JP3860809B2 - 核酸配列増幅 - Google Patents
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Description
本明細書において特に断らない限り、以下の術語は以下の意味を有する。
A.核酸
「核酸」は、配列中に存在するかもしれず本発明の実施を妨害しないヌクレオチド類似体または他の分子に加えて、RNAまたはDNAのいずれかを意味する。
「鋳型」は、核酸ポリメラーゼによってコピーすることのできる核酸分子である。鋳型はRNAかまたはDNAのいずれであってもよく、ポリメラーゼに応じて一本鎖、二本鎖または部分的に二本鎖のいずれであってもよい。合成されたコピーは鋳型に相補的である。この発明において、コピーなる術語はまた、鋳型に等価なRNAまたはDNA配列(当該技術分野で一般に相同配列と呼ばれる)を有する核酸をも包含する。
「プライマー」は、鋳型に相補的なオリゴヌクレオチドであって、鋳型とハイブリダイズしてDNAポリメラーゼ(逆転写酵素など)による合成を開始させるためのプライマー/鋳型複合体を与え、その3’末端に連結した鋳型に相補的な共有結合した塩基の付加により伸長するものをいう。その結果、プライマー伸長生成物が得られる。DNA合成を開始するには、知られている実質的にすべてのDNAポリメラーゼ(逆転写酵素を含む)は、オリゴヌクレオチドが一本鎖の鋳型と複合体を形成すること(「プライミング」)を必要とする。適当な環境下では、プライマーはプロモーター−プライマーの一部である。そのようなプライマーは、一般に10〜100塩基の長さ、好ましくは20〜50塩基の長さである。
「プロモーター」または「プロモーター配列」は、核酸分子に結合して特定の部位でRNAの転写を開始するためのシグナルとして、DNA依存性RNAポリメラーゼ(「転写酵素」)によって認識される特定の核酸配列である。結合のためには、そのような転写酵素は、一般にプロモーターおよびその相補体が二本鎖であることを要求する;鋳型部分は二本鎖である必要はない。個々のDNA依存性RNAポリメラーゼは、種々の異なるプロモーター配列(その転写促進能は顕著に変わり得る)を認識する。RNAポリメラーゼがプロモーター配列に結合して転写を開始するとき、該プロモーター配列は転写される配列の部分ではない。それゆえ、かくして生成されたRNA転写物はプロモーター配列を含んでいないであろう。
プロモーター−プライマーは、プロモーターおよびプライマーからなる。プロモーター−プライマーは、標的核酸配列の3’末端に充分に相補的であるため該標的核酸配列の3’末端またはその近傍で複合体を形成できるオリゴヌクレオチドである。このことは、プロモーター−プライマーが標的配列の末端に充分に近くで複合体を形成するため、アッセイ、試験、クローニングまたは増幅された核酸の他の用途の要件を満たすに充分な標的配列の増幅を可能とすることを意味する。プロモーター−プライマーは鋳型として用いられて標的核酸配列の3’末端から伸長する相補的核酸配列を生成し、その結果、一般に二本鎖のプロモーターを形成し、該二本鎖を破砕する変性または酵素的活性を受けることになる。そのようなプロモーター−プライマーは、一般に長さが40〜100塩基、好ましくは40〜60塩基である。
DNA−またはRNA−依存性DNAポリメラーゼはまた、標的配列を鋳型として用いて該標的核酸分子に対する相補鎖を生成する。
プライマーまたはプロモーター−プライマーの3’末端は、該末端から進行する伸長反応の速度および/または範囲を回避または減少させるため、修飾またはブロックすることができる。修飾した成員および修飾していない成員をともに有するプライマーまたはプロモーター−プライマーは、本発明の目的のためには本質的に同じ核酸配列からなる。言い換えると、修飾したプライマーまたはプロモーター−プライマーは、修飾したオリゴヌクレオチドおよび修飾していないオリゴヌクレオチドともに標的核酸配列上の実際上同じ位置で(プラスまたはマイナス約10塩基)ハイブリダイズする点で、異なる複合体形成配列(プライマー)を含有してはいない。また、修飾したプロモーター−プライマーは、修飾していないプロモーター−プライマーと異なる認識配列(プロモーター)を含有してはいない。このことは、約10塩基内で、修飾したおよび修飾していないプライマーまたはプロモーター−プライマーは同じであり、同じRNAポリメラーゼによって認識され、多かれ少なかれ同じ標的配列とハイブリダイズする(必ずしも正確に同じ部位ではないが)ことを意味する。好ましい態様においては、修飾したおよび修飾していないプライマーまたはプロモーター−プライマーは、修飾の点を除けば同一である。
