DE69329636T2 - Verfahren zur Vervielfältigung von Nukleinsäuresequenzen - Google Patents
Verfahren zur Vervielfältigung von NukleinsäuresequenzenInfo
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Description
- Diese Erfindung betrifft Verfahren zur Erhöhung der Zahl von Kopien einer spezifischen Nukleinsäuresequenz oder "Zielsequenz", die entweder einzeln oder als große oder kleine Komponente eines homogenen oder heterogenen Gemischs von Nukleinsäuren vorliegen kann. Das Gemisch von Nukleinsäuren kann das in einer Probe vorliegende sein, die für diagnostische Tests; ökologische Tests, für Forschungsstudien, für die Herstellung von Reagentien oder Materialien, für andere Verfahren wie das Klonen oder für weitere Zwecke entnommen wurde.
- Die selektive Amplifikation spezifischer Nukleinsäuresequenzen ist zur Erhöhung der Empfindlichkeit diagnostischer und ökologischer Assays unter Beibehaltung der Spezifität, zur Erhöhung der Empfindlichkeit, Bequemlichkeit, Genauigkeit und Zuverlässigkeit einer Vielfalt von Forschungstechniken und zur Bereitstellung eines reichlichen Vorrats an spezifischen Oligonukleotiden für verschiedene Zwecke von Nutzen.
- Die vorliegende Erfindung eignet sich aufgrund der Bequemlichkeit ihrer Ausführung besonders zur Anwendung bei ökologischen und diagnostischen Tests.
- Der Nachweis und/oder die Quantifizierung spezifischer Nukleinsäuresequenzen stellt eine zunehmend wichtige Methode zur Identifizierung und Klassifizierung von Mikroorganismen, zur Diagnose von Infektionskrankheiten, für den Nachweis und die Charakterisierung genetischer Anomalien, zur Identifizierung mit Krebs assoziierter genetischer Veränderungen, zur Untersuchung genetischer Krankheitsanfälligkeiten und zur Messung der Reaktion auf verschiedene Behandlungsarten dar. Derartige Verfahrensweisen finden auch erweiterten Einsatz beim Nachweisen und Quantifizieren von Mikroorganismen in Nahrungsmitteln, Umweltproben, Saatgut und weiteren Materialarten, bei denen das Vorhandensein spezifischer Mikroorganismen eine Überwachung erfordern kann. Weitere Anwendungen finden sich in der Gerichtsmedizin, der Anthropologie, der Archäologie und der Biologie, bei denen die Messung der verwandtschaftlichen Beziehungen von Nukleinsäuresequenzen zur Identifizierung von Tatverdächtigen, zur Abklärung von Vaterschaftsprozessen, zur Aufstellung genealogischer und phylogenetischer Stammbäume und als Klassifikations-Hilfsmittel für eine Vielfalt von Lebensformen eingesetzt wird.
- Eine verbreitete Methode zum Nachweisen und Quantifizieren spezifischer Nukleinsäuresequenzen ist die Nukleinsäure-Hybridisierung. Diese Methode basiert auf der Fähigkeit zweier Nukleinsäure-Stränge, die komplementäre oder im wesentlichen komplementäre Sequenzen enthalten, unter geeigneten Bedingungen spezifisch aneinander zu binden und dabei eine doppelsträngige Struktur auszubilden. Zum Nachweisen und/oder Quantifizieren einer spezifischen Nukleinsäuresequenz (bekannt als "Zielsequenz") wird ein markiertes Oligonukleotid (bekannt als "Sonde") hergestellt, die zur Zielsequenz komplementäre Sequenzen enthält. Die Sonde wird mit einer Probe gemischt, in der die Zielsequenz vermutet wird, und es werden für die Hybridbildung geeignete Bedingungen geschaffen. Die Sonde hybridisiert an die Zielsequenz, sofern sie in der Probe vorhanden ist. Die Sonden-Ziel-Hybride werden dann von der einzelsträngigen Sonde auf eine von vielfältigen Weisen getrennt. Die Menge an an die Hybride gebundenem Marker wird dann als Mengenangabe der Zielsequenz in der Probe gemessen.
- Die Empfindlichkeit des Nukleinsäure-Hybridisierungs-Assays ist in erster Linie durch die spezifische Aktivität der Sonde, die Rate und den Umfang der Hybridisierungsreaktion, die Durchführung des Verfahrens zur Trennung hybridisierter und unhybridisierter Sonde und die Empfindlichkeit, mit welcher der Marker nachgewiesen werden kann, begrenzt. Die empfindlichsten Verfahren können viele der Merkmale vermissen lassen, die für routinemäßige klinische und ökologische Tests erforderlich sind, wie Schnelligkeit, Bequemlichkeit und Wirtschaftlichkeit. Darüber hinaus können ihre Empfindlichkeitsgrade für viele gewünschte Anwendungen nicht ausreichend sein.
- Als Folge der Wechselwirkungen zwischen den verschiedenen Komponenten und Komponent-Schritten dieser Art von Assay liegt nahezu immer eine Umkehrbeziehung zwischen Empfindlichkeit und Spezifität vor. Daher können Schritte, die der Erhöhung der Empfindlichkeit des Assays dienen sollen (zum Beispiel eine Steigerung der spezifischen Wirksamkeit der Sonde) zu einem höheren Prozentsatz falsch-positiver Testergebnisse führen. Die Verknüpfung von Empfindlichkeit und Spezifität stellt eine beträchtliche Hürde hinsichtlich einer verbesserten Empfindlichkeit der Hybridisierungs-Assays dar. Eine Lösung für dieses Problem bestünde in einer spezifischen Erhöhung der Menge an vorhandener Zielsequenz unter Verwendung eines Amplifikationsverfahrens. Würde man einen einzelnen Abschnitt der Zielsequenz unter Aussparung wesentlicher Teile der in den restlichen Sequenzen der Probe codierten Information amplifizieren, so könnte dies zu einer Erhöhung der Empfindlichkeit führen, ohne daß zugleich die Spezifität beeinträchtigt würde.
- Ein Verfahren zur spezifischen Amplifikation von Nukleinsäuresequenzen mit der Bezeichnung "polymerase chain reaction" oder "PCR" wurde beschrieben von Mullis et al. (Siehe US-Patentschriften 4.683.195, 4.683.202 und 4.800.159 und Europäische Patentanmeldungen 86302298.4, 863022299.2 und 87300203.4 und Methods in Enzymology, Band 155, 1987, S. 335-350.) Das Verfahren verwendet sich wiederholende Zyklen einer Primer-abhängigen Nukleinsäure-Synthese, die gleichzeitig ablaufen und wobei jeder Strang einer komplementären Sequenz als eine Matrize genützt wird. Die zu amplifizierende Sequenz ist definiert durch die Positionen der Primer-Moleküle, die die Synthese initiieren. Die Primer sind zum 3'-Endabschnitt der Zielsequenz oder ihres Komplements komplementär und müssen mit jenen Stellen komplexieren, damit die Nukleinsäure-Synthese einsetzen kann. Nach Synthese des Verlängerungsprodukts werden die Stränge im allgemeinen durch Wärmedenaturierung vor dem nächsten Syntheseschritt getrennt. Beim PCR-Verfahren werden Kopien beider Stränge einer komplementären Sequenz synthetisiert.
- Der Schritt der Strangtrennung, wie bei der PCR zur Auftrennung der neu synthetisierten Stränge am Ende jedes Zyklus der PCR-Reaktion angewandt, erfolgt oftmals als Denaturierung durch Wärme. Das erfordert entweder ein thermostabiles Enzym oder die Zugabe von neuem Enzym zwischen den Schritten der Wärmedenaturierung und der Einleitung des nächsten Zyklus der DNA-Synthese. Die Erfordernis einer wiederholten Kreisführung der Reaktionstemperatur zwischen mehreren unterschiedlichen und extremen Temperaturen ist ein Nachteil des PCR- Verfahrens. Um die PCR bequem durchführbar zu machen, sind programmierbare Wärmekreisprozeß-Instrumente erforderlich.
- Das PCR-Verfahren wurde an die RNA-Transkription gekoppelt, indem eine Promotor-Sequenz in einen der bei der PCR-Reaktion verwendeten Primer eingebaut und dann nach mehrzyklischer Amplifikation mittels des PCR-Verfahrens die doppelsträngige DNA als Matrize für die Transkription der einzeisträngigen RNA verwendet wurde. (Siehe z. B. Murakawa et al., DNA 7 : 287-295 (1988).)
- Weitere Verfahren zur Amplifikation einer spezifischen Nukleinsäuresequenz umfassen eine Reihe von Schritten der Primer-Hybridisierung, Verlängerung und Denaturation zur Bereitstellung eines intermediären doppeisträngigen DNA-Moleküls, das eine Promotorsequenz durch die Verwendung eines Promotorsequenzenthaltenden Primers aufweist. Die doppelsträngige DNA wird zur Erzeugung multipler RNA-Kopien der Zielsequenz verwendet. Die resultierenden RNA-Kopien können als Zielsequenzen zum Erhalt weiterer Kopien, und diese wiederum in multiplen Zyklen, verwendet werden. (Gelegentlich als "Transkriptions-Amplifikations- System" oder TAS bezeichnet; siehe z. B. Burg, et al., WO 89/1050; Gingeras, et al., WO 88/10315; Europäische Patentanmeldung Nr. 89313154.0, wie veröffentlicht unter Nr. 0373960 (Gingeras et al.); Europäische Patentanmeldung Nr. 88113948.9, wie veröffentlicht unter Nr. 0329822 (Davey und Malek); Malek et al. WO91/02818 und Europäische Patentanmeldung Nr. 90307503.4, wie veröffentlicht unter Nr. 0408295 (Kaciarl und Fultz), wie auch unten erörtert.)
- Bei Walker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89 : 392-396 (Jan. 1992) wird ein mit Oligonukleotiden arbeitendes Amplifikations-Verfahren zur Verwendung mit einer DNA-Matrize unter Gebrauch einer Restriktionsendonuklease zum Erhalt der Ausgangs-Zielsequenz und eines Enzyms zum Strangbrechen beim DNA/DNA- Komplex, um eine Verlängerungsreaktion und dadurch die Amplifikation zu ermöglichen. In der Europäischen Patentanmeldung Nr. 88306717.5, wie unter Nr. 0300796 veröffentlicht (Becker et al), ist ein Amplifikation-Verfahren beschrieben, bei dem ein Primer an die Zielsequenz hybridisiert ist und der resultierende Duplex vor der Verlängerungsreaktion und Amplifikation aufgespalten wird; in einem Fall, bei dem sich der Primer über die Hybridisierungsregion hinaus erstreckt, erfordert dies vor der Verlängerung eine Abspaltung und eine Blockierung des Primers an seinem 3'-Ende, um das Auftreten unerwünschter Verlängerungsreaktionen vor der Amplifikation zu verhindern.
