DE4428651C1 - Verfahren zur Herstellung und Amplifikation von Nukleinsäuren - Google Patents

Description

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung und/oder Amplifikation von Nukleinsäuren ohne zusätzliche Zugabe von definierten Startern ("Primern") sowie die Verwendung dieser Nukleinsäuren als Sonden.

Doppelsträngige Nukleinsäuresequenzen können durch Zugabe von für jeden der Stränge spezifischen Startern mit einer durch die Starter induzierten Verlängerungsreaktion unter Verwendung von Nukleotiden und einem für die Verlängerungsreaktion ge­ eigneten Enzym amplifiziert werden. Diese als Polymerase-Ket­ tenreaktion ("polymerase chain reaction", "PCR") bezeichnete Reaktion ist in EP-B1 0 201 184 beschrieben. Insbesondere ist bei der PCR ein molarer Überschuß der als Starter fungierenden definierten Oligonukleotide ("Primer") erforderlich, um die gewünschte Amplifikation der doppelsträngigen Nukleinsäurese­ quenzen zu erhalten. Jeder durch einen der spezifischen Star­ ter induzierte und enzymatisch synthetisierte Strang bildet im nächsten Reaktionszyklus die Matrize für einen durch den ande­ ren Starter induzierten und enzymatisch zu synthetisierenden Strang, wobei die enzymatisch synthetisierten Stränge eines Zyklus jeweils zueinander komplementäre Nukleinsäuresequenzen sind. Die Reaktionszyklen können beliebig oft wiederholt wer­ den, bis eine gewünschte Menge der doppelsträngigen Nuklein­ säure im Reaktionsgemisch vorliegt. Nachteilig bei der PCR ist die zusätzliche Zugabe von Sequenz-spezifischen Oligonukleo­ tid-Primern, was voraussetzt, daß sich genau zu diesen Oligo­ nukleotid-Sequenzen entsprechende komplementäre Sequenzen in den zu amplifizierenden Nukleinsäuremolekülen befinden müssen. Dies kann u. a. zu keinem Amplifikationsprodukt führen, wenn keine entsprechenden komplementären Sequenzen in den zu ampli­ fizierenden, doppelsträngig vorliegenden Nukleinsäuren vorhan­ den sind. Ferner kann bei der PCR eine Amplifikation der Pri­ mer durch Selbst-Anlagerung ("Primer-Selfannealing") auftre­ ten, was ein falsches Reaktionsprodukt sowie falsche Signale bei einer anschließenden in situ Hybridisierung mit den ampli­ fizierten Nukleinsäuresequenzen zur Folge hat. Ferner wird im Reaktionsansatz für die PCR die Wahrscheinlichkeit einer Kon­ tamination mit Fremd-Nukleinsäuren erhöht, da durch die zu­ sätzliche Zugabe der Starter zwei weitere Pipetierschritte notwendig sind.

WO 93/12245 A1 beschreibt ein Verfahren zur exponentiellen Amplifikation einer Nukleinsäuresequenz in einer Probe, wobei ein einzelner, ungepaarter, spezifischer oder ausgewählter Primer, der für die selektive Hybridisierung mit der Nukleinsäuresequenz konstruiert worden ist, in einem Reakti­ onsgemisch an die komplementäre Sequenz in der Nukleinsäure­ sequenz bindet, dieses Konstrukt einer Polymerasereaktion un­ terworfen wird, das doppelsträngige Reaktionsprodukt in Ein­ zelstränge getrennt wird und diese Reaktionssequenz gemäß der gewünschten Amplifikation entsprechend wiederholt wird. EP 543 484 A2 beschreibt ein Verfahren zur Amplifikation von DNS durch PCR, wobei im Reaktionsansatz ein Oligonukleiotid als Primer und eine doppelsträngige DNS vorliegt, und, nach der Denaturierung der doppelsträngigen DNS durch Wärme in Ein­ zelstränge, die Primermoleküle zur Bindung an jeden der DNS- Einzelstränge befähigt sind und somit unter Verwendung der PCR eine Amplifikation der DNS erreicht werden kann. EP 427 074 A1 und EP 427 073 A1 beschreiben Verfahren zur Amplifikation von Nukleinsäuren unter Verwendung von transkribierbaren, zur Schleifenbildung befähigten Sonden ("hairpin"-Sonden), wobei diese Sonden einen Abschnitt für die Schleifenbildung, einen Abschnitt für eine transkribierbare Sequenz und einen Ab­ schnitt für die Hybridisierung mit einer zu amplifizierenden Zielsequenz aufweisen. Die amplifizierten Transkriptionspro­ dukte ("RNS-Moleküle") werden mittels DNS- oder RNS-abhängigen RNS-Polymerasen in 3′-5′-Richtung erzeugt.