核酸合成の議論は、核酸二本鎖の2つの相補鎖の命名の術語を採用することにより非常に簡単になり明瞭になる。伝統的に、タンパク質や構造RNAを生成するのに用いられる配列をコードする鎖は「プラス」鎖とよばれ、その相補鎖は「マイナス」鎖とよばれる。現在、多くの場合において両方の鎖とも機能性であり、一方の鎖に「プラス」の表示を他方の鎖に「マイナス」の表示を当てはめることは恣意的なものであることがわかっている。にもかかわらず、両術語は核酸の配列の方向性を示すのに非常に有用であり、本明細書においてその目的のために用いるであろう。その場合、「プラス」鎖は第一のプライマーまたはプロモーター−プライマーと複合体を形成する最初の標的配列を示す。
「標的核酸配列」または「標的配列」は増幅すべき所望の核酸配列を有し、一本鎖または二本鎖のいずれであってもよく、増幅すべき配列の5’または3’側に他の配列(増幅しても増幅しなくてもよい)を含有していてもよい。
標的配列には、本発明を実行する際にプロモーター−プライマーがハイブリダイズする複合体形成配列を包含する。標的核酸配列がもともと一本鎖である場合は、該術語は(+)または(−)鎖のいずれかを意味し、該標的配列に相補的な配列をも意味するであろう。標的核酸配列がもともと二本鎖である場合は、該術語は(+)および(−)鎖の両方を意味するであろう。
「DNA依存性DNAポリメラーゼ」は、DNA鋳型から相補的DNAコピーを合成する酵素である。一つの例は、バクテリオファージT7 DNAポリメラーゼである。知られているすべてのDNA依存性DNAポリメラーゼは、合成を開始するには相補的なプライマー(RNAまたはDNAであってよい)またはコポリマーを必要とする。適当な条件下では、ある種のDNA依存性DNAポリメラーゼはRNA鋳型から相補的なDNAコピーを合成することが知られている。
「DNA依存性RNAポリメラーゼ」または「転写酵素」は、(通常、二本鎖の)プロモーター配列を有する二本鎖または部分的に二本鎖のDNA分子から複数のRNAコピーを合成する酵素である。本発明は、プロモーター−プライマー中の一本鎖プロモーター配列および該一本鎖プロモーター配列を認識するRNAポリメラーゼを包含することに注意すべきである。RNA分子(「転写物」)は、プロモーターのすぐ下流の位置から始まってRNA分子の5’→3’方向に合成される。転写酵素の例としては、バクテリオファージT7、T3およびSP6からのDNA依存性RNAポリメラーゼが挙げられる。
「RNA依存性DNAポリメラーゼ」または「逆転写酵素」は、RNA鋳型から相補的なDNAコピーを合成する酵素である。知られているすべての逆転写酵素はまた、DNA鋳型から相補的なDNAコピーを作製する能力をも有する;それゆえ、該ポリメラーゼはRNAおよびDNAの両方に依存性のDNAポリメラーゼである。RNA鋳型またはDNA鋳型のいずれかを用いて合成を開始するにはプライマーを必要とする。
「RNアーゼH」は、RNA:DNA二本鎖のRNA部分を分解する酵素である。RNアーゼHは、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼである。ニワトリの骨髄芽球症ウイルスおよびモロニーマウス白血病ウイルスの逆転写酵素は、そのポリメラーゼ活性に加えてRNアーゼH活性をも有する。幾つかのクローニングされた逆転写酵素は、RNアーゼH活性を欠いている。ポリメラーゼ活性を伴わなくとも利用できるRNアーゼH源もまた存在する。この分解の結果、RNA:DNA複合体からRNAが分離される。別の場合には、RNアーゼHは、RNAの部分が溶け出したり(melt off)または酵素がRNAの部分を巻き戻すのを可能にしたり、または生成したRNA断片がポリメラーゼによる伸長のためのプライマーとして機能するように、単にRNAを種々の位置で切断するだけである。