- Urdea, WO 91/10746, beschreibt eine Signal-Amplifikationsmethode, die eine T7-Promotorsequenz einbezieht. In WO 92/22663, die Teil des Stands der Technik unter Artikel 54(3) EPC darstellt, ist eine Nukleinsäure-Amplifikationsmethode unter Verwendung eines Primers beschrieben, der eine Promotorsequenz trägt und außerdem ein blockiertes 3'-Ende zur Verhinderung einer Polymerase-Verlängerung aufweist. In EP-A-0408295 sind außerdem Methoden zur Nukleinsäure-Amplifikation unter Verwendung eines Promotor-Primers beschrieben. Genauer gesagt lehrt sie interalia Methoden zur Nukleinsäure-Amplifikation unter Verwendung zweier Primer (einer zur Hybridisierung an das 3'-Ende der Zielsequenz und der andere zur Hybridisierung an das 3'-Ende des Komplements der Zielsequenz fähig), wobei einer der Primer ein Promotor-Primer mit einem blockierten 3'-Ende ist. In EP-A-0587266, die ebenso wie WO 92/22663 lediglich Teil des Stands der Technik unter Artikel 54(3) EPC darstellt, ist die Verwendung eines Gemischs von Promotor-Primern, das zur Hybridisierung an effektiv dieselbe Position auf einem Zielnukleinsäure-Strang fähig ist, wobei mindestens ein derartiger Promotor-Primer eine Modifikation am oder nahe dem 3'-Ende zur Verhinderung der Polymerase-Verlängerung aufweist, zum Zwecke der Herstellung multipler RNA-Transkripte der Zielnukleinsäure-Sequenz beschrieben.
- Zu weiteren Verfahren der Amplifikation von Nukleinsäure zählt die Ligase Chain Reaction (LCR), wie beschrieben in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 320.308, bei der mindestens vier separate Oligosonden verwendet werden; zwei der Oligosonden hybridisieren an entgegengesetzte Enden desselben Zielstranges in geeigneter Orientierung, so daß die dritten und vierten Oligosonden mit den ersten und zweiten Oligosonden hybridisieren, wobei sie im Zuge der Ligation miteinander verbundene Sonden bilden, die denaturiert und nachgewiesen werden können. Bei einer weiteren Methode handelt es sich um die in EP-A-0 427 073, veröffentlicht am 15. Mai 1991, beschriebene Methode, bei der eine palindrome Sonde, die zur Bildung einer Haarnadel fähig ist und eine funktionelle Promotor-Region in der Haarnadel aufweist, an eine Zielsequenz hybridisiert wird, dann an ein anderes Oligonukleotid ligiert wird, das an die Zielsequenz hybridisiert ist, so daß spezifische RNA-Transkripte erhalten werden können.
- Es können relativ große Mengen bestimmter RNAs unter Verwendung eines rekombinanten einzelsträngigen RNA-Moleküls mit einer Erkennungssequenz für die Bindung einer RNA-gerichteten Polymerase, bevorzugt einer Qß-Replikase, hergestellt werden. (Siehe z. B. US-Patentschrift Nr. 4.786.600 an Kramer et al.) Eine Anzahl von Schritten ist erforderlich, um die spezifische Sequenz in eine DNA-Kopie des Varianten-Moleküls einzuführen, sie in einen Expressionsvektor zu klonieren, sie in RNA zu transkribieren und sie dann mit Qß-Replikase zu replizieren.
- Wie hierin verwendet, weisen die folgenden Begriffe die folgenden Bedeutungen auf, wenn nicht ausdrücklich anders angegeben.
- Mit "Nukleinsäure" ist entweder RNA oder DNA, neben jeglichen Nukleotid-Analoga oder anderen Molekülen, gemeint, die in der Sequenz vorhanden sein können und die die Ausführung der vorliegenden Erfindung nicht behindern.
- Eine "Matrize" ist ein Nukleinsäure-Molekül, das durch eine Nukleinsäure- Polymerase kopierbar ist. Eine Matrize kann entweder in RNA oder in DNA bestehen und kann in Abhängigkeit von der Polymerase entweder einzelsträngig oder doppelsträngig oder teilweise doppelsträngig vorliegen. Die synthetisierte Kopie ist zur Matrize komplementär. Bei dieser Erfindung umfaßt der Begriff Kopien auch Nukleinsäure mit der einer Matrize äquivalenten RNA- oder DNA-Sequenz, die im Fachbereich herkömmlicherweise als homologe Sequenzen bezeichnet werden.
- Bei einem "Primer" handelt es sich um ein Oligonukleotid, das komplementär zu einer Matrize ist und mit der Matrize zum Erhalt eines Primer/Matrize-Komplexes hybridisiert, um die Synthese mittels einer DNA-Polymerase, zum Beispiel einer reversen Transkriptase, einzuleiten, und der durch die Zugabe kovalent gebundener und an sein 3'-Ende geknüpfter Basen, die komplementär zur Matrize sind, verlängert wird. Das Ergebnis ist ein Primer-Verlängerungsprodukt. Nahezu alle bekannten DNA-Polymerasen (einschließlich reverser Transkriptasen) erfordern die Komplexbildung eines Oligonukleotids mit einer einzelsträngigen Matrize ("Priming") zur Initiation der DNA-Synthese. Unter geeigneten Umständen kann ein Primer ein Teil eines Promotor-Primers sein. Solche Primer sind allgemein 10 bis 100 Basen, bevorzugt 20 bis 50 Basen, lang.
- Bei einem "Promotor" oder einer "Promotor-Sequenz" handelt es sich um eine spezifische Nukleinsäuresequenz, die durch eine DNA-abhängige RNA-Polymerase ("Transkriptase") als ein Signal zur Bindung an ein Nukleinsäure-Molekül und zur Initiation der Transkription von RNA an einer spezifischen Stelle erkannt wird. Zur Bindung erfordern solche Transkriptasen allgemein, daß der Promotor und sein Komplement doppelsträngig sind; der Matrizen-Abschnitt braucht nicht doppelsträngig zu sein. Einzelne DNA-abhängige RNA-Polymerasen erkennen eine Vielzahl verschiedener Promotor-Sequenzen, die in ihrer Effizienz hinsichtlich einer Förderung der Transkription deutlich variieren können. Bindet eine RNA-Polymerase an eine Promotor-Sequenz zur Initiation der Transkription, so ist diese Promotor- Sequenz nicht Teil der transkribierten Sequenz. Daher enthalten die so hergestellten RNA-Transkripte die Promotor-Sequenz nicht.
- Ein Promotor-Primer umfaßt einen Promotor und einen Primer. Nur mit einem Oligonukleotid, das hinreichend komplementär zum 3'-Ende einer Zielnukleinsäure- Sequenz ist, um am oder nahe dem 3'-Ende jener Zielnukleinsäure-Sequenz zu komplexieren, was bedeutet, daß der Promotor-Primer dicht genug am Ende der Zielsequenz komplexiert, um eine Amplifikation einer ausreichenden Menge an Zielsequenz zu ermöglichen, werden die Anforderungen für den Assay, die Tests, die Klonierung und weiterer Anwendungen der amplifizierten Nukleinsäure erfüllt. Der Promotor-Primer wird als eine Matize zum Erhalt einer komplementären Nukleinsäuresequenz verwendet, die vom 3'-Ende (auch bekannt als der 3'- Terminus) einer Zielnukleinsäure-Sequenz ausgeht, um einen generell doppelsträngigen Promotor zu ergeben, der einer beliebigen denaturierenden oder enzymatischen Aktivität unterzogen werden kann, durch die der Doppelstrang zerstört werden kann. Solche Promotor-Primer sind allgemein 40 bis 100 Basen, bevorzugt 40 bis 60 Basen, lang.
- Mit einer DNA- oder RNA-abhängigen DNA-Polymerase wird auch ein komplementärer Strang zum Zielnukleinsäure-Molekül erhalten, wobei die Zielsequenz als eine Matrize Verwendung findet.
- Das 3'-Ende des Primers oder Promotor-Primer kann modifiziert oder blockiert werden, um die Rate und/oder den Umfang einer davon ausgehenden Verlängerungsreaktion zu verhindern oder zu vermindern. Ein Primer oder Promotor- Primer mit sowohl modifizierten als auch unmodifizierten Bestandteilen besteht für die Zwecke der vorliegenden Erfindung aus im wesentlichen derselben Nukleinsäuresequenz. Anders gesagt enthält der modifizierte Primer oder Promotor- Primer keine unterschiedliche Komplexier-Sequenz (Primer) insofern, als sowohl das modifizierte als auch das unmodifizierte Oligonukleotid in effektiv derselben Position (plus oder minus etwa 10 Basen) an die Zielnukleinsäure-Sequenz hybridisiert. Auch enthält der modifizierte Promotor-Primer keine vom unmodifizierten Promotor-Primer verschiedene Erkennungssequenz (Promotor). Dies bedeutet, daß innerhalb von etwa 10 Basen die modifizierten und unmodifizierten Primer oder Promotor-Primer gleich sind, durch dieselbe RNA-Polymerase erkannt werden und an mehr oder weniger dieselbe Zielsequenz hybridisieren (obschon nicht notwenigerweise an exakt dieselbe Position). Bei einer bevorzugten Ausführungsform sind modifizierte und unmodifizierte Primer oder Promotor-Primer mit Ausnahme der Modifikation identisch.
- Das 3'-Ende des zum Ziel komplementären Abschnitts eines Primers oder Promotor- Primers kann in vielfältiger Weise modifiziert werden, wie den Fachleuten des Bereichs wohlbekannt. Geeignete Modifikationen eines Promotor-Primers können in der Addition von Ribonukleotiden, 3'-Desoxynukleotid-Resten (z. B. Cordycepin (CO, Glen Research)), 3',2'-Didesoxynukleotid-Reste, modifizierten Nukleotiden mit nicht- Phosphodiester-Rückgrat-Verknüpfungen (z. B. Phosphorthioaten) und nicht- Nukleotid-Verknüpfungen, wie z. B. beschrieben bei Arnold, et al., WO 89/02439 (RS), oder Alkandiol-Modifikationen (Wilk et al. Nuc. Acids Res. 18 : 2065, 1990) (RP) bestehen, oder die Modifikation kann einfach in einem oder mehreren 3'-Nukleotid- Resten zur Hybridisierungs-Sequenz bestehen, die nicht komplementär zur Zielnukleinsäure sind. Natürlich sind auch andere wirksame Modifikationen möglich.
- Bei einer Amplifikationsreaktion kann ein Gemisch aus modifizierten und unmodifizierten Oligonukleotiden in einem breiten Verhältnisbereich von modifizierten zu unmodifizierten Oligonukleotiden (z. B. 1 : 1 bis 1.000 : 1) Verwendung finden. Auch kann ein Gemisch aus Oligonukleotiden mit verschiedenen 3'-Modifikationen verwendet werden.
- Erörterungen der Nukleinsäure-Synthese lassen sich, indem Begriffe zur Benennung der beiden komplementären Stränge eines Nukleinsäure-Duplex übernommen werden, stark vereinfachen und verdeutlichen. Traditionell wurde der Strang, der für die zur Erzeugung von Proteinen oder strukturellen RNAs verwendeten Sequenzen codiert, als der "Plus"-Strang und sein Komplement als der "Minus"-Strang bezeichnet. Heute ist bekannt, daß in vielen Fällen beide Stränge funktionell sind und demnach die Zuordnung der Bezeichnung "plus" für einen und "minus" für den anderen willkührlich ist. Nichtsdestotrotz sind die Begriffe sehr nützlich zur Bezeichnung der Sequenz-Orientierung der Nukleinsäuren und werden zu diesem Zweck hierin verwendet, wobei der "Plus"-Strang den ursprünglichen Zielsequenz- Strang bezeichnet, der mit dem ersten Primer oder Promotor-Primer komplexiert wird.