Somit liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein neues Ver­ fahren zur Herstellung und/oder Amplifikation von Nukleinsäu­ ren bereitzustellen, das keine Zugabe von spezifischen Oligo­ nukleotid-Primern erfordert, um aus kleinsten Mengen von Nukleinsäuren, ohne den Zusatz von synthetisch hergestellter Fremd-DNS in Form von Primern, große Mengen an Nukleinsäuren herzustellen. Desweiteren sollen "Primer-Selfannealing" und somit ungewünschte amplifizierte Nukleinsäuresequenzen vermie­ den und das Risiko einer Kontamination des Reaktionsansatzes mit Fremd-Nukleinsäuren minimiert werden.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren zur Herstellung und/oder Amplifikation von Nukleinsäuren, die repetitive Sequenzen oder inverted repeats enthalten, ohne Zugabe von spezifischen Primern gelöst, wobei der Reaktionsansatz ein einzelsträngig vorliegendes Nukleinsäuremolekül als Startermolekül mit einer als Starter wirkenden endständigen Nukleo­ tidsequenz und einer diese Sequenz flankierenden Sequenz und ein einzelsträngig vorliegendes Nukleinsäuremo­ lekül als Matrizenmolekül mit mindestens einer zur Anlagerung an die endständige Nukleotidsequenz eines Startermoleküls be­ fähigten Nukleotidsequenz enthält, umfassend die Schritte

• (a) Anlagern der endständigen im Startermolekül enthaltenen Nukleotidsequenz an eine im Matrizenmolekül enthaltenen Nukleotidsequenz unter Bildung eines überstehenden Stran­ ges des Matrizenmoleküls,
• (b) Synthetisieren eines Verlängerungsproduktes durch Induzie­ ren mit der als Starter wirkenden endständigen Nukleotidsequenz des Startermoleküls unter Verwendung des überstehenden Stranges des Matrizenmoleküls als Matrize in Gegenwart von Nukleotiden und mindestens einem zur Syn­ these des Verlängerungsproduktes geeigneten Agens, wobei eine das Verlängerungsprodukt enthaltende Nukleinsäure als Reaktionsprodukt erhalten wird,
• (c) Trennen des Reaktionsproduktes vom Matrizenmolekül, und
• (d) mindestens einmaliges Wiederholen der Schritte (a) bis (c).

Der Begriff "Nukleinsäuremolekül" bedeutet ein natives, halbsynthetisches, synthetisches oder modifiziertes Nuklein­ säuremolekül aus Desoxyribonukleotiden und/oder Ribonukleoti­ den und/oder modifizierten Nukleotiden, wie Aminonukleotiden oder [α-S]-Triphosphatnukleotiden.

Der Begriff "Startermolekül" bedeutet ein vorstehend definier­ tes Nukleinsäuremolekül mit mindestens einer endständigen, vorzugsweise 3′-endständigen Nukleotidsequenz und einer die endständige Nukleotidsequenz flankierende Nukleotidsequenz, die vorzugsweise mindestens eine weitere zur Anlagerung an eine Nukleotidsequenz des Matrizenmoleküls befähigte Nukleo­ tidsequenz enthält; vgl. Fig. 1 bis 7.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist diese weitere Nukleo­ tidsequenz am anderen Ende des Startermoleküls, vorzugsweise 5′-endständig, lokalisiert.

Der Begriff "Matrizenmolekül" bedeutet ein vorstehend defi­ niertes Nukleinsäuremolekül mit mindestens einer zur Anlage­ rung an die endständige Nukleotidsequenz des Startermoleküls befähigten Nukleotidsequenz; vgl. Fig. 1 bis 7.

In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das Matrizenmole­ kül mindestens eine endständige, vorzugsweise 3′-endständige Nukleotidsequenz, die zur Anlagerung an die endständige Nu­ kleotidsequenz des Startermoleküls befähigt ist.

Der Begriff "Reaktionsansatz" bedeutet ein Reaktionsgemisch, das neben den Nukleotiden und mindestens einem zur Synthese des Verlängerungsproduktes geeigneten Agens ein oder mehrere Startermoleküle und ein oder mehrere Matrizenmoleküle enthält, wobei weitere, nicht an dem erfindungsgemäßen Verfahren betei­ ligte Nukleinsäuren vorhanden sein können. Die Startermoleküle und/oder die Matrizenmoleküle liegen in einer ausreichenden Konzentration, vorzugsweise mindestens etwa 1×10^-15 g, im Re­ aktionsansatz vor.

Der Begriff "Anlagerung" bedeutet die Ausbildung von bei­ spielsweise Wasserstoffbrücken zwischen einzelsträngigen, kom­ plementären Bereichen von Nukleinsäuremolekülen, insbesondere zwischen den erfindungsgemäß definierten Nukleotidsequenzen der Startermoleküle und Matrizenmolekülen, bei einer geeigne­ ten Temperatur, vorzugsweise 90°C oder weniger, und gegebe­ nenfalls bei einer geeigneten Salzkonzentration, vorzugsweise 50 bis 300 mM.

Der Begriff "Verlängerungsprodukt" bedeutet eine an die end­ ständige Nukleotidsequenz des Startermoleküls über beispiels­ weise eine Phosphodiester-, Thioester- oder Amidbindung kova­ lent gebundene, "synthetisierte" Nukleinsäuresequenz, deren Primärsequenz komplementär zu der entsprechenden Sequenz des Matrizenmoleküls ist.

Der Begriff "ein zur Synthese des Verlängerungsproduktes ge­ eignetes Agens" bedeutet ein natives Enzym oder ein synthe­ tisch hergestelltes Agens, welches bei der Synthese des Ver­ längerungsproduktes als Katalysator wirkt. Beispiele für na­ tive Enzyme sind die Taq-Polymerase, das Klenow-Fragment der DNA-Polymerse I, die E. coli DNA-Polymerase I und die Reverse Transkriptase.

