiber-Kontrolle DNS-Hybridisierung wurden mittels einer thermostabilen DNS-Polymerase bei erhöhter Temperatur aufgefüllt, wie im Stand der Technik beschrieben. Die für den Tester spezifischen wiederverschmolzenen Sequenzen enthielten den ligierten Adapter an beiden Strängen der wiederverschmolzenen Sequenz. Somit erzeugte das Auffüllen der 3'-Enden dieser Moleküle Sequenzen, welche komplementär zu PCR-Primern beider DNS-Stränge waren. In dieser Form wurden die DNS-Spezies mittels PCR exponentiell amplifiziert. Es bildeten sich geringe Mengen von Tester:Tester- oder Treiber-Kontrolle:Treiber-Kontrolle-Hybriden für Sequenzen, die Gemeinsamkeiten mit dem Treiber hatten. Auch diese DNS-Spezies wurden exponentiell amplifiziert. Im Gegensatz dazu wurde eine relativ große Menge von Hybridmolekülen, in denen ein Strang aus dem Tester oder der Treiber-Kontrolle stammte, und ein weiterer Strang vom Treiberamplikon abgeleitet war, linear mittels PCR amplifiziert. Dies erfolgte, da nur ein Strang (abgeleitet vom Tester oder der Treiber-Kontrolle) die ligierte Adaptersequenz enthielt und das Auffüllen des 3'-Endes nur Sequenzen erzeugte, die komplementär zum PCR-Primer des Strangs war, der aus dem Treiberamplikon abgeleitet war.
  • Anschließend wurde die interessierende doppelsträngige DNS (d. h. primär die Tester-spezifische Sequenz) quantitativ unter Verwendung von PCR mit 10 Amplifikationszyklen angereichert. Noch verbleibende einzelsträngige DNS wurde mittels Abbau durch eine Einzelstrang-DNS-Nuclease entfernt, unter Verwendung der Mungbohnen-Nuclease, wie im Stand der Technik beschrieben. Die nach dem Nucleaseabbau verbleibende doppelsträngige DNS wurde mittels PCR für zusätzlich 17 bis 27 Zyklen amplifiziert.
  • Schließendlich wurden die Subtraktionsprodukte der Treiber/Tester- und Treiber/Treiber-Kontrolle-Hybridisierungen mittels Restriktionsendonuclease beispielsweise Sau3AI) geschnitten, um die Oligonucleotid-Adapter (2, unten) zu entfernen. Ein Teil dieser DNS-Produkte wurde zusätzlichen Runden der Subtraktion und Amplifikation (ausgehend von der Ligation eines Oligonucleotid-Adaptersatzes, der nicht in einer der vorangehenden Runden der RDA verwendet wurde) unterworfen. Beim Treiber jeder neuen Runde der RDA handelte es sich um das Restriktionsendonuclease-geschnittene Produkt der Treiber/Treiber-Kontrolle-Subtraktion aus der vorangehenden Runde (beispielsweise wurden Treiber/Treiber-Kontrolleprodukte aus der ersten Runde als Treiber in der zweiten Runde wieder eingesetzt, usw.).
  • Diese beschriebenen Modifikationen von bekannten RDA-Verfahren betreffen die Präparation von Amplikons mit verminderter Komplexität für Tester und Treiber-DNS jeweils, zusätzliche RDA-Adaptersätze, Zentrifugationssäulenaufreinigung und Restriktionsendonucleaseverdaue sowie die Verwendung eines wiederverwendbaren Treibers. Da die RDA-Empfindlichkeit bekanntermaßen invers proportional zur Amplikonkomplexität ist, stellt die Art und Weise, wie diese Komplexität gesteuert wird, einen wichtigen Aspekt des Verfahrens dar. Bisher wurden RDA-Amplikons aus DNS abgeleitet, die durch eine Restriktionsendonuclease mit einer 4-Basen- oder 6-Basen-Erkennungsstelle verdaut wurde. Somit lagen nur solche Fragmente ausreichend im Amplikon vor, die kurz genug waren, um effizient mittels PCR amplifiziert zu werden, wodurch sich die Amplikonkomplexität verringerte. Theoretisch wird die Empfindlichkeit der RDA vermindert, wenn die Amplikonkomplexität relativ hoch bleibt (wie im Falle eines Enzyms mit 4 Basen-Erkennungsstelle). Demgegenüber würden weniger Fragmente erzeugt werden, deren durchschnittliche Länge größer wäre, falls ein Enzym mit einer 6 Basenpaar großen Erkennungsstelle verwendet werden würde. Dies führt zu einem Amplikon mit geringerer Komplexität, jedoch erhöht es die Wahrscheinlichkeit, dass die Zielfragmente unzureichend amplifiziert werden würden, um funktionell im Testeramplikon repräsentiert zu sein. Somit würden längere Tester-spezifische Sequenzen in geringerer Kopienzahl vorliegen, relativ zu anderen Sequenzen im Amplikon, bedingt durch eine Tendenz der PCR, kürzere Sequenzen bevorzugt zu amplifizieren, wodurch sich ein Verlust längerer Sequenzen aus dem Amplikon ergeben würde. Somit hätten zuvor beschriebene RDA-Verfahren möglicherweise Zielsequenzen nicht detektiert, falls die Zielsequenz nur in geringer Kopienanzahl vorlag (beispielsweise bei einem Virus mit geringem Titer) oder falls die Restriktionsstellen zu weit voneinander entfernt gewesen wären.
  • In Anbetracht des oben Genannten lag es nahe, dass die Verwendung eines oder mehrerer selektiver PCR-Primer eine präzisere Regulation der Amplikonkomplexität im erfindungsgemäßen Verfahren erlauben würde. Diese Regulation würde somit erlauben, Amplikons unter Verwendung von Restriktionsenzymen zu erzeugen, welche häufiger schneiden (d. h. 4-Basenpaar große Erkennungsstellen), wobei gleichzeitig eine verminderte Amplikonkomplexität aufrechterhalten wird, ähnlich wie dies durch Restriktionsenzyme erreicht wird, die weniger häufig schneiden (d. h. 6-Basenpaar große Erkennungsstellen). Demgemäß konnte eine selektive Primerbindung durch die Verwendung einer spezifischen 3'-Base (Basen) (bezeichnet als "selektive Base") am, bei der Erzeugung der Amplikons verwendeten, PCR-Primer erreicht werden. Theoretisch würden nur solche Restriktionsfragmente amplifiziert werden, die Basen besitzen, welche komplementär zur selektiven Base am 3'-Ende beider Stränge wäre (TABELLE 1 und 1). TABELLE 1 Wirkung der selektiven Primerbindung auf die Amplikonkomplexität
    Figure 00160001
    • a Theoretisches Beispiel eines kleinen viralen Genoms (12300 Bp) in Anwesenheit eines Hintergrunds eines größeren Genoms (4,1 × 109 Bp).
    • b Gesamtzahl der Restriktionsfragmente, erzeugt mittels Verdau mit BamHI (6 Bp große Erkennungsstelle) oder Sau3AI (4 Bp große Erkennungsstelle) und durchschnittliche Fragmentgröße jeweils (unter der Annahme, dass eine statistische Basenverteilung vorliegt).
    • c Berechnete Anzahl von Sau3AI-Fragmenten (% gesamt), die durch einen Primer amplifiziert werden würden, enthaltend eine einzelne spezifische 3'-selektive Base oder durch einen Primer, enthaltend eine doppelt selektive Base (d. h. beide der zwei Basen liegen gleichermaßen häufig am 3'-Ende vor).
  • In Anbetracht der Ergebnisse aus Tabelle 1 sollte die Amplikonkomplexität mittels spezifischer Amplifikation eines Teilsatzes aller möglichen Restriktionsfragmente reduziert werden, nicht jedoch durch die Größenselektion basierend auf der PCR-Effizienz.
  • In der Vergangenheit wurden für die RDA nur drei Oligonucleotid-Adaptersätze verwendet. Ein Satz diente der Erzeugung der Amplikons, und die anderen zwei Sätze wurden alternierend zwischen aufeinanderfolgenden Runden der RDA verwendet. Demgemäß muss ein Adaptersatz aus einer vorhergehenden Runde wiederverwendet werden, wann immer mehr als zwei Subtraktionsrunden durchgeführt wurden. Es wurde festgestellt, dass RDA-Subtraktionsprodukte einen angehängten Oligonucleotid-Adaptersatz aus einer vorherigen Runde aufweisen konnten. Dies stellte ein Problem dar, da solche mitgeschleppten Produkte immer dann amplifiziert werden würden, falls der homologe Adaptersatz wiederverwendet wurde, wodurch die Voraussetzung für eine richtige Hybridbildung umgangen und damit die Subtraktionseffizienz vermindert wurde. Aus diesem Grund wurde für jede neue Runde der RDA ein neuer Oligonucleotidsatz verwendet. Somit würden, obwohl eine Mitverschleppung des Adaptersatzes auftreten könnte, diese Fragmente nur amplifiziert werden, falls sie am subtraktiven Hybridisierungsschritt teilnehmen würden.
  • Als Teilantwort auf das, wie oben beschriebene, Problem des Mitverschleppens des Adaptersatzes wurden alle Restriktionsenzymverdaue mittels Durchleitung dieser Abbauprodukte durch eine Gelfiltrationszentrifugationssäule vor Ligation eines neuen Adaptersatzes aufgereinigt. Es wurde angenommen, dass dies die Konzentration an freien Adaptern, welche vom Restriktionsenzym abgeschnitten wurden, stark vermindert hätte, wodurch diese daran gehindert werden würden, an der darauf folgenden Ligationsreaktion teilzunehmen. Darüber hinaus wurde eine Säulenzentrifugationsaufreinigung während der initialen Bildung von Treiber und Testeramplikons angewendet, um die Menge an nicht ligiertem Oligonucleotidsatz #1 zu verringern, so dass dieser nicht mit den selektiven PCR-Primern in Konkurrenz treten würde. Schließendlich bestand die Annahme, dass eine Aufreinigung mittels Zentrifugationssäulen helfen würde, sehr kleine PCR-Produkte, wie beispielsweise Primerdimere, welche die größeren gewünschten Produkte verdrängen würden, zu eliminieren. In diesem Sinne ist eine solche Zentrifugationssäulenaufreinigung vergleichbar mit dem Schritt der Größenselektion mittels Gelelektrophorese des Testeramplikons wie im Stand der Technik beschrieben, mit der Ausnahme davon, dass eine Selektion gegen kleine PCR-Produkte während des gesamten Verfahrens aufrecht erhalten wird, nicht nur zu Beginn. Somit stellt die Fähigkeit, kleine PCR-Produkte auszusortieren, eine Verbesserung dar, die durch die bekannten RDA-Verfahren nicht realisiert wurde.
  • Bei Durchführung der RDA im Stand der Technik wird das Treiberamplikon zum Zeitpunkt des Verfahrensbeginns einmalig erzeugt und wird für die Subtraktion gegen das Testeramplikon und das Differenzprodukt aus allen darauf folgenden Runden verwendet. Nach der ersten RDA-Runde spiegelt der Treiber jedoch nicht mehr genau die relative Zusammensetzung des Subtraktionsprodukts in Bezug auf die Gleichartigkeit der Sequenzen wider. Ein Ergebnis der Anwendung des RDA-Verfahrens liegt darin, dass mit jeder Subtraktionsrunde der Treiber eine immer geringere Wirksamkeit aufweist. Deshalb besteht ein Nachteil der bisher bekannten RDA-Verfahren darin, dass Sequenzen, die gleichzeitig im Treiber und Tester vorliegen und ineffizient subtrahiert werden, unerwünschterweise als Tester-spezifische Sequenzen durch die RDA isoliert werden können.