「ハイブリダイズ」および「複合体形成」なる語は、ワトソン−クリック塩基対形成により二本鎖(または「複合体」)を形成するに充分に相補的なヌクレオチド配列間での二本鎖の形成を意味する。プロモーター−プライマーまたはプライマーが標的(鋳型)と「ハイブリダイズ」すると、そのような複合体(またはハイブリッド)はDNAポリメラーゼによって必要とされるプライミング機能を果たすのに充分安定であり、DNA合成を開始する。
特異性は、配列およびアッセイ条件に応じて標的配列と非標的配列とを識別する核酸配列の能力を説明する特性である。
生成したRNAコピーまたは転写物は、さらに操作することなく自己触媒的に増幅する。
以下の実施例は、本発明の方法の有用性を示す。これら実施例は限定するものではなく、限定するものと考えるべきでない。
特に断らない限り、以下の実施例において使用する増幅のための反応条件は、100μl容量中に50mMトリス−HCl、35mM KCl、20mM MgCl2、15mM N−アセチルシステイン、4mM rATP、4mM rCTP、4mM rGTP、4mM rUTP、1mM dATP、1mM dCTP、1mM dGTP、1mM dTTP、10%グリセリン、10%ジメチルスルホキシド、300〜600単位のMMLV逆転写酵素、200〜400単位のT7RNAポリメラーゼ、各0.15μMのプライマーまたはプロモーター−プライマー、および所定量の鋳型および酵素、42℃で1時間であった。ジチオトレイトール、スペルミジンおよび/またはポリエチレンイミン(PEI)もまた反応混合物に有利に添加することができる。
これら反応条件は必ずしも最適化する必要はなく、幾つかの系において示したように変えることができる。他の配列をこれらおよび他の標的配列に用いたように、使用したオリゴヌクレオチド配列は例示であって限定することを意図するものではない。
RNA標的内の配列に相補的な修飾したプロモーター−プライマーで増幅が起こることを示すため、マイコバクテリウム・チューバーキュローシスrRNA内の配列に相補的なプロモーター−プライマー(配列番号:1)を修飾しないかまたは3’アルカンジオール(RP)もしくは3’コルジセピン(CO)を用いて合成し、該標的RNAと同じセンスのプライマー(配列番号:2)および3ゼプトモルの標的とともに上記条件下でインキュベートした。ホーガンにより記載されているヘルパーオリゴヌクレオチド(米国特許第5,030,557号、核酸ハイブリダイゼーションの促進手段、配列番号:4および配列番号:5)を用い、標的RNAと同じセンスのプローブ(配列番号:3)で反応液を分析した。その結果は、3’修飾を有するプロモーター−プライマーで有意の増幅が起こることを示している。
修飾せず 314,445
3’コルジセピン 71,382
修飾せず 683,737
3’−RP 70,014
この実験では、マイコバクテリウム・チューバーキュローシスの23S rRNAに相補的な配列を有するプロモーター−プライマーを3’モノチオリン酸ヌクレオチドの存在により修飾した。15ピコモルのプロモーター−プライマーおよびプライマー(配列番号:6および配列番号:7)を用いて0.3ゼプトモルの標的RNAを増幅し、ついでヘルパープローブ(配列番号:9および配列番号:10)を用いて標的RNAと同じセンスを有するプローブ(配列番号:8)で検出した。その結果は、3’モノチオリン酸修飾したプロモーター−プライマーは修飾していないオリゴヌクレオチドと同様に機能することを示している。
修飾せず 2,614,079 899
3’モノチオリン酸 2,570,798 647
修飾したプロモーター−プライマーおよび修飾していないプロモーター−プライマーの混合物が増幅アッセイにおいて機能することを示すため、15ピコモルのプライマーおよびプロモーター−プライマー(以下参照)を用いて反応を行い、実施例1に記載するようにしてアッセイした。3ゼプトモルの標的RNAを用いた。
修飾せず CO−修飾 RLU
実験1 +標的 15 0 834,902
+標的 3 12 971,938
−標的 3 12 1,456
実験2 +標的 3 12 1,015,199