Der Begriff "Reaktionsprodukt" bedeutet eine, das Verlänge­ rungsprodukt enthaltende Nukleinsäure, wobei das Reaktionspro­ dukt per se bei jeder Wiederholung der Reaktionssequenz (a) bis (c) als Startermolekül und/oder als Matrizenmolekül gemäß den vorstehend aufgeführten Definitionen verwendet werden kann.

In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind das Startermolekül und das Matrizenmolekül gleich, wobei das Ma­ trizenmolekül (bzw. das Startermolekül) mindestens eine Nukleotidsequenz enthält, die zur Anlagerung an die endstän­ dige, vorzugsweise 3′-endständige Nukleotidsequenz des Star­ termoleküls (bzw. des Matrizenmoleküls) befähigt ist; vgl. Fig. 3. Ferner kann das Matrizenmolekül (bzw. das Startermole­ kül) eine weitere Nukleotidsequenz enthalten, die zur Anlage­ rung der endständigen, vorzugsweise 3′-endständigen Nukleotid­ sequenz des Verlängerungsproduktes befähigt ist.

In einer bevorzugten Ausführungsform sind das Startermolekül und das Matrizenmolekül gleich und das Matrizenmolekül (bzw. das Startermolekül) enthält mindestens eine am anderen Ende, vorzugsweise 5′-endständig, lokalisierte Nukleotidsequenz, die zur Anlagerung an die endständige, vorzugsweise 3′-endständige Nukleotidsequenz des Startermoleküls (bzw. des Matrizenmole­ küls) befähigt ist; vgl. Fig. 4.

In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält das Matrizenmolekül mindestens teilweise die komple­ mentäre Sequenz des Startermoleküls, wobei das Matrizenmolekül mindestens eine, vorzugsweise zwei zur Anlagerung an die end­ ständige Nukleotidsequenz des Startermoleküls befähigten Nukleotidsequenzen enthält; vgl. Fig. 5. Vorzugsweise ist mindestens eine der zur Anlagerung an die endständige Nukleo­ tidsequenz des Startermoleküls befähigten Nukleotidsequenzen des Matrizenmoleküls endständig, vorzugsweise 5′-endständig, lokalisiert.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfin­ dung ist das Matrizenmolekül die komplementäre Sequenz des Startermoleküls, wobei mindestens zwei, vorzugsweise gleiche, zur Anlagerung an die endständige Nukleotidsequenz des Star­ termoleküls befähigte Nukleotidsequenzen endständig lokali­ siert sind; vgl. Fig. 6.

In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Startermolekül beispielsweise über eine Phosphodi­ ester-, Thioester- oder Amidbindung kovalent an das Matrizen­ molekül gebunden, so daß im Reaktionsansatz des erfindungsge­ mäßen Verfahrens mindestens eine Nukleinsäure vorliegt, die die Primärsequenzen des Startermoleküls und des Matrizenmole­ küls gemäß den vorstehend aufgeführten Definitionen enthält. Die endständige, vorzugsweise 3′-endständige Nukleotidsequenz dieser Nukleinsäure ist die zur Anlagerung an mindestens eine im Matrizenmolekül enthaltene Nukleotidsequenz befähigte Nukleotidsequenz des Startermoleküls; vgl. Fig. 7. Die im Ma­ trizenmolekül enthaltene Nukleotidsequenz kann beispielsweise 3′- oder 5′-endständig sein.

Die zur Anlagerung ("Hybridisierung") befähigten Nukleotidse­ quenzen des Startermoleküls und/oder des Matrizenmoleküls sind vorzugsweise repetitive Sequenzen. Der Begriff "repetitive Se­ quenzen" bedeutet sich wiederholende Sequenzen, wobei unter­ schieden wird zwischen (1) repetitiven Genen, wie Gene von rRNA, tRNA, Histonen und Immunoglobulinen, (2) mittelrepetiti­ ven Sequenzen, bestehend aus etwa 200 bis 300 Nukleotiden, und (3) hochrepetitive Sequenzen, bestehend aus kurzen Sequenzen von mindestens etwa 20 bp, die 1000fach wiederholt sein können und sich, wie bei der "Alu-Familie" von Eukaryoten (Sequenzen von 300 bp), über das ganze Genom verteilen.

Ferner können die zur Anlagerung befähigten Nukleotidsequenzen des Startermoleküls und/oder des Matrizenmoleküls mindestens eine Erkennungssequenz für Endonukleasen oder für andere Nukleinsäure-spaltende Agentien, wie "molecular scissors", die auf einer Ausbildung von triple-Helix-DNS-Erkennungssequenzen basieren, enthalten.

Zur Markierung der erfindungsgemäß hergestellten Reaktionspro­ dukte kann ein Teil der Nukleotide im Reaktionsansatz markiert sein. Geeignete Markierungen sind beispielsweise mit Biotin, Digoxigenin oder Fluoreszenzfarbstoffen gekoppelte Nukleotide oder mit einem radioaktiven Isotop markierte Nukleotide. Fer­ ner können die Reaktionsprodukte selbst markiert werden, bei­ spielsweise durch den Einbau von markierten Nukleotiden mit­ tels "Nick-Translation".