  • Deshalb wird ein Treiber benötigt, der genauer die Zusammensetzung des Subtraktionsprodukts nach jeder Runde repräsentiert. Um dies zu erreichen, wurde eine Kontrollsubtraktion (Treiber gegen Treiber) entwickelt, die parallel mit der Treiber-versus-Tester-Subtraktion (vgl. 2) durchgeführt wurde. Das Produkt dieser Kontrollsubtraktion wurde als Treiber für die darauf folgenden Runden verwendet. Diese Möglichkeit, eine Kontrollsubtraktion zu verwenden, sieht eine Quelle für einen variablen Treiber während des gesamten Verfahrens vor, der genau solche Fragmente repräsentiert, die gleichermaßen in Treiber/Tester-Subtraktionsprodukt vorkommen. Ein zusätzlicher Vorteil ist darin zu sehen, dass durch den Vergleich des Treiber/Tester-Subtraktionsprodukts die Treiberkontrolle einen visuellen Hinweis bietet, der bei der Identifikation solcher Fragmente hilft, die Tester-spezifisch sind. Dies ist analog einem direkten Vergleich zweier Proben, wie dies beim Nucleinsäure-Fingerprintingverfahren durchgeführt wird, um Sequenzen zu identifizieren, die spezifisch für eine der zwei Proben ist. Dies stellt eine Option dar, die durch herkömmliche RDA-Verfahren nicht verfügbar war, da bisher nicht bekannt war, wie eine solche Referenz für die RDA erzeugt werden könnte.
  • Die vorliegende Erfindung wird im Anschluss mittels Beispielen näher beschrieben, die nur der Illustration dienen, jedoch den Umfang der Erfindung nicht einschränken.
  • BEISPIELE
  • Die unten angeführten Beispiele beschreiben im Detail die Verwendung des erfindungsgemäßen SPAD-RDA-Verfahrens und darauf folgende Produkt-Screeningverfahren zur Isolierung viraler Sequenzen aus Plasma. Ursprünglich wurde eine Demonstration der SPAD-RDA an Plasmaproben durchgeführt, die einen bekannten Virus enthielten und die Subtraktionsprodukte wurden anschließend auf die Anwesenheit des Virus mittels unterschiedlicher Techniken gescreent. Die Wirksamkeit der kombinierten Verfahren wird mit der des unmodifizierten herkömmlichen RDA-Verfahrens nach Listisyn zur Isolierung von viralen Sequenzen verglichen, wenn dies auf dieselben Proben angewendet wird. Darüber hinaus wird die Verwendbarkeit des SPAD-RDA-Verfahrens bei der Isolierung von Sequenzen eines bisher unbekannten viralen Genoms gezeigt.
  • Beispiel 1. HCV-Proben
  • A. Animpfung von Tieren (Colonel).
  • Ein Acute-Phase Leberhomogenat eines Schimpansen in Passage 2, der mit HCV (Hutchinson-Stamm) infiziert wurde, wurde intravenös einem Schimpansen CH117 inokuliert. Dies führte zu einer chronischen Infektion in CH117. CH117-Serum (10 ml), erhalten 945 Tage nach Infektion dieses Tiers, wurde anschließend intravenös dem Schimpansen CH427 inokuliert. Dies führte zu einer akuten Infektion in CH427, die innerhalb von drei Monaten verschwand. Plasmaproben wurden aus CH427 vor der inititalen Inokluierung gesammelt und anschließend in Intervallen von wenigen Tagen, während denen ALT-Mengen signifikant erhöht waren (vgl. G. G. Schlauder et al., J. Clin. Microbiol. 29: 2175–2179 (1991)).
  • B. HCV-Sequenz.
  • Das komplette HCV-Genom einer Virus-abgeleiteten cDNS aus CH427 wurde sequenziert und bei der Genbank unter der HCV Colonel-Accession-Nummer AF290978 hinterlegt.
  • Beispiel 2. Subtraktiven Hybridisierung gepaarter Proben unter Verwendung von Amplikons mit verminderter Komplexität und einer wiederverwendeten Treiberkontrolle
  • A. Erzeugung doppelsträngiger DNS für Amplikons.
  • Das oben in Materialien und Methoden beschriebene Amplikon-Verfahren wurde verwendet, um ein Testeramplikon aus Gesamtnucleinsäure herzustellen, die aus einem Pool von Acute-Phase CH427 Plasmaproben gewonnen wurde, die am Tag 49, 54, 56, 61, 66, 68, 77 und 84 nach Inokulation erhalten wurden und die zuvor in der RT-PCR HCV-RNS zeigten (G. G. Schlauder et al., supra). Das Treiberamplikon wurde wie folgt aus Gesamtnucleinsäure hergestellt, die aus einer Plasmaprobe von CH427 vor Inokulation erhalten wurde. Dafür wurden 100 μl jedes Plasma unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Kits gewonnen (beispielsweise ein Kit erhältlich von United States Biochemical [USB], Cleveland OH, Katalog Nummer 73750) und 10 μg Hefe tRNS als Träger zugegeben. Diese Nucleinsäuremischung wurde einer reversen Transkription mit Random-Primern unterworfen, gefolgt von einer DNS-Synthese mit Random-Primern. Dann wurde eine 80 μl reverse Transkriptionsreaktion unter Verwendung eines RNS-PCR-Kits (erhältlich von Perkin Elmer, Norwald, CT, Katalog Nummer N808-0017) nach Maßgabe des Herstellers durchgeführt, unter Verwendung von stochastischen (random) Hexameren und bei Inkubationsbedingungen von 10 Minuten bei 20°C gefolgt durch eine Inkubation bei 42°C für eine Stunde. Die Reaktion wurde anschließend unterbrochen und cDNS/RNS-Duplexe mittels Inkubation bei 99°C für 2 Minuten denaturiert. Die Ansätze wurden mit 10 μl 10-fach RP-Puffer (enthaltend 100 mMol NaCl, 420 mM Tris [pH 8,0], 50 mMol DTT, 100 mg/ml BSA) versetzt, 250 pMol Random-Hexamere und 13 Einheiten SequenaseR 2,0 Polymerase (erhältlich von USB, Katalog-Nummer 70775) in einem Gesamtvolumen von 100 μl. Die Ansätze wurden bei 20°C für 10 Minuten inkubiert, gefolgt von einer Inkubation für 1 Stunde bei 37°C. Nach Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanolpräzipitation wurden die doppelsträngigen DNS-Produkte dieser Reaktion mit 4 Units Restriktionsendonuclease Sau3AI (erhältlich von New England Biolabs [NEB], Beverly, MA, Katalognummer 169L) in einem Reaktionsvolumen von 30 μl für 30 Minuten verdaut, nach Maßgabe des Herstellers.
  • B. Erzeugung von Amplikons.
  • Die Sau3A-verdaute DNS wurde wie oben beschrieben extrahiert und präzipitiert. Das gesamte Sau3AI-verdaute Produkt wurde mit 465 pMol R-Bam 24 (SEQUENZ ID NR. 1) und 465 pMol R-Bam-12 (SEQUENZ ID NR. 2) in 30 μl Reaktionsvolumen verschmolzen, gepuffert mit 1 × T4 DNA-Ligasepuffer (erhältlich von NEB), durch Platzieren des Ansatzes in einem 50 bis 55°C Heizblock, der anschließend 1 Stunde bei 4°C inkubiert wurde. Das verschmolzene Produkt wurde mittels Zugabe von 400 Units T4 DNS-Ligase (erhältlich von NEB, Katalog Nummer 202S) ligiert. Nach Inkubation für 14 Stunden bei 16°C wurden 20 μl Wasser zum Ligationsansatz gegeben und der gesamte 50 μl-Ansatz über einer PCR SELECTR-II Zentrifugensäule (erhältlich von 5 Prime, 3 Prime, Boulder, CO, Katalog-Nummer 1-829527) nach Herstellerangaben aufgereinigt. Mit dem Eluat der Zentrifugensäule wurde eine PCR im kleinen Maßstab wie folgt durchgeführt. 20 μl des Zentrifugensäuleneluats wurden zu 42 μl H2O, 18 μl 5-fach PCR-Puffer (335 mM Tris, pH 8,8, 80 mM [NH4] 2504 20 mM MgCl2, 0,5 mg/ml Rinderserumalbumin und 50 mM 2-Mercaptoethanol), 8 μl dNTP-Stock (4 mM jeweils), 1 μl (62 pMol) R-Bam 19C (SEQUENZ ID NR. 3) und 1 μl (62 pMol) R-Bam 19G (SEQUENZ ID NR. 4) gegeben.
  • Die PCR Amplifikation erfolgte in einem GeneAmpR 9600 Thermocycler (erhältlich von Perkin Elmer, Foster City, CA). Die Proben wurden für 3 Minuten bei 72°C inkubiert, danach wurden 10 μl einer Amplitaq-Verdünnung (3,75 Units AmplitaqR [erhältlich von Perkin Elmer, Katalog Nummer N808-1012] in 1-fach PCR-Puffer) (vgl. oben) zugegeben. Die Inkubation erfolgte für weitere 5 Minuten bei 72°C, um die überhängenden 3'-Enden der ligierten Adaptoren aufzufüllen. Die Proben wurden für 30 Zyklen (30 Sekunden bei 95°C, 30 Sekunden bei 60°C, 1 Minute bei 72°C) amplifiziert, gefolgt von einer endgültigen Verlängerungsreaktion bei 72°C für 10 Minuten.
  • Nach der Bestätigung mittels Agarosegel, dass erfolgreich Amplikon erzeugt wurde (d. h. Produkte, die in einem Bereich von ungefähr 100 Bp bis über 1500 Bp liegen), wurde eine Amplifikation des Tester- und Treiber-Amplikons in großem Maßstab durchgeführt. Zwölf 100 μl Polymerase-Kettenreaktionen (PCR) und acht 100 μl PCR respektive wurden, wie oben zur Herstellung von Treiber- und Tester-Amplikons in kleinem Maßstab beschrieben, angesetzt, mit der Ausnahme davon, dass die Amplitaq-Polymerase bei Raumtemperatur zugegeben wurde. Zwei μl des PCR-Produkts aus dem Ansatz in kleinem Maßstab pro 100 μl Reaktionsvolumen dienten als Template für die Amplikonerzeugung in großem Maßstab. Die Thermocyclisierung erfolgte wie oben beschrieben über zusätzliche 20 Zyklen der Amplifikation, mit Ausnahme davon, dass der Endauffüllungsschritt bei 72°C ausgelassen wurde. Die PCR-Reaktion für Treiber und Tester-DNS wurden anschließend jeweils zweimal Phenol/Chloroform-extrahiert, Isopropanol-präzipitiert, mit 70%-igem Ethanol gewaschen, mit Sau3AI verdaut, um selektiver Primersequenzen zu entfernen, erneut extrahiert, präzipitiert und gewaschen. Zehn μg wurden jeweils mittels Zentrifugensäule wie oben beschrieben aufgereinigt. Der durch die Zentrifugensäule aufgereinigte Treiber wird als Treiberkontrolle (DC) benannt, wohingegen der Sau3AI-verdaute Treiber, vor Säulenaufreinigung, als D benannt wird.
  • C. Hybridisierung und selektive Amplifikation von Amplikons.
