JP2023503946A - 乾燥試料からのポリヌクレオチド分析物の定量化 - Google Patents

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Abstract

乾燥試料の製造に使用される流体試料中の分析物の濃度を決定するのに役立つ方法、システム、およびソフトウェア製品が提示され、乾燥試料は、検出および定量化手順で分析物の供給源として機能する。特に示されているのは、ポリヌクレオチド分析物を定量化するための乾燥血液スポットの使用である。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年１２月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／９４６，２７０号、および２０１９年１２月９日に出願された６２／９４５，６８５の米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく利益を主張する。これらの先行出願の全開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
本開示は、概して、バイオテクノロジーの分野に関する。より具体的には、本開示は、乾燥試料を調製するために使用される液体試料中の分析物の濃度を決定するための方法、システム、およびソフトウェア製品に関するものであり、乾燥試料は、検出および定量化手順における分析物の供給源となる。
分析物の検出に乾燥血液試料などの乾燥体液試料を使用すると、試料の収集、輸送、および処理の要件が簡素化されるため、高度な臨床検査の可用性が大幅に向上する。乾燥血液スポット（ＤＢＳ）は、特定のタイプの乾燥試料を表す。より具体的には、ＤＢＳは、５０～７０μｌの血液を濾紙の円上に吸い取り、乾燥させた後、血液試料中の１つ以上の生体分析物の検出に使用するバイオサンプリングの形態である。このアプローチにより、血液スポットを都合よく調製し、乾燥させてから、遠隔の検査場所に送ることができる。スポッティングのために血液試料が採取される場所には、従来の採血を実行するためのリソースは必要ない。ここでの利点は、生物分析物の試験を、リソース的に困難な環境だけでなく、匿名の寄付および家庭内試験のカテゴリでも利用できるようにすることである。
ＤＢＳサンプリングの使用には、多くの利点がある。例えば、試料は冷蔵を必要とせずに収集、保管、輸送が簡単である。試料収集は、非常に少量だけの血液量が必要であるため、放血による採血よりも侵襲性が低い。乾燥した試料は、周囲温度で数ヶ月間安定である可能性がある。したがって、このタイプの試料は、従来の臨床環境以外の患者に検査室へのアクセスを提供する便利な方式を提供する。乾燥した試料は、リアルタイム核酸増幅反応などのインビトロ核酸増幅反応をプライミングするためのテンプレートの供給源としても使用され得る。
残念ながら、定量的なＤＢＳ結果（例えば、再構成されたＤＢＳ試料を使用してコピー／ｍｌで測定）を、異なるタイプの液体または流体試料（例えば、全血または血漿）の正確な「ウェット試料」結果（例えば、コピー／ｍｌで測定）に変換することは非常に困難な場合がある。液体試料（血漿試料など）を処理する核酸分析器からの定量的アウトプットは、通常、再構成されたＤＢＳ試料を使用して生成された定量的アウトプットとは大きく異なる。実際、試料調製の効率は、流体血液生成物および再構成されたＤＢＳ試料の直接サンプリングでは大幅に異なる可能性があり、それによって増幅および検出の経路に入る本来の標的の量に影響を与える。
ＤＢＳの結果が、医学的治療または治療の変更に関する情報決定を行うために使用される場合、ＤＢＳおよびウェット試料の定量的結果との密接な対応が重要になる可能性がある。例えば、ＤＢＳ試験結果をＨＩＶ－１の抗レトロウイルス治療の失敗を判断するために使用する場合、世界保健機関のガイドライン（ＨＩＶ感染の治療または予防のための抗レトロウイルス薬の使用に関するＷＨＯ統合ガイドライン、２０１６年）に従えば、ＨＩＶウイルス量が血漿中の１，０００コピー／ｍｌのレベルを超えるときを検出することができなければならない。