- Eine "Zielnukleinsäure-Sequenz" oder "Zielsequenz" weist eine gewünschte, zu amplifizierende Nukleinsäuresequenz auf und kann entweder einzelsträngig oder doppelsträngig sein und kann weitere Sequenzen in 5'- oder 3'-Position der zu amplifizierenden Sequenzen umfassen, die amplifiziert werden können oder auch nicht.
- Die Zielnukleinsäure-Sequenz enthält die komplexbildenden Sequenzen, an die der Promotor-Primer während der Ausführung der vorliegenden Erfindung hybridisiert. Dort, wo die Zielnukleinsäure-Sequenz ursprünglich einzelsträngig ist, bezieht sich der Begriff sowohl auf den (+)- als auch den (-)-Strang, ebenso wie auf die zur Zielsequenz komplementäre Sequenz. Dort, wo die Zielnukleinsäure-Sequenz ursprünglich doppelsträngig ist, bezieht sich der Begriff sowohl auf die (+)- als auch die (-)-Stränge.
- Bei einer "DNA-abhängigen DNA-Polymerase" handelt es sich um ein Enzym, welches eine komplementäre DNA-Kopie von einer DNA-Matrize synthetisiert. Ein Beispiel hierfür ist die Bakteriophagen-T7-DNA-Polymerase. Alle bekannten DNAabhängigen DNA-Polymerasen erfordern einen komplementären Primer, der RNA oder DNA sein kann, oder ein Copolymer, um die Synthese zu initiieren. Es ist bekannt, daß unter geeigneten Bedingungen bestimmte DNA-abhängige DNA- Polymerasen zur Synthetisierung einer komplementären DNA-Kopie von einer RNA- Matrize in der Lage sind.
- Bei einer "DNA-abhängigen RNA-Polymerase" oder "Transkriptase" handelt es sich um ein Enzym, das multiple RNA-Kopien aus einem doppelsträngigen oder teilweise doppelsträngigen DNA-Molekül mit einer (gewöhnlich doppelsträngigen) Promotor- Sequenz synthetisiert. Es sollte zur Kenntnis genommen werden, daß die vorliegende Erfindung einzelsträngige Promotor-Sequenzen im Promotor-Primer, neben den RNA-Polymerasen, die sie erkennen, umfaßt. Die RNA-Moleküle ("Transkripte") werden in der 5' → 3'-Richtung des RNA-Moleküls, beginnend bei einer spezifischen Position direkt flußabwärts des Promotors, synthetisiert. Beispiele der Transkriptasen sind die DNA-abhängigen RNA-Polymerasen der Bakteriophagen T7, T3 und SP6.
- Bei einer "RNA-abhängigen DNA-Polymerase" oder "reversen Transkriptase" handelt es sich um ein Enzym, welches eine komplementäre DNA-Kopie von einer RNA- Matrize synthetisiert. Alle bekannten reversen Transkriptasen sind auch zur Herstellung einer komplementären DNA-Kopie von einer DNA-Matrize in der Lage; also handelt es sich sowohl um RNA- als auch DNA-abhängige DNA-Polymerasen. Ein Primer muß die Synthese sowohl mit den RNA- als auch den DNA-Matrizen initiieren können.
- Bei "RNAse H" handelt es sich um ein Enzym, das den RNA-Abschnitt eines RNA:DNA-Duplex abbaut. RNAse Hs können Endonukleasen oder Exonukleasen sein. Die reversen Transkriptasen von Vogel-Myeloblastose-Virus und Moloney- Mäuse-Leukämie-Virus weisen über ihre Polymerase-Aktivität hinaus eine RNAse H- Aktivität auf. Bei einigen geklonten reversen Transkriptasen fehlt die RNAse H- Aktivität. Es stehen auch Quellen für RNAse H ohne eine assoziierte Polymerase- Aktivität zur Verfügung. Der Abbau kann zur Abtrennung von RNA aus einem RNA:DNA-Komplex führen. Alternativ dazu kann die RNAse H die RNA an verschiedenen Stellen einfach so zerschneiden, daß Abschnitte der RNA abschmelzen oder Enzymen ermöglicht wird, Abschnitte der RNA aufzuwinden oder die erzeugten RNA-Fragmente als Primer für die Verlängerung durch eine Polymerase dienen können.
- Die Begriffe "hybridisieren" und "Komplex" beziehen sich auf die Bildung von Duplexen zwischen Nukleotid-Sequenzen, die ausreichend komplementär sind, um Duplexe (oder "Komplexe") über Watson-Crick-Basenpaarung zu bilden. Dort, wo ein Promotor-Primer oder Primer mit dem Ziel (Matrize) hybridisiert, sind die Komplexe (oder Hybride) ausreichend stabil, um der durch eine DNA-Polymerase zur Initiation der DNA-Synthese geforderten Priming-Funktion zu dienen.
- Bei Spezifität handelt es sich um eine Eigenschaft der Nukleinsäuresequenz, mit der ihre Fähigkeit zur Unterscheidung zwischen Ziel- und nicht-Ziel-Sequenzen in Abhängigkeit von den Sequenz- und Assay-Bedingungen beschrieben wird.
- Die vorliegende Erfindung richtet sich auf eine neuartige autokatalytische Methode zur Synthetisierung multipler Kopien einer Zielnukleinsäure-Sequenz (d. h. die Methode zykliert automatisch ohne Erfordernis einer Modifikation der Reaktionsbedingungen wie Temperatur, pH-Wert oder Ionenstärke).
- Die vorliegende Erfindung stellt die Behandlung einer Zielsequenz mit einem ersten Oligonukleotid bereit (das eine komplexbildende Sequenz aufweist, die ausreichend komplementär zu einem 3'-Endabschnitt der Zielsequenz ist, um damit zu hybridisieren) (dies allein wird als Primer bezeichnet) und das eine 5'-Sequenz zur komplexbildenden Sequenz aufweist, die eine Sequenz umfaßt, die in doppelsträngiger Form als ein Promotor für eine RNA-Polymerase dient (diese Anordnung wird als Promotor-Primer bezeichnet) und ein zweites Oligonukleotid (das ein Primer oder Promotor-Primer ist, der eine komplexbildende Sequenz aufweist, die ausreichend komplementär zum Komplement der Zielsequenz ist, um damit zu hybridisieren), unter Bedingungen, bei denen ein Oligonukleotid/Zielsequenz- Komplex gebildet werden kann und die DNA- und RNA-Synthese einsetzen kann. Bei dieser Erfindung sind einer oder beide der ersten und zweiten Oligonukleotide ein Gemisch aus einer blockierten und einer unblockierten Oligonukleotid-Sequenz (blockierte Oligonukleotide weisen ein modifiziertes 3'-Ende auf, um die Rate und/oder den Umfang der Primer-Verlängerung durch eine DNA-Polymerase ganz zu verhindern oder zu vermindern) oder ein Gemisch aus Oligonukleotiden mit unterschiedlichen 3'-Modifikationen. Ein derartiges Gemisch erhöht die Effizienz der spezifischen Amplifikationsreaktion signifikant, verglichen zur Verwendung von entweder blockierten oder unblockierten Oligonukleotiden. Das Verhältnis solcher Oligonukleotide kann in Abhängigkeit von der spezifisch zu amplifizierenden Matrizen-Sequenz variiert werden, doch liegt es allgemein zwischen 1 : 1 und 1000 : 1, blockiert zu unblockiert. Für die Erfindung sind keine definierten 3'- und 5'-Enden der Zielsequenz erforderlich.
- Eine Ausführungsform der Erfindung umfaßt (a) das Behandeln einer Zielsequenz mit einem ersten Promotor-Primer-Oligonukleotid, das eine komplexbildende Sequenz aufweist, die ausreichend komplementär zu einem 3'-Endabschnitt der Zielsequenz ist, um damit zu hybridisieren, und das eine 5'-Sequenz zur komplexbildenden Sequenz aufweist, die eine Sequenz umfaßt, die in doppelsträngiger Form als ein Promotor für eine RNA-Polymerase dient, unter Bedingungen, bei denen ein Oligonukleotid/Zielsequenz-Komplex gebildet werden kann und die DNA-Synthese mittels einer geeigneten Polymerase (z. B. einer DNA- Polymerase) initiiert werden kann, (b) Inkubieren des ersten Oligonukleotid/Ziel- Komplexes unter Verlängerungsreaktions-Bedingungen, so daß das 3'-Ende des Ziels zum Erhalt einer Hybrid-Matrize für eine RNA-Polymerase verlängert werden kann; und (C) Inkubieren der Hybrid-Matrize unter Bedingungen, bei denen multiple RNA-Kopien der Zielsequenz unter Verwendung einer RNA-Polymerase, die die Promotor-Sequenz erkennt, hergestellt werden können. Die Erfindung umfaßt auch die Erzeugung eines 3'-Endes einer RNA-Zielsequenz in Schritt (b) durch die Wirkung eines Enzyms, das selektiv den RNA-Abschnitt eines RNA:DNA-Hybrids (z. B. RNAse H) abbaut. Die derart hergestellte RNA kann zum Erhalt weiterer Mengen an Produkt autokatalytisch zykliert werden.
- Bei anderen Verfahren stellt die Erfindung (a) das Zusammenbringen einer Nukleinsäure-(z. B. RNA oder DNA)-Zielsequenz mit einem ersten Oligonukleotid- Primer oder Promotor-Primer unter Bedingungen bereit, bei denen ein erster Oligonukleotid/Zielsequenz-Komplex so gebildet wird, daß die DNA-Synthese durch eine geeignete Polymerase (z. B. eine DNA-Polymerase) initiiert werden kann, (b) Inkubieren des ersten Oligonukleotids unter Verlängerungsreaktions- Bedingungen, so daß das Ziel durch die Polymerase als einer Matrize zum Erhalt eines ersten, zum Ziel (sofern der erste Primer nicht blockiert ist) komplementären DNA-Verlängerungsprodukt verwendet werden kann; (c) sofern das Ziel ein RNA- Molekül ist, Trennen des DNA-Verlängerungsprodukts vom RNA-Ziel unter Verwendung eines Enzyms, das selektiv das RNA-Ziel abbaut, oder, sofern das Ziel ein DNA-Molekül ist, Trennen der beiden DNA-Stränge (z. B. durch Erhitzen bei 90-100ºC oder mittels anderer Methoden); (d) Zusammenbringen des DNA- Verlängerungsprodukts mit einem zweiten Oligonukleotid, das einen Primer oder einen Promotor-Primer umfaßt und das eine ausreichend komplementäre komplexbildende Sequenz zum 3'-Endabschnitt des DNA-Verlängerungsprodukts aufweist, um damit unter Bedingungen zu hybridisieren, bei denen ein zweiter Oligonukleotid/Verlängerungsprodukt-Komplex gebildet und die DNA-Synthese wie oben initiiert werden kann, was von jeglichem blockierenden Molekül auf diesem Primer abhängt. Ist bei dieser Erfindung das erste Oligonukleotid kein Promotor- Primer, so ist das zweite Oligonukleotid ein Promotor-Primer, was bedeutet, daß das zweite Oligonukleotid eine 5'-Sequenz zur komplexbildenden Sequenz aufweist, die eine Promotor-Sequenz für eine RNA-Polymerase enthält. Darüber hinaus bestehen die ersten und/oder zweiten Oligonukleotide entweder aus einem Gemisch blockierter und unblockierter Oligonukleotide oder einem Gemisch von Oligonukleotiden mit unterschiedlichen 3'-Modifikationen.
