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FACHBEREICH
DER ERFINDUNG
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Diese
Erfindung betrifft Verfahren zur Erhöhung der Anzahl Kopien einer
spezifischen Nukleinsäuresequenz
oder „Zielsequenz" der rRNA von M.tuberculosis,
die entweder einzeln oder als große oder kleine Komponente eines
homogenen oder heterogenen Gemischs von Nukleinsäuren vorliegen kann. Das Gemisch von
Nukleinsäuren
kann das in einer Probe vorliegende sein, die für diagnostische Tests, ökologische
Tests, für
Forschungsstudien, für
die Herstellung von Reagentien oder Materialien, für andere
Verfahren wie das Klonen oder für
weitere Zwecke entnommen wurde.
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Die
selektive Amplifikation spezifischer Nukleinsäuresequenzen ist nützlich zur
Erhöhung
der Empfindlichkeit diagnostischer und ökologischer Assays unter Beibehaltung
der Spezifität,
zur Erhöhung
der Empfindlichkeit, Bequemlichkeit, Genauigkeit und Zuverlässigkeit
einer Vielfalt von Forschungstechniken und zur Bereitstellung eines
reichlichen Vorrats an spezifischen Oligonukleotiden für verschiedene
Zwecke.
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Die
vorliegende Erfindung eignet sich aufgrund der Bequemlichkeit ihrer
Ausführungsform
besonders zur Anwendung bei diagnostischen Tests.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Der
Nachweis und/oder die Quantifizierung spezifischer Nukleinsäuresequenzen
stellt eine zunehmend wichtige Methode zur Identifizierung und Klassifizierung
von Mikroorganismen, zur Diagnose von Infektionskrankheiten, für den Nachweis
und die Charakterisierung genetischer Anomalien, zur Identifizierung
mit Krebs assoziierter genetischer Veränderungen, zur Untersuchung
genetischer Krankheitsanfälligkeiten
und zur Messung der Reaktion auf verschiedene Behandlungsarten dar.
Derartige Verfahrensweisen finden auch erweiterten Einsatz beim
Nachweisen und Quantifizieren von Mikroorganismen in Nahrungsmitteln,
Umweltproben, Saatgut und weiteren Materialarten, bei denen das
Vorhandensein spezifischer Mikroorganismen eine Überwachung erfordern kann.
Weitere Anwendungen finden sich in der Gerichtsmedizin, der Anthropologie, der
Archäologie
und der Biologie, bei denen die Messung des Verwandtschaftsgrads
von Nukleinsäuresequenzen
zur Identifizierung von Tatverdächtigen,
zur Abklärung
von Vaterschaftsprozessen, zur Aufstellung genealogischer und phylogenetischer
Stammbäume
und als Klassifikations-Hilfsmittel für eine Vielfalt von Lebensformen
eingesetzt wird.
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Eine
verbreitete Methode zum Nachweisen und Quantifizieren spezifischer
Nukleinsäuresequenzen ist
die Nukleinsäure-Hybridisierung.
Diese Methode basiert auf der Fähigkeit
zweier Nukleinsäure-Stränge, die komplementäre oder
im Wesentlichen komplementäre
Sequenzen enthalten, unter geeigneten Bedingungen spezifisch aneinander
zu binden und dabei eine doppelsträngige Struktur auszubilden.
Zum Nachweisen und/oder Quantifizieren einer spezifischen Nukleinsäuresequenz
(bekannt als „Zielsequenz") wird ein markiertes
Oligonukleotid (bekannt als „Sonde") hergestellt, die
zur Zielsequenz komplementäre
Sequenzen enthält. Die
Sonde wird mit einer Probe gemischt, in der die Zielsequenz vermutet
wird, und es werden für
die Hybridbildung geeignete Bedingungen geschaffen. Die Sonde hybridisiert
an die Zielsequenz, sofern sie in der Probe vorhanden ist. Die Sonden-Ziel-Hybride
werden dann von der einzelsträngigen
Sonde auf eine von vielfältigen Weisen
getrennt. Die Menge an an die Hybride gebundenem Marker wird dann
als Mengenangabe der Zielsequenz in der Probe gemessen.
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Die
Empfindlichkeit des Nukleinsäure-Hybridisierungs-Assays
ist in erster Linie durch die spezifische Aktivität der Sonde,
die Rate und den Umfang der Hybridisierungs-reaktion, die Durchführung des
Verfahrens zur Trennung hybridisierter und unhybridisierter Sonde
und die Empfindlichkeit, mit welcher der Marker nachgewiesen werden
kann, begrenzt. Die empfindlichsten Verfahrensweisen können viele
der Merkmale vermissen lassen, die für routinemäßige klinische und ökologische
Tests erforderlich sind, wie Schnelligkeit, Bequemlichkeit und Wirtschaftlichkeit.
Darüber
hinaus können
ihre Empfindlichkeitsgrade für
viele gewünschte
Anwendungen nicht ausreichend sein.
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Als
Folge der Wechselwirkungen zwischen den verschiedenen Komponenten
und Komponent-Schritten
dieser Art von Assay liegt nahezu immer eine Umkehrbeziehung zwischen
Empfindlichkeit und Spezifität vor.
Daher können
Schritte, die der Erhöhung
der Empfindlichkeit des Assays dienen sollen (zum Beispiel eine Steigerung
der spezifischen Wirksamkeit der Sonde) zu einem höheren Prozentsatz
falsch-positiver
Testergebnisse führen.
Die Verknüpfung
von Empfindlichkeit und Spezifität
stellt eine beträchtliche
Hürde hinsichtlich einer
verbesserten Empfindlichkeit der Hybridisierungs-Assays dar. Eine
Lösung
für dieses
Problem bestünde in
einer spezifischen Erhöhung
der Menge an vorhandener Zielsequenz unter Verwendung eines Amplifikationsverfahrens.
Würde man
einen einzelnen Abschnitt der Zielsequenz amplifizieren, ohne dass
ein wesentlicher Teil der in den restlichen Sequenzen der Probe
codierten Information amplifiziert würde, so könnte dies zu einer Erhöhung der
Empfindlichkeit führen,
ohne daß zugleich
die Spezifität
beeinträchtigt
würde.
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Ein
Verfahren zur spezifischen Amplifikation von Nukleinsäuresequenzen
mit der Bezeichnung Polymerasekettenreaktion („polymerase chain reaction" oder „PCR") wurde beschrieben
von Mullis et al. (Siehe US-Patentschriften 4683195, 4683202 und
4800159 und Europäische
Patentanmeldungen 86302298.4, 86302299.2 und 87300203.4 und Methods
in Enzymology, Band 155, 1987, S. 335-350.) Das Verfahren verwendet
sich wiederholende Zyklen einer Primer-abhängigen Nukleinsäure-Synthese,
die gleichzeitig ablaufen, und wobei jeder Strang einer komplementären Sequenz
als eine Matrize genützt
wird. Die zu amplifizierende Sequenz ist definiert durch die Positionen
der Primer-Moleküle,
die die Synthese einleiten. Die Primer sind zum 3'-Endabschnitt der
Zielsequenz oder ihres Komplements komplementär und müssen mit jenen Stellen komplexieren,
damit die Nukleinsäure-Synthese
einsetzen kann. Nach Synthese des Verlängerungsprodukts werden die
Stränge
im allgemeinen durch Wärmedenaturierung
vor dem nächsten
Syntheseschritt getrennt. Beim PCR-Verfahren werden Kopien beider
Stränge
einer komplementären
Sequenz synthetisiert.
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Der
Schritt der Strangtrennung, wie bei der PCR zur Auftrennung der
neu synthetisierten Stränge
am Ende jedes Zyklus der PCR-Reaktion angewandt, erfolgt oftmals
als Denaturierung durch Wärme.