  • Ein μg Zentrifugensäuleneluat des Testers (T) und DC wurden getrennt voneinander mit J-Bam 24 (SEQUENZ ID NR. 5) und J-Bam 12 (SEQUENZ ID NR. 6) wie oben beschrieben ligiert. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Ligaseaktivität mittels Inkubation der Proben bei 67°C für 10 Minuten gestoppt. Für die erste subtraktive Hybridisierung wurde D-Amplikon (40 μg) gleichzeitig zu DC (0,5 μg) und T (0,5 μg) Amplikons gegeben, die an den J-Bam-Adaptersatz ligiert waren, um die Mischungen DC-1 und D/T-1, respektive (80/1-Verhältnis) zu erzeugen. DC-1 und D/T-1 wurden anschließend Phenol/Chloroform-extrahiert, Ethanol-präzipitiert und wie oben beschrieben gewaschen, und die DNS in 4 μl EE × 3 Puffer (30 mM EPPS, pH 8,0 bei 20°C [erhältlich von Sigma, St. Louis, MO], 3 mM EDTA) resuspendiert, anschließend mit 40 μl Mineralöl überschichtet. Nach Hitzedenaturierung (3 Minuten bei 99°C) wurde 1 μ(l) 5 M NaCl zugegeben und die DNS bei 67°C über 22 Stunden hybridisiert.
  • Die wässrige Phase wurde anschließend in ein neues Röhrchen verbracht und 95 μl TE Puffer (10 mM Tris, pH 7,4 und 1 mM EDTA) zur Probe gegeben und gemischt. Elf μl der verdünnten Hybridisierungsmischung wurden zu 293,7 μl H2O, 88 μl 5fach PCR-Puffer (oben), 35,2 μl dNTP Stock (jeweils 4 mM) und 3,3 μl (16,5 Einheiten) AmplitaqR Polymerase gegeben. Diese Lösung wurde in zwei Aliquots (196 μl jeweils) aufgeteilt und für 5 Minuten bei 72°C inkubiert, um die 5'-Überhänge, die durch die ligierten J-Bam 24 Primer erzeugt wurden, aufzufüllen. Vier μl J-Bam 24 (SEQUENZ ID NR: 5, 248 pMol) wurden pro Röhrchen zugegeben und jeweils 200 μl Ansatz in zwei Aliquots (100 μl jeweils) bei 72°C aufgeteilt. Die Proben wurden anschließend für 10 Zyklen (30 Sekunden bei 95°C, 1 Minute bei 70°C) gefolgt durch eine Endverlängerung bei 72°C für 10 Minuten amplifiziert. DC-1 und D/T-1 wurden getrennt voneinander gepoolt, zweimal Phenol/Chloroform-extrahiert, Isopropanol-präzipitiert, mit 70%-igem Ethanol gewaschen und anschließend in 34 μl H2O resuspendiert.
  • Einzelsträngige DNS wurde mittels Mungobohnen-Nuclease (MBN) wie folgt verdaut. Die amplifizierte DNS wurde mit 20 Untis MBN (erhältlich von NEB, Katalog Nr. 250S) in einem 40 μl Ansatz nach Herstellerangaben verdaut. 160 μl 50 mM Tris, pH 8,9 wurden zum MBN-Verdau gegeben und das Enzym bei 99°C für 5 Minuten inaktiviert. Einundvierzig μl MBN-verdaute DNS wurden zu 242,9 μl H2O, 82 μl 5fach PCR-Puffer (oben), 32,8 μl dNTP-Stock (4 mM jeweils) und 3,1 μl (15,5 Einheiten) AmplitaqR Polymerase und 8,2 μl J-Bam 24 (SEQUENZ ID NR: 5, 508 pMol) gegeben. Diese Lösung wurde in 4 Aliquots (jeweils 100 μl) aufgeteilt und für 17 Zyklen (30 Sekunden bei 95°C, 1 Minute bei 70°C) amplifiziert, gefolgt von einer Enverlängerung bei 72°C für 10 Minuten. Amplifiziertes DC-1 und D/T-1 wurde gepoolt und die Produkte mittels Agarosegelelektrophorese sichtbar gemacht. Die gepoolten Proben wurden zweimal Phenol/Chloroform-extrahiert, Isopropanol-präzipitiert, wie oben gewaschen, anschließend in H2O resuspendiert. Die amplifizierte DNS (40 μg) wurde mit Sau3AI verdaut, und wie oben beschrieben extrahiert und präzipitiert. Die Pellets wurden jeweils in 26 μl H2O resuspendiert. Zehn μg wurden jeweils wie oben beschrieben mit einer Zentrifugensäule aufgereinigt.
  • Anschließend wurde eine DC-1-Präparation im großen Maßstab hergestellt zur Verwendung als Treiber in der zweiten Runde der Subtraktion. Der DC-1 Mungobohnen-Nucleaseverdau (162 μl) zu 960 μl H2O, 324 μl 5fach PCR-Puffer (oben), 129,6 μl dNTP Stock (4 mM jeweils) und 12,25 μl (15,5 Einheiten) AmplitaqR-Polymerase und 32,4 μl J-Bam 24 (SEQUENZ ID NR. 5, 2000 pMol) gegeben. Diese Lösung wurde in 16 Aliquots (jeweils 100 μl) aufgeteilt und für 17 Zyklen wie oben beschrieben amplifiziert. Die Ansätze wurden gepoolt, zweimal Phenol/Chloroform-extrahiert, Isopropanol-präzipitiert, gewaschen, in H2O resuspendiert, mit Sau3AI verdaut, erneut wie oben beschrieben extrahiert und präzipitiert. Das endgültige Pellet wurde in 256 μl H2O aufgenommen.
  • D. Aufeinanderfolgende Hybridisierung/Amplifikationsschritte.
  • Ein μg der mittels Zentrifugensäule aufgereinigten DNS (DC-1 und D/T-1) aus der vorhergehenden Hybridisierung/selektiven Amplifikation wurde an den N-Bam Adaptersatz (SEQUENZ ID NR. 7 und SEQUENZ ID NR. 8) wie zuvor beschrieben ligiert. Für die zweite subtraktive Hybridisierung wurde DC-1-Treiber (40 μg) gleichzeitig zu DC-1 (50 ng) und D/T-1 (50 ng) Produkten, welche zuvor mit dem N-Bam Adaptersatz ligiert wurden, gegeben, um die Mischungen DC-2 und D/T-2 respektive zu erzeugen (800/1-Verhältnis). Die Hybridisierungs- und Amplifikationsschritte wurden, wie oben beschrieben wiederholt, mit der Ausnahme davon, dass die Hybridisierung für 90 Stunden bei 67°C erfolgte, des sich beim verwendeten PCR-Primer um N-Bam 24 (SEQUENZ ID NR. 7) handelte, die Verlängerungstemperatur während des Thermocycling 72°C betrug und die endgültige Amplifikation über 20 Zyklen erfolgte (nach MBN-Verdau). Es wurde eine DC-2 Präparation in großem Maßstab analog zum DC-1-Treiber oben zur Verwendung als Treiber in der dritten Runde erzeugt.
  • Ein μg der Zentrifugensäulen-aufgereinigten DNS (DC-2 und D/T-2) aus der vorhergehenden Hybridisierung/selektiven Amplifikation wurde an den F-Bam Adaptersatz (SEQUENZ ID NR. 9 und SEQUENZ ID NR. 10) wie zuvor beschrieben ligiert. Für die dritte subtraktive Hybridisierung wurde DC-2-Treiber (40 μg) jeweils zu DC-2 (4 ng) und D/T-2 (4 ng) Produkten gegeben, die zuvor mit dem F-Bam Adaptersatz ligiert wurden, um die Mischungen DC-3 und D/T-3 respektive zu bilden (104/1-Verhältnis). Die Hybridisierungs- und Amplifikationsschritte wurden wie oben beschrieben wiederholt, mit der Ausnahme davon, dass die Hybridisierung für 21 Stunden bei 67°C erfolgte, als PCR-Primer F-Bam 24 (SEQUENZ ID NR. 9) verwendet wurde, die Extensionstemperatur während des Thermocycling 72°C betrug und die endgültige Amplifikation (nach MBN-Verdau) über 23 Zyklen erfolgte. Eine DC-3-Präparation in großem Maßstab analog zum DC-1-Treiber wurde wie oben beschrieben zur Verwendung als Treiber in der vierten Runde erzeugt.
  • Ein μg der Zentrifugensäulen-aufgereinigten DNS (DC-3 und D/T-3) der vorangehenden Hybridisierung/selektiven Amplifikation wurde an den S-Bam Adaptersatz (SEQUENZ ID NR. 11 und SEQUENZ ID NR. 12) wie zuvor beschrieben ligiert. Für die vierte subtraktive Hybridisierung wurde DC-3-Treiber (40 μg) jeweils zu DC-3 (400 pg) und D/T-3 (400 pg) Produkten gegeben, die zuvor mit dem S-Bam Adaptersatz ligiert wurden, um die Mischungen DC-4 und D/T-4 respektive zu erzeugen (105/1-Verhältnis). Die Hybridisierungs- und Amplifikationsverfahren wurden wie oben beschrieben wiederholt, mit der Ausnahme davon, dass die Hybridisierung über 94 Stunden bei 67°C erfolgte, als PCR-Primer S-Bam 24 (SEQUENZ ID NR. 11) verwendet wurde, die Extensionstemperatur während des Thermocycling 72°C betrug und der endgültige Amplifikationsschritt nach MBN-Verdau über 27 Zyklen erfolgte.
  • E. Klonierung der Differenzprodukte.
  • Es wurden drei Banden aus der vierten Runde der Subtraktion, die augenscheinlich in D/T-4, nicht jedoch in DC-4 vorlagen, aus einem 2%-igen Agarosegel ausgeschnitten, wie in Materialien und Methoden supra, beschrieben aufgereinigt unter Verwendung des GENECLEAN II Kit (BIO 101, San Diego, CA, Kat. #1001-400) nach Herstellerangaben. Die Differenzprodukte, die zuvor mit Sau3AI verdaut wurden, wurden anschließend in die BamHI-Stelle des pUC18 unter Verwendung des Ready-To-Go-Ligationskits (Pharmacia, Piscataway, New Jersey, Kat. #27-5260-01) nach Herstellerangaben kloniert. 0,5 μl des Ligationsansatzes wurden verwendet, um kompetente E. coli-XL-1 Blue-Zellen (erhältlich von Stratagene, La Jolla, CA, Kat. #200236) nach Herstellerangaben zu transformieren. Die Transformationsmischungen wurden auf LB-Platten, supplementiert mit Ampicillin (150 μg/ml) ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert. Sechsunddreißig der sich ergebenden Kolonien wurden in Flüssigmedium hochgezogen und eine Plasmid-Miniprep-DNS mit dem Wizard 373 DNS-Aufreinigungssystem (erhältlich von Promega, Madison, WI, Kat. #A7030) erzeugt.
  • Zusätzlich zur Klonierung der drei Sau3AI-Fragmente aus den oben beschriebenen Produkten der vierten Runde wurden 50 ng der Gesamtpopulation der Produkte aus der vierten Runde (ungeschnitten) in einen PCR-Produkt-Klonierungsvektor ligiert unter Verwendung des pT7Blue T-Vektorkits plus Ligase (erhältlich von Novagen, Madison, WI, Kat. #6983-1) nach Herstellerangaben. Ein μl des Ligationsprodukts wurde verwendet, um kompetente XL-1 Blue E. coli-Zellen wie zuvor beschrieben zu transformieren und anschließend weitere 36 Plasmid-Minipreps aus den sich ergebenden Kolonien, wie oben beschrieben, hergestellt.