- Die Amplifikationsreaktion wird in einem Gemisch vorgenommen, das im wesentlichen aus den erforderlichen Reaktionspartnern und Reagentien besteht. Ein derartiges Gemisch kann allerdings auch Enzyme oder weitere Substituenten enthalten, die die Amplifikation der Erfindung (z. B. den Mechanismus der Reaktion) nicht qualitativ beeinflussen. Solche Substituenten können die Menge an beobachteter Amplifikation beeinflussen. Zum Beispiel kann das Gemisch andere Promotor-Primer für dieselbe Zielsequenz enthalten oder kann "Helfer"- Oligonukleotide aufweisen. Solche Helfer-Oligonukleotide werden in einer Weise ähnlich der der Hybridisierungs-Helfer-Sonden verwendet, wie beschrieben bei Hogan et al., US-Patentschrift 5.030.557, nämlich durch Förderung der Bindung des Promotor-Primers an seine Zielnukleinsäure, und zwar selbst dann, wenn die Zielnukleinsäure eine signifikante Sekundärstruktur aufweist. Trotz der Ähnlichkeit bezüglich der Verwendung solcher Helfer-Oligonukleotide überraschte es, daß solche Helfer-Oligonukleotide bei einem Amplifikations-Protokoll ohne nachteilige Auswirkung auf die Effizienz des Verfahrens eingesetzt werden konnten.
- Das erste Oligonukleotid kann ein Promotor-Primer und das zweite Oligonukleotid ein Primer, oder umgekehrt, sein, oder es können sowohl das erste als auch das zweite Oligonukleotid ein Promotor-Primer sein, wobei die Promotor entweder identisch (in dem Sinne, daß die Promotoren durch dieselbe RNA-Polymerase erkannt werden) oder verschieden sein können. Die Verwendung verschiedener Promotoren ist besonders dann nützlich, wenn die amplifizierte Nukleinsäure zum Klonen verwendet wird. Die ersten und zweiten Oligonukleotide und die aus der Zielsequenz erhaltene RNA können dann für die autokatalytische Synthese multipler Kopien (womit sowohl komplementäre als auch homologe Nukleinsäuresequenzen gemeint sind) der Zielsequenz verwendet werden.
- Der modifizierte Primer oder Promotor-Primer der vorliegenden Erfindung besteht im wesentlichen in einer einzelnen Nukleinsäuresequenz, die eine Modifikation am oder nahe (innerhalb von 3 Basen) dem 3'-Ende des gegebenen Primers oder Promotor- Primers ausweist, der die Verlängerung des Primers auf einer Matrize mittels einer DNA-Polymerase verändert (vermindert oder blockiert). Vorzugsweise wird dieser modifizierte Primer oder Promotor-Primer mit einem unmodifizierten Primer oder Promotor-Primer gemischt, der im wesentlichen in derselben Nukleinsäuresequenz besteht, neben einem oder mehreren anderen Primern oder Promotor-Primern einer unterschiedlichen Nukleinsäuresequenz (die ebenfalls ein Gemisch von blockierten und unblockierten Oligonukleotiden sein können). Die Erfindung umfaßt auch die Verwendung von Gemischen von Primern und Promotor-Primern mit mehr als einer Modifikation am oder nahe ihren 3'-Enden.
- Darüber hinaus kann bei einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, bei der die zu amplifizierende Sequenz, DNA ist, unter Anwendung einer geeigneten Vorbehandlung die Herstellung von RNA-Kopien erhöht werden, die dann gemäß der vorliegenden Erfindung amplifiziert werden können. Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung auch Vorbehandlungen zur Verwendung in Verbindung mit dem Amplifikationsverfahren der vorliegenden Erfindung, die nicht nur die Anzahl der zu amplifizierenden Kopien erhöhen kann, sondern auch RNA- Kopien einer DNA-Sequenz zur Amplifikation bereitstellen können.
- Bei einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung die Erzeugung eines definierten 5'-Endes (d. h. eines von bekannter Sequenz) in einer RNA-Zielsequenz durch Behandlung der RNA mit einem DNA-Oligonukleotid bereit, das nahe der zweiten Primer-Bindungsstelle hybridisiert und dabei ein Substrat für RNAse H bildet. Dieses Substrat wird dann mittels RNAse H zur Begrenzung des 5'-Endes des RNA- Ziels gespalten, welches wie oben erörtert amplifiziert werden kann.
- Bei einer anderen Ausführungsform umfaßt die vorliegende Erfindung die Zusammenwirkung einer DNA-Polymerase (zum Beispiel einer reversen Transkriptase) und einer DNA-abhängigen RNA-Polymerase (Transkriptase) mit einem enzymatischen Hybrid-Trennschritt zur Herstellung von Produkten, die selbst zur Erzeugung weiteren Produkts verwendet werden können, ohne daß eine Beeinflussung der Reaktionsbedingungen, z. B. eine Wärmezyklierung, erforderlich wäre. Ferner werden bei einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, die eine Vorbehandlung einbeziehen, alle bis auf den/die einleitenden Schritt/en der Vorbehandlung bei ein und derselben Temperatur ausgeführt.
- Die vorliegende Erfindung kann als eine Komponente von Assays zum Nachweisen und/oder Quantifizieren spezifischer Nukleinsäure-Zielsequenzen in klinischen, ökologischen, forensischen und ähnlichen Proben oder zur Erzeugung großer Kopienzahlen der DNA und/oder RNA einer spezifischen Zielsequenz für eine Vielzahl von Verwendungszwecken eingesetzt werden. Diese Verfahren können auch zur Herstellung multipler DNA-Kopien eines DNA-Ziels zur Klonierung oder zur Erzeugung von Sonden oder zur Herstellung von RNA- und DNA-Kopien für die Sequenzierung verwendet werden.
- Bei einem Beispiel eines typischen Assays wird eine zu amplifizierende Probe (einschließlich RNA- oder DNA-Ziel) mit einem Puffer-Konzentrat, enthaltend den Puffer, Salze (z. B. divalente Kationen wie Magnesium), Nukleotid-Triphosphate, Primer und/oder Promotor-Primer (blockiert und/oder unblockiert), ein Thiolreduzierendes Mittel wie Dithiothreitol und ein Polykation wie Spermidin, gemischt. Die Reaktion wird dann wahlweise bei nahezu 100ºC zur Denaturierung jeglicher Sekundärstruktur inkubiert. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur (etwa 20ºC) werden Enzyme, enthaltend DNA- und RNA-abhängige DNA-Polymerase-Aktivität, RNAse H-Aktivität und DNA-abhängige RNA-Polymerase-Aktivität zugesetzt und das Gemisch über etwa 10 Minuten bis vier Stunden hinweg bei 37ºC bis 42ºC inkubiert. Die Reaktion kann dann durch Zugabe einer lumineszierend markierten Sonde, durch Inkubieren über 10 bis 30 Minuten hinweg bei 60ºC, durch Zugabe einer Lösung zur selektiven Hydrolyse des Markers, auf nicht-hybridisierter Sonde, durch Inkubieren der Reaktion über 5 bis 10 Minuten hinweg bei 60ºC, und durch Messen der verbliebenen Chemilumineszenz in einem Luminometer analysiert werden. (Siehe z. B. den Hybridisierungs-Schutzassay (HPA) von Arnold et al., wie beschrieben in WO 89/02476, veröffentlicht am 29. März 1989, und die entsprechende veröffentlichte Europäische Anmeldung Nr. 0309230.)
- Die Produkte der Erfindung können bei vielen weiteren Assay-Systemen, wie sie den Fachleuten des Bereichs bekannt sind, Verwendung finden.
- Wahlweise kann ein DNA-Ziel ohne ein definiertes 3'-Ende bei nahezu 100ºC zur Denaturierung jeglicher Sekundärstruktur und Abkühlung auf Raumtemperatur inkubiert werden. Reverse Transkriptase wird zugegeben und das Reaktionsgemisch über 12 Minuten hinweg bei 42ºC inkubiert. Die Reaktion wird nochmals bei nahezu 100ºC denaturiert, diesmal zur Abtrennung des Primer-Verlängerungsprodukts von der DNA-Matrize. Nach der Abkühlung werden Enzyme mit DNA- und RNAabhängiger DNA-Polymerase-Aktivität, RNAse H-Aktivität und DNA-abhängiger RNA-Polymerase zugegeben und die Reaktion über 10 Minuten bis 4 Stunden hinweg bei 37ºC bis 42ºC inkubiert. Für ein DNA-Ziel kann ein definiertes 3'-Ende durch Verwenden einer Restriktionsendonuklease erhalten werden. Ein definiertes 3'-Ende kann auch mittels weiterer, im Fachbereich bekannter Methoden erhalten werden.
- Für die Ausführung der Methoden der Erfindung nützliche Sequenzen sind in der SEQUENZAUFLISTUNG zusammengestellt und können an andere Sequenzen gebunden werden, die durch ein Enzym (zum Beispiel eine Polymerase oder Restriktionsendonuklease) erkannt werden. Im besonderen sind die Oligonukleotide zur Amplifikation von Mycobacterium-Nukleinsäure, z. B. der von M. tuberculosis, nützlich und können modifizierte 3'-Enden aufweisen, wie oben erörtert.
- Die bei der vorliegenden Erfindung verwendeten Materialien können in Diagnose-Kits oder anderen Kits zur Verwendung bei diagnostischen oder anderen Verfahren integriert werden, und außerdem ist die Erfindung für die Multi-Well-Technologie adaptierbar, die im Kit-Format bereitgestellt werden kann.
- In Abb. 1 ist die Struktur der Alkandiol-Modifikation, bezeichnet als RP, gezeigt.
- Wie im vorangegangenen angegeben, stellt die vorliegende Erfindung neuartige Verfahren zur Amplifikation spezifischer Nukleinsäure-Zielsequenzen zur Verwendung bei Assays für den Nachweis und/oder die Quantifizierung spezifischer Nukleinsäure-Zielsequenzen oder für die Herstellung großer Kopienzahlen von DNA- und/oder RNA-spezifischen Zielsequenzen für eine Vielfalt von Anwendungen bereit.