Das erfordert entweder ein thermostabiles Enzym oder die Zugabe
von neuem Enzym zwischen den Schritten der Wärmedenaturierung und der Einleitung
des nächsten
Zyklus der DNA-Synthese. Die Erfordernis einer wiederholten Kreisführung der
Reaktionstemperatur zwischen mehreren unterschiedlichen und extremen
Temperaturen ist ein Nachteil des PCR-Verfahrens. Um die PCR bequem
durchführbar
zu machen, sind programmierbare Wärmekreisprozeß-Instrumente
erforderlich.
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Das
PCR-Verfahren wurde an die RNA-Transkription gekoppelt, indem eine
Promotor-Sequenz in einen der bei der PCR-Reaktion verwendeten Primer
eingebaut und dann nach mehrzyklischer Amplifikation mittels des
PCR-Verfahrens die doppelsträngige
DNA als Matrize für
die Transkription der einzelsträngigen
RNA verwendet wurde. (Siehe z.B. Murakawa et al., DNA 7:287-295
(1988).)
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Weitere
Verfahren zur Amplifikation einer spezifischen Nukleinsäuresequenz
umfassen eine Reihe von Schritten der Primer-Hybridisierung, Verlängerung
und Denaturierung zur Bereitstellung eines intermediären doppelsträngigen DNA-Moleküls, das
eine Promotorsequenz durch die Verwendung eines Promotorsequenz-enthaltenden
Primers aufweist. Die doppelsträngige
DNA wird zur Erzeugung vielfacher RNA-Kopien der Zielsequenz verwendet.
Die resultierenden RNA-Kopien können
als Zielsequenzen zum Erhalt weiterer Kopien, und diese wiederum
in vielfachen Zyklen, verwendet werden. (Gelegentlich als „Transkriptions-Amplifikations-System" oder TAS bezeichnet;
siehe z.B. Burg, et al., WO 89/1050; Gingeras, et al., WO 88/10315; Europäische Patentanmeldung
Nr. 89313154.0, wie veröffentlicht
unter Nr. 0373960 (Gingeras et al.); Europäische Patentanmeldung; Nr.
88113948.9, wie veröffentlicht
unter Nr. 0329822 (Davey und Malek); Malek et al. WO 91/02818 und
Europäische
Patentanmeldung Nr. 90307503.4, wie veröffentlicht unter Nr. 0408295
(Kacian und Fultz), wie auch unten erörtert.).
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Bei
Walker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89:392-396 (Jan. 1992)
wird ein mit Oligonukleotiden arbeitendes Amplifikations-Verfahren
zur Verwendung mit einer DNA-Matrize unter Gebrauch einer Restriktionsendonuklease
zum Erhalt der Ausgangs-Zielsequenz und eines Enzyms zum Strangbrechen
beim DNA/DNA-Komplex, um eine Verlängerungsreaktion und dadurch
die Amplifikation zu ermöglichen.
In der Europäischen
Patentanmeldung Nr. 88306717.5, wie unter Nr 0300796 veröffentlicht
(Becker et al), wird ein Amplifikations-Verfahren beschrieben, bei
dem ein Primer an die Zielsequenz hybridisiert wird und der resultierende
Duplex vor der Verlängerungsreaktion
und Amplifikation aufgespalten wird; falls sich der Primer über die Hybridisierungsregion
hinaus erstreckt, erfordert dies vor der Verlängerung eine Abspaltung und
eine Blockierung des Primers an dessen 3'-Ende, um das Auftreten unerwünschter
Verlängerungsreaktionen
vor der Amplifikation zu verhindern. Urdea, WO 91/10746, beschreibt
eine Signal-Amplifikationsmethode, die eine T7-Promotorsequenz einbezieht.
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Zu
weiteren Verfahren der Amplifikation von Nukleinsäure zählt die
Ligasekettenreaktion (Ligase Chain Reaction oder „LCR"), wie beschrieben
in der Europäischen
Patentanmeldung Nr. 320308, bei der mindestens vier separate Oligosonden
verwendet werden; zwei der Oligosonden hybridisieren an entgegengesetzte
Enden desselben Zielstranges in geeigneter Orientierung, so daß die dritten
und vierten Oligosonden mit den ersten und zweiten Oligosonden hybridisieren,
wobei sie im Zuge der Ligation miteinander verbundene Sonden bilden,
die denaturiert und nachgewiesen werden können. Bei einem weiteren Verfahren
handelt es sich um das in EP-A-0427073, veröffentlicht am 15. Mai 1991,
beschriebene Verfahren, bei dem eine palindrome Sonde, die zur Bildung
einer Haarnadel fähig
ist und eine funktionelle Promotor-Region in der Haarnadel aufweist,
an eine Zielsequenz hybridisiert wird, dann an ein anderes Oligonukleotid
durch Ligation verknüpft wird,
das an die Zielsequenz hybridisiert ist, so daß spezifische RNA-Transkripte
erhalten werden können.
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Es
können
relativ große
Mengen bestimmter RNAs unter Verwendung eines rekombinanten einzelsträngigen RNA-Moleküls mit einer
Erkennungssequenz für
die Bindung einer RNA-gerichteten Polymerase, bevorzugt einer Qβ-Replikase,
hergestellt werden. (Siehe z.B. US-Patentschrift Nr. 4786600 an
Kramer et al.) Eine Anzahl von Schritten ist erforderlich, um die
spezifische Sequenz in eine DNA-Kopie des Varianten-Moleküls einzuführen, sie
in einen Expressionsvektor zu klonieren, sie in RNA zu transkribieren
und sie dann mit Qβ-Replikase
zu replizieren.
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DEFINITIONEN
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Wie
hierin verwendet, weisen die folgenden Begriffe die folgenden Bedeutungen
auf, wenn nicht ausdrücklich
anders angegeben.
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A. Nukleinsäure
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Mit „Nukleinsäure" ist entweder RNA
oder DNA, neben jeglichen Nukleotid-Analoga oder anderen Molekülen, gemeint,
die in der Sequenz vorhanden sein können und die die Ausführung der
vorliegenden Erfindung nicht behindern.
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B. Matrize
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Eine „Matrize" ist ein Nukleinsäure-Molekül, das durch
eine Nukleinsäure-Polymerase
kopierbar ist. Eine Matrize kann entweder aus RNA oder aus DNA bestehen
und kann in Abhängigkeit
von der Polymerase entweder einzelsträngig oder doppelsträngig oder
teilweise doppelsträngig
vorliegen. Die synthetisierte Kopie ist zur Matrize komplementär. Bei dieser
Erfindung umfaßt
der Begriff Kopien auch Nukleinsäure
mit der zu einer Matrize äquivalenten
RNA- oder DNA-Sequenz, die im Fachbereich herkömmlicherweise als homologe Sequenzen
bezeichnet werden.