  • Beispiel 3. Identifizierung von HCV Klonen und DNS Sequenzanalyse
  • Es wurde ein Dotblot aller 72 Minipreps aus Beispiel 2 hergestellt und gegen eine HCV Genomsonde hybridisiert. 0,5 μl jeder Plasmidpräparation wurden auf ein Hybond-N-Filter punktförmig aufgebracht (erhältlich von Amersham, Arlington Heights, IL, Kat. #RPN2020B), denaturiert, neutralisiert, UV-quervernetzt und unter Wärme im Vakuum getrocknet, nach Herstellerangaben. Der Dotblot wurde prä-hybridisiert, mit einer 32P-markierten Sonde, die das gesamte HCV-Genom umfasste, hybridisiert, gewaschen und entwickelt, wie im Stand der Technik beschrieben.
  • Ein Teilsatz dieser Klone, welche positiv für HCV Inserts waren (13 von 43) wurde weiter mittels DNS-Sequenzierung untersucht unter Verwendung des ABI automatisierten Sequenzverfahrens, wie im Stand der Technik bekannt (vgl. beispielsweise Muerhoff et al., J. Virol. 71: 6501–6508 (1997)). Diese Sequenzen fallen in fünf nicht-überlappende Konsensusgruppen, wobei jede mit der GenBank Database unter Verwendung des BLASTN Algorithmus (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403–410 [1990]) verglichen wurde. Die BLASTN Suche (Wisconsin Sequence Analysis Package, Genetics Computer Group, Madison, WI; Standard Parameter (d. h. Wortgröße = 11, Match = 1, Mismatch = –3, Lückengewichtung = 10, Längengewichtung = 1)) zeigte, dass ein hoher Grad an Sequenzähnlichkeit mit dem Hepatitis C-Virus für alle 5 Gruppen vorlag. Die Konsensussequenzen waren homolog mit den folgenden fünf Sau3AI-Fragmenten, wie vorausgesehen durch die CH427 HCV Genbank-Sequenz: (1) Basen 3515 bis 3955, (2) 3952 bis 4161, (3) 6470 bis 6683, (4) 6680 bis 6867 und (5) 6864 bis 7101. Diese Sequenzen (ingesamt 1285 Nucleotide) umfassten 13,7% des CH427 HCV-Genoms.
  • Von den 25 Sau3AI-Fragmenten, die in der CH427 HCV-Sequenz vorlagen, waren vier komplett kompatibel mit der selektiven Primersequenz (d. h. beide Enden des Fragments können richtig mit der 3'-Base entweder des einen oder des anderen selektiven Primers paaren). Es wurde davon ausgegangen, dass eines dieser vier Fragmente möglicherweise aufgrund der Größe (1800 Bp) nicht effizient amplifiziert worden war und deshalb nicht im Originalamplikon vorlag. Es blieben deshalb nur drei Fragmente, die theoretisch durch die SPAD-RDA isoliert werden sollten, wobei zwei erhalten wurden (67%). Die verbleibenden drei Sau3AI-Fragmente, welche durch das erfindungsgemäße Verfahren isoliert wurden, wurden nicht vorausgesehen, was darauf hinweist, dass die selektive Primerbindung nicht 100%-ig spezifisch war. Jedoch war für jedes dieser Fragmente ein Ende kompatibel mit den selektiven Primern (3 von 12 oder 25%), während keines der verbleibenden neun Fragmente mit zwei nicht-kompatiblen Enden isoliert wurde (0%). Somit scheint es so, dass die Verminderung der Amplikonkomplexität mittels selektiver Primerbindung von Sau3AI-Fragmenten effektiv war. Im Gegensatz dazu hätten keine HCV-Fragmente isoliert werden können, falls die Amplikons aus BglII, BamHI oder HindIII-Fragmenten bestanden hätten [wie beschrieben von Lisitsyn et al., supra (1993a)]. Die CH427-Sequenz besitzt nur eine (BamHI, HindIII) oder zwei (BglII) Erkennungsstellen dieser Enzyme jeweils, und keines der vorausgesagten Fragmente wäre amplifizierbar.
  • Beispiel 4. Subtraktive Hybridisierung gepaarter Proben unter Verwendung von komplexen Amplikons als Einzeltreiber
  • A. Erzeugung doppelsträngiger DNS für Amplikons.
  • Doppelsträngige DNS für D und T wurde wie oben in Beispiel 2 beschrieben hergestellt.
  • B. Erzeugung von Amplikons.
  • D und T Amplikons wurden wie oben in Beispiel 2 beschrieben hergestellt, mit drei Ausnahmen. Erstens wurde R-Bam 24 (SEQUENZ ID NR. 1) für PCR-Priming verwendet, jeweils in den Amplikons in kleinem und großem Maßstab, bei einer Konzentration von 124 pMol pro 100 μl PCR (nicht 62 pMol jeweils von R Bam 19C und R Bam 19G, Konzentrationen, die zuvor in Beispiel 2 verwendet wurden). Zweitens bestand die Herstellung des D-Amplikons in großem Maßstab aus 16 × 100 μl PCR-Ansätzen (nicht 12, wie zuvor in Beispiel 2). Drittens wurde nur T an den J Bam Adaptersatz ligiert (es wurde keine DC Subtraktion parallel dazu durchgeführt, wie dies zuvor in Beispiel 2 geschehen ist).
  • C. Hybridisierung und selektive Amplifikation von Amplikons.
  • Vier Runden subtraktive Hybridisierung wurden wie in Beispiel 2 oben beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme davon, dass der Treiber für jede Runde D war (nicht das DC Subtraktionsprodukt aus der vorhergehenden Runde).
  • Beispiel 5. Vergleich von RDA-Verfahren
  • Es wurden Southern Blot-Hybridisierungen gemäß Standardverfahren durchgeführt, wie im Stand der Technik beschrieben (vgl. beispielsweise Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989)), um die Leistung der SPAD-RDA, wie hierin beschrieben, mit dem von Lisitsyn et al., Science 259: 946–951 (1993) beschriebenen Verfahren zu vergleichen. 400 bis 500 ng DNS eines Sau3AI-verdauten Treibers, Testers sowie der Produkte aus allen vier Runden der Subtraktion wurden einer Elektrophorese auf drei getrennten 2%-igen Agarosegelen unterworfen: ein Gel jeweils für zwei unterschiedliche Verfahren sowie ein Summengel für einen direkten Vergleich. Nach dem Transfer wurden die Blots prä-hybridisiert, mit 32P-markierter Sonde hybridisiert, die das gesamte HCV-Genom umfasste, gewaschen und entwickelt.
  • Für beide Verfahren wurde eine Zunahme der Sequenzen beobachtet, die an die HCV-Sonde hybridisierten, insbesondere in den späteren Runden (3). Jedoch korrespondierte keine der Ethidiumbromid (EtBr) gefärbten Banden, die in den herkömmlichen RDA-Produkten gesehen wurde, mit einer HCV-Hybridisierungssequenz, was nahelegte, dass solche Sequenzen nach vier Runden der Anreicherung immer noch relativ selten vorkommen. Im Gegensatz dazu hybridisierten drei EtBr gefärbte Banden, die im SPAD-RDA-Verfahren gesehen wurden, mit der HCV-Sonde, was darauf hinweist, dass es sich um Hauptprodukte des Anreicherungsprozesses handelt. Darüber hinaus waren alle drei EtBr-Banden spezifisch für die Tester/Treiber-Subtraktion im Vergleich zur Treiber-Kontrolle, was darauf schließen lässt, dass sogar in Abwesenheit der Sondenhybridisierungsdaten HCV-Sequenzen relativ leicht isoliert werden kann.
  • Beispiel 6. Subtraktive Hybridisierung von nicht-gepaarten Proben unter Verwendung von Amplikons mit verminderter Komplexität und wiederverwendeter Treiber-Kontrolle
  • Eine der Haupteinschränkungen der herkömmlichen RDA zur Isolierung infektiöser Erreger ist die Voraussetzung, dass gepaarte Nucleinsäureproben für die Herstellung der Tester- und Treiberamplikons vorhanden sind. Im Falle von infektiösen Erregern, die Menschen befallen, sind diese gepaarten Proben relativ selten erhältlich, in Ermangelung eines etablierten Tiermodells. Somit ist es nahezu unmöglich, identische Amplikons herzustellen, falls Proben aus zwei Individuen bei der Durchführung des herkömmlichen RDA-Verfahrens verwendet werden sollen. Demgemäß würden isolierte Sequenzen polymorphe Unterschiede zwischen den zwei Individuen darstellen. Tatsächlich zeigte die ursprüngliche Beschreibung der RDA die Isolierung von polymorphen Unterschieden zwischen zwei verwandten Individuen (Lisitsyn et al., supra (1993)).
  • Es wurde davon ausgegangen, dass es durch eine signifikante Verminderung der Komplexität eines Amplikons möglich wäre, nahezu identische Amplikons aus zwei distinkten Nucleinsäurequellen herzustellen. Somit würden die isolierten Sequenzen nach Durchführung einer Reihe von Subtraktionen und Amplifikationszyklen tatsächlich Unterschiede zwischen den zwei Quellen verkörpern und nicht polymorphe Varianten, wie das mittels des herkömmlichen RDA bisher leicht der Fall gewesen ist. Zusätzlich dazu wurde der Treiber wie in Beispiel 2 beschrieben, wiederverwendet, um den Grad der Anreicherung für solche spezifischen Unterschiede zwischen Tester und Treiberamplikons zu erhöhen.
  • A. Erzeugung doppelsträngiger DNS für Amplikons.
  • Unter Verwendung des wie in Materialien und Methoden oben beschriebenen Verfahrens, wurde ein Treiberamplikon unter Verwendung von Gesamtnucleinsäuren aus 50 μl eines Humanplasmapools, erhalten durch Kombination gleicher Volumina von Plasma aus fünf Normalspendern, hergestellt. Jeder dieser Spender war in einer zuvor durchgeführten PCR und einem Immunoassay als Hepatitis A, B, C, D, E und GBV-A, -B und -C negativ bestimmt worden. Testeramplikons wurden aus Plasma-Gesamtnucleinsäure durch eine von zwei Vorgehensweisen hergestellt. Zuerst wurde Nucleinsäure aus 50 μl Humanplasma extrahiert, erhalten aus Patient LG, einem Individuum, bei dem mittels RT-PCR HCV RNS in einer Konzentration von ungefähr 1 × 107 Genomen pro Milliliter nachgewiesen wurde. Als zweites wurde Nucleinsäure aus 50 μl Humanplasma extrahiert, erhalten durch Verdünnung von 5 μl LG-Plasma in 45 μl des, wie oben beschriebenen gesunden, Humanplasmapools. Es wurde angenommen, dass dieses zweite Testeramplikon äquivalent zu 1 × 106 HCV Genomen pro ml war. Das Verfahren zur Extraktion und das Verfahren für die Synthese der Einzelstrang- und Doppelstrang-cDNS war wie in Beispiel 2 beschrieben.
  • B. Hybridisierung und selektive Amplifikation von Amplikons.
  • Das verwendete Verfahren und die Vorgesehensweise zur Hybridisierung und selektiven Amplifikation der Amplikons sind in Beispiel 2 beschrieben, mit einigen Abweichungen. Beispielsweise betrug die Gesamtmenge an verwendetem Treiber 35 μg anstelle von 40 μg (12,5% weniger), obwohl das Tester- und Treiberverhältnis das gleiche für die Runden 2, 3 und 4 der subtraktiven Hybridisierungsreaktion war. Um das gewünschte Verhältnis zu erhalten, wurde die Menge an verwendetem Tester um 12,5% verringert, im Vergleich zu Beispiel 2. Weiterhin wurde die Dauer der Hybridisierung bei 22 Stunden für jede der substraktiven Komponenten des Verfahrens eingehalten.