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfin­ dung enthält der überstehende Strang des Matrizenmoleküls eine Nukleinsäuresequenz, die zum Nachweis ei­ ner genetischen, kanzerogenen oder infektiösen Krankheit geeignet ist. In diesem Fall handelt es sich um spezifische Nuklein­ säuresequenzen, die modifiziert oder nativ bzw. direkt oder indirekt die Induktion einer solchen Krankheit verursachen.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann mit einzelsträngig oder doppelsträngig vorliegenden Nukleinsäuren durchgeführt werden, wobei doppelsträngig vorliegende Nukleinsäuren vor Schritt (a) in einzelsträngige Nukleinsäuren nach im Stand der Technik be­ kannten Verfahren, wie Hitze-Denaturuierung oder pH-abhängige Denaturierung mit HCl oder NaOH, überführt werden.

Der Reaktionsansatz hat ein geeignetes Volumen, beispielsweise 20 bis 200 µl, und enthält (1) eine für die Synthese des Ver­ längerungsproduktes geeignete Konzentration an gewünschten Nukleotiden, vorzugsweise 5 bis 100 nmol, mehr bevorzugt etwa 20 nmol, (2) für die Synthese des Verlängerungsproduktes aus­ reichende Einheiten eines synthetisierenden Agens, beispiels­ weise 1 bis 15 Einheiten, vorzugsweise 5 Einheiten Taq-Polyme­ rase, und (3) mindestens etwa 1×10^-15 g Startermoleküle und Matrizenmoleküle bzw. Nukleinsäuren, die das Startermolekül und das Matrizenmolekül kovalent miteinander verbunden enthal­ ten, in einer geeigneten Reaktionslösung.

Die Reaktionslösung enthält vorzugsweise MgCl₂ (1 bis 200 mmol, bevorzugt 1 bis 50 mmol, mehr bevorzugt 1 bis 20 mmol und am meisten bevorzugt 3 mmol), NaCl (30 bis 300 mmol, be­ vorzugt 50 bis 250 mmol, mehr bevorzugt 100 bis 200 mmol und am meisten bevorzugt 160 mmol) und/oder KCl (10 bis 70 mmol, bevorzugt 30 bis 70 mmol, mehr bevorzugt 40 bis 60 mmol und am meisten bevorzugt 50 mmol) und/oder Tris(hydroxymethyl)amino­ methan (5 bis 50 mmol, bevorzugt 5 bis 30 mmol, mehr bevorzugt 5 bis 20 mmol und am meisten bevorzugt 10 mmol) und/oder Tween 20 (Polyoxyethylensorbitanmonolaurat) (0,01 bis 0,1 Vol.-% bevorzugt 0,01 bis 0,06 Vol.-%, mehr bevorzugt 0,01 bis 0,04 Vol.-% und am meisten bevorzugt 0,02 Vol.-%) und gegebenen­ falls Gelatine (0,1 bis 1 mmol). Der pH-Wert der Reaktionslö­ sung liegt in einem geeigneten, insbesondere von dem syntheti­ sierenden Agens abhängigen Bereich.

In Schritt (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens lagern sich die endständigen Nukleotidsequenzen der Startermoleküle an in den Matrizenmolekülen enthaltene Nukleotidsequenzen unter Bil­ dung überstehender Stränge, die als Matrize wirken, an.

Diese Anlagerung wird bei im Reaktionsansatz zunächst doppel­ strängig vorliegenden Nukleinsäuren und vor Schritt (a) dena­ turierten und somit in Einzelstrangform überführten Nuklein­ säuren auch als "versetzte Renaturierung" bezeichnet.

Die Anlagerung erfolgt bei einer Temperatur, die jeweils von der Art der im Reaktionsansatz vorliegenden Nukleinsäuren ab­ hängt.

Beispielsweise wird die Anlagerung der Nukleinsäuremoleküle, die von chromosomaler DNS mit mittelrepetitiven und hochrepe­ titiven Sequenzen, beispielsweise "Alu-Sequenzen", stammen, bei einer Temperatur zwischen 70 und 90°C durchgeführt. Dabei kann die Anlagerung derart erfolgen, daß gemäß Fig. 7 die einzelsträngig vorliegende Nukleinsäure mit beispielsweise "inverted repeats" enthaltenden "Alu-Sequenzen" unter Bildung einer Schleife mit der endständigen, vorzugsweise 3′-endstän­ digen "Alu-Sequenz" an eine in der Nukleinsäure enthaltene kom­ plementäre "Alu-Sequenz" hybridisiert, wobei sich gemäß der vorstehend aufgeführten Definitionen die endständige "Alu-Se­ quenz" im Bereich des Startermoleküls und die komplementäre "Alu-Sequenz" im Bereich des Matrizenmoleküls befinden. Somit kann eine endständige "Alu-Sequenz" in Schritt (b) des erfin­ dungsgemäßen Verfahrens die Synthese eines Verlängerungspro­ duktes durch beispielsweise die Taq-Polymerase induzieren, wo­ bei der überstehende Strang der einzelsträngigen Nukleinsäure als Matrize verwendet wird.