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C. Primer
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Bei
einem „Primer" handelt es sich
um ein Oligonukleotid, das komplementär zu einer Matrize ist und mit
der Matrize zum Erhalt eines Primer/Matrize-Komplexes hybridisiert,
um die Synthese mittels einer DNA-Polymerase, zum Beispiel einer
Reverse Transcriptase, einzuleiten, und der durch die Zugabe kovalent gebundener
und an sein 3'-Ende
geknüpfter
Basen, die komplementär
zur Matrize sind, verlängert
wird. Das Ergebnis ist ein Primer-Verlängerungsprodukt. Nahezu alle
bekannten DNA-Polymerasen (einschließlich Reverse Transcriptasen)
erfordern die Komplexbildung eines Oligonukleotids mit einer einzelsträngigen Matrize („Priming") zur Einleitung
der DNA-Synthese. Unter geeigneten Umständen kann ein Primer ein Teil
eines Promotor-Primers sein. Solche Primer sind allgemein 10 bis
100 Basen, bevorzugt 20 bis 50 Basen, lang.
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D. Promotor oder Promotor-Sequenz
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Bei
einem „Promotor" oder einer „Promotor-Sequenz" handelt es sich
um eine spezifische Nukleinsäuresequenz,
die durch eine DNA-abhängige
RNA-Polymerase („Transkriptase") als ein Signal
zur Bindung an ein Nukleinsäure-Molekül und zur
Einleitung der Transkription von RNA an einer spezifischen Stelle
erkannt wird. Zur Bindung erfordern solche Transkriptasen allgemein,
daß der
Promotor und sein Komplement doppelsträngig sind; der Matrizen-Abschnitt
braucht nicht doppelsträngig
zu sein. Einzelne DNA-abhängige
RNA-Polymerasen erkennen eine Vielzahl verschiedener Promotor-Sequenzen,
die in ihrer Effizienz hinsichtlich einer Förderung der Transkription deutlich
variieren können.
Bindet eine RNA-Polymerase an eine Promotor-Sequenz zur Einleitung
der Transkription, so ist diese Promotor-Sequenz nicht Teil der
transkribierten Sequenz. Daher enthalten die so hergestellten RNA-Transkripte
die Promotor-Sequenz nicht.
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E. Promotor-Primer
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Ein
Promotor-Primer umfaßt
einen Promotor und einen Primer. Es handelt sich um ein Oligonukleotid, das
hinreichend komplementär
zum 3'-Ende einer
Zielnukleinsäure-Sequenz
ist, um am oder nahe dem 3'-Ende
jener Zielnukleinsäure-Sequenz
zu komplexieren, was bedeutet, daß der Promotor- Primer dicht genug
am Ende der Zielsequenz komplexiert, um eine Amplifikation einer
ausreichenden Menge an Zielsequenz zu ermöglichen, so dass die Anforderungen
für den
Assay, die Tests, die Klonierung und weitere Anwendungen der amplifizierten
Nukleinsäure
erfüllt
sind. Der Promotor-Primer wird als eine Matrize zum Erhalt einer
komplementären
Nukleinsäuresequenz
verwendet, die vom 3'-Ende
(auch bekannt als der 3'-Terminus)
einer Zielnukleinsäure-Sequenz
ausgeht, um einen generell doppel-strängigen Promotor zu ergeben,
der einer beliebigen denaturierenden oder enzymatischen Aktivität unterzogen
werden kann, durch die der Doppelstrang zerstört werden kann. Solche Promotor-Primer
sind allgemein 40 bis 100 Basen, bevorzugt 40 bis 60 Basen, lang.
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Mit
einer DNA- oder RNA-abhängigen
DNA-Polymerase wird auch ein komplementärer Strang zum Zielnukleinsäure-Molekül erhalten,
wobei die Zielsequenz als eine Matrize verwendet wird.
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F. Modifizierter Primer
oder Promotor-Primer
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Das
3'-Ende des Primers
oder des Promotor-Primers kann modifiziert oder blockiert werden,
um die Rate und/oder den Umfang einer davon ausgehenden Verlängerungsreaktion
zu verhindern oder zu vermindern. Ein Primer oder Promotor-Primer
mit sowohl modifizierten als auch unmodifizierten Bestandteilen
besteht für
die Zwecke der vorliegenden Erfindung aus im Wesentlichen derselben
Nukleinsäuresequenz.
Anders gesagt enthält
der modifizierte Primer oder Promotor-Primer keine unterschiedliche
Komplexier-Sequenz (Primer) insofern, als sowohl das modifizierte
als auch das unmodifizierte Oligonukleotid in effektiv derselben
Position (plus oder minus etwa 10 Basen) an die Zielnukleinsäure-Sequenz
hybridisiert. Auch enthält
der modifizierte Promotor-Primer keine vom unmodifizierten Promotor-Primer
unterschiedliche Erkennungssequenz (Promotor). Dies bedeutet, daß innerhalb
von etwa 10 Basen die modifizierten und unmodifizierten Primer oder Promotor-Primer
gleich sind, durch dieselbe RNA-Polymerase erkannt werden und an
mehr oder weniger dieselbe Zielsequenz hybridisieren (obschon nicht
notwendigerweise an exakt dieselbe Position). Bei einer bevorzugten
Ausführungsform
sind modifizierte und unmodifizierte Primer oder Promotor-Primer
mit Ausnahme der Modifikation identisch.
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Das
3'-Ende des zum
Ziel komplementären
Abschnitts eines Primers oder Promotor-Primers kann in vielfältiger Weise
modifiziert werden, wie den Fachleuten des Bereichs wohlbekannt.
Geeignete Modifikationen eines Promotor-Primers können in
der Addition von Ribonukleotiden, 3'-Desoxynukleotid-Resten (z.B. Cordycepin (CO, Glen Research)),
3',2'-Didesoxynukleotid-Resten,
modifizierten Nukleotiden mit nicht-Phosphodiester-Rückgrat-Verknüpfungen
(z.B. Phosphorthioaten) und nicht-Nukleotid-Verknüpfimgen, wie z.B. beschrieben
bei Arnold, et al., WO 89/02439 (RS), oder Alkandiol-Modifikationen (Wilk
et al. Nuc. Acids Res. 18:2065, 1990) (RP) bestehen, oder die Modifikation
kann einfach in einem oder mehreren Nukleotid-Resten, die 3' zur Hybridisierungs-Sequenz
und nicht komplementär
zur Zielnukleinsäure
sind, bestehen. Natürlich
sind auch andere wirksame Modifikationen möglich.
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Bei
einer Amplifikationsreaktion kann ein Gemisch aus modifizierten
und unmodifizierten Oligonukleotiden in einem breiten Verhältnisbereich
von modifizierten zu unmodifizierten Oligonukleotiden (z.B. 1:1
bis 1000:1) Verwendung finden. Auch kann ein Gemisch aus Oligonukleotiden
mit verschiedenen 3'-Modifikationen
verwendet werden.
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G. Plus (+)- und Minus
(–)-Strang/Stränge
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Erörterungen
der Nukleinsäure-Synthese
lassen sich, indem Begriffe zur Benennung der beiden komplementären Stränge eines
Nukleinsäure-Duplex übernommen
werden, stark vereinfachen und verdeutlichen. Traditionell wurde
der Strang, der für
die zur Erzeugung von Proteinen oder strukturellen RNAs verwendeten Sequenzen
codiert, als der „Plus"-Strang und sein
Komplement als der „Minus"-Strang bezeichnet.
Heute ist bekannt, daß in
vielen Fällen
beide Stränge
funktional sind und demnach die Zuordnung der Bezeichnung „plus" für einen
und „minus" für den anderen
willkürlich
ist. Nichtsdestotrotz sind die Begriffe sehr nützlich zur Bezeichnung der
Sequenz-Orientierung der Nukleinsäuren und werden zu diesem Zweck
hierin verwendet, wobei der „Plus"-Strang den ursprünglichen
Zielsequenz-Strang bezeichnet, der mit dem ersten Primer oder Promotor-Primer
komplexiert wird.
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H. Zielnukleinsäure-Sequenz,
Zielsequenz
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Eine „Zielnukleinsäure-Sequenz" oder „Zielsequenz" weist eine gewünschte,
zu amplifizierende Nukleinsäuresequenz
auf und kann entweder einzelsträngig
oder doppelsträngig
sein und kann weitere Sequenzen in 5'- oder 3'-Position der zu amplifizierenden Sequenzen
umfassen, die amplifiziert werden können oder auch nicht.