  • C. Klonierung der Differenzprodukte.
  • Es wurde beobachtet, dass die zwei DNS-Fragmente aus der dritten Runde der Subtraktion/Amplifikation im Tester vorlagen, jedoch nicht in der Treiber-Kontrolle. Diese Fragmente wurden in die BamHI-Stelle von pUC18 ligiert, der anschließend verwendet wurde, um kompetente XL-1 Bluezellen zu transformieren, wie zuvor in Beispiel 2 beschrieben. Sechsunddreißig Kolonien jeder Transformation wurden anschließend in Flüssigkultur angezogen und daraus Plasmid mittels Miniprep-Analyse, wie durchgeführt in Beispiel 2, isoliert. Das größte der zwei Fragmente war ungefähr 475 Bp, nach Ausschneiden aus pUC18 mit einer Kombination der Restriktionsenzyme EcoRI und XbaI und lag in 22 der 36 analysierten Klone vor. Das kleinere der zwei Fragmente besaß nach Ausschneiden aus pUC18 mit EcoRI und XbaI ungefähr eine Länge von 275 Bp, und lag in 18 von 36 Klonen vor.
  • D. Identifizierung von HCV-Klonen und DNS-Sequenzanalyse.
  • Wie in Beispiel 3 beschrieben, wurde jeder der 72 Plasmid DNS auf eine Nylonmembran geblottet, und mit einer 32P-markierten Sonde hybridisiert, die das gesamte HCV-Genom umfasste. Von den 22 Klonen, die das größere, in Beispiel 5(C) oben beschriebene Insert trugen, wurden 16 mit der HCV-Sonde hybridisiert, während zwei der 18 Klone, die das kleinere in Beispiel 5(C) beschriebene Insert trugen, hybridisierungspositiv waren. Sechs der großen Insertklone, die hybridisierungspositiv waren, als auch beide der kleinen Insertklone wurden mittels Sequenzanalyse wie in Beispiel 3 beschrieben untersucht. BLASTN-Vergleich (Wisconsin Sequence Analysis Package, Genetics Computer Group, Madison, WI; Standard Parameter (d. h. Wortgröße = 11, Match = 1, Mismatch = –3, Lückengewichtung = 10, Längengewichtung = 1)) zeigte, dass die größeren Klone identisch zueinander waren und aus den Basen 6469 bis 6912 des HCV-1 abgeleitet waren, dem sogenannten Prototyp-Genom (GenBank Numer M62321). Die zwei kleineren Klone waren auch identisch zueinander und repräsentierten die Basen 6912 bis 7103 des HCV-1 Prototyp-Genoms. Aus dieser Analyse wurde die Schlussfolgerung gezogen, dass mittels ausreichender Verminderung der Komplexität zweier nicht gepaarter Proben und unter Verwendung einer gepoolten Probe als Treiber Amplikons hergestellt werden konnten, die im Wesentlichen identisch für die subtraktiven Hybridisierungszwecke waren. In diesem Sinne konnten Sequenzen isoliert werden, welche tatsächliche Unterschiede zwischen den zwei Nucleinsäurequellen aufwiesen.
  • Beispiel 7. Immunisolierung eines cDNS Klons, der für eine antigene Region eines neuartigen infektiösen Erregers codiert
  • Diese Experimente dienten zwei Zwecken: (i) Festzustellen, ob RDA-abgeleitete Amplikons, die immunreaktive Proteindomänen (Epitope) des infektiösen Erregers codieren, mittels Immunoscreening isoliert werden könnten, falls sie in einem geeigneten Vektor kloniert werden würden, um so eine Expressionsbibliothek zu erzeugen und (ii) festzustellen, ob RDA tatsächlich diese Sequenzen in aufeinanderfolgenden Verfahrensrunden anreichern würde. Um das oben Genannte zu testen, wurden die zuvor aus jeder der vier RDA-Runden erzeugten Amplikons sowie die nichtsubtrahierten Testeramplikons, wie in Beispiel 2 beschrieben, in lgt11 kloniert. Die sich ergebenden Bibliotheken wurden anschließend unter Verwendung von Serum des sich in Genesung befindenden Affen CH427 immunogescreent, um immunoreaktive Epitope, die von HCV codiert werden, zu isolieren.
  • Es wurde festgestellt, dass, um eine repräsentative Expressionsbibliothek in lgt11 zu erzeugen, RDA-abgeleitete Amplikons in der Bibliothek in jedem der drei Forward-Leserahmen vorliegen müssen. Zusätzlich dazu benötigten die Amplikons die Ligation von Linkern/Adaptern, welche die Expression in jeden der drei Forward-Leserahmen erlaubten und eine EcoRI-Restriktionsendonuclease-Erkennungsstelle vorsehen, da die Klonierungsstelle in lgt11 nur EcoRI-verdaute DNS-Fragmente einbauen kann. Die in Tabelle 2 gezeigten Linker/Adapter wurden so konzipiert, dass, wenn sie zur Bildung eines doppelsträngigen Adapters verschmelzen, sie einen Sau3AI-kompatiblen 5'-Überhang (5'-GATC ...) aufweisen sowie eine EcoRI-Restriktionsendonuclease-Erkennungsstelle.
  • Tabelle 2
    Figure 00340001
  • Die drei Adaptersätze (BE1F/R, BE2F/R, BE3F/R) wurden in drei getrennten Reaktionen an die Amplikons ligiert. Die Linker-adaptierten Amplikons wurden aus einem Überschuss von Linkern aufgereinigt und anschließend an lgt11 Arme ligiert, wodurch drei getrennte Bibliotheken entstanden, wobei jede davon einen der drei möglichen Forward-(sense)-Leserahmen repräsentiert. Die gleiche Zahl von rekombinanten Phagen für jede dieser Bibliotheken wurde zur Herstellung der endgültigen Bibliothek kombiniert.
  • A. Erzeugung der cDNS-Bibliothek
    • 1. Herstellung der Linker/Adapter: Es wurden 100 μM Stocklösungen (in Wasser) für jede der sechs synthetischen einzelsträngigen Oligos, die in Tabelle 2 gezeigt sind, hergestellt. Zwanzig μl des korrespondierenden Forward- und Reverse-Primerpaars wurden vermischt und für 10 Minuten auf 65°C erwärmt. Die Röhrchen wurden anschließend in 37°C für 10 Minuten transferiert und danach vor Verwendung auf Raumtemperatur (20–23°C) für 10 Minuten abgekühlt.
    • 2. Herstellung der Amplikons: Amplikons für jede der vier RDA-Runden wurden aufgereinigt, um Rest-RDA-Adapter zu entfernen, die möglicherweise nach dem Sau3AI-Verdau vorlagen, Phenol:Chloroform-Extraktion und Ethanolpräzipitation. 500 ng Tester, D/T-1, D/T-2, D/T-3, D/T-4 Amplikons wurden unter Verwendung des GeneClean Kits (Bio-101, San Diego, CA) nach Herstellerangaben aufgereinigt. Nachdem doppelsträngige DNS-Fragmente mit einer Größe von weniger als 200 Bp nicht effizient an das Glasmilchharz des Kits binden, sollten jegliche noch in den Amplikons vorliegende RDA-Adapter entfernt werden. Die DNS wurde aus dem Glasmilchharz in 300 μl Wasser eluiert. Jede Probe wurde in drei gleiche Teile (100 μl) geteilt und mit Natriumacetat und 100%-igem Ethanol unter Verwendung von Standardverfahren präzipitiert. Die Ausbeute zu diesem Zeitpunkt betrug annähernd 100%, so dass jedes Röhrchen in etwa 166 ng DNS enthielt.
    • 3. Ligation der drei Leserahmen Linker/Adapter: Jedes der aufgereinigten RDA-Amplikons (166 ng) wurde an jeden der drei Leserahmenadapter ligiert; somit wurden 15 getrennte Ansätze hergestellt. Die präzipitierte DNS wurde in 2,5 μl Wasser resuspendiert und die folgenden Komponenten zugegeben: 1 μl 10fach Ligasepuffer (200 mM Tris-HCl, pH 7,6, 50 mM MgCl2), 0,5 μl 100 mM DTT, 0,5 μl 10 mM ATP, 0,5 μl T4 DNS-Ligase (2–3 Weiss-Einheiten), 5 μl 100 μM verschmolzener Leserahmen 1, 2, oder 3 Linkeradapter. Das Gesamtvolumen betrug 10 μl. Die Ansätze wurden bei 4°C für etwa 16 Stunden inkubiert. Anschließend wurden die Ansätze bei 65°C inkubiert, um die Ligase zu inaktivieren. Die Proben wurden anschließend der Phenol:Chloroform-Extraktion unterzogen und Ethanol-präzipitiert.
    • 4. EcoRI-Verdau: Das getrocknete Pellet aus Schritt 4 oben wurde in 85 μl Wasser resuspendiert und anschließend mit der Restriktionsendonuclease EcoRI (100 Einheiten) in einem Endvolumen von 100 μl für 3–4 Stunden bei 37°C verdaut. Vor Ligation der adaptierten Amplikons an lgt11 Arme mussten die EcoRI-Fragmente, welche während des Verdaus freigesetzt wurden, entfernt werden. Die Proben wurden deshalb mittels des GeneClean-Verfahrens wie oben beschrieben aufgereinigt. Die DNS wurde in 10 μl Wasser eluiert.
    • 5. Ligation an lgt11 Arme: Die Linker-adaptierten aufgereinigten Amplikons wurden an lgt11 Arme unter Verwendung des lgt11 EcoRI-CIAP-behandelten Vektorkits (Stratagene, San Diego, CA) nach Herstellerangaben, in einem Endvolumen von 15 μl ligiert. Die Ligationsansätze wurden bei 16°C für etwa 16 Stunden inkubiert. Es wurde auch eine Ligationsnegativkontrolle, in der sich kein Insert in der Reaktionsmischung befand, und eine Reaktionspositivkontrolle, die ein vom Hersteller geliefertes Insert enthielt, durchgeführt.
    • 6. Verpackung und Titration der Bibliotheken: Der rekombinate Phage wurde in Lambda-Phage unter Verwendung des GigaPack III Gold Packaging-Extrakts (Stratagene, San Diego, CA) nach Herstellerangaben verpackt. Vier Mikroliter (4 μl) jeder Ligation wurden für die Verpackung verwendet. Die sich ergebenden Bibliotheken (0,5 ml) wurden unter Verwendung von E. coli Y1090r-Zellen titriert (Stratagene, La Jolla, CA) in Anwesenheit von X-GAL und IPTG, die eine Blau-Weiß-Selektion des rekombinanten Phagen unter Verwendung von herkömmlichen Verfahren zur Infektion und Ausplattierung ermöglichten. Vergleiche beispielsweise J. Sambrook et al., supra. Die Titrationsergebnisse und Volumina jeder verwendeten Bibliothek, zur Erzeugung eines ausreichenden Pools zu, sind in Tabelle 3 wiedergegeben. Das zur Erzeugung der gepoolten Bibliothek verwendete Volumen jeder korrespondierenden Leserahmenbibliothek (beispielsweise aus Tester, D/T/-1, usw.) wurde wie folgt berechnet: Um 185.000 Rekombinationsereignisse (d. h. Phagen, die Inserts enthielten) zu erhalten, musste wie folgt um die Rekombinationseffizienz korrigiert werden: Volumen zu Pool = 185.000 Rekombinationsereignisse/% Rekombinationsereignisse × Plaque-bildende Einheiten (pfu) Titer (pfu/μl)
  • Für D/T-1 wurde die Gesamtzahl an Klonen mit Inserts zum Poolen für jede Leserahmenbibliothek willkürlich bei 171.000 gesetzt. Da das benötigte Volumen für die Tester-Leserahmen 1-Bibliothek 2,42 ml betrug und nur 0,5 ml erhältlich waren, wurden zusätzliche Verpackungsreaktionen durchgeführt, um 185.000 Rekombinationsereignisse (Daten nicht gezeigt) zu erhalten. TABELLE 3
    Figure 00370001
    Figure 00380001
    • 1 T = Tester
    • 2 N/A = nicht durchführbar
  • Nach dem Poolen der Leserahmen 1, 2 und 3 Bibliotheken wurden die endgültigen Bibliotheken wie oben beschrieben retitriert und ausplattiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt.