- Die vorliegende Erfindung stellt in vorteilhafter Weise ein Amplifikationsverfahren bereit, mit dem RNA-Kopien einer Zielsequenz durch Verwendung eines Gemischs von blockierten und unblockierten Promotor-Primern oder Promotor-Primern mit unterschiedlichen 3'-Modifikationen, synthetisiert werden, bestehend im wesentlichen in derselben Nukleinsäure-Sequenz in einem Verhältnis, das eine verminderte Menge an nicht-spezifischen Nebenprodukten erzielt. Bei der vorliegenden Erfindung verläuft der Amplifikationsprozess spontan und isothermisch unter einem breiten Bereich von Bedingungen. Die nachfolgend beschriebenen Amplifikationsreaktionen stellen eines Reihe logischer Schritte dar. Die relative Rate jedes Schritts bestimmt die effektive Ausbeute an Amplifikationsprodukt. Die Verwendung eines Gemischs von blockierten und unblockierten Primern vermindert die Nebenreaktionen und verbessert folglich die Amplifikation. Nebenprodukte, wie etwa "Primer-Dimeren", wurden beschrieben und sind im Fachbereich als die Effizienz der Amplifikationsreaktionen beeinflussend wohlbekannt. Mit der vorliegenden Erfindung wird der Wirkungsgrad vermindert, mit dem solche Nebenprodukte gebildet werden, und daher die Amplifikationsleistung erhöht.
- Geeignete DNA-Polymerasen für die vorliegende Erfindung umfassen reverse Transkriptasen, wie zum Beispiel die reversen Transkriptasen von Vogel- Myeloblastose-Virus (AMV) und Moloney-Mäuse-Leukämie-Virus (MMLV).
- Promotoren oder Promotor-Sequenzen, die sich für den Einbau dieser Sequenz in bei der vorliegenden Erfindung verwendete Promotor-Primer eignen, sind Nukleinsäure-Sequenzen (entweder natürlich vorkommende oder synthetisch oder mittels Verdauung durch Restriktionsendonuklease erzeugte), die durch eine RNA- Polymerase spezifisch erkannt werden, die durch das Erkennen dieser Sequenz an sie bindet und den Transkriptionsprozeß initiiert, bei welchem RNA-Transkripte erzeugt werden. Zu solchen Promotoren zählen jene, die durch bestimmte Bakteriophagen-Polymerasen, wie zum Beispiel Bakteriophage T3, T7 oder SP6, erkannt werden. Die Sequenz kann wahlweise Nukleotid-Basen umfassen, die sich über die eigentliche Erkennungsstelle für die RNA-Polymerase hinaus erstrecken und die zusätzliche Stabilität und Empfänglichkeit für Abbauprozesse oder eine erhöhte Transkriptionsleistung verleihen können.
- Obschon einige der reversen Transkriptasen, die zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung geeignet sind, eine RNAse H-Aktivität aufweisen, wie zum Beispiel AMV- oder MMLV-reverse Transkriptase, kann die Zugabe einer exogenen RNAse H, wie z. B. E. coli RNAse H, bevorzugt sein. Die Beispiele (siehe unten) zeigen zwar, daß die Zugabe exogener RNAse H nicht erforderlich ist, doch kann die in AMV-reverser Transkriptase vorliegende RNAse H-Aktivität durch relativ große Mengen an im Reaktionsgemisch vorhandener heterologer DNA gehemmt werden; eine Lösung für das Problem besteht in der Zugabe von exogener RNAse H. Ein weiterer Fall, bei dem die Zugabe von RNAse H erforderlich sein kann, liegt dann vor, wenn ein Oligonukleotid intern an die Ziel-RNA hybridisiert (d. h. das Oligonukleotid hybridisiert so, daß sich Zielsequenz-Nukleotide sowohl über das 3'- als auch das 5'-Ende des Oligonukleotids hinaus erstrecken).
- Die vorliegende Erfindung erfordert keinen Denaturierungsschritt zur Trennung des RNA-DNA-Komplexes, wie durch die erste DNA-Verlängerungsreaktion erzeugt. Solche Denaturierungsschritte erfordern eine Beeinflussung der Reaktionsbedingungen, indem die Temperatur des Reaktionsgemischs (allgemein von Raumtemperatur bis etwa 80ºC bis 105ºC) wesentlich erhöht wird, die Ionenstärke reduziert wird (im allgemeinen auf ein Zehnte) oder mehr) oder der pH-Wert verändert wird (gewöhnlich auf 10 oder mehr erhöht wird). Solche Beeinflussungen der Reaktionsbedingungen beeinflussen die Enzymaktivitäten oftmals in abträglicher Weise, was die Zugabe zusätzlichen Enzyms und außerdem weitere Beeinflussungen des Reaktionsgemischs erfordert, um es auf für die weitere Nukleinsäure-Synthese geeignete Bedingungen zurückzubringen.
- Das zweite Oligonukleotid im Gemisch kann blockiert oder ähnlich dem ersten Oligonukleotid modifiziert sein. Bei einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist dann, wenn das erste Oligonukleotid unmodifiziert ist, das zweite Oligonukleotid modifiziert. Auch ist dann, wenn das erste Oligonukleotid kein Promotor-Primer ist, das zweite Oligonukleotid ein Promotor-Primer. Ist außerdem das erste Oligonukleotid lediglich ein Primer, so kann es unblockiert sein, wobei das zweite Oligonukleotid dann ein Promotor-Primer ist, der sowohl blockierte als auch unblockierte Bestandteile enthält, die im wesentlichen in einer einzigen Nukleinsäure-Sequenz bestehen.
- Überraschenderweise wird durch solch ein Gemisch von blockierten und unblockierten Oligonukleotiden, die im wesentlichen in derselben Nukleinsäure- Sequenz bestehen, die gebildete Menge an nicht-spezifischem Produkt vermindert und dadurch der Wirkungsgrad der Amplifikation erhöht.
- Die erzeugten RNA-Kopien oder Transkripte können ohne weitere Beeinflussung autokatalytisch vervielfacht werden.
- Bei einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind sowohl das erste als auch das zweite Oligonukleotid Promotor-Primer, und einer oder beide können jeweils sowohl aus modifizierten als auch unmodifizierten Promotor-Primern bestehen. In solch einem Falle ist es bevorzugt, daß beide Promotoren durch dieselbe RNA-Polymerase erkannt werden, sofern nicht Einführung des zweiten Promotors zu anderen Zwecken als der Amplifikation, zum Beispiel zum Klonen, angestrebt wird. Sind beide Oligonukleotide Promotor-Primer, so werden während der autokatalytischen Reaktion zu beiden Strängen der doppelsträngigen Matrize komplementäre Transkripte erzeugt, wodurch die Zahl der synthetisierten Kopien der Zielsequenz erhöht werden kann.
- Zu beachten ist, daß, indem das erste Oligonukleotid (Primer oder Promotor-Primer) ein Ende der Zielsequenz definiert, nun das zweite Oligonukleotid (Primer oder Promotor-Primer) das andere Ende definiert; die Endigungen ebenfalls durch eine spezifische Restriktionsendonuklease definiert sein können oder durch andere geeignete Mittel (was ein natürliches 3'-Ende einschließt). Die RNA-Transkripte können zur ursprünglichen Zielnukleinsäure verschiedene Endigungen aufweisen, doch bleibt die Sequenz zwischen dem ersten Oligonukleotid und dem zweiten Oligonukleotid intakt. Die so hergestellten RNA-Transkripte können in obigem System ohne weitere Beeinflussung automatisch im Kreisprozeß geführt werden. Daher ist die Reaktion autokatalytisch.
- Ebenfalls zu beachten ist, daß jedes Oligonukleotid 5'-Nukleotid-Sequenzen zu seiner Priming-Sequenz aufweisen kann, was zur Addition einer zusätzlichen Nukleotid-Sequenz zur schließlich resultierenden doppelsträngigen DNA führen kann; wobei die zusätzliche Nukleotid-Sequenz nicht auf eine Promotor-Sequenz beschränkt ist.
- Bei einer anderen Ausführungsform kann die vorliegende Erfindung aus einem ersten und zweiten Oligonukleotid bestehen, mit dem ein Promotor-Primer bereitgestellt wird, der lediglich aus einem blockierten Oligonukleotid besteht, oder lediglich aus einem unblockierten Oligonukleotid, oder aus einem Oligonukleotid mit einem Gemisch unterschiedlicher Modifikationen am oder nahe dem 3'-Ende.
- Bei weiteren Ausführungsformen wird die Amplifikation in Gegenwart von Zusatzstoffen zur Förderung der Amplifikation vorgenommen. Bereits verwendete Beispiele stellen Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid, Ethylenglycol, Glycerin oder Zink dar.
- Die Komponenten des Reaktionsgemischs können schrittweise oder auf einmal zugegeben werden. Die Reaktion läuft in vorteilhafter Weise unter Bedingungen ab, die zur Aufrechterhaltung der Stabilität der Reaktionsbestandteile, wie etwa der Enzym-Komponenten, geeignet sind, ohne, daß eine Modifikation oder Beeinflussung der Reaktionsbedingungen während des Ablaufs der Amplifikationsreaktion erforderlich wäre.
- Die vorliegende Erfindung kann als eine Komponente von Assays zum Nachweisen und/oder Quantifizieren spezifischer Nukleinsäure-Zielsequenzen in klinischen, ökologischen, forensischen und ähnlichen Proben oder zur Erzeugung großer Kopienzal der DNA und/oder RNA einer spezifischen Zielsequenz für vielfältige Anwendungen eingesetzt werden.
- Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Nützlichkeit der Verfahren der vorliegenden Erfindung. Sie stellen keine Beschränkung dar und sollten nicht als solche verstanden werden.
- Sofern nicht anderweitig spezifiziert, waren die Reaktionsbedingungen zur Amplifikation, wie in den folgenden Beispielen angelegt, 50 mM Tris-HOI, 35 mM KCl, 20 mM MgCl&sub2;, 15 mM N-Acetylcystein, 4 mM rATP, 4 mM rCTP, 4 mM rGTP, 4 mM rUTP, 1 mM dATP, 1 mM dCTP, 1 mM dGTP, 1 mM dTTP, 10% Glycerin, 10% Dimethylsulfoxid, 300-600 Einheiten MMLV-reverse Transkriptase, 200-400 Einheiten T7 RNA-Polymerase, 0,15 uM jeweils von Primer oder Promotor-Primer und spezifische Mengen an Matrize und Enzymen in 100 ul-Volumina bei 42ºC für 1 Stunde. Auch Dithiothreitol, Spermidin und/oder Polyethylenimin (PEI) können dem Reaktionsgemisch in vorteilhafter Weise zugegeben werden.
- Die in den folgenden Beispielen verwendeten Enzyme sind T7- oder T3-RNA- Polymerase und die reverse Transkriptase von Moloney-Mäuse-Leukämie-Virus (MMLV). Weitere RNA-Polymerasen mit verschiedenen Promotor-Spezifitäten eignen sich ebenfalls.