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Die
Zielnukleinsäure-Sequenz
enthält
die komplexbildenden Sequenzen, an die der Promotor-Primer während der
Ausführung
der vorliegenden Erfindung hybridisiert. Dort, wo die Zielnukleinsäure-Sequenz ursprünglich einzelsträngig ist,
bezieht sich der Begriff sowohl auf den (+)- als auch den (–)-Strang, ebenso wie auf
die zur Zielsequenz komplementäre
Sequenz. Dort, wo die Zielnukleinsäure-Sequenz ursprünglich doppelsträngig ist,
bezieht sich der Begriff sowohl auf die (+)- als auch auf die (–)-Stränge.
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I. DNA-abhängige DNA-Polymerase
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Bei
einer „DNA-abhängigen DNA-Polymerase" handelt es sich
um ein Enzym, welches eine komplementäre DNA-Kopie von einer DNA-Matrize
synthetisiert. Ein Beispiel hierfür ist die Bakteriophagen-T7-DNA-Polymerase.
Alle bekannten DNA-abhängigen
DNA-Polymerasen erfordern einen komplementären Primer, der RNA oder DNA
sein kann, oder ein Copolymer, um die Synthese einzuleiten. Es ist
bekannt, daß unter
geeigneten Bedingungen bestimmte DNA-abhängige DNA-Polymerasen zur Synthetisierung einer komplementären DNA-Kopie
von einer RNA-Matrize in der Lage sind.
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J. DNA-abhängige RNA-Polymerase
(Transkriptase)
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Bei
einer „DNA-abhängigen RNA-Polymerase" oder „Transkriptase" handelt es sich
um ein Enzym, das vielfache RNA-Kopien aus einem doppelsträngigen oder
teilweise doppelsträngigen
DNA-Molekül mit einer
(gewöhnlich
doppelsträngigen)
Promotor-Sequenz synthetisiert. Es sollte zur Kenntnis genommen
werden, daß die
vorliegende Erfindung einzelsträngige
Promotor-Sequenzen im Promotor-Primer,
neben den RNA-Polymerasen, die sie erkennen, umfaßt. Die
RNA-Moleküle
(„Transkripte") werden in der 5' → 3'-Richtung des RNA-Moleküls, beginnend
bei einer spezifischen Position direkt flußabwärts des Promotors, synthetisiert.
Beispiele der Transkriptasen sind die DNA-abhängigen RNA-Polymerasen der Bakteriophagen T7, T3
und SP6.
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K. RNA-abhängige DNA-Polymerase
(Reverse Transkriptase)
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Bei
einer „RNA-abhängigen DNA-Polymerase" oder „reversen
Transkriptase" handelt
es sich um ein Enzym, welches eine komplementäre DNA-Kopie von einer RNA-Matrize
synthetisiert Alle bekannten reversen Transkriptasen sind auch zur
Herstellung einer komplementären
DNA-Kopie von einer DNA-Matrize
in der Lage; also handelt es sich sowohl um RNA- als auch DNA-abhängige DNA-Polymerasen.
Ein Primer muß die Synthese
sowohl mit den RNA- als auch den DNA-Matrizen einleiten können.
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L. RNAse H
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Bei
der „RNAse
H" handelt es sich
um ein Enzym, das den RNA-Abschnitt eines RNA:DNA-Duplex abbaut. Die
RNAse H können
Endonukleasen oder Exonukleasen sein. Die reversen Transkriptasen
von Vogel-Myeloblastose-Virus und Moloney-Mäuse-Leukämie-Virus weisen über ihre
Polymerase-Aktivität hinaus eine
RNAse H-Aktivität
auf. Bei einigen geklonten reversen Transkriptasen fehlt die RNAse
H-Aktivität.
Es stehen auch Quellen für
RNAse H ohne eine assoziierte Polymerase-Aktivität zur Verfügung. Der Abbau kann zur Abtrennung
von RNA aus einem RNA:DNA-Komplex führen. Alternativ dazu kann
die RNAse H die RNA an verschiedenen Stellen einfach so zerschneiden,
daß Abschnitte
der RNA abschmelzen, oder Enzymen ermöglichen, Abschnitte der RNA
abzuwickeln, oder die erzeugten RNA-Fragmente können als Primer für die Verlängerung
durch eine Polymerase dienen.
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M. Hybridisieren, Komplex
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Die
Begriffe „hybridisieren" und „Komplex" beziehen sich auf
die Bildung von Duplexen zwischen Nukleotid-Sequenzen, die ausreichend
komplementär
sind, um Duplexe (oder „Komplexe") über Watson-Crick-Basenpaarung
zu bilden. Dort, wo ein Promotor-Primer oder Primer mit dem Ziel
(Matrize) hybridisiert, sind die Komplexe (oder Hybride) ausreichend
stabil, um der durch eine DNA-Polymerase zur Einleitung der DNA-Synthese
geforderten Priming-Funktion zu dienen.
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N. Spezifität
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Bei
Spezifität
handelt es sich um eine Eigenschaft der Nukleinsäuresequenz, mit der ihre Fähigkeit
zur Unterscheidung zwischen Ziel- und nicht-Ziel-Sequenzen in Abhängigkeit
von den Sequenz- und Assay-Bedingungen beschrieben wird.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein Kit zur Verfügung, das ein erstes Oligonukleotid
bestehend aus der Sequenz xGCCGTCACCCCACCAACAAGCT (SEQ ID Nr. 22)
und ein zweites Oligonukleotid bestehend aus der Sequenz xGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACC
(SEQ ID Nr. 2), enthält,
wobei x für
nichts steht oder eine durch eine RNA-Polymerase erkannte Sequenz
ist. Solch ein Kit kann zur Durchführung einer autokatalytischen
Methode zur Synthetisierung vielfacher Kopien von der M.tuberculosis-Ziel-rRNA-Nukleinsäure-Sequenz
verwendet werden (d.h. die Methode zykliert automatisch ohne Erfordernis
einer Veränderung
der Reaktionsbedingungen wie Temperatur, pH-Wert oder Ionenstärke).
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Solch
eine Methode stellt die Behandlung einer Zielsequenz mit einem ersten
Oligonukleotid (das eine komplexbildende Sequenz aufweist, die ausreichend
komplementär
zu einem 3'-Endabschnitt
der Zielsequenz ist, um damit zu hybridisieren) (dies allein wird
als Primer bezeichnet) und das eine Sequenz in 5'-Position zur komplexbildenden Sequenz
aufweist, die eine Sequenz umfaßt,
die in doppelsträngiger Form
als ein Promotor für
eine RNA-Polymerase dient (diese Anordnung wird als Promotor-Primer
bezeichnet), und mit einem zweiten Oligonukleotid (das ein Primer
oder Promotor-Primer ist, der eine komplexbildende Sequenz aufweist,
die ausreichend komplementär
zum Komplement der Zielsequenz ist, um damit zu hybridisieren),
bereit, unter Bedingungen, bei denen ein Oligonukleotid/Zielsequenz-Komplex
gebildet werden kann und die DNA- und RNA-Synthese einsetzen kann.
In einer Ausführungsform
sind eines oder beide der ersten und zweiten Oligonukleotide ein
Gemisch aus einer blockierten und einer unblockierten Oligonukleotid-Sequenz
(blockierte Oligonukleotide weisen ein modifiziertes 3'-Ende auf, um die
Rate und/oder den Umfang der Primer-Verlängerung durch eine DNA-Polymerase
ganz zu verhindern oder zu vermindern) oder ein Gemisch aus Oligonukleotiden mit
unterschiedlichen 3'-Modifikationen. Ein
derartiges Gemisch erhöht
die Effizienz der spezifischen Amplifikationsreaktion signifikant,
im Vergleich zu einer Verwendung von entweder nur blockierten oder
nur unblockierten Oligonukleotiden. Das Verhältnis solcher Oligonukleotide
kann in Abhängigkeit
von der spezifisch zu amplifizierenden Matrizen-Sequenz variiert
werden, doch liegt es allgemein zwischen 1:1 und 1000:1, blockiert zu
unblockiert. Für
die Erfindung sind keine definierten 3'- und 5'-Enden der Zielsequenz erforderlich.