  • TABELLE 4
    Figure 00380002
  • B. Immunoscreening der Lambda-gt11-Bibliothek.
  • Das für das Immunoscreening des rekombinanten Phagen verwendete Verfahren basierte auf dem von Young und Davis beschriebenen Verfahren mit Modifikationen, wie unten beschrieben (R. A. Young und R. W. Davis, PNAS 80: 1194–1198 (1983)). Bei dem primär verwendeten Antiserum handelte es sich um Serum des genesenden (28. Woche nach Animpfung) Schimpansen CH427 (vgl. Beispiel 1). Das Antiserum wurde vor Verwendung gegen E. coli-Extrakt prä-adsorbiert, um nicht-spezifische Wechselwirkungen des Antikörpers mit E-coli-Proteinen zu verringern und anschließend 1:500 in Tris-gepufferter Saline (TBS), pH 7,5, enthaltend 1% BSA, 1% Gelatine und 3% Tween-20® ("Blockierungspuffer") verdünnt. 75.000 rekombinante Phagen aus jeder der fünf in Tabelle 3 gezeigten Bibliotheken wurden auf einem E. coli-Rasen, Stamm Y1090r- (Stratagene, La Jolla, CA) ausplatziert und bei 37°C für 3,5 Stunden inkubiert. Die Platten wurden anschließend mit Nylonfiltern bedeckt, die mit IPTG (10 mM) getränkt waren und die Platten bei 42°C für 3,5 Stunden inkubiert. Die Filter wurden anschließend für 1 Stunde bei 22°C in Blockierungspuffer blockiert und anschließend mit primärem Antiserum (1:500-Verdünnung) bei 4°C für 16 Stunden inkubiert. Das primäre Antiserum wurde entfernt und für darauf folgende Runden der Plaque-Aufreinigung aufgehoben. Die Filter wurden viermal in Tris-Saline, enthaltend 0,1% Tween-20® (TBS-Tween) gewaschen. Die Filter wurden anschließend in Blockierungspuffer inkubiert, enthaltend alkalische Phosphatase konjugiertes Ziegen-Antihuman-IgG (0,1 g/ml) (erhältlich von Kirkegaard und Perry, Gaithersburg, MD) für 60 bis 120 Minuten bei 22°C, dreimal mit TBS-Tween gewaschen, gefolgt durch einmaliges Waschen mit TBS. Immunoreaktive Klonen wurden unter Verwendung des BCIP/NBT Farbentwicklungskits (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) nach Herstellerangaben visualisiert.
  • Die immunoreaktiven Klone wurden aus den Originalplatten isoliert und anschließend einer zweiten Runde des Immunoscreenings unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren unterworfen. Die Inserts dieser Klone, die nach der zweiten Runde des Immunoscreenings weiterhin immunoreaktiv waren, wurden mittels PCR-Amplifikation des Inserts unter Verwendung von lgt11 Forward- und Reverse-Primern isoliert. Die PCR-Produkte wurden mittels Elektrophorese unter Verwendung eines 2%-igen Agarosegels getrennt, anschließend ausgeschnitten und unter Verwendung des QIAEX Gel-Extraktionskits (Qiagen, Chatsworth, CA) aufgereinigt. Die aufgereinigten PCR-Produkte wurden direkt auf einer ABI Modell 373 DNS Sequenzmaschine sequenziert unter Verwendung des ABI-Sequencing Ready Reaktionskits (Perkin-Elmer, Norwalk, CT) und lgt11 Forward- und Reverse-Primern. Die Anzahl an Klonen, deren Sequenz nachgewiesenermaßen aus dem HCV-Stamm stammte, der den Affen CH427 infiziert hatte, ist in Tabelle 5 gezeigt.
  • TABELLE 5
    Figure 00400001
  • Von den 36 Klonen, die sequenziert wurden, zeigte die Analyse, dass sie sämtlich Sequenz-identisch mit einem Segment des NS5-Gens an den Positionen 6680 bis 6867 des CH427-HCV-Genoms (GenBank Accession Nummer AF290978) waren. Es bleibt festzuhalten, dass Sau3AI Restriktionsfragmentendonuclease-Erkennungsstellen an diesen beiden flankierenden Positionen zu finden sind und dass dieses Fragment bei der Sequenzanalyse der D/T-4-Subtraktionsprodukte (vergleiche Beispiel 3) gefunden wurde. Darüberhinaus, ausgehend von den in Tabelle 5 gezeigten Daten ist es eindeutig, dass das RDA-Verfahren dieses Fragment anreichert, dadurch dass es in hoher Kopienzahl in der Bibliothek der dritten Runde der selektiven Amplifikation/Subtraktion (D/T-3) vorliegt, im Vergleich zu den Bibliotheken, die aus der ersten oder zweiten Runde abgeleitet wurden. Leider war es nicht möglich, den für dieses Fragment erreichten Anreicherungsgrad genau festzustellen, da keine HCV-abgeleiteten immunoreaktiven Klone aus den ursprünglichen Tester-Amplikons erhalten wurden. Jedoch wurde die Durchführbarkeit der Erzeugung der Expressionsbibliotheken in lgt11 aus RDA-abgeleiteten Amplikons gezeigt. Es wurde weiterhin gezeigt, dass man aus einer solchen Expressionsbibliothek Sequenzen isolieren kann, die für Epitope codieren, welche aus einem infektiösen Erreger abgeleitet sind.
  • Beispiel 8. Bestimmung des Anreicherungsgrads von Tester-spezifischen Sequenzen mittels modifizierter RDA.
  • Um genau den Anreicherungsgrad zu bestimmen, der für die Tester-spezifischen Sequenzen erreicht wurde, wurden die in lgt11 (vgl. Beispiel 7) erzeugten Bibliotheken mittels Southern-Hybridisierung wie folgt beschrieben mit drei cDNS-Sonden gescreent, die das gesamte HCV-Colonel-Genom umfassten.
  • Die aus den Amplikons jeder Runde des modifizierten RDA (vgl. Tabelle 4) erhaltenen lgt11 Bibliotheken wurden verwendet, um E. coli-Zellen zu infizieren, gemäß bekannter Verfahren. Es wurden fünfundzwanzigtausend pfu für den Tester und D/T-1, D/T-2 und D/T-3 Bibliotheken ausplattiert. Da für die D/T-4 Bibliothek eine genaue Auszählung nicht möglich war, ein vorläufiges Experiment hatte ergeben, dass die Dichte der hybridisierbaren Plaques extrem hoch war, wurde die Bibliothek erneut bei 200 und 1000 pfu pro Platte ausplattiert. Es wurden Duplikatfilterabdrücke von Duplikatfiltern für jede Bibliothek (d. h. D/T-1, 2, 3 und 4) hergestellt, und die Filter unter Verwendung herkömmlicher Verfahren mit drei 32P-radiomarkierten cDNS hybridisiert, die das gesamte HCV-Genom umfassten. Nach dem Waschen der Filter bei hoher Stringenz und Auslegen auf einem Röntgenfilm, wurde die Anzahl der Plaques, welche auch auf dem Duplikatfilter hybridisierten, gezählt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 gezeigt. TABELLE 6
    Figure 00420001
    • a Rekomb.Effiz. = Rekombinationseffizienz. Die Rekombinationseffizienz der Bibliothek wurde bestimmt mittels Ausplattieren eines Teils der Bibliothek in Anwesenheit von IPTG und XGAL, und anschließender Bestimmung der Anzahl an rekombinanten (weißen) Plaques und nicht-rekombinanten (blauen) Plaques. Die Effizienz ist die Anzahl der erhaltenen weißen Plaques geteilt durch die Gesamtzahl der ausplattierten Ereignisse.
    • b Berechnung des Verhältnisses von Hybridisierungs-positiven zu Hybridisierungs-negativen Plaques wurde durchgeführt durch Teilung des Mittelwerts der Hybridisierungs-positiven Plaques durch die Anzahl an tatsächlich rekombinanten Plaques auf der Platte; d. h. 25.000 (Anzahl der ausplattierten Plaques) multipliziert mit der Rekombinationseffizienz der Bibliothek.
    • c Anreich. = Anreicherungsgrad. Die Berechnung des Anreicherungsgrads wurde durchgeführt mittels Division des Verhältnisses von erhaltenen positiven:negativen Plaques für jede Bibliothek mit den Ergebnissen aus der Tester-Bibliothek.
  • Die in Tabelle 6 gezeigten Ergebnisse zeigen, dass das modifizierte RDA-Verfahren für HCV-spezifische Sequenzen mit jeder voranschreitenden Runde der Amplifikation/Subtraktion anreicherte. Bei der vierten Runde waren die HCV-Sequenzen in einem Drittel der Klone der Bibliothek zu finden, im Vergleich zu 1/554 Klone der Tester (nicht angereicherten) Bibliothek. Dies stellt eine 276-fache Anreicherung der HCV-Sequenzen dar. Somit sehen diese Daten einen quantitativen Beweis dafür vor, dass das modifizierte RDA-Verfahren zu einer sehr signifikanten Anreicherung der Tester-abgeleiteten Sequenzen führt.
  • Beispiel 9. Isolierung von Tester-abgeleiteten Sequenzen unter Verwendung von differentieller Hybridisierung
  • Wie in Beispiel 7 oben gezeigt, ist es möglich, RDA, gefolgt vom Immunoscreening einer Expressionsbibliothek, enthaltend Tester-abgeleitete Amplikons, zu verwenden, um Sequenzen zu isolieren, die aus einem infektiösen Erreger abgeleitet sind. Ein weiteres Verfahren zur Isolierung solcher Sequenzen verwendet ein als differentielle Hybridisierung bekanntes Verfahren (vgl. 4). (Vgl. beispielsweise J. Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989).) Dieses System schließt die Erzeugung einer Bibliothek aus RDA-angereicherten Tester-Amplikons ein, gefolgt von Southern-Hybridisierung auf Duplikatfiltern, die von der gleichen Tester-Bibliothekplatte stammen, unter Verwendung von Tester- und Treiber-Kontrolle abgeleiteten Amplikons als Sonden. Die in der Bibliothek vorliegenden Sequenzen, welche nur im Tester gefunden werden, hybridisieren mit der Tester-Amplikonsonde, nicht jedoch mit der Treiber-Amplikonsonde; Sequenzen, die dem Tester und dem Treiber gemeinsam sind, werden mit beiden Sonden hybridisiert. Somit können Sequenzen isoliert werden, die Tester-spezifisch und potentiell aus einem unbekannten infektiösen Erreger abgeleitet sind oder möglicherweise ein Gen, das während der Infektion und/oder Erkrankung hochreguliert wird.