In beiden Fällen, nämlich "versetzte Renaturierung" oder Schleifenbildung bei chromosomaler DNS, ist die Temperatur der Anlagerung bzw. "Renaturierungstemperatur" von Bedeutung. Re­ petitive Sequenzen renaturieren aufgrund ihres häufigen Vor­ kommens und ihres zum Teil großen A-T-Gehalts schneller. Hoch­ repetitive DNS renaturiert schon bei Temperaturen unter 90°C. Die Renaturierung ist aber zum großen Teil unspezifisch, wo­ durch teilweise eine versetzte Anlagerung ("Hybridisierung") der einzelnen Stränge erreicht wird. Dies macht sich die vor­ liegende Erfindung zum Nutzen. Die schnelle Renaturierung der einzelsträngig vorliegenden Stränge bzw. die schnelle Renatu­ rierung einer einzelsträngig vorliegenden Nukleinsäure unter Schleifenbildung führt dazu, daß bei der erfindungsgemäßen Herstellung von Nukleinsäuren aus chromosomaler DNS der soge­ nannte "Annealingschritt", welcher bei der PCR erforderlich ist, unnötig ist. Dies führt dazu, daß in den chromosomalen Nukleinsäuren enthaltene "single copy" Gene bedeutend lang­ samer renaturieren und somit unter den gewählten Bedingungen von beispielsweise über 70°C nicht oder nur viel langsamer renaturieren und damit keine Startsequenzen für eine Elonga­ tion bilden können. Wenn beispielsweise eine hochrepetitive Nukleinsäuresequenz vor dem "single copy" Gen in Synthese- bzw. Elongationsrichtung vorliegt, bietet sich die Mög­ lichkeit, das entsprechende Gen vollständig, d. h. einschließ­ lich seiner "Exons" (kodierende Sequenzen) und seiner "Introns" (nicht-kodierende Sequenzen), herzustellen. Dies hat den Vorteil, daß in diesem Fall die genaue Sequenz des betref­ fenden Gens in der nativen DNS erhalten wird und man somit nicht auf Kopien ("cDNA") der mRNS der betreffenden Gene ange­ wiesen ist, die keine Introns mehr enthalten. Diese Möglich­ keit ist für die Analyse von beispielsweise des menschlichen Genoms von großer Bedeutung, da sie die Herstellung von spezi­ fischer DNS aus bestimmten Chromosomenregionen in Verbindung mit einer exakten Analyse des nativen Zustands erlaubt.

Bei der Amplifikation von doppelsträngig vorliegender cDNA (Menge im Reaktionsansatz vorzugsweise 1×10^-9 bis 1×10^-8 g, mehr bevorzugt 6×10^-9 g), die "single copy"-Sequenzen reprä­ sentieren und somit keine hochrepetitiven Abschnitte in ihrer Sequenz aufweisen, wird die Anlagerung je nach Zusammensetzung der Nukleinsäuresequenz bei einer Temperatur von etwa 40 bis 80°C durchgeführt. Damit wird einzelnen zum Teil endständigen AT-reichen bzw. GC-reichen Bereichen der Startermoleküle er­ möglicht, an komplementäre Nukleotidsequenzen entweder inner­ halb der einzelsträngigen Nukleinsäuren unter Schleifenbildung oder versetzt zu renaturieren. Dabei sollte der Anlagerungs­ schritt zur Vermeidung einer vollständigen Renaturierung der zu amplifizierenden Nukleinsäuren eine Dauer von einer Stunde nicht überschreiten.

Alle vorstehenden Ausführungen zu Schritt (a) des erfindungs­ gemäßen Verfahrens sind mutatis mutandis auf die Ausführungs­ form, bei der Startermolekül und Matrizenmolekül gleich sind, anwendbar.

In Schritt (b) wird die Synthese des Verlängerungsproduktes ("Elongation") bei einer Temperatur durchgeführt, die insbe­ sondere von dem zur Synthese geeigneten Agens abhängt, wobei Reaktionsprodukte gemäß der vorstehend aufgeführten Definition erhalten werden. Beispielsweise erfolgt die Synthese bei Ver­ wendung der Taq-Polymerase bei einer Temperatur zwischen 70 bis 80°C, vorzugsweise 72°C, für 1 bis 15 Minuten, vorzugs­ weise 5 Minuten.

In Schritt (c) wird das Trennen des Reaktionsproduktes vom Ma­ trizenmolekül beispielsweise durch Erhitzen des Reaktionsgemi­ sches ("Denaturierung") auf 90 bis 100°C, vorzugsweise 95°C, für 1 bis 15 Minuten, vorzugsweise 5 Minuten, erreicht.

Die Reaktionssequenz (a) bis (c) wird in Schritt (d) des er­ findungsgemäßen Verfahrens mindestens einmal wiederholt. Ins­ besondere wird das erfindungsgemäße Verfahren 1 bis 200 mal, vorzugsweise 80 mal wiederholt, wobei nach jeder 40. Wiederho­ lung gegebenenfalls weitere Einheiten des für die Synthese ge­ eigneten Agens, bespielsweise 1 bis 15 Einheiten, vorzugsweise 5 Einheiten Taq-Polymerase zugegeben werden.