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Im
Besonderen umfasst eine Amplifikationsmethode wie oben beschrieben
(a) das Behandeln einer Zielsequenz mit einem ersten Promotor-Primer-Oligonukleotid,
das eine komplexbildende Sequenz aufweist, die ausreichend komplementär zu einem
3'-Endabschnitt
der Zielsequenz ist, um damit zu hybridisieren, und das eine Sequenz
in 5'-Position zur
komplexbildenden Sequenz aufweist, die eine Sequenz umfaßt, die
in doppelsträngiger
Form als ein Promotor für
eine RNA-Polymerase dient, unter Bedingungen, bei denen ein Oligonukleotid/Zielsequenz-Komplex
gebildet werden kann und die DNA-Synthese
mittels einer geeigneten Polymerase (z.B. einer DNA-Polymerase)
eingeleitet werden kann, (b) Inkubieren des ersten Oligonukleotid/Ziel-Komplexes
unter Verlängerungsreaktions-Bedingungen,
so daß das
3'-Ende des Ziels
zum Erhalt einer Hybrid-Matrize für eine RNA-Polymerase verlängert werden
kann, und (c) Inkubieren der Hybrid-Matrize unter Bedingungen, bei
denen vielfache RNA-Kopien der Zielsequenz unter Verwendung einer
RNA-Polymerase, die die Promotor-Sequenz erkennt, hergestellt werden
können.
Die Erfindung umfaßt
auch die Erzeugung eines 3'-Endes
einer RNA-Zielsequenz in Schritt (b) durch die Wirkung eines Enzyms,
das selektiv den RNA-Abschnitt eines RNA:DNA-Hybrids (z.B. RNAse
H) abbaut. Die derart hergestellte RNA kann zum Erhalt weiterer Mengen
an Produkt autokatalytisch zykliert werden.
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Bei
anderen Methoden erfolgen die folgenden Schritte: (a) Zusammenbringen
einer Nukleinsäure-(z.B. RNA oder DNA)-Zielsequenz
mit einem ersten Oligonukleotid-Primer oder Promotor-Primer unter
Bedingungen, bei denen ein erster Oligonukleotid/Zielsequenz-Komplex
so gebildet wird, daß die
DNA-Synthese durch
eine geeignete Polymerase (z.B. eine DNA-Polymerase) eingeleitet
werden kann, (b) Inkubieren des ersten Oligonukleotids unter Verlängerungsreaktions-Bedingungen,
so daß das
Ziel von der Polymerase als eine Matrize zum Erhalt eines ersten,
zum Ziel komplementären
DNA-Verlängerungsprodukt
verwendet werden kann (sofern der erste Primer nicht blockiert ist);
(c) sofern das Ziel ein RNA-Molekül ist, Trennen des DNA-Verlängerungsprodukts
vom RNA-Ziel unter Verwendung eines Enzyms, das selektiv das RNA-Ziel
abbaut, oder, sofern das Ziel ein DNA-Molekül ist, Trennen der beiden DNA-Stränge (z.B.
durch Erhitzen auf 90-100°C
oder mittels anderer Methoden); (d) Zusammenbringen des DNA-Verlängerungsprodukts
mit einem zweiten Oligonukleotid, das einen Primer oder einen Promotor-Primer
umfaßt
und das eine komplexbildende Sequenz aufweist, die ausreichend komplementär zum 3'-Endabschnitt des
DNA-Verlängerungsprodukts
ist, um damit unter Bedingungen zu hybridisieren, bei denen ein
zweiter Oligonukleotid/Verlängerungsprodukt-Komplex
gebildet wird und die DNA-Synthese wie oben eingeleitet werden kann,
was von jeglichen blockierenden Molekülen auf diesem Primer abhängt. Ist
bei dieser Erfindung das erste Oligonukleotid kein Promotor-Primer,
so ist das zweite Oligonukleotid ein Promotor-Primer, was bedeutet,
daß das
zweite Oligonukleotid eine Sequenz in 5'-Position
zur komplexbildenden Sequenz aufweist, die eine Promotor-Sequenz
für eine
RNA-Polymerase enthält.
Darüber
hinaus bestehen das erste und/oder zweite Oligonukleotid entweder aus
einem Gemisch eines blockierten und eines unblockierten Oligonukleotids
oder einem Gemisch von Oligonukleotiden mit unterschiedlichen 3'-Modifikationen.
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Die
Amplifikationsreaktion wird in einem Gemisch vorgenommen, das im
Wesentlichen aus den erforderlichen Reaktionspartnern und Reagentien
besteht. Ein derartiges Gemisch kann allerdings auch Enzyme oder
weitere Substituenten enthalten, die die Amplifikation der Erfindung
(z.B. den Mechanismus der Reaktion) nicht qualitativ beeinflussen.
Solche Substituenten können
die Menge an beobachteter Amplifikation beeinflussen. Zum Beispiel
kann das Gemisch andere Promotor-Primer für dieselbe Zielsequenz enthalten
oder kann „Helfer"-Oligonukleotide
aufweisen. Solche Helfer-Oligonukleotide werden in einer Weise ähnlich der
der Hybridisierungs-Helfer-Sonden verwendet, wie beschrieben bei
Hogan et al., US-Patentschrift 5030557, nämlich durch Förderung
der Bindung des Promotor-Primers an seine Zielnukleinsäure, und
zwar selbst dann, wenn die Zielnukleinsäure eine signifikante Sekundärstruktur
aufweist. Trotz der Ähnlichkeit
bezüglich
der Verwendung solcher Helfer-Oligonukleotide überraschte es, daß solche
Helfer-Oligonukleotide
bei einem Amplifikations-Protokoll ohne nachteilige Auswirkung auf
die Effizienz des Verfahrens eingesetzt werden konnten.
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Das
erste Oligonukleotid kann ein Promotor-Primer und das zweite Oligonukleotid
ein Primer, oder umgekehrt, sein, oder es können sowohl das erste als auch
das zweite Oligonukleotid ein Promotor-Primer sein, wobei die Promotor entweder
identisch (in dem Sinne, daß die
Promotoren durch dieselbe RNA-Polymerase erkannt werden) oder verschieden
sein können.
Die Verwendung verschiedener Promotoren ist besonders dann nützlich,
wenn die amplifizierte Nukleinsäure
zum Klonen verwendet wird. Die ersten und zweiten Oligonukleotide
und die aus der Zielsequenz erhaltene RNA können dann für die autokatalytische Synthese
vielfacher Kopien (womit sowohl komplementäre als auch homologe Nukleinsäuresequenzen
gemeint sind) der Zielsequenz verwendet werden.
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Der
modifizierte Primer oder Promotor-Primer des Kits gemäß der vorliegenden
Erfindung besteht im Wesentlichen aus einer einzelnen Nukleinsäuresequenz,
die eine Modifikation am oder nahe (innerhalb von 3 Basen) dem 3'-Ende des gegebenen
Primers oder Promotor-Primers aufweist, die die Verlängerung
des Primers auf einer Matrize mittels einer DNA-Polymerase verändert (vermindert
oder blockiert). Vorzugsweise wird dieser modifizierte Primer oder
Promotor-Primer mit einem unmodifizierten Primer oder Promotor-Primer
gemischt, der im Wesentlichen aus derselben Nukleinsäuresequenz
besteht, neben einem oder mehreren anderen Primern oder Promotor-Primern
einer unterschiedlichen Nukleinsäuresequenz
(die ebenfalls ein Gemisch von blockierten und unblockierten Oligonukleotiden
sein können).