  • Die aus der dritten Runde des modifizierten RDA-Verfahrens abgeleitete lgt11 Bibliothek (D/T-3; Tabelle 4) wurde wie folgt für eine differentielle Hybridisierung verwendet. Fünftausend Plaques wurden auf jede der vier großen NZY-Agarplatten wie oben beschrieben ausplattiert. Die Phagen-DNS wurde anschließend auf Nylonfiltern immobilisiert, denaturiert, neutralisiert, UV-quervernetzt und in einem Vakuumofen für 30 Minuten bei 80°C getrocknet. Die Duplikat-"Abdrücke" der Phagen-DNS wurden für jede Platte hergestellt. Die Filter wurden anschließend mit radioaktiv markierten Tester- und Treiber-Amplikon-Sonden hybridisiert. Die Sonden wurden aus 25 ng DC-3 oder D/T-3 DNS hergestellt, die mit Sau3AI verdaut wurden, um Linker/Primer-Sequenzen zu entfernen, gefolgt von Entfernen von Linker/Primer-DNS-Fragmenten unter Verwendung von G50 Sepharose-Zentrifugensäulen. Die Sonden wurden mittels Random-Primern radioaktiv markiert, gefolgt von der Entfernen von nicht eingebautem 32P-dATP unter Verwendung herkömmlicher Verfahren. Ein Satz der Duplikatfilter wurde mit den Testerproben hybridisiert und der andere Satz mit der Treiberprobe und unter stringenten Bedingungen gewaschen. Die Filter wurden auf einen Röntgenfilm aufgelegt und die Autoradiographie aus Duplikatfiltern miteinander verglichen. Plaques, welche mit der Testersonde hybridisierten, nicht jedoch mit der Treibersonde, wurden für eine darauf folgende Testung ausgewählt. Eine Gesamtzahl von 12 Plaques wurde isoliert und einer zweiten Runde des differentiellen Hybridisierungsscreenings unterworfen.
  • Beim der zweiten Screeningrunde wurde eine Gesamtzahl von vier Plaques festgestellt, die eine Hybridisierung mit der Testersonde aufwiesen. Diese vier Plaques (Klone) wurden aus den Platten isoliert und die Insertsequenz mittels Verwendung von lgt11 Forward- und Reverse-Primern amplifiziert (Stratagene, La Jolla, CA). Die PCR-Produkte wurden mittels Elektrophorese auf einem 2%-igen Agarosegel getrennt, anschließend ausgeschnitten und mittels des QIAEX Gel-Extraktionskits (Qiagen, Chatsworth, CA) auf gereinigt. Aufgereinigte PCR-Produkte wurden direkt auf einem ABI-DNS-Sequenzermodell 373 (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) sequenziert, unter Verwendung des ABI Sequencing Ready Reaction Kits (Perkin-Elmer) und gt11 Forward- und Reverse-Primern. Die Analyse der sich ergebenden Sequenz zeigte, dass alle vier Klone Insert-DNS-Sequenzen besaßen, korrespondierend zu einem 437 Basenpaar großen Sau3AI-Fragment von HCV-CH427 (entsprechend Nucleotiden 3514–3951). Somit wurde ein aus HCV abgeleiteter Klon mittels differentieller Hybridisierung einer mittels modifizierter RDA angereicherten lgt11 Bibliothek isoliert.
  • Beispiel 10. Isolierung eines neuartigen Virus mittels subtraktiver Hybridisierung von nicht-gepaarten Proben unter Verwendung von SPAD-RDA
  • Die Verwendbarkeit des SPAD-RDA-Verfahrens unter Verwendung nicht-gepaarter Proben wurde in Beispiel 6 demonstriert. Diese Strategie wurde auf eine Probe angewendet, abgeleitet aus einem Schimpansen (CH19), welcher mit HCV infiziert war, der gleichzeitig jedoch ein zusätzliches nicht identifiziertes Virus (Viren) trug. Zuvor wurde das Serum aus einem menschlichen Spender, enthaltend Virus-ähnliche Partikel, nacheinander durch 6 Schimpansen geschleust. Ein Plasmapool dieser Schimpansen wurde CH19 inokuliert, wodurch es zu einer akuten Hepatitiserkrankung kam.
  • Erzeugung doppelsträngiger DNS für Amplikons:
  • Unter Verwendung des in "Materialien und Methoden" beschriebenen Verfahrens wurde ein Treiber-Amplikon hergestellt unter Verwendung von Gesamtnucleinsäure aus 100 μl eines Plasmapools, erhalten durch Kombination gleicher Volumina von Plasma aus 6 normalen Schimpansen. Das CH19 Tester-Amplikon wurde hergestellt aus zwei Pools von Plasma-Gesamtnucleinsäure (0 bis 30 Tage nach Infektion und 36 bis 83 Tage nach Infektion). 100 μl jedes Testerpools wurden getrennt voneinander im Amplikonschritt in kleinem Maßstab bearbeitet, wobei gleiche Volumina jeweils kombiniert und verwendet wurden, um ein einzelnens Tester-Amplikon in großem Maßstab zu erzeugen. Das Verfahren der Extraktion und die Verfahren, die für die Synthese des ersten und zweiten Strangs der cDNS verwendet wurde, sind in Beispiel 2 beschrieben.
  • Hybridisierung und selektive Amplifikation des Amplikons.
  • Die Methoden und Verfahren zur Hybridisierung und selektiven Amplifikation der Amplikons sind in Beispiel 2 beschrieben mit den folgenden Ausnahmen: 1) 0,5 bis 1,0 μg Sau3AI geschnittene cDNS, repräsentierend das gesamte CH427 HCV Genom, wurden zu 40 μg des Treibers vor jeder Subtraktionsrunde zugegeben. Dies erfolgte, um die Wahrscheinlichkeit zu verringern, dass HCV, das bekanntermaßen in der CH19 Probe vorlag, durch das SPAD-RDA angereichert werden würde, und um die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen andere Viren, die möglicherweise in der Probe vorliegen, detektiert zu können. 2) Die Dauer der Hybridisierung lag bei 21 bis 22 Stunden für jede der subtraktiven Komponenten des Verfahrens. 3) Es wurden nur 3 Subtraktionsrunden durchgeführt.
  • Klonierung der Differenzprodukte.
  • Multiple DNS-Fragmente aus der 3. Runde der Subtraktion/Amplifikation lagen im Tester vor, nicht jedoch in der Treiber-Kontrolle. Diese Fragmente wurden in den pT7Blue Cloning Vektor ligiert, der anschließend verwendet wurde, um kompetente XL-1 Blue-Zellen, wie in Beispiel 2 beschrieben, zu transformieren. Zwölf von 18 Kolonien jeder Transformation (72 insgesamt) wurden anschließend in flüssigem Medium angezogen, aus dem dann das Plasmid isoliert wurde, gefolgt von einer Miniprep-Analyse wie in Beispiel 2. Die Insertgröße reichte von etwa 350 Basenpaaren bis 900 Basenpaaren.
  • Identifizierung von HCV-Klonen und DNS-Sequenzanalyse.
  • Wie in Beispiel 3 beschrieben, wurden 65 der 72 Plasmid-DNS mittels Sequenzanalyse untersucht. Diese Sequenzen unterteilten sich in 13 Konsensusgruppen. BLASTN-Vergleiche (Wisconsin Sequence Analysis Package, Genetics Computer Group, Madison, WI; Standard Parameter (d. h. Wortgröße = 11, Match = 1, Mismatch = –3, Lückengewichtung = 10, Längengewichtung = 1)) zeigte, dass 7 der Konsensusgruppen homolog zur GB-Virusfamilie waren, insbesondere GBV-C, während die anderen 6 Konsensusgruppen homolog zu nicht-viralen Sequenzen waren oder nicht in der Datenbank gefunden werden konnten. Über 80% (54 von 65) Klonen enthielten Sequenzen des neuen Virus, während keine HCV-Sequenzen beobachtet wurden. Daraus kann geschlossen werden, dass die SPAD-RDA von zwei nicht-gepaarten Proben erfolgreich für die Isolierung von Virus (Viren) mit unbekannter Sequenz angewendet werden kann, falls gleichzeitig ein bekannter Virus im Tester vorliegt.
  • Beispiel 11. Subtraktive Hybridisierung von gepaarten oder nicht-gepaarten Proben unter Verwendung von Amplikons mit verminderter Komplexität und einer Einzelhybridisierungsreaktion als Quelle für die wiederverwendete Treiber-Kontrolle und die Ziel-angereicherte Fraktion
  • In den vorangehenden Beispielen wurden die Vorteile einer wiederverwendeten Treiber-Kontrolle gegenüber dem Einzeltreiber für das herkömmliche RDA-Verfahren gezeigt. Jedoch setzt dies voraus, dass eine Treiber-Kontrollsubtraktion parallel mit der Treiber/Tester-Subtraktion durchgeführt wird. Aufgrund der getrennten Natur können Unterschiede, die in einer Subtraktion auftreten, nicht jedoch in der anderen, zu dem Verlust des gewünschten "gepaarten" Aspekts der Produkte führen. Solche Unterschiede können zufällig vorkommen oder als Konsequenz einer Sequenzvariabilität zwischen nicht-gepaarten Treiber- und Testerproben. Mit jeder Subtraktionsrunde ist es wahrscheinlich, dass die Anzahl und der Schweregrad solcher Unterschiede zunehmen wird, was zu einer verminderten Treibereffizienz führt und zur Isolierung von Sequenzen, die nicht-spezifisch für den Tester sind (was häufig auftritt). Die Entwicklung eines Verfahrens, bei dem die Erzeugung der Treiber-Kontrolle und der Treiber/Tester-Subtraktionsprodukte dergestalt verknüpft sind, dass diese Unterschiede minimiert werden, sollte sich somit als zweckdienlich erweisen. Das folgende Beispiel wird als Verfahren zur Erreichung dieses Ziels vorgeschlagen.
  • A. Erzeugung doppelsträngiger DNS für Amplikons.
  • Doppelsträngige DNS für D und T wurden wie in Beispiel 2 beschrieben (Teil A) hergestellt.
  • B. Erzeugung von Amplikons.
  • D und T-Amplikons werden wie in Beispiel 2 oben beschrieben hergestellt (Teil B).
  • C. Hybridisierung und selektive Amplifikation von Amplikons.
  • Die gewünschte Anzahl der Runden der subtraktiven Hybridisierung wird wie in Beispiel 2 beschrieben (Teil C), mit Ausnahme des unten und in 5 Beschriebenen durchgeführt.
  • Das Oligonucleotid, das auf die DC ligiert wird, enthält eine 5-geprimte Biotinmarkierung (beispielsweise 5'-Bio J-Bam 24, SEQUENZ ID NR: 5). Das gleiche Oligonucleotid, ohne Biotin (beispielsweise J-Bam 24, SEQUENZ ID NR: 5) wird mit dem Tester ligiert. Als nächstes wird eine Einzelhybridisierungsmischung (Hyb-1) hergestellt, umfassend das D-Amplikon (40 μg), plus DC (0,5 μg) und T (0,5 μg) Amplikons, die mit dem J-Bam Adaptersatz ligiert sind, mit oder ohne die 5-geprimte Biotinmarkierung respektive (80/1/1-Verhältnis). Nach Hybridisierung bei 67°C und Verdünnung mit TE-Puffer werden 50 μl (20 μg) der Hybridisierungsreaktion (beispielsweise mit dem QIAquickR PCR Aufreinigungskit, QIAGEN, Chatsworth, CA) nach Herstellerangaben aufgereinigt, Gesamtvolumen 60 μl), um nicht-ligierte Oligonucleotide zu eliminieren. Diese Aufreinigung ist mit eingeschlossen, um jegliche noch vorhandene 5'-Bio J-Bam 24 (SEQUENZ ID NR: 5) davon abzuhalten, mit dem darauf folgenden Streptavidin-Aufreinigungsschritt zu interferieren.