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Reakti­ onsprodukte können mit geeigneten Verfahren und/oder Mitteln physikalisch (z. B. durch Ultraschall) und/oder chemisch (z. B. durch "molecular scissors") und/oder enzymatisch (z. B. durch Endonukleasen) mindestens einmal gespalten werden.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäß hergestellten und/oder amplifi­ zierten Nukleinsäuren als Nukleinsäuresonden. Insbesondere können die erfindungsgemäß hergestellten und/oder amplifizier­ ten Nukleinsäuren zu diagnostischen Zwecken in der Medizin so­ wie zu Forschungszwecken verwendet werden.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Ver­ wendung der Reaktionsprodukte in einem diagnostischen Kit zum Nachweis von Nukleinsäuresequenzen und/oder von Nuklein­ säuren, der mindestens eine erfindungsgemäß hergestellte und/oder amplifizierte Nukleinsäure enthält. Insbesondere kann der erfindungsgemäße Kit auf den Gebieten der biologischen Do­ simetrie, der Tumorzytogenetik, der Mikrobiologie und der Evo­ lutionsbiologie verwendet werden und hier zum Nachweis von ge­ netischen, kanzerogenen oder infektiösen Krankheiten verwendet werden. Beispielsweise kann bei durch Retroviren ("temperente Phagen") verursachten infektiösen Krankheiten ein Reaktionsge­ misch mit der Wirts-DNS und der Nukleinsäuresequenz der Phagen gemäß der vorliegenden Erfindung erstellt werden. Dabei fun­ giert die spezifische Nukleinsäure der Phagen als Startermole­ kül und die Wirts-DNS als Matrize. Wenn eine Phageninfektion in der Wirts-DNS vorliegt, kann sich das Startermolekül der Phagennukleinsäure unter geeigneten Reaktionsbedingungen an seine komplementäre Sequenz in der Wirts-DNS anlagern und seine Funktion als Starter übernehmen. Die Vorteile hierbei sind (1) der Nachweis einer Phageninfektion und (2) Erkennt­ nisse über den Inkorporationsmechanismus der betreffenden Pha­ gennukleinsäure in die Wirts-DNS, da die Phagennukleinsäure als Starter fungiert und demgemäß die synthetisierten Sequen­ zen ("Elongationsprodukte") teilweise Sequenzen der nativen Wirts-DNS sind. Dadurch können neue Erkenntnisse bezüglich der für die Inkorporation in die Wirts-DNS benötigten Agenzien, beispielsweise Endonukleasen oder andere DNS-spaltende und/oder inkorporierende Agenzien, erhalten werden.

Die Figuren zeigen:

Fig. 1 bis 7 sind schematische Darstellungen bevorzugter Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, wobei (-) ein beliebiges Nukleotid bedeutet, (*) ein Nukleotid des Verlänge­ rungsproduktes bedeutet und (|) komplementäre Nukleotide be­ deuten.

Fig. 8 ist die photographische Abbildung eines Agarosegels mit nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Ampli­ fikationsprodukten. Es bedeuten (von links nach rechts): Bahn 1: DNS-Probe spezifisch für das Centromer des menschlichen Chromosoms #1 (pUC 1.77, Cooke et al., 1972); Bahn 2: mikro­ dissektiertes Chromosomensegment #1; Bahn 3: durch Mikrodis­ sektion gewonnene Nukleinsäure-Probe spezifisch für das Cen­ tromer des menschlichen Chromosoms #8. (für die Bahnen 1 bis 3 wird jeweils der Amplifikationspuffer Nr. 1 verwendet, die auf­ getragene Menge beträgt jeweils 3 µl aus einem Endvolumen von 50 µl nach beendeter Amplifikation); Bahn 4: DNS-Längen­ standardmarker Nr. III (Boehringer Mannheim, Mannheim, FRG) (aufgetragene Menge 500 ng); und Bahnen 5 bis 8: wie Bahnen 1 bis 3, jedoch in Amplifikationspuffer Nr. 2.

Fig. 9 ist die photographische Abbildung eines Agarosegels mit nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Ampli­ fikationsprodukten. Es bedeuten (von links nach rechts): Bahn 1 : 500 ng DNS-Längenstandardmarker Nr. III (Boehringer Mann­ heim, Mannheim, FRG) und Bahn 2: cDNA des menschlichen myf3- Gens (aufgetragene Menge beträgt 3 µl aus einem Endvolumen von 50 µl nach beendeter Amplifikation).

Fig. 10 ist die photographische Abbildung eines Agarosegels mit nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Ampli­ fikationsprodukten. Es bedeuten (von links nach rechts): Bahn 1: cDNA des menschlichen Fibronectin-Gens (aufgetragene Menge beträgt 3 µl aus einem Endvolumen von 50 µl nach beendeter Am­ plifikation) und Bahn 2 : 500 ng DNS-Längenstandardmarker Nr. III (Boehringer Mannheim, Mannheim, FRG).

Fig. 11 ist eine photographische Abbildung einer "fluorescent multicolor" in situ Hybridisierung nach einem modifizierten Verfahren (Celeda et al., Z. Naturforsch. 47c (1992), 739-747) an menschlichen Metaphase-Chromosomen. Gelbe Hybridisierungs­ markierungen (FITC) zeigen die für das menschliche Chromosom #1 spezifische pUC 1.77 DNS-Probe aus Fig. 8, Bahn 1; rote Hy­ bridisierungsmarkierungen (Texas Red) zeigen die für das men­ schliche Chromosom #8 spezifische DNS-Probe aus Fig. 8, Bahn 3.