+標的 0.1 15 961,041
これら結果は、ブロックしたオリゴヌクレオチドに対するブロックしていないオリゴヌクレオチドの比が1:150であっても、ブロックしたオリゴヌクレオチドとブロックしていないオリゴヌクレオチドとの混合物はすべてブロックしていないオリゴヌクレオチドと同等かまたは一層良好に機能したことを示している。
この実験では、3ゼプトモルの標的RNAを、種々の濃度のCOブロックしたプライマーおよびブロックしていないプライマー、および実施例1におけるように15ピコモルのCOブロックしたプロモーター−プライマーと0.1ピコモルのブロックしていないプロモーター−プライマーとの混合物とともにインキュベートした。生成物をハイブリダイゼーションアッセイにより検出した。
ブロックしたもの ブロックしていないもの
0 15 969,522
10 5 802,840
13 2 648,271
満足のいく増幅結果が観察されたのに加えて、驚くべきことに、ブロックしたオリゴヌクレオチドを用いて行った反応においてはブロックしていないオリゴヌクレオチドを用いて行った反応に比べて、鋳型に向けられない生成物の量が有意に減少することがわかった。
この実験では、単一のオリゴヌクレオチド配列を2つの異なる3’修飾物と混合することの効果を示した。3ゼプトモルの標的RNAを実施例1と同様にして増幅した。プロモーター−プライマーを3’末端をブロックせずに、RPでブロックして、またはCOでブロックして合成した。2ピコモルのプライマーを用いた。
RPで修飾 COで修飾 修飾せず
0 15 0.1 450,157
2 13 0.01 681,647
2 13 0 678,871
5 10 0 755,839
この実験は、修飾していないプロモーター−プライマーと修飾したプロモーター−プライマーとの混合物または異なるタイプの修飾したプロモーター−プライマーの混合物で良好に増幅できることを示しており、1時間で3ゼプトモルのRNA標的を検出することができる。
この実施例では、修飾したおよび修飾していないプライマーおよびプロモーター−プライマーの混合物を用いて3ゼプトモルのマイコバクテリウム・チューバーキュローシスのrRNAを増幅した。2ピコモルのRP修飾したプロモーター−プライマーと13ピコモルのCO修飾したプロモーター−プライマーとの混合物を、修飾していないプライマーまたは修飾していないプライマーと3’モノチオリン酸ヌクレオチド(PS)で合成したプライマーとの混合物とともにインキュベートした。配列およびハイブリダイゼーションプローブは実施例1と同じである。
修飾せず PS修飾
− 15ピコモル 118,411
1ピコモル 14ピコモル 364,733
標的なし 1,266
これら条件下、修飾したプライマーと修飾していないプライマーとの混合物は最良に機能する。
この実施例においては、80ゼプトモルのネイセリア・ゴノロエアエ(Neisseria gonorrhoeae)のrRNAを、該rRNAに相補的なプライマー(配列番号:13)および28ピコモルの該RNA標的と同じセンスの3’−RPブロックしたプロモータープライマーと2ピコモルの該RNA標的と同じセンスのブロックしていないプロモータープライマー(配列番号:14)との混合物を用いて増幅した。幾つかの反応においては、ネイセリア・ゴノロエアエのrRNAにハイブリダイズすることができRNアーゼH基質を生成することのできる3’ブロックしたオリゴヌクレオチド(配列番号:15)を増幅に加えた。反応液のアリコートを、AE標識したプローブおよび該rRNA配列に相補的な2つのヘルパープローブ(それぞれ、配列番号:16、配列番号:17および配列番号:18)にハイブリダイズさせた。
7,910 32,473
16,337 728,246
17,304 80,487
12,518 51,893
この実施例では、3または30ゼプトモルのマイコバクテリウム・チューバーキュローシスのrRNAを、プライマー(配列番号:7)、およびT3RNAポリメラーゼのプロモーターを含有する14ピコモルの3’−RPブロックしたプロモータープライマーと1ピコモルのブロックしていないプロモータープライマー(配列番号:19)との混合物で増幅した。450単位のMMLVRTを用い、200単位のT3RNAポリメラーゼをT7RNAポリメラーゼと置換し、反応を40分後に停止させた他は実施例1と同様にして反応を行った。