  • Ein Teil (12 μl, 4 μg DNS) der aufgereinigten Hybridisierungsreaktion wird für die Amplifikation der Ziel-angereicherten Fraktion beiseite gestellt. Ein weiterer Teil wird für die Aufreinigung der DC-Fraktion (d. h. Biotin enthaltende Moleküle) reserviert, unter Verwendung von Streptavidin-beschichteten paramagnetischen Partikeln (SA-PMPs, beispielsweise MagneSpheresR von Promega), wie beschrieben und modifiziert von D. J. Lavery et al., Proc. Natl. Aca. Sci. USA 94: 6831–6836 (1997). Insbesondere werden die SA-PMPs (80 μl) resuspendiert und 3-mal bei Raumtemperatur (RT) mit 300 μl 1 M TENT-Puffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, 0,1% Triton X-100, 1 M NaCl, pH 8,0) enthaltend 20 ng/μl synthetische Poly A-DNS gewaschen. Die Zugabe erfolgte, um eine nicht-spezifische Bindung des Hybridisierungsprodukts an die SA-PMPs zu verhindern. Die gewaschenen SA-PMPs werden in 200 μl 1 M TENT/Poly A-Puffer resuspendiert. Die verbleibenden 48 μl (16 μg) der aufgereinigten Hybridisierungsreaktion werden auf 0,1 M NaCl durch Zugabe von 1 μl einer 5 M Stocklösung gebracht und mit den gewaschenen SA-PMPs vereinigt. Die Bindung von Biotin markierten Hybridisierungsprodukten an die SA-PMPs erfolgt für 30 Minuten bis zu 2 Stunden bei RT mit gelegentlichem Durchmischen. Nicht-gebundene DNS wird mittels 3-maligem Waschen bei RT mit 300 μl 1 M TENT-Puffer, gefolgt von 2 hochstringenten Waschschritten mit 300 μl 50 mM TENT-Puffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, 0,1% Triton X-100, 50 mM NaCl, pH 8, 0) bei 60°C entfernt. Anschließend werden die SA-PMPs 2-mal mit 300 μl 10 mM Tris (pH 8,5) bei RT gewaschen und in einem Endvolumen von 48 μl des gleichen Puffers resuspendiert.
  • Alle darauf folgenden Schritte der PCR-Amplifikation und Nucleaseverdau werden wie in Beispiel 2 beschrieben (Teil C) durchgeführt, mit der Ausnahme davon, dass die Ausgangs-Templates für DC-1 und D/T-1 PCR 12 μl SA-PMP gebundene DNS oder 12 μl der auf gereinigten Hybridisierungsreaktions DNS, respektive, waren.
  • D. Aufeinander folgende Hybridisierungs/Amplifikationsschritte und Klonierung/Analyse der Differenzprodukte
  • Zusätzliche Subtraktionsrunden wurden wie in Beispiel 2 durchgeführt (Teil D) mit den in Beispiel 10 (Teil C) genannten Ausnahmen. Die Klonierung und Analyse der interessierenden Sequenzen wurde wie in Beispiel 2 (Teil E) und Beispiel 3, respektive, beschrieben durchgeführt.
  • Die obigen Beispiele zeigen die Anwendbarkeit des erfindungsgemäßen SPAD-RDA-Verfahrens sowie die Vorteile gegenüber dem herkömmlichen RDA-Verfahren. Diese Verbesserung gegenüber dem modifizierten Verfahren von Simons et al. und Hubank et al. ist offensichtlich (Referenzen siehe oben). Durch Verwendung des erfindungsgemäßen SPAD-RDA-Verfahrens kann die Amplikonkomplexität vermindert werden, gleichzeitig kann eine genauere Probennahme aller Sequenzen erfolgen. Darüber hinaus ist die Treiberzusammensetzung bei jedem Schritt optimal und es ist ein Beispiel angeführt, das direkt die Treiberzusammensetzung mit der des subtrahierten Testers verknüpft, sogar bei einem nicht-gepaarten Treiber. Zu guter Letzt kann der visuelle Vergleich verwendet werden, um die interessierenden Subtraktionsprodukte zu identifizieren.
  • Über die visuelle Identifikation hinaus können aus den SPAD-RDA-Produkten hergestellte rekombinante Bibliotheken mittels Immunoscreening und durch differentielle Hybridisierung analysiert werden, um Tester-spezifische Sequenzen zu identifizieren. Dies alles erlaubt die Identifizierung und Isolierung vieler Zielsequenzen, die sonst schwierig oder unmöglich zu isolieren wären, wie beispielsweise solche, die in einem komplexen genomischen Hintergrund enthalten sind und/oder nur in geringer Kopienanzahl vorliegen.
  • Sequenzliste
    Figure 00510001
  • Figure 00520001
  • Figure 00530001
  • Figure 00540001
  • Figure 00550001

Claims (8)

  1. Ein Verfahren zur Durchführung einer subtraktiven Hybridisierung unter Verwendung einer Testerprobe und einer Treiberprobe, um das Vorliegen eines Unterschieds in der Nucleinsäuresequenz zwischen der Testerprobe und der Treiberprobe zu bestimmen, das folgendes umfasst: (a) getrenntes Isolieren der Gesamtnucleinsäure aus der Testerprobe und der Treiberprobe, und Erzeugen von doppelsträngiger cDNS/DNS aus der Gesamtnucleinsäure von der Testerprobe und der Treiberprobe; (b) Verdauen der doppelsträngigen cDNS/DNS, die aus der Testerprobe und der Treiberprobe in Schritt (a) erzeugt wurde, mit einer Restriktionsendonuclease, um einen Satz von Restriktionsfragmenten für jede Probe zu erzeugen; (c) Ligieren der Treiber- und Tester-Restriktionsfragmente von jedem Satz aus Schritt (b) an einen Oligonucleotid-Adaptersatz 1, und Amplifizieren der resultierenden Produkte mit selektiven Primern, so dass ein Teilsatz der Restriktionsfragmente aus Schritt (b) amplifiziert wird; (d) Entfernen der selektiven Primersequenzen (erste Runde) oder der Adaptersequenzen (anschließende Runden) mittels Restriktions-Endonucleaseverdau, um Tester- und Treiber-Amplikons zu erzeugen, Ligieren der 5'-Enden der Treiber- und Tester-Amplikons an einen Oligonucleotid-Adaptersatz 2, um Treiber-Kontrolle und Tester zu bilden, getrenntes Mischen von Treiber-Kontrolle und Tester jeweils mit einem Überschuss an nicht-ligiertem Treiber-Amplikon, Denaturieren der resultierenden Mischungen, und Erlauben, dass die denaturierten Nucleinsäurestränge in der jeweiligen Mischung hybridisieren; (e) Auffüllen der 3'-Enden des wiederverschmolzenen Treibers/Testers und der wiederverschmolzenen Treiber/Treiber-Kontrolle unter Verwendung einer thermostabilen DNS-Polymerase, und Amplifizieren der sich ergebenden Sequenzen; (f) Entfernen der restlichen einzelsträngigen DNS durch Verdau mit einer Einzelstrang-DNS-Nuclease und Amplifizieren; (g) Wiederholen der Schritte (d) bis (f), wobei in den Schritten (d) bis (f) ein Oligonucleotid-Adaptersatz verwendet wird, der in keiner der vorangehenden Runden der RDA verwendet wurde, wobei eine Runde aus der Ausführung der RDA-Schritte (d) bis (f) besteht, und für jede neue RDA-Runde, das Restriktionsendonuclease-geschnittene Produkt der Treiber/Treiber-Kontrolle-Subtraktion aus den unmittelbar vorangehenden Schritten (d) bis (f) als Treiber verwendet wird.
  2. Das Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die Restriktionsendonuclease von Schritt (b) eine 4–6 Basenpaar Erkennungsstelle besitzt.
  3. Das Verfahren gemäß Anspruch 2, worin die Restriktionsendonuclease von Schritt (b) eine 4 Basenpaar Erkennungsstelle besitzt.
  4. Das Verfahren gemäß Anspruch 3, worin die Restriktionsendonuclease Sau3AI ist.
  5. Das Verfahren gemäß Anspruch 1, worin das Restriktionsenzym von Schritt (d) eine 4–6 Basenpaar Erkennungsstelle besitzt.
  6. Das Verfahren gemäß Anspruch 5, worin das Restriktionsenzym von Schritt (d) eine 4 Basenpaar Erkennungsstelle besitzt.
  7. Das Verfahren gemäß Anspruch 6, worin das Restriktionsenzym Sau3AI ist.
  8. Ein Verfahren zur visuellen Identifizierung eindeutiger Testersequenzen, das die folgenden Schritte umfasst: (a) getrenntes Isolieren der Gesamtnucleinsäure aus einer Testerprobe und einer Treiberprobe, und Erzeugen von doppelsträngiger cDNS/DNS aus der Gesamtnucleinsäure der Testerprobe und Treiberprobe; (b) Verdauen der doppelsträngigen cDNS/DNS, die aus der Testerprobe und der Treiberprobe aus Schritt (a) erzeugt wurde, mit einer Restriktionsendonuclease, um einen Satz von Restriktionsfragmenten für jede Probe zu erzeugen; (c) Ligieren der Treiber- und Tester-Restriktionsfragmente aus Schritt (b) an einen Oligonucleotid-Adaptersatz 1 und Amplifizieren der resultierenden Produkte mit selektiven Primern, so dass ein Teilsatz der Restriktionsfragmente aus Schritt (b) amplifiziert wird; (d) Entfernen der selektiven Primersequenzen (erste Runde) oder der Adaptersequenzen (anschließende Runden) mittels Restriktions-Endonucleaseverdau, um Tester- und Treiber-Amplikons zu erzeugen, Ligieren der 5'-Enden der Treiber- und Tester-Amplikons an einen Oligonucleotid-Adaptersatz 2, um Treiber-Kontrolle und Tester zu bilden, getrenntes Mischen von Treiber-Kontrolle und Tester jeweils mit einem Überschuss an nicht-ligiertem Treiber-Amplikon, Denaturieren der resultierenden Mischungen, und Erlauben, dass die denaturierten Nucleinsäurestränge in der jeweiligen Mischung hybridisieren; (e) Auffüllen der 3'-Enden des wiederverschmolzenen Treibers/Testers und der wiederverschmolzenen Treiber/Treiber-Kontrolle unter Verwendung einer thermostabilen DNS-Polymerase und Amplifizieren der sich ergebenden Sequenzen; (f) Entfernen der restlichen einzelsträngigen DNS durch Verdau mit einer Einzelstrang-DNS-Nuclease und Amplifizieren; wobei in den Schritten (d) bis (f) ein Oligonucleotid-Adaptersatz verwendet wird, der in keiner der vorangehenden Runden der RDA verwendet wurde, wobei eine Runde aus der Ausführung der RDA-Schritte (d) bis (f) besteht, und für jede neue RDA-Runde, das Restriktionsendonuclease-geschnittene Produkt der Treiber/Treiber-Kontrolle-Subtraktion aus den unmittelbar vorangehenden Schritten (d) bis (f) als Treiber verwendet wird, (g) Aufbringen der Treiber-Tester und Treiber-Kontrollprodukte auf ein festes Substrat; und (h) visuelles Identifizieren der Treiber-Tester-Banden, welche nicht in den Treiber-Kontrollbanden vorhanden sind.
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