- Die relative Amplifikation wurde wie folgt gemessen. Eine Probe des Amplifikations- Reaktionsgemisch (gewöhnlich 10 ul) wurde 100 ul einer lumineszierend markierten Sondenlösung (zum Beispiel mit Acridiniumester markiert - siehe obigen HPA- Bezug), enthaltend etwa 75 fMol Sonde, 0,1 M Lithiumsuccinat, pH 4,7, 2% (GewNol) Lithiumlaurylsulfat, 15 mM Aldrithiol, 20 mM EDTA und 20 mM EGTA, zugegeben und gemischt. Die Reaktionen wurden dann 20 Minuten lang bei 60ºC inkubiert und abgekühlt. Jeder Hybridisierungsreaktion wurden 300 ul von 0,6 M Natriumborat, pH 8,5, 1% Triton X-100, zugegeben. Die Reaktionen wurden dann gemischt und sechs Minuten lang bei 60ºC inkubiert, um den chemilumineszierenden Marker der unhybridisierten Sonde zu zerstören. Dieses Verfahren der Zerstörung des chemilumineszierenden Markers der unhybridisierten Sonde ist recht spezifisch; es bleibt lediglich eine sehr geringe Fraktion der unhybridisierten Sonde chemilumineszent. Die Reaktionen wurden abgekühlt und die verbliebene Chemilumineszenz in einem Luminometer auf die Zugabe von 200p1 an 0,1% Wasserstoffperoxid, 1 mM Salpetersäure und grenzflächenaktives Mittel und 200 ul von 1,0 N Natriumhydroxid quantifiziert. Im Assay emittiert aus hybridisierter Sonde Licht. Die abgestrahlte Photonenmenge wurde in einem Luminometer gemessen und die Ergebnisse als Relative Licht-Einheiten (RLU) aufgezeichnet. Da die Reaktion, die den chemilumineszierenden Marker der unhybridisierten Sonde zerstört, nicht 100% wirksam ist, liegt im allgemeinen ein Hintergrundpegel an vorhandenem Signal im Bereich von etwa 1.000 bis 2.000 RLU vor.
- Viele weitere Assay-Methoden sind ebenfalls anwendbar, einschließlich von Assays unter Anwendung einer Hybridisierung an isotopisch markierte Sonden, von Blotting- Verfahren und der Elektrophorese.
- Diese Reaktionsbedingungen sind nicht unbedingt optimiert und wurden, wie für einige Systeme angemerkt, verändert. Die verwendeten Oligonukleotid-Sequenzen stellen Beispiele dar und sind nicht als Beschränkung zu verstehen, da auch andere Sequenzen für diese und weitere Zielsequenzen verwendet wurden.
- Um zu zeigen, daß die Amplifikation mit einem modifizierten Promotor-Primer eintrat, der komplementär zu einer Sequenz innerhalb eines RNA-Ziels war, wurde ein zu einer Sequenz in M. tuberculosis rmA (Seq ID Nr. 1) komplementärer Promotor- Primer in entweder unmodifizierter Form oder mit 3'-Alkandiol (RP) oder 3'- Cordycepin (CO) synthetisiert und mit einem Primer derselben Richtung wie die Ziel- RNA (Seq ID Nr. 2) inkubiert und 3 tMol des Ziels unter den oben beschriebenen Bedingungen inkubiert. Die Reaktionen wurden mit einer Sonde derselben Richtung wie die Ziel-RNA (Seq. ID Nr. 3) mit Helfer-Oligonukleotiden analysiert, wie beschrieben bei Hogan (US-Patentschrift 5.030.557, Means for Enhancing Nucleic Acid Hybridization, Seq ID Nrn. 4 und 5). Die Ergebnisse zeigen, daß eine signifikante Amplifikation mit einem Promotor-Primer eintritt, der eine 3'-Modifikation aufweist.
- Promotor-Primer-Modifikation RLU
- Unmodifiziert 314.445
- 3'-Cordycepin 71.382
- Unmodifiziert 683.737
- 3'-RP 70.014
- Bei diesem Experiment wurde ein Promotor-Primer mit einer zu M. tuberculosis 23S rmA komplementären Sequenz durch das Vorhandensein eines 3'-Phosphorthioat- Nukleotids modifiziert. Fünfzehn pMol an Promotor-Primer und Primer (Seq ID Nrn. 6 und 7) wurden zur Amplifikation von 0,3 tMol der Ziel-RNA verwendet, gefolgt vom Nachweis mit Sonde derselben Richtung wie die Ziel-RNA (Seq ID Nr. 8) mit Helfer- Sonden (Seq. ID Nrn. 9 und 10). Die Ergebnisse zeigen, daß der 3'-Phosphorthioatmodifizierte Promotor-Primer ebenso gut funktionierte wie das unmodifizierte Oligonukleotid.
- Um zu zeigen, daß Gemische von modifzierten und unmodifizierten Promotor- Primern in einem Amplifikations-Assay funktionieren, wurden Reaktionen mit 15 pMol des Primers und eines Promotor-Primers (siehe unten) vorgenommen und untersucht, wie in Beispiel 1 beschrieben. Es wurden drei tMol der Ziel-RNA verwendet.
- Die Ergebnisse zeigen, daß ein Gemisch von blockierten und unblockierten Oligonukleotiden ebensogut oder besser wie alle unblockierten Oligonukleotide, selbst bei einem Verhältnis von 1 : 150, unblockiert zu blockiert, funktionierte.
- Bei diesem Experiment wurden 3 tMol der Ziel-RNA mit verschiedenen Konzentrationen von CO-blockiertem und unblockiertem Primer und einem Gemisch von 15 pMol CO-blockiertem Promotor-Primer und 0,1 pMol unblockiertem Promotor- Primer wie in Beispiel 1 inkubiert. Die Produkte wurden mittels Hybridisierungs-Assay nachgewiesen.
- Über die beobachtete zufriedenstellende Amplifikation hinaus wurde überraschenderweise festgestellt, daß die Menge an nicht-Matrizen-gerichtetem Produkt in jenen Reaktionen beträchtlich geringer war, die mit blockierten Oligonukleotiden vorgenommen wurden, als bei den mit unblockierten Oligonukleotiden vorgenommenen Reaktionen.
- Bei diesem Experiment wurde die Wirkung des Mischens einer einzelnen Oligonukleotid-Sequenz mit zwei verschiedenen 3'-Modifikationen gezeigt. In Beispiel 1 wurden drei tMol der Ziel-RNA amplifiziert. Der Promotor-Primer wurde mit einem unblockierten 3'-Ende, blockiert mit RP oder mit CO, synthetisiert. Zwei pMol des Primers wurden verwendet.
- Dieses Beispiel zeigte, daß ein Gemisch von unmodifizierten und modifizierten oder ein Gemisch verschiedener Typen von modifizierten Promotor-Primern gut amplifizierte, indem es den Nachweis von 3 tMol RNA-Ziel in einer Stunde zuließ.
- Bei diesem Beispiel wurde ein Gemisch von modifizierten und unmodifizierten Primern und Promotor-Primern zur Amplifikation von 3 tMol M. tuberculosis rmA verwendet. Ein Gemisch von 2 pMol RP-modifiziertem Promotor-Primer und 13 pMol CO-modifiziertem Promotor-Primer wurde mit unmodifiziertem Primer oder einem Gemisch von unmodifiziertem Primer und mit einem 3'-Phosphorthioat-Nukleotid (PS) synthetisiertem Primer verwendet. Die Sequenzen und Hybridisierungs-Sonden sind dieselben wie in Beispiel 1.
- Unter diesen Bedingungen zeigte das Gemisch von modifizierten und unmodifizierten Primern die beste Wirkung.
- Bei diesem Beispiel wurden 80 tMol Neisseria gonorrhoeae-rmA mit einem Primer, der komplementär zur rmA (SeQ. ID Nr. 13) war, und einem Gemisch aus 28 pMol 3'-RP-blockiertem und 2 pMol unblockiertem Promotor-Primer derselben Richtung wie das RNA-Ziel (SEQ. ID Nr. 14) amplifiziert. Bei einigen Reaktionen wurde ein 3'-blockiertes Oligonukleotid (SEQ ID Nr. 15), das zur Hybridisierung an N. gonorrhoeae rmA und Bildung eines RNAse H-Substrats fähig war, der Amplifikation zugegeben. Eine Teilmenge der Reaktionen wurde an eine AEmarkierte Sonde und zwei zur rmA-Sequenz (SEQ ID Nrn. 16, 17 bzw. 18) komplementäre Helfer-Sonden hybridisiert.
- RLU - RNAse H-Substrat oligo RLU + RNAse H-Substrat oligo
- 7.910 32.473
- 16. 337 728.246
- 17. 304 80.487
- 12. 518 51.893
- Bei diesem Beispiel wurden 3 oder 30 tMol M. tuberculosis rmA mit einem Primer (SEQ ID Nr. 7) und einem Gemisch von 14 pMol 3'-RP-blockiertem und 1 pMol unblockiertem Promotor-Primer, enthaltend einen Promotor für T3-RNA-Polymerase (SEQ ID Nr. 19), amplifiziert. Die Reaktion wurde wie in Beispiel 1 vorgenommen, außer daß 450 Einheiten MMLV RT verwendet wurden, T7-RNA-Polymerase durch 200 Einheiten T3-RNA-Polymerase ersetzt wurde und die Reaktion nach 40 Minuten abgebrochen wurde.
- Zielkonzentration RLU-Wert
- 30 tMol 358.053
- 3 tMol 75.440
- 0 tMol 553
- Die Ergebnisse zeigen, daß ein Gemisch von blockiertem und unblockiertem Promotor-Primer zur Amplifikation von RNA unter Verwendung von reverser Transkriptase und T3-RNA-Polymerase verwendet werden kann.
- Bei diesem Beispiel wurde die Amplifikation eines DNA-Ziels mit einem RPmodifizierten Promotor-Primer untersucht. Drei tMol geklonte HIV-1-DNA wurden mit 30 pMol eines Primers mit Sequenz 5'-ATAATCCACCTATCCCAGTAGGAGAAAT-3' (SEQ ID Nr. 20) und einem Promotor-Primer mit Sequenz 5'-AATTTAATACGACTC- ACTATAGGGAGACCACACCTTGTCTTATGTCCAGAATGCT-3' (SEQ ID Nr. 21) bei 95ºC für 5 Minuten inkubiert und dann auf Raumtemperatur abgekühlt. Nach der Enzym-Zugabe wurde die Reaktion bei 37ºC für 2 Stunden inkubiert. Die Bedingungen waren 50 mM Tris-HOI, 40 mM Kaliumacetat, pH 8, 18 mM MgCl&sub2;, 5 mM DTT, 2 mM Spermidin, 6,2 mM GTP, 6,2 mM ATP, 2 mM CTP, 2 mM UTP, 0,2 mM dTTP, 0,2 mM dATP, 0,2 mM dGTP, 0,2 mM dCTP, 800 E MMLV RT, 400 E T7-RNA-Polymerase. Der Promotor-Primer war unmodifiziert oder mit einem RP am 3'-Ende modifiziert. Die Reaktionen wurden mit AE-markierter Sonde derselben Richtung wie der Primer untersucht. Bei den gezeigten Ergebnissen handelt es sich um den Mittelwert von fünf Wiederholungsversuchen.