30ゼプトモル 358,053
3ゼプトモル 75,440
0ゼプトモル 553
これら結果は、逆転写酵素およびT3RNAポリメラーゼを用い、ブロックしたプロモータープライマーとブロックしていないプロモータープライマーとの混合物を用いてRNAを増幅することができることを示している。
この実施例においては、RP修飾したプロモータープライマーを用いたDNA標的の増幅を調べた。クローニングしたHIV−1DNA(3ゼプトモル)を、30ピコモルの配列:
5'-ATAATCCACCTATCCCAGTAGGAGAAAT-3'(配列番号:20)を有するプライマーおよび配列:
5'-AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACACCTTGTCTTATGTCCAGAATGCT-3'(配列番号:21)を有するプロモータープライマーとともに95℃にて5分間インキュベートし、ついで室温に冷却した。酵素を添加した後、反応液を37℃で2時間インキュベートした。反応条件は、50mMトリス−HCl、40mM酢酸カリウム(pH8)、18mM MgCl2、5mM DTT、2mMスペルミジン、6.2mM GTP、6.2mM ATP、2mM CTP、2mM UTP、0.2mM dTTP、0.2mM dATP、0.2mM dGTP、0.2mM dCTP、800U MMLV RT、400U T7RNAポリメラーゼであった。プロモータープライマーは、修飾しないかまたはRPで3’末端を修飾した。プライマーと同じセンスのAE標識プローブを用いて反応液をアッセイした。示した結果は、5回行ったものの平均である。
修飾せず 修飾 平均RLU
30 0 127,223
26 4 411,692
0 30 743,877
DNA標的、とりわけ定められた3’末端を有しないDNA標的の増幅が、修飾したプロモータープライマーの使用によって阻害されないことは予期しないことであり、驚くべきことであった。
この発明の本態様はすべての観点において例示的なものと考えられるべきであって限定するものではなく、本発明の範囲は上記記載によるよりもむしろ添付の請求の範囲によって示され、該請求の範囲の意味および等価物の範囲内におけるすべての変更は本発明の範囲に包含される。
Claims (15)
- 配列:
xGCCGTCACCCCACCAACAAGCT(式中、xは何もないかまたはRNAポリメラーゼによって認識されるプロモーター配列である)(xが何もないときに配列番号:22)からなる第一のオリゴヌクレオチド、および配列:
xGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACC(式中、xは前記と同じ)(xが何もないときに配列番号:2)からなる第二のオリゴヌクレオチドを含む、試料中のマイコバクテリウム・チューバーキュローシス複合体核酸を増幅するためのキット。 - 該第一のオリゴヌクレオチドが配列:
GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAGCCGTCACCCCACCAACAAGCT(配列番号:1)のプロモーター−プライマーからなり、該第二のオリゴヌクレオチドが配列:
GGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACC(配列番号:2)からなる、請求項1に記載のキット。 - 該配列の1または2以上が、ポリメラーゼによる伸長を低減またはブロックする修飾した3’末端を有する請求項1または2に記載のキット。
- 該プロモーター−プライマーが、修飾した成員と修飾していない成員との混合物または異なって修飾した成員の混合物を含み、各修飾した成員がその3’末端またはその近傍にポリメラーゼによる伸長を低減またはブロックする修飾を有する、請求項1ないし3のいずれかに記載のキット。
- さらにハイブリダイゼーションアッセイプローブを含み、該プローブが配列:
GTCTTGTGGTGGAAAGCGCTTTAG(配列番号:3)からなる、請求項1ないし4のいずれかに記載のキット。 - 配列:
CCGGATAGGACCACGGGATGCAT(配列番号:4)および配列:
CGGTGTGGGATGACCCCGCG(配列番号:5)よりなる群から選ばれた配列からなるヘルパーオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項1ないし5のいずれかに記載のキット。 - 試料中のマイコバクテリウム核酸の増幅方法であって、該核酸を配列:
xGCCGTCACCCCACCAACAAGCT(式中、xは何もないかまたはRNAポリメラーゼによって認識されるプロモーター配列である)(xが何もないときに配列番号:22)からなる第一のオリゴヌクレオチド、および配列:
xGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACC(式中、xは前記と同じ)(xが何もないときに配列番号:2)からなる第二のオリゴヌクレオチドで増幅することを含む方法。 - 該第一のオリゴヌクレオチドが配列:
GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAGCCGTCACCCCACCAACAAGCT(配列番号:1)のプロモーター−プライマーからなり、該第二のオリゴヌクレオチドが配列:
GGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACC(配列番号:2)からなる、請求項7に記載の方法。 - 該配列の1または2以上が、ポリメラーゼによる伸長を低減またはブロックする修飾した3’末端を有する請求項7または8に記載の方法。
- 該プロモーター−プライマーが、修飾した成員と修飾していない成員との混合物または異なって修飾した成員の混合物を含み、各修飾した成員がその3’末端またはその近傍にポリメラーゼによる伸長を低減またはブロックする修飾を有する、請求項7ないし9のいずれかに記載の方法。
- 試料中のマイコバクテリウム・チューバーキュローシス核酸を検出する方法であって、
(i)該核酸を配列:
xGCCGTCACCCCACCAACAAGCT(式中、xは何もないかまたはRNAポリメラーゼによって認識されるプロモーター配列である)(xが何もないときに配列番号:22)からなる第一のオリゴヌクレオチドおよび配列:
xGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACC(式中、xは前記と同じ)(xが何もないときに配列番号:2)からなる第二のオリゴヌクレオチドで増幅させ、ついで
(ii)増幅した核酸を配列:
GTCTTGTGGTGGAAAGCGCTTTAG(配列番号:3)からなるハイブリダイゼーションプローブで検出することを含む方法。 - 該第一のオリゴヌクレオチドが配列:
GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAGCCGTCACCCCACCAACAAGCT(配列番号:1)のプロモーター−プライマーからなり、該第二のオリゴヌクレオチドが配列:
GGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACC(配列番号:2)からなる、請求項11に記載の方法。 - 該配列の1または2以上が、ポリメラーゼによる伸長を低減またはブロックする修飾した3’末端を有する請求項11または12に記載の方法。
- 該プロモーター−プライマーが、修飾した成員と修飾していない成員との混合物または異なって修飾した成員の混合物を含み、各修飾した成員がその3’末端またはその近傍にポリメラーゼによる伸長を低減またはブロックする修飾を有する、請求項11ないし13のいずれかに記載の方法。
- さらにヘルパーオリゴヌクレオチドを使用することを含み、該ヘルパーオリゴヌクレオチドが、配列:
CCGGATAGGACCACGGGATGCAT(配列番号:4)および
CGGTGTGGGATGACCCCGCG(配列番号:5)よりなる群から選ばれた配列からなる、請求項11ないし14のいずれかに記載の方法。
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