本開示は、ＤＢＳ試験からの結果をウェット試料標準に変換する必要性に対処し、それにより、非常に正確かつ正確の両方である様式で２つの結果を相互に関連付ける。
本明細書では、以下の実施形態が提供される。
実施形態１は、乾燥して乾燥血液スポット（ＤＢＳ）を生成する流体血液試料中に存在するポリヌクレオチド分析物を定量化する方法であって、（ａ）ＤＢＳをテンプレートの供給源として使用して核酸増幅反応を行い、測定結果を得るステップであって、測定結果が、ポリヌクレオチド分析物の濃度または量を示す、ステップと、（ｂ）測定結果に補正係数を掛けて補正結果を得るステップであって、補正係数が、測定結果の関数として補正係数を指定する方程式の解であり、それにより、流体血液試料中に存在するポリヌクレオチド分析物を定量化する、ステップと、を含む、方法である。
実施形態２は、乾燥血液スポット（ＤＢＳ）を作製した流体血液試料中に存在するポリヌクレオチド分析物を定量化する方法であって、（ａ）テンプレートの供給源としてＤＢＳを使用して核酸増幅反応を実施して増幅産物を生成し、測定結果を得るステップであって、測定結果が、ポリヌクレオチド分析物の濃度または量を示す、ステップと、（ｂ）方程式を解いて補正係数を決定するステップであって、方程式が、測定結果の関数として補正係数を指定する、ステップと、（ｃ）測定結果に補正係数を掛けて、補正結果を得るステップであって、それにより流体血液試料中に存在するポリヌクレオチド分析物を定量化する、ステップと、を含む、方法である。
実施形態３は、ステップ（ｂ）の方程式が非線形方程式を含む、実施形態１または２に記載の方法である。
実施形態４は、非線形方程式が、近似曲線を定義するために数学的カーブフィッティング手順で最適化された係数を含む、実施形態３に記載の方法である。
実施形態５は、非線形方程式が４つの計数を含む、実施形態４に記載の方法である。
実施形態６は、ステップ（ａ）が、ポリヌクレオチド分析物を増幅し、核酸増幅反応が起こっているときに増幅産物を検出する自動核酸分析器を用いて実施することを含む、実施形態１～５のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態７は、ステップ（ｂ）の方程式が、ステップ（ａ）の核酸増幅反応を実施するために使用された自動核酸分析器とは異なる自動核酸分析器から得られた結果を使用して作成された非線形方程式である、実施形態６に記載の方法である。
実施形態８は、ステップ（ａ）が、ポリヌクレオチド分析物を単離し、次いで単離されたポリヌクレオチド分析物を増幅する自動核酸分析器を用いて実施することを含む、実施形態１～５のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態９は、自動核酸分析器が、核酸増幅反応が起こっているときに増幅産物の合成をさらに検出する、実施形態８に記載の方法である。
実施形態１０は、測定結果が血漿試料中のポリヌクレオチド分析物の濃度を示す、実施形態１～９のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１１は、核酸増幅反応が等温核酸増幅反応である、実施形態１～１０のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１２は、等温核酸増幅反応が、転写関連核酸増幅反応である、実施形態１１に記載の方法である。
実施形態１３は、転写関連核酸増幅反応が、転写媒介性増幅（ＴＭＡ）反応を含む、実施形態１２に記載の方法である。
実施形態１４は、ポリヌクレオチド分析物がウイルスゲノムのセグメントを含む、実施形態１～１３のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１５は、ウイルスゲノムがＲＮＡを含む、実施形態１４に記載の方法である。