- Unvorhergesehen und überraschend war, daß die Amplifikation eines DNA-Ziels, besonders eines DNA-Ziels ohne definiertes 3'-Ende, durch die Verwendung eines modifzierten Promotor-Primers nicht gehemmt wurde.
- (1) ALLGEMEINE INFORMATION:
- (i) ANMELDER:
- (A) NAME: Gen-Probe Incorporated
- (B) STRAßE: 10210 Genetic Center Drive
- (C) STADT: San Diego
- (D) STAAT: Kalifornien
- (E) LAND: Vereinigte Staaten von Amerika
- (F) POSTLEITZAHL (ZIP): 92121
- (ii) TITEL DER ERFINDUNG: Amplifikationsmethode für Nukleinsäure-Sequenzen
- (iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 21
- (iv) COMPUTER-LESBARE FORM:
- (A) MEDIUM-TYP: Floppy disk
- (B) COMPUTER: IBM PC-kompatibel
- (C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOSIMS-DOS
- (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Version #1,25 (EPO)
- (v) DERZEiTIGE ANMELDEDATEN:
- ANMELDUNGS-NR: EP 93 306 169.9
- (2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR: 1:
- (i) SEQUENZ-EIGENSCHAFTEN:
- (A) LÄNGE: 55
- (B) TYP: Nukleinsäure
- (C) STRÄNGIGKEIT: einzeln
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 1:
- GAAATTAATA CGACTCACTA TAGGGAGACC ACAGCCGTCA CCC
- CACCAACAAG CT 55
- (2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR: 2:
- (1) SEQUENZ-EIGENSCHAFTEN:
- (A) LÄNGE: 31
- (B) TYP: Nukleinsäure
- (C) STRÄNGIGKEIT: einzeln
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 2:
- GGGATAAGCC TGGGAAACTG GGTCTAATAC C 31
- (2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR: 3:
- (1) SEQUENZ-EIGENSCHAFTEN:
- (A) LÄNGE: 24
- (B) TYP: Nukleinsäure
- (C) STRÄNGIGKEIT: einzeln
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 3:
- GTCTTGTGGT GGAAAGCGCT TTAG 24
- (2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR: 4:
- (i) SEQUENZ-EIGENSCHAFTEN:
- (A) LÄNGE: 23
- (B) TYP: Nukleinsäure
- (C) STRÄNGIGKEIT: einzeln
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 4:
- CCGGATAGGA CCACGGGATG CAT 23
- (2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR: 5:
- (i) SEQUENZ-EIGENSCHAFTEN:
- (A) LÄNGE: 20
- (B) TYP: Nukleinsäure
- (C) STRÄNGIGKEIT: einzeln
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 5:
- CGGTGTGGGA TGACCCGGCG 20
- (2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR: 6:
- (i) SEQUENZ-EIGENSCHAFTEN:
- (A) LÄNGE: 47
- (B) TYP: Nukleinsäure
- (C) STRÄNGIGKEIT: einzeln
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 6:
- AATTTAATAC GACTCACTAT AGGGAGACCA GGCCACTTCC GCTAACC 47
- (2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR: 7:
- (i) SEQUENZ-EIGENSCHAFTEN:
- (A) LÄNGE: 24
- (B) TYP: Nukleinsäure
- (C) STRÄNGIGKEIT: einzeln
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 7:
- CGCGGAACAG GCTAAACCGC ACGC 24
- (2) INFORMATION FÜR SEQ 1D NR: 8:
- (i) SEQUENZ-EIGENSCHAFTEN:
- (A) LÄNGE: 23
- (B) TYP: Nukleinsäure
- (C) STRÄNGIGKEIT: einzeln
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 8:
- GGAGGATATG TCTCAGCGCT ACC 23
- (2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR: 9:
- (1) SEQUENZ-EIGENSCHAFTEN:
- (A) LÄNGE: 38
- (B) TYP: Nukleinsäure
- (C) STRÄNGIGKEIT: einzeln
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 9:
- CGGCTGAGAG GCAGTACAGA AAGTGTCGTG GTTAGCGG 38
- (2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR: 10:
- (1) SEQUENZ-EIGENSCHAFTEN:
- (A) LÄNGE: 36
- (B) TYP: Nukleinsäure
- (C) STRÄNGIGKEIT: einzeln
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 10:
- GGGTAACCGG GTAGGGGTTG TGTGTGCGGG GTTGTG 36
- (2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR: 11:
- (1) SEQUENZ-EIGENSCHAFTEN:
- (A) LÄNGE: 28
- (B) TYP: Nukleinsäure
- (C) STRÄNGIGKEIT: einzeln
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 11:
- ATAATCCACC TATCCCAGTA GGAGAAAT 28
- (2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR: 12:
- (i) SEQUENZ-EIGENSCHAFTEN:
- (A) LÄNGE: 55
- (B) TYP: Nukleinsäure
- (C) STRÄNGIGKEIT: einzeln
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 12:
- AATTTAATAC GACTCACTAT AGGGAGACCA CACCTTGTCT
- TATGTCCAGA ATGCT 55
- (2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR: 13:
- (i) SEQUENZ-EIGENSCHAFTEN:
- (A) LÄNGE: 30
- (B) TYP: Nukleinsäure
- (C) STRÄNGIGKEIT: einzeln
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 13:
- GCACGTAGTT AGCCGGTGCT TATTCTTCAG 30
- (2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR: 14:
- (1) SEQUENZ-EIGENSCHAFTEN:
- (A) LÄNGE: 53
- (B) TYP: Nukleinsäure
- (C) STRÄNGIGKEIT: einzeln
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 14:
- AATTTAATAC GACTCACTAT AGGGAGAGCA AGCCTGATCC
- AGCCATGCCG CGT 53
- (2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR: 15:
- (i) SEQUENZ-EIGENSCHAFTEN:
- (A) LÄNGE: 32
- (B) TYP: Nukleinsäure
- (C) STRÄNGIGKEIT: einzeln
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 15:
- GCTTGCGCCC ATTGTCCAAA ATTTCCCACT GC 32
- (2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR: 16:
- (i) SEQUENZ-EIGENSCHAFTEN:
- (A) LÄNGE: 18
- (B) TYP: Nukleinsäure
- (C) STRÄNGIGKEIT: einzeln
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 16:
- TCGGCCGCCG ATATTGGC 18
- (2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR: 17:
- (i) SEQUENZ-EIGENSCHAFTEN:
- (A) LÄNGE: 40
- (B) TYP: Nukleinsäure
- (C) STRÄNGIGKEIT: einzeln
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 17:
- AACGGCCTTT TCTTCCCTGA CAAAAGTCCT TTACAACCCG 40
- (2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR: 18:
- (i) SEQUENZ-EIGENSCHAFTEN:
- (A) LÄNGE: 36
- (B) TYP: Nukleinsäure
- (C) STRÄNGIGKEIT: einzeln
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 18:
- CGTAGTTAGC CGGTGCTTAT TCTTCAGGTA CCGTCA 36
- (2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR: 19:
- (i) SEQUENZ-EIGENSCHAFTEN:
- (A) LÄNGE: 46
- (B) TYP: Nukleinsäure
- (C) STRÄNGIGKEIT: einzeln
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 19:
- TAATATTAAC CCTCACTAAA GGGAGACCAG GCCACTTCCG CTAACC 46
- (2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR: 20:
- (i) SEQUENZ-EIGENSCHAFTEN:
- (A) LÄNGE: 28
- (B) TYP: Nukleinsäure
- (C) STRÄNGIGKEIT: einzeln
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 20:
- ATAATCCACC TATCCCAGTA GGAGAAAT 28
- (2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR: 21:
- (i) SEQUENZ-EIGENSCHAFTEN:
- (A) LÄNGE: 55
- (B) TYP: Nukleinsäure
- (C) STRÄNGIGKEIT: einzeln
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 21:
- AATTTAATAC GACTCACTAT AGGGAGACCA CACCTTGTCT
- TATGTCCAGA ATGCT 55
Claims (42)
1. Verfahren zur Herstellung multipler Kopien einer Zielnukleinsäure, umfassend die
folgenden Schritte:
a) Inkubieren, unter Bedingungen, bei denen ein Oligonukleotid/Zielsequenz-
Komplex gebildet wird und eine DNA- und RNA-Synthese eintritt, eines
Gemischs, umfassend:
eine Nukleinsäure, umfassend eine (+)-Zielsequenz,
ein erstes Oligonukleotid, umfassend eine Primersequenz, die zur Hybridisierung
am oder nahe dem 3'-Ende der (+)-Zielsequenz fähig ist, eine 5'-
Promotorsequenz und eine Modifikation am oder nahe dem 3'-Ende dieser
ersten Oligonukleotid-Primersequenz, die die Verlängerung dieser ersten
Oligonukleotid-Primersequenz durch eine Polymerase reduziert oder blockiert,
relativ zur ersten Oligonukleotid-Primersequenz ohne diese Modifikation,
ein zweites Oligonukleotid, umfassend eine Primersequenz, die zur
Hybridisierung am oder nahe dem 3'-Ende der (+)-Zielsequenz fähig ist, eine 5'-
Promotorsequenz und eine wahlweise vorhandene Modifikation am oder nahe
dem 3'-Ende dieser zweiten Oligonukleotid-Primersequenz, die die Verlängerung
dieser zweiten Oligonukleotid-Primersequenz durch eine Polymerase reduziert
oder blockiert, relativ zur zweiten Oligonukleotid-Primersequenz ohne diese
Modifikation, wobei dieses zweite Oligonukleotid an die (+)-Zielsequenz in
effektiv derselben Position wie das erste Oligonukleotid hybridisiert und die
zweite Oligonukleotid-Modifikation, sofern vorhanden, von der ersten
Oligonukleotid-Modifikation verschieden ist,
ein drittes Oligonukleotid, umfassend eine Primersequenz, die zur Hybridisierung
am 3'-Ende einer (-)-Zielnukleinsäure-Sequenz fähig ist, welche während dieses
Verfahrens erzeugt wird und welche das Komplement der (+)-Zielsequenz ist,
eine wahlweise vorhandene 5'-Promotorsequenz und eine wahlweise
vorhandene Modifikation am oder nahe dem 3'-Ende dieser dritten
Oligonukleotid-Primersequenz, die die Verlängerung dieser dritten
Oligonukleotid-Primersequenz durch eine Polymerase reduziert oder blockiert,
relativ zur dritten Oligonukleotid-Primersequenz ohne diese Modifikation,
mindestens eine Enzymaktivität, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus:
DNAabhängige DNA-Polymerase und RNA-abhängige DNA-Polymerase und
ein oder mehrere RNA-Polymerasen, die zum Erkennen der ersten und der
zweiten Oligonukleotid-5'-Promotorsequenzen fähig sind,
wobei unter den Inkubationsbedingungen das dritte Oligonukleotid die
Herstellung der (+)-Zielsequenz unter Verwendung der (-)-Zielsequenz als einer
Matrize erleichtert, und
(b) Produzieren der multiplen Kopien der Zielsequenz.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die ersten und die zweiten Oligonukleotide
innerhalb einer Entfernung von 10 Basen voneinander hybridisieren.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei das zweite Oligonukleotid
die Modifikation nicht aufweist.