Die erfindungsgemäßen Kits
umfassen auch Gemische von Primern und Promotor-Primern mit mehr
als einer Modifikation an oder in der Nähe von ihren 3'-Enden.
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Ein
erfindungsgemäßer Kit
kann nach der Erzeugung eines definierten 5'-Endes (d.h. eines von bekannter Sequenz)
in einer RNA-Zielsequenz verwendet werden, durch Behandlung der
RNA mit einem DNA-Oligonukleotid, das nahe der zweiten Primer-Bindungsstelle
hybridisiert und dabei ein Substrat für RNAse H bildet. Dieses Substrat
wird dann mittels RNAse H zur Begrenzung des 5'-Endes des RNA-Ziels gespalten, welches
wie oben erörtert
amplifiziert werden kann.
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Eine
Amplifikation unter Verwendung des erfindungsgemäßen Kits kann die Zusammenwirkung
einer DNA-Polymerase (zum Beispiel einer reversen Transkriptase)
und einer DNA-abhängigen
RNA-Polymerase (Transkriptase)
mit einem enzymatischen Hybrid-Trennschritt zur Herstellung von
Produkten, die selbst zur Erzeugung weiteren Produkts verwendet
werden können,
einschliessen, wobei eine autokatalytische Reaktion entsteht ohne
daß eine
Beeinflussung der Reaktionsbedingungen, z.B. eine Wärmezyklierung,
erforderlich wäre.
Ferner werden bei einigen Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung, die eine Vorbehandlung einbeziehen,
alle bis auf den/die einleitenden Schritt/e der Vorbehandlung bei
ein und derselben Temperatur ausgeführt.
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Bei
einem Beispiel eines typischen Assays wird eine Probe einschließlich zu
amplifizierendes rRNA-Ziel mit einem Puffer-Konzentrat, enthaltend
den Puffer, Salze (z.B. divalente Kationen wie Magnesium), Nukleotid-Triphosphate,
Primer und/oder Promotor-Primer (blockiert und/oder unblockiert),
ein Thiol-Reduktionsmittel wie Dithiothreitol und ein Polykation
wie Spermidin, gemischt. Die Reaktion wird dann wahlweise bei nahezu
100°C zur
Denaturierung jeglicher Sekundärstruktur
inkubiert. Nach Abkühlen
auf Raumtemperatur (etwa 20°C)
werden Enzyme, enthaltend DNA- und RNA-abhängige DNA-Polymerase-Aktivität, RNAse H-Aktivität und DNA-abhängige RNA-Polymerase-Aktivität zugesetzt
und das Gemisch über
etwa 10 Minuten bis vier Stunden hinweg bei 37°C bis 42°C inkubiert. Die Reaktion kann
dann durch Zugabe einer lumineszierend markierten Sonde, durch Inkubieren über 10 bis
30 Minuten hinweg bei 60°C,
durch Zugabe einer Lösung
zur selektiven Hydrolyse des Markers auf nicht-hybridisierter Sonde,
durch Inkubieren der Reaktion über
5 bis 10 Minuten hinweg bei 60°C,
und durch Messen der verbliebenen Chemilumineszenz in einem Luminometer
analysiert werden. (Siehe z.B. den Hybridisierungs-Schutzassay (HPA)
von Arnold et al., wie beschrieben in WO 89/02476, veröffentlicht
am 29. März
1989, und die entsprechende veröffentlichte
Europäische
Anmeldung Nr. 0309230.) Die erfindungsgemäßen Kits können bei vielen weiteren Assay-Systemen,
wie sie den Fachleuten bekannt sind, verwendet werden.
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Gemäss einem
weiteren Aspekt der Erfindung wird eine Mischung modifizierter und
unmodifizierter Oligonukleotide oder eine Mischung unterschiedlich
modifizierter Oligonukleotide bereitgestellt, wobei die Mischung
eine Mischung von Primern oder eine Mischung von Promotor-Primern
ist, die die gleiche Promotorsequenz aufweisen und wobei jedes modifizierte
oder unmodifizierte Oligonukleotid im Wesentlichen an die gleiche
Zielsequenz hybridisiert und wobei die Oligonukleotide aus einem
der folgenden Oligonukleotide (a) bis (c) ausgewählt sind:
- (a)
Oligonukleotid bestehend aus einer Nukleinsäuresequenz ausgewählt aus
GGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACC (SEQ ID Nr. 2) und dem Oligonukleotid,
das zu der Nukleinsäuresequenz
komplementär
ist;
- (b) Oligonukleotid wie in (a) oben aufgeführt, das am 5'-Ende mit einer durch
eine RNA-Polymerase
erkannten Sequenz verbunden ist; und
- (c) Oligonukleotid wie in (a) oder (b) oben aufgeführt, das
eine Modifikation an oder in der Nähe seines 3'-Endes aufweist, die die Verlängerung
durch eine Polymerase vermindert oder blockiert.
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Unter
dieser Mischung wird auch eine solche verstanden, die eine Komponente
eines erfindungsgemäßen Kits
bilden kann.
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Die
Kits gemäß der Erfindung
können
diagnostische Kits oder andere Kits sein, die in diagnostischen Verfahrensweisen
oder anderen Verfahrensweisen Verwendung finden können, und
die Erfindung ist anpassbar an die Multiwell-Verfahrenstechnik,
welche in der Form von Kits bereitgestellt werden kann.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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In 1 ist
die Struktur der Alkandiol-Modifikation, bezeichnet als RP, gezeigt.
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AUSFÜHRLICHE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Ein
Kit gemäß der Erfindung
stellt in vorteilhafter Weise Oligonukleotide für ein Amplifikationsverfahren bereit,
mit dem RNA-Kopien einer M.tuberculosis rRNA-Zielsequenz durch Verwendung
eines Gemischs von blockierten und unblockierten Promotor-Primern
oder Promotor-Primern mit unterschiedlichen 3'-Modifikationen, synthetisiert werden,
bestehend im Wesentlichen aus derselben Nukleinsäure-Sequenz in einem Verhältnis, das
eine verminderte Menge an nicht-spezifischen Nebenprodukten erzielt.
Der Amplifikationsprozess verläuft
spontan und isothermisch unter einem breiten Bereich von Bedingungen.
Die nachfolgend beschriebenen Amplifikationsreaktionen stellen eines
Reihe logischer Schritte dar. Die relative Rate jedes Schritts bestimmt die
effektive Ausbeute an Amplifikationsprodukt. Die Verwendung eines
Gemischs von blockieren und unblockierten Primern vermindert die
Nebenreaktionen und verbessert folglich die Amplifikation. Nebenprodukte, wie
etwa „Primer-Dimere", wurden beschrieben
und sind im Fachbereich als die Effizienz der Amplifikationsreaktionen
beeinflussend wohlbekannt. Ein Amplifikationsverfahren, wie in dieser
Anmeldung vorgestellt, vermindert den Wirkungsgrad, mit dem solche
Nebenprodukte gebildet werden, und erhöht daher die Amplifikationsleistung.