Fig. 12 ist eine photographische Abbildung einer "fluores­ zierenden" in situ Hybridisierung unter Verwendung der cDNA des menschlichen myf3-Gens aus Fig. 9 nach einem modifizierten Verfahren (Celeda et al., Z. Naturforsch. 47c (1992), 739-747) mittels eines konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops. Es bedeu­ ten: Bild 1: Hybridisierung an menschliche, in Kultur gehal­ tene Rhabdomyosarkomzellen; und Bild 2: Hybridisierungen an menschliche, aus peripherem Blut gewonnenen Lymphozyten.

Die nachstehenden Beispiele erläutern die Erfindung.

1. Amplifikation einer für das Centromer des menschlichen Chromosoms #1 spezifischen DNS-Probe

6×10^-9 g einer im Handel erhältlichen pUC 1.77 DNS-Probe für das menschliche Chromosom #1 wird zu einer Reaktionslösung (Endvolumen 50 µl, "Amplifikationspuffer Nr. 1") zugegeben, die jeweils 0,8 nmol der Nukleotide dATP, dCTP, dGTP und dTTP, 10 mmol Tris(hydroxymethyl)aminomethan, 3 mmol MgCl₂, 50 mmol KCl und 5 Einheiten einer im Handel erhältlichen Taq-Polymerase enthält.

Der Reaktionsansatz wird in einem im Handel erhältlichen Thermocycler eingebracht und 80 Wiederholungen ("Zyklen") der Reaktionssequenzen werden durchgeführt, wobei nach 40 Wiederholungen weitere 5 Einheiten der Taq-Polymerase zuge­ geben werden.

Die Reaktionsbedingungen einer Reaktionssequenz sind (1) Denaturieren der im Reaktionsgemisch enthaltenen Nuklein­ säuren bei 90°C für 2 Minuten und (2) Synthetisieren ("Elongation") eines neuen Nukleinsäurestranges unter Ver­ wendung eines überstehenden Stranges als Matrize bei 72°C für 3 Minuten.

In Fig. 8, Bahn 1, ist das Ergebnis dieser Reaktion mit­ tels Agarose-Gelelektrophorese dargestellt.

In Bahn 5 von Fig. 8 ist ein Ergebnis mit der gleichen DNS-Probe dargestellt, wobei hier die Reaktionslösung (Endvolumen 50 µl, "Amplifikationspuffer Nr. 2") jeweils 0,8 nmol der Nukleotide dATP, dCTP, dGTP und dTTP, 3 mmol MgCl₂, 160 mmol NaCl, 0,02 Vol.-% Tween 20 (Polyoxyethylen­ sorbitanmonolaurat) und 5 Einheiten einer im Handel erhält­ lichen Taq-Polymerase enthält.

2. Amplifikation eines mikrodissektierten Segments vom Chromo­ som #1

Die gleichen, wie in Beispiel 1 aufgeführten Reaktionen werden durchgeführt, mit der Ausnahme, daß 6×10^-9 g eines mikrodissektierten Segments von Chromosom #1 verwendet wird.

Die Ergebnisse sind in Fig. 8, Bahnen 2 (Amplifikations­ puffer Nr. 1) und 6 (Amplifikationspuffer Nr. 2), darge­ stellt.

3. Amplifikation einer mikrodissektierten, für das Centromer des menschlichen Chromosoms #8 spezifischen Nukleinsäure- Probe

Die gleichen, wie in Beispiel 1 aufgeführten Reaktionen werden durchgeführt, mit der Ausnahme, daß 6×10^-9 g einer mikrodissektierten, für das Centromer des menschlichen Chromosoms #8 spezifischen Nukleinsäure-Probe verwendet wird.

Die Ergebnisse sind in Fig. 8, Bahnen 3 (Amplifikations­ puffer Nr. 1) und 7 (Amplifikationspuffer Nr. 2), darge­ stellt.

4. Amplifikation einer cDNA des menschlichen myf3-Gens

5×10^-9 g einer myf-3 DNS-Probe werden zu einer Reaktionslö­ sung (Endvolumen 50 µl) zugegeben, die jeweils 0,8 nmol der Nukleotide dATP, dCTP, dGTP und dTTP, 3 mmol MgCl₂, 160 mmol NaCl, 0,02 Vol.-% Tween 20 (Polyoxyethylensorbitan­ monolaurat) und 5 Einheiten einer im Handel erhältlichen Taq-Polymerase enthält.

Der Reaktionsansatz wird in einem im Handel erhältlichen Thermocycler eingebracht und 40 Wiederholungen ("Zyklen") der Reaktionssequenzen werden durchgeführt. Die Reaktions­ bedingungen einer Reaktionssequenz sind (1) Denaturieren der im Reaktionsgemisch enthaltenen Nukleinsäuren bei 90°C für 2 Minuten und (2) Synthetisieren ("Elongation") eines neuen Nukleinsäurestranges unter Verwendung eines überste­ henden Stranges als Matrize bei 72°C für 1 Minute.

In Fig. 9, Bahn 2, ist das Ergebnis dieser Reaktion mit­ tels Agarose-Gelelektrophorese dargestellt.