4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die ersten und die zweiten Oligonukleotide
jeweils in einem Molverhältnis von zwischen 1 : 1 bis 1000 : 1 vorhanden sind.
5. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei das zweite Oligonukleotid
die Modifikation enthält.
6. Verfahren nach Anspruch 5, außerdem umfassend die Verwendung eines vierten
Oligonukleotids während des Schritts (a), wobei das vierte Oligonukleotid eine
Primersequenz umfaßt, die zur Hybridisierung in effektiv derselben Position wie
die ersten und zweiten Oligonukleotide fähig ist, und eine 5'-Promotorsequenz,
wobei das vierte Oligonukleotid keine Modifikation am oder nahe seinem 3'-Ende
aufweist, die zur Reduzierung oder Blockierung der Primer-Verlängerung fähig
ist.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das dritte Oligonukleotid die
5'-Promotorsequenz enthält.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das dritte Oligonukleotid die
Modifikation nicht enthält.
9. Verfahren nach Anspruch 7, wobei das dritte Oligonukleotid die Modifikation
enthält.
10. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die erste Oligonukleotid-5'-Promotorsequenz,
die zweite Oligonukleotid-5'-Promotorsequenz und die dritte Oligonukleotid-5'-
Promotorsequenz dieselben sind.
11. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die erste Oligonukleotid-5'-Promotorsequenz
dieselbe wie die zweite Oligonukleotid-5'-Promotorsequenz ist und die ersten und
zweiten 5'-Promotorsequenzen von der dritten Oligonukleotid-5'-
Promotorsequenz verschieden sind.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die ersten und die zweiten
Oligonukleotid-Primersequenzen dieselben sind.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die ersten und die zweiten
Oligonukleotid-Primersequenzen verschieden sind.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei die erste Oligonukleotid-
Modifikation gewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem oder mehreren
von: Alkandiol-Modifikation, 3'-Desoxynukleotid-Rest, Nukleotid mit einer
nicht-Phosphodiester-Verknüpfung, nicht-Nukleotid-Modifikation,
nichtkomplementärer Base zur (+)-Zielsequenz und Didesoxynukleotid.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei die erste Oligonukleotid-
Modifikation gewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem oder mehreren
von: Cordycepin, Ribonukleotid und Phosphorthioat-Nukleotid.
16. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die erste Oligonukleotid-Modifikation und die
zweite Oligonukleotid-Modifikation jeweils unabhängig voneinander gewählt sind
aus der Gruppe, bestehend aus einem oder mehreren von: Alkandiol-
Modifikation, 3'-Desoxynukleotid-Rest, Nukleotid mit einer nicht-Phosphodiester-
Verknüpfung, nicht-Nukleotid-Modifikation, nichtkomplementärer Base zur
(+)-Zielsequenz und Didesoxynukleotid.
17. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die erste Oligonukleotid-Modifikation und die
zweite Oligonukleotid-Modifikation jeweils unabhängig voneinander gewählt sind
aus der Gruppe, bestehend aus einem oder mehreren von: Cordycepin,
Ribonukleotid und Phosphorthioat-Nukleotid.
18. Verfahren zur Herstellung multipler Kopien einer Zielnukleinsäure-Sequenz,
umfassend die folgenden Schritte:
a) Inkubieren, unter Bedingungen, bei denen ein Oligonukleotid/Zielsequenz-
Komplex gebildet wird und eine DNA- und RNA-Synthese eintritt, eines
Gemischs, umfassend:
eine Nukleinsäure, umfassend eine (+)-Zielsequenz,
ein erstes Oligonukleotid, umfassend eine Primersequenz, die zur Hybridisierung
am 3'-Ende der (+)-Zielsequenz fähig ist, eine wahlweise vorhandene 5'-
Promotorsequenz und eine wahlweise vorhandene Modifikation am oder nahe
dem 3'-Ende dieser ersten Oligonukleotid-Primersequenz, die zur Reduzierung
oder Blockierung der Verlängerung dieser ersten Oligonukleotid-Primersequenz
durch eine Polymerase fähig ist, relativ zur ersten Oligonukleotid-Primersequenz
ohne diese Modifikation,
ein zweites Oligonukleotid, umfassend eine Primersequenz, die zur
Hybridisierung am oder nahe dem 3'-Ende einer (-)-Zielnukleinsäure-Sequenz
fähig ist, welche während dieses Verfahrens erzeugt wird und welche das
Komplement der (+)-Zielsequenz ist, eine 5'-Promotorsequenz und eine
Modifikation am oder nahe dem 3'-Ende dieser zweiten Oligonukleotid-
Primersequenz, die die Verlängerung dieser zweiten Oligonukleotid-
Primersequenz durch eine Polymerase reduziert oder blockiert, relativ zur
zweiten Oligonukleotid-Primersequenz ohne diese Modifikation,
ein drittes Oligonukleotid, umfassend eine Primersequenz, die zur Hybridisierung
am oder nahe am 3'-Ende der (-)-Zielsequenz fähig ist, eine 5'-Promotorsequenz
und eine wahlweise vorhandene Modifikation am oder nahe dem 3'-Ende dieser
dritten Oligonukleotid-Primersequenz mittels einer Polymerase, die die
Verlängerung dieser dritten Oligonukleotid-Primersequenz durch eine
Polymerase reduziert oder blockiert, relativ zur dritten Oligonukleotid-
Primersequenz ohne diese Modifikation, wobei dieses dritte Oligonukleotid an die
(-)-Zielsequenz in effektiv derselben Position wie das zweite Oligonukleotid
hybridisiert und die dritte Oligonukleotid-Modifikation, sofern vorhanden, von der
zweiten Oligonukleotid-Modifikation verschieden ist,
mindestens eine Enzymaktivität, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus:
DNA-abhängige DNA-Polymerase und RNA-abhängige DNA-Polymerase und
ein oder mehrere RNA-Polymerasen, die zum Erkennen der ersten und der
zweiten Oligonukleotid-5'-Promotorsequenzen fähig sind,
wobei unter den Inkubationsbedingungen das erste Oligonukleotid die
Herstellung der (-)-Zielsequenz unter Verwendung der (+)-Zielsequenz als einer
Matrize erleichtert, und
(b) Herstellen der multiplen Kopien der Zielsequenz.
19. Verfahren nach Anspruch 18, wobei die zweiten und die dritten Oligonukleotide
innerhalb einer Entfernung von 10 Basen voneinander hybridisieren.
20. Verfahren nach Anspruch 18 oder Anspruch 19, wobei das dritte Oligonukleotid
die Modifikation nicht enthält.
21. Verfahren nach Anspruch 20, wobei die zweiten und die dritten Oligonukleotide
jeweils in einem Molverhältnis von zwischen 1 : 1 bis 1000 : 1 vorhanden sind.
22. Verfahren nach Anspruch 18 oder Anspruch 19, wobei das dritte Oligonukleotid
die Modifikation enthält.
23. Verfahren nach Anspruch 22, außerdem umfassend die Verwendung eines
vierten Oligonukleotids während des Schritts (a), wobei das vierte Oligonukleotid
eine Primersequenz umfaßt, die zur Hybridisierung in effektiv derselben Position
wie die zweiten und dritten Oligonukleotide fähig ist, und eine
5'-Promotorsequenz, wobei das vierte Oligonukleotid keine Modifikation am oder nahe
seinem 3'-Ende aufweist, die zur Reduzierung oder Blockierung der Primer-
Verlängerung fähig ist.
24. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 23, wobei das erste Oligonukleotid
die 5'-Promotorsequenz enthält.
25. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 24, wobei das erste Oligonukleotid
die Modifikation nicht enthält.
26. Verfahren nach Anspruch 24, wobei das erste Oligonukleotid die Modifikation
enthält.
27. Verfahren nach Anspruch 24, wobei die erste Oligonukleotid-5'-
Promotorsequenz, die zweite Oligonukleotid-5'-Promotorsequenz und die dritte
Oligonukleotid-5'-Promotorsequenz dieselben sind.
28. Verfahren nach Anspruch 24, wobei die zweite Oligonukleotid-5'-
Promotorsequenz dieselbe wie die dritte Oligonukleotid-5'-Promotorsequenz ist
und die zweite und die dritte 5'-Promotorsequenz von der ersten Oligonukleotid-
5'-Promotorsequenz verschieden sind.
29. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 28, wobei die zweite und die dritte
Oligonukleotid-Primersequenz dieselben sind.
30. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 28, wobei die zweite und die dritte
Oligonukleotid-Primersequenz verschieden sind.
31. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 30, wobei die zweite Oligonukleotid-
Modifikation gewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem oder mehreren
von: Alkandiol-Modifikation, 3'-Desoxynukleotid-Rest, Nukleotid mit einer nicht-
Phosphodiester-Verknüpfung, nicht-Nukleotid-Modifikation,
nichtkomplementäre Basen zur (-)-Zielsequenz und Didesoxynukleotid.
32. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 30, wobei die zweite Oligonukleotid-
Modifikation gewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem oder mehreren
von: Cordycepin, Ribonukleotid und Phosphorthioat-Nukleotid.
33. Verfahren nach Anspruch 22, wobei die zweite Oligonukleotid-Modifikation und
die dritte Oligonukleotid-Modifikation jeweils unabhängig voneinander gewählt
sind aus der Gruppe, bestehend aus einem oder mehreren von: Alkandiol-
Modifikation, 3'-Desoxynukleotid-Rest, Nukleotid mit einer nicht-Phosphodiester-
Verknüpfung, nicht-Nukleotid-Modifikation, nichtkomplementäre Basen zur (-)-
Zielsequenz und Didesoxynukleotid.
34. Verfahren nach Anspruch 22, wobei die zweite Oligonukleotid-Modifikation und
die dritte Oligonukleotid-Modifikation jeweils unabhängig voneinander gewählt
sind aus der Gruppe, bestehend aus einem oder mehreren von: Cordycepin,
Ribonukleotid und Phosphorthioat-Nukleotid.
35. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, außerdem umfassend
den Schritt des Nachweisens des Vorhandenseins oder der Menge von
Nukleinsäuren, wie durch den Schritt (b) erhalten.
36. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bestehend im
wesentlichen aus diesen Schritten.
37. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der Schritt (a)
außerdem das Vorhandensein von ein oder mehreren Agentien umfaßt, gewählt
aus der Gruppe, bestehend aus: DMSO, Dimethylformamid, Ethylenglycol,
Glycerin und Zink.
38. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Verfahren
ohne Auftrennen doppelsträngiger Nukleinsäuren durch Wärmekreisführung
vorgenommen wird.
39. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die (+)-Zielsequenz
eine RNA-Zielsequenz ist.
40. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei Schritt (a)
außerdem das Vorhandensein einer RNAse H-Aktivität umfaßt.
41. Verfahren nach Anspruch 40, wobei die RNAse H-Aktivität durch E. coli RNAse H
bereitgestellt wird.
42. Verfahren nach Anspruch 40, wobei die RNAse H-Aktivität durch eine reverse
Transkriptase bereitgestellt wird.
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
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ID=25451694
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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