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Geeignete
DNA-Polymerasen umfassen reverse Transkriptasen, wie zum Beispiel
die reversen Transkriptasen von Vogel-Myeloblastose-Virus (AMV)
und Moloney-Mäuse-Leukämie-Virus
(MMLV). Promotor oder Promotor-Sequenzen, die sich für den Einbau
in bei der vorliegenden Erfindung verwendete Promotor-Primer eignen,
sind Nukleinsäure-Sequenzen
(entweder natürlich
vorkommende oder synthetisch oder mittels Verdauung durch Restriktionsendonuklease
erzeugte), die durch eine RNA-Polymerase spezifisch erkannt werden,
die diese Sequenz erkennt und sich daran bindet und den Transkriptionsprozeß einleitet,
bei welchem RNA-Transkripte erzeugt werden. Promotorsequenzen für die es
eine bekannte und verfügbare
Polymerase gibt, die dazu fähig
ist, die Startersequenz zu erkennen sind besonders geeignet. Zu
solchen Promotoren zählen
jene, die durch bestimmte Bakteriophagen-Polymerasen, wie zum Beispiel
Bakteriophage T3, T7 oder SP6, erkannt werden. Die Sequenz kann
wahlweise Nukleotid-Basen umfassen, die sich über die eigentliche Erkennungsstelle
für die
RNA-Polymerase hinaus erstrecken und die zusätzliche Stabilität und Empfänglichkeit
für Abbauprozesse
oder eine erhöhte
Transkriptionsleistung verleihen können.
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Obschon
einige der reversen Transkriptasen, die zur Verwendung mit den Oligonukleotid-Kits
gemäß der Erfindung
geeignet sind, eine RNAse H-Aktivität aufweisen, wie zum Beispiel
AMV- oder MMLV-reverse Transkriptase, kann die Zugabe einer exogenen
RNAse H, wie z.B. E. coli RNAse H, bevorzugt sein. Die Beispiele
(siehe unten) zeigen zwar, daß die
Zugabe exogener RNAse H nicht erforderlich ist, doch kann die in AMV-reverser
Transkriptase vorliegende RNAse H-Aktivität durch relativ große Mengen
an im Reaktionsgemisch vorhandener heterologer DNA gehemmt werden;
eine Lösung
für das
Problem besteht in der Zugabe von exogener RNAse H. Ein weiterer
Fall, bei dem die Zugabe von RNAse Herforderlich sein kann, liegt
dann vor, wenn ein Oligonukleotid intern an die Ziel-RNA hybridisiert
(d.h. das Oligonukleotid hybridisiert so, daß sich Zielsequenz-Nukleotide
sowohl über
das 3'- als auch das 5'-Ende des Oligonukleotids
hinaus erstrecken).
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Das
zweite Oligonukleotid das eine Primersequenz bereitstellt kann blockiert
oder ähnlich
dem ersten Oligonukleotid modifiziert sein. Bei einer Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist dann, wenn das erste Oligonukleotid
unmodifiziert ist, das zweite Oligonukleotid modifiziert. Auch ist
dann, wenn das erste Oligonukleotid kein Promotor-Primer ist, das
zweite Oligonukleotid ein Promotor-Primer. Ist außerdem das
erste Oligonukleotid lediglich ein Primer, so kann es unblockiert
sein, wobei das zweite Oligonukleotid dann ein Promotor-Primer ist,
der sowohl blockierte als auch unblockierte Bestandteile enthält, die
im Wesentlichen aus einer einzigen Nukleinsäure-Sequenz bestehen.
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Überraschenderweise
wird durch solch ein Gemisch von blockierten und unblockierten Oligonukleotiden,
die im Wesentlichen aus derselben Nukleinsäure-Sequenz bestehen, die gebildete
Menge an nicht-spezifischem Produkt vermindert und dadurch der Wirkungsgrad
der Amplifikation erhöht.
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Die
erzeugten RNA-Kopien oder Transkripte können ohne weitere Handhabung
autokatalytisch vervielfacht werden.
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Gemäss einem
anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung sind sowohl das erste
als auch das zweite Oligonukleotid Promotor-Primer, und eines oder
beide können
jeweils sowohl aus modifizierten als auch unmodifizierten Promotor-Primern
bestehen. In solch einem Falle ist es bevorzugt, daß beide
Promotoren durch dieselbe RNA-Polymerase erkannt werden, sofern
nicht Einführung
des zweiten Promotors zu anderen Zwecken als der Amplifikation,
zum Beispiel zum Klonen, angestrebt wird. Sind beide Oligonukleotide
Promotor-Primer, so werden während
der autokatalytischen Reaktion zu beiden Strängen der doppelsträngigen Matrize
komplementäre
Transkripte erzeugt, wodurch die Anzahl der synthetisierten Kopien
der Zielsequenz erhöht
werden kann.
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Zu
beachten ist, daß,
indem das erste Oligonukleotid (Primer oder Promotor-Primer) ein
Ende der Zielsequenz definiert, nun das zweite Oligonukleotid (Primer
oder Promotor-Primer) das andere Ende definiert; die Endigungen
ebenfalls durch eine spezifische Restriktionsendonuklease definiert
sein können
oder durch andere geeignete Mittel (was ein natürliches 3'-Ende einschließt). Die RNA-Transkripte können von
der ursprünglichen
Zielnukleinsäure
verschiedene Endigungen aufweisen, doch bleibt die Sequenz zwischen
dem ersten Oligonukleotid und dem zweiten Oligonukleotid intakt.
Die so hergestellten RNA-Transkripte
können
in obigem System ohne weitere Handhabung automatisch im Kreisprozeß geführt werden.
Daher ist die Reaktion autokatalytisch.
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Ebenfalls
zu beachten ist, daß jedes
Oligonukleotid Nukleotid-Sequenzen in 5'-Position zu seiner Priming-Sequenz
aufweisen kann, was zum Zusatz einer zusätzlichen Nukleotid-Sequenz
an der schließlich resultierenden
doppelsträngigen
DNA führen
kann; wobei die zusätzliche
Nukleotid-Sequenz nicht auf eine Promotor-Sequenz beschränkt ist.
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Bei
einer anderen Ausführungsform
kann die vorliegende Erfindung aus einem ersten und zweiten Oligonukleotid
bestehen, mit dem ein Promotor-Primer bereitgestellt wird, der lediglich
aus einem blockierten Oligonukleotid besteht, oder lediglich aus
einem unblockierten Oligonukleotid, oder aus einem Oligonukleotid
mit einem Gemisch unterschiedlicher Modifikationen am oder nahe
dem 3'-Ende.
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Die
Amplifikation kann in Gegenwart von Zusatzstoffen zur Förderung
der Amplifikation vorgenommen werden. Bereits verwendete Beispiele
stellen Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid, Ethylenglycol, Glycerin oder
Zink dar.
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Die
Komponenten des Reaktionsgemischs können schrittweise oder auf
einmal zugegeben werden. Die Reaktion läuft in vorteilhafter Weise
unter Bedingungen ab, die zur Aufrechterhaltung der Stabilität der Reaktionsbestandteile,
wie etwa der Enzym-Komponenten, geeignet sind, ohne, daß eine Modifikation
oder Beeinflussung der Reaktionsbedingungen während des Ablaufs der Amplifikationsreaktion
erforderlich wäre.
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BEISPIELE
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VORWORT
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Die
folgenden Beispiele veranschaulichen die Nützlichkeit der Kits gemäß der vorliegenden
Erfindung. Sie stellen keine Beschränkung dar und sollten nicht
als solche verstanden werden.
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Sofern
nicht anderweitig angegeben, waren die Reaktionsbedingungen für die Amplifikation
in den folgenden Beispielen wie folgt: 50 mM Tris-HCl, 35 mM KCl,
20 mM MgCl2, 15 mM N-Acetylcystein, 4 mM
rATP, 4 mM rCTP, 4 mM rGTP, 4 mM rUTP, 1 mM dATP, 1 mM dCTP, 1 mM
dGTP, 1 mM dTTP, 10% Glycerin, 10% Dimethylsulfoxid, 300-600 Einheiten
MMLV-reverse Transkriptase, 200-400 Einheiten T7 RNA-Polymerase, 0,15 μM jeweils
von Primer oder Promotor-Primer und spezifische Mengen an Matrize
und Enzymen in 100 μl-Volumina
bei 42°C
für 1 Stunde.