実施形態１６は、ポリヌクレオチド分析物がＨＩＶ－１ゲノムのセグメントを含む、実施形態１～１５のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１７は、流体血液試料が全血を含む、実施形態１～１６のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１８は、乾燥血液スポット（ＤＢＳ）を生成するために乾燥した流体血液試料中に存在するポリヌクレオチド分析物を定量化するためのソフトウェア命令でプログラムされたコンピュータであって、ソフトウェア命令がコンピュータによって実行されると、コンピュータに（ａ）測定結果を受け取ることと、（ｂ）方程式を解いて補正係数を決定することであって、方程式が、測定結果の関数として補正係数を指定する、決定することと、（ｃ）測定結果に補正係数を掛けて、補正結果を計算することと、（ｄ）修正された結果を非一時的な形態で記録し、それによってポリヌクレオチド分析物を定量化することと、を行わせる、コンピュータである。
実施形態１９は、測定結果が、リアルタイム核酸増幅反応の結果から決定され、リアルタイム核酸増幅反応が、増幅産物を生成するためのテンプレートの供給源としてＤＢＳを使用して実行され、測定結果が、ポリヌクレオチド分析物の濃度または量を示す、実施形態１８に記載のコンピュータである。
実施形態２０は、測定結果および補正結果の両方が濃度単位で表される、実施形態１８または１９に記載のコンピュータである。
実施形態２１は、方程式が非線形方程式である、実施形態１８～２０のいずれか１つに記載のコンピュータである。
実施形態２２は、非線形方程式が、近似曲線を定義するために数学的カーブフィッティング手順で最適化された係数を含む、実施形態２１に記載のコンピュータである。
実施形態２３は、非線形方程式が４つの係数を含む、実施形態２２に記載のコンピュータである。
実施形態２４は、非一時的な形態が、コンピュータ可読メモリデバイス上への記憶を含む、実施形態１８～２３のいずれか１つに記載のコンピュータである。
実施形態２５は、流体血液試料が全血を含む、実施形態１８～２４のいずれか１つに記載のコンピュータである。
実施形態２６は、コンピュータによって実行されると、コンピュータに実施形態１８に記載の方法を行わせる命令を含む、コンピュータ可読媒体である。
実施形態２７は、試験試料中に存在し得るポリヌクレオチド分析物を定量化するためのシステムであって、温度制御されたインキュベータと、温度制御されたインキュベータと光通信する蛍光光度計であって、蛍光光度計が、時間またはサイクル数の関数として、温度制御されたインキュベータ内に収容される核酸増幅産物の産生を測定するように構成される、蛍光光度計と、蛍光光度計と通信するコンピュータであって、コンピュータが、（ａ）蛍光光度計による測定値を使用して測定結果を計算することと、（ｂ）方程式を解いて補正係数を決定することであって、方程式が、測定結果の関数として補正係数を指定する、補正係数を決定することと、（ｃ）測定結果に補正係数を掛けて補正結果を計算することと、（ｄ）補正結果を非一時的な形態で記録し、それによって試験試料に存在する標的ポリヌクレオチド分析物を定量化することと、をコンピュータに行わせるようにソフトウェア命令でプログラムされている、コンピュータと、を行わせるようにソフトウェア命令によってプログラムされたコンピュータと、を含む核酸分析器を含む、システムである。
実施形態２８は、温度制御されたインキュベータが一定の温度を維持するように構成される、実施形態２７に記載のシステムである。
実施形態２９は、温度制御されたインキュベータが温度サイクルのために構成される、実施形態２７に記載のシステムである。
実施形態３０は、蛍光光度計が複数の異なる波長の光を検出するように構成される、実施形態２７～２９のいずれか１つに記載のシステムである。
実施形態３１は、温度制御されたインキュベータ、蛍光光度計、およびコンピュータがすべて、核酸分析器の不可欠なコンポーネントである、実施形態２７～３０のいずれか１つに記載のシステムである。
実施形態３２は、測定結果が、ポリヌクレオチド分析物の濃度値を含む、実施形態２７～３１のいずれか１つに記載のシステムである。
実施形態３３は、乾燥されて乾燥試料を生成する体液試料中に存在する分析物を定量化する方法であって、（ａ）分析物の供給源として乾燥試料を使用して反応を実行し、測定結果を取得するステップであって、測定結果が、分析物の濃度または量を示す、ステップと、（ｂ）測定結果に補正係数を掛けて、ステップと、を含み、補正係数が、測定結果の関数として補正係数を指定する方程式の解であり、これにより、体液試料中に存在する分析物を定量化する、方法である。