5. Amplifikation einer cDNA-Nukleinsäuresonde des menschlichen Fibronectin-Gens

5×10^-9 g einer Fibronectin-DNS-Probe werden zu einer Reak­ tionslösung (Endvolumen 50 µl) zugegeben, die jeweils 0,8 nmol der Nukleotide dATP, dCTP, dGTP und dTTP, 10 mmol Tris(hydroxymethyl)aminomethan, 3 mmol MgCl₂, 50 mmol KCl und 5 Einheiten einer im Handel erhältlichen Taq-Polymerase enthält.

Der Reaktionsansatz wird in einem im Handel erhältlichen Thermocycler eingebracht und 80 Wiederholungen ("Zyklen") der Reaktionssequenzen werden durchgeführt, wobei nach 40 Wiederholungen weitere 5 Einheiten der Taq-Polymerase zuge­ geben werden.

Die Reaktionsbedingungen einer Reaktionssequenz sind (1) Denaturieren der im Reaktionsgemisch enthaltenen Nuklein­ säuren bei 94°C für 2 Minuten, (2) Anlagerung ("Annealing") bei 54°C für 2 Minuten und (3) Synthetisie­ ren ("Elongation") eines neuen Nukleinsäurestranges unter Verwendung eines überstehenden Stranges als Matrize bei 72°C für 2 Minuten.

In Fig. 10, Bahn 1, ist das Ergebnis dieser Reaktion mit­ tels Agarose-Gelelektrophorese dargestellt.

6. In situ Hybridisierungen

Die in den Fig. 11 und 12 dargestellten in situ Hybridi­ sierungen werden nach dem von Celeda et al. (Z. Natur­ forsch. 47c (1992), 739-747) beschriebenen Verfahren durch­ geführt.

Claims (16)

1. Verfahren zur Herstellung und/oder Amplifikation von Nukleinsäuren, die repetitive Sequenzen oder inverted repeats enthalten, ohne Zugabe von spezifischen Primern, wobei der Reaktionsansatz ein einzelsträngiges Nukleinsäuremolekül als Startermolekül mit einer als Starter wirkenden endständigen Nukleotidsequenz und einer diese Sequenz flankierenden Sequenz und ein einzelsträngiges Nukleinsäuremolekül als Matrizenmolekül mit mindestens einer zur Anlagerung an die endständige Nukleotidsequenz eines Startermoleküls befähigten Nukleotidsequenz enthält, umfassend die Schritte

• (a) Anlagern der endständigen im Startermolekül enthaltenen Nukleotidsequenz an eine im Matrizenmolekül enthaltenen Nukleotidsequenz unter Bildung eines überstehenden Stranges des Matrizenmoleküls,
• (b) Synthetisieren eines Verlängerungsproduktes durch Induzieren mit der als Starter wirkenden endständigen Nukleotidsequenz des Startermoleküls unter Verwendung des überstehenden Stranges des Matrizenmoleküls als Matrize in Gegenwart von Nukleotiden und mindestens einem zur Synthese des Verlängerungsproduktes geeigneten Agens, wobei eine das Verlängerungsprodukt enthaltende Nukleinsäure als Reaktionsprodukt erhalten wird,
• (c) Trennen des Reaktionsproduktes vom Matrizenmolekül, und
• (d) mindestens einmaliges Wiederholen der Schritte (a) bis (c).

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Matrizenmolekül die komplementäre Sequenz des Startermoleküls ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Startermolekül und das Matrizenmolekül gleich sind.

4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Startermolekül kovalent an das Matrizenmolekül gebunden ist.

5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, wobei das Reaktionsprodukt eine endständige Nukleotidsequenz in Verlängerungsrichtung enthält, die zur Anlagerung an mindestens einer Nukleotidsequenz des Matrizenmoleküls befähigt ist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei mindestens eine zur Anlagerung an die endständige Nukleotidsequenz des Startermoleküls befähigte Nukleotidsequenz des Matrizenmoleküls endständig ist und im Schritt (b) das Matrizenmolekül als Startermolekül und das Startermolekül als Matrizenmolekül gemäß den Definitionen in Anspruch 1 verwendet wird.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Startermolekül und/oder das Matrizenmolekül aus chromosomaler DNS stammt.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei der überstehende Strang des Matrizenmoleküls eine Nukleinsäure­ sequenz enthält, die zum Nachweis einer genetischen, kanzerogenen oder infektiösen Krankheit geeignet ist.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die zur Anlagerung befähigten Nukleotidsequenzen des Startermoleküls und/oder des Matrizenmoleküls mindestens eine Erkennungssequenz für Endonukleasen enthalten.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei zusätzlich das Reaktionsprodukt jeder Reaktionssequenz (a) bis (c) als Startermolekül und/oder als Matrizenmolekül gemäß den Definitionen in Anspruch 1 verwendet wird.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei das Agens T4-DNA-Polymerase, E. coli DNA-Polymerase I, Reverse Transkriptase oder ein synthetisierendes und/oder hitze­ stabiles Enzym ist.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei mindestens ein Teil der Nukleotide eine Markierung aufweist.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die Reaktionsprodukte markiert werden.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei das Reaktionsprodukt mindestens einmal gespalten wird.

15. Verwendung der nach einem der Ansprüche 1 bis 14 hergestellten Reaktionsprodukte als Nukleinsäuresonden.

16. Verwendung nach Anspruch 15 in einem diagnostischen Kit.