Auch Dithiothreitol, Spermidin und/oder Polyethylenimin (PEI) können dem Reaktionsgemisch
in vorteilhafter Weise zugegeben werden.
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Die
in den folgenden Beispielen verwendeten Enzyme sind T7- oder T3-RNA-Polymerase
und die reverse Transkriptase von Moloney-Mäuse-Leukämie-Virus (MMLV). Weitere RNA-Polymerasen
mit verschiedenen Promotor-Spezifitäten eignen sich ebenfalls.
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Die
relative Amplifikation wurde wie folgt gemessen. Eine Probe des
Amplifikations-Reaktionsgemisch (gewöhnlich 10 μl) wurde
100 μl einer
lumineszierend markierten Sondenlösung (zum Beispiel mit Acridiniumester
markiert – siehe
obigen HPA-Bezug), enthaltend etwa 75 fMol Sonde, 0,1 M Lithiumsuccinat,
pH 4,7, 2% (Gew/Vol) Lithiumlaurylsulfat, 15 mM Aldrithiol, 20 mM
EDTA und 20 mM EGTA, zugegeben und gemischt. Die Reaktionen wurden
dann 20 Minuten lang bei 60°C
inkubiert und abgekühlt.
Jeder Hybridisierungsreaktion wurden 300 μl von 0,6 M Natriumborat, pH
8,5, 1% TritonJX-100,
zugegeben. Die Reaktionen wurden dann gemischt und sechs Minuten
lang bei 60°C
inkubiert, um den chemilumineszierenden Marker der unhybridisierten
Sonde zu zerstören.
Dieses Verfahren der Zerstörung
des chemilumineszierenden Markers der unhybridisierten Sonde ist
recht spezifisch; es bleibt lediglich eine sehr geringe Fraktion
der unhybridisierten Sonde chemilumineszent. Die Reaktionen wurden
abgekühlt
und die verbliebene Chemilumineszenz in einem Luminometer unter
Zugabe von 200μl
von 0,1% Wasserstoffperoxid, 1 mM Salpetersäure und grenzflächenaktives Mittel,
und 200 μl
von 1,0 N Natriumhydroxid quantifiziert. Im Assay emittiert aus
hybridisierter Sonde Licht. Die abgestrahlte Photonenmenge wurde
in einem Luminometer gemessen und die Ergebnisse als Relative Licht-Einheiten
(RLU) aufgezeichnet Da die Reaktion, die den chemilumineszierenden
Marker der unhybridisierten Sonde zerstört, nicht 100% wirksam ist,
liegt im allgemeinen ein Hintergrundpegel an vorhandenem Signal
im Bereich von etwa 1000 bis 2000 RLU vor.
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Viele
weitere Assay-Methoden sind ebenfalls anwendbar, einschließlich von
Assays unter Anwendung einer Hybridisierung an isotopisch markierte
Sonden, von Blotting-Verfahren und der Elektrophorese.
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Diese
Reaktionsbedingungen sind nicht unbedingt optimiert und wurden,
wie für
einige Systeme angemerkt, verändert.
Die verwendeten Oligonukleotid-Sequenzen stellen Beispiele dar und
sind nicht als Beschränkung
zu verstehen, da auch andere Sequenzen für diese und weitere Zielsequenzen
verwendet wurden.
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BEISPIEL 1
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Um
zu zeigen, daß die
Amplifikation mit einem modifizierten Promotor-Primer eintrat, der
komplementär
zu einer Sequenz innerhalb eines RNA-Ziels war, wurde ein zu einer
Sequenz in M. tuberculosis rRNA (Seq ID Nr. 1; Primer-Teil ist Seq
ID Nr. 22) komplementärer
Promotor-Primer in entweder unmodifizierter Form oder mit 3'-Alkandiol (RP) oder
3-Cordycepin (CO) synthetisiert und mit einem Primer derselben Richtung
wie die Ziel-RNA (Seq ID Nr. 2) inkubiert und 3 zMol des Ziels unter
den oben beschriebenen Bedingungen inkubiert. Die Reaktionen wurden
mit einer Sonde derselben Richtung wie die Ziel-RNA (Seq. ID Nr.
3) mit Helfer-Oligonukleotiden analysiert, wie beschrieben bei Hogan
(US-Patentschrift 5030557, Means for Enhancing Nucleic Acid Hybridization,
Seq ID Nrn. 4 und 5).
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Die
Ergebnisse zeigen, daß eine
signifikante Amplifikation mit einem Promotor-Primer eintritt, der
eine 3'-Modifikation aufweist.
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BEISPIEL 2
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Um
zu zeigen, daß Gemische
von modifzierten und unmodifizierten Promotor-Primern in einem Amplifikations-Assay
funktionieren, wurden Reaktionen mit 15 pMol des Primers und eines
Promotor-Primers
(siehe unten) vorgenommen und untersucht, wie in Beispiel 1 beschrieben.
Es wurden drei zMol der Ziel-RNA verwendet.
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Die
Ergebnisse zeigen, daß ein
Gemisch von blockierten und unblockierten Oligonukleotiden ebenso gut
oder besser wie alle unblockierten Oligonukleotide, selbst bei einem
Verhältnis
von 1:150, unblockiert zu blockiert, funktionierte.
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BEISPIEL 3
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Bei
diesem Experiment wurden 3 zMol der Ziel-RNA mit verschiedenen Konzentrationen
von CO-blockiertem
und unblockiertem Primer und einem Gemisch von 15 pMol CO-blockiertem
Promotor-Primer und 0,1 pMol unblockiertem Promotor-Primer wie in
Beispiel 1 inkubiert. Die Produkte wurden mittels Hybridisierungs-Assay
nachgewiesen.
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Über die
beobachtete zufriedenstellende Amplifikation hinaus wurde überraschenderweise
festgestellt, daß die
Menge an nicht-Matrizen-gerichtetem Produkt in jenen Reaktionen
beträchtlich
geringer war, die mit blockierten Oligonukleotiden vorgenommen wurden,
als bei den mit unblockierten Oligonukleotiden vorgenommenen Reaktionen.
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BEISPIEL 4
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Bei
diesem Experiment wurde die Wirkung des Mischens einer einzelnen
Oligonukleotid-Sequenz mit zwei verschiedenen 3'-Modifikationen gezeigt. Drei zMol der
Ziel-RNA wurden amplifiziert wie in Beispiel 1. Der Promotor-Primer
wurde mit einem unblockierten 3'-Ende,
blockiert mit RP oder mit CO, synthetisiert. Zwei pMol des Primers
wurden verwendet.
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Dieses
Beispiel zeigte, daß ein
Gemisch von unmodifizierten und modifizierten oder ein Gemisch verschiedener
Arten von modifizierten Promotor-Primern gut amplifizierte, indem
es den Nachweis von 3 zMol RNA-Ziel in einer Stunde zuließ.
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BEISPIEL 5
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Bei
diesem Beispiel wurde ein Gemisch von modifizierten und unmodifizierten
Primern und Promotor-Primern zur Amplifikation von 3 zMol M. tuberculosis-rRNA
verwendet. Ein Gemisch von 2 pMol RP-modifiziertem Promotor-Primer
und 13 pMol CO-modifiziertem Promotor-Primer wurde mit unmodifiziertem
Primer oder einem Gemisch von unmodifiziertem Primer und mit einem
3'-Phosphorthioat-Nukleotid
(PS) synthetisiertem Primer verwendet. Die Sequenzen und Hybridisierungs-Sonden sind dieselben
wie in Beispiel 1.
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Unter
diesen Bedingungen zeigte das Gemisch von modifizierten und unmodifizierten
Primern die beste Wirkung. SEQUENZBESCHREIBUNG