実施形態３４は、ステップ（ｂ）の方程式が非線形方程式を含む、実施形態３３に記載の方法である。
実施形態３５は、非線形方程式が、近似曲線を定義するために数学的カーブフィッティング手順で最適化された係数を含む、実施形態３４に記載の方法である。
実施形態３６は、非線形方程式が４つの係数を含む、実施形態３５に記載の方法である。
実施形態３７は、分析物がポリヌクレオチド分析物であり、ステップ（ａ）が、ポリヌクレオチド分析物を増幅し、核酸増幅反応が起こっているときに増幅産物を検出する自動核酸分析器を用いて実行することを含む、実施形態３３～３６のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態３８は、ステップ（ｂ）の方程式が非線形方程式を含み、非線形方程式が、近似曲線を定義するために数学的カーブフィッティング手順で最適化された係数を含み、非線形方程式が、ステップ（ａ）で核酸増幅反応を実行するために使用された自動核酸分析器とは異なる自動核酸分析器から得られた結果を使用して作成される、実施形態３３または３７に記載の方法である。
実施形態３９は、ステップ（ａ）が、ポリヌクレオチド分析物を単離し、次いで、単離されたポリヌクレオチド分析物を増幅する自動核酸分析器を用いて実施することを含む、実施形態３７に記載の方法である。
実施形態４０は、自動核酸分析器が、核酸増幅反応が起こっているときに増幅産物の合成をさらに検出する、実施形態３９に記載の方法である。
実施形態４１は、測定結果が血漿試料中のポリヌクレオチド分析物の濃度を示す、実施形態３７、３９または４０のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態４２は、核酸増幅反応が等温核酸増幅反応である、実施形態３７～４１のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態４３は、等温核酸増幅反応が転写関連核酸増幅反応である、実施形態４２に記載の方法である。
実施形態４４は、転写関連核酸増幅反応が転写媒介性増幅（ＴＭＡ）反応を含む、実施形態４３に記載の方法である。
実施形態４５は、ポリヌクレオチド分析物がウイルスゲノムのセグメントを含む、実施形態３７～４４のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態４６は、ウイルスゲノムがＲＮＡを含む、実施形態４５に記載の方法である。
実施形態４７は、ポリヌクレオチド分析物がＨＩＶ－１ゲノムのセグメントを含む、実施形態３７～４６のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態４８は、体液試料は、全血試料、血漿試料、尿試料、および唾液試料からなる群から選択される、実施形態３３～４７のいずれか１つに記載の方法である。
（発明を実施するための形態）
序論および概要
本明細書に開示されるのは、乾燥体液試料を使用して得られた定量的結果を、乾燥試料を作成するために使用された液体試料について、濃度単位で測定された対応する結果に正確に変換するためのアプローチである。例示的な手順では、ＨＩＶ核酸はモデル分析物として役立った。優れた結果を達成するために、核酸の増幅および検出に使用されたケミストリーを変更する必要はない。これは、単一のアッセイケミストリーを使用して、広いダイナミックレンジにわたって液体試料または再構成された乾燥試料のいずれかを使用してポリヌクレオチド分析物を定量化することができることを意味する。乾燥血液スポットのサンプリングが、技術を説明するために使用された。
アッセイのケミストリーを変更するのではなく、数値の「補正係数」（以下、ＣＦ）乗数を使用して目的の結果を達成する。ＣＦを、分析物の供給源として再構成されたＤＢＳを使用して定量アッセイの出力された、または「測定」結果に乗算することができる。これにより、測定結果が異なる試料タイプの対応する濃度（例えば、コピー／ｍｌ）に変換される。例えば、再構成されたＤＢＳ試料を使用して得られた結果は、全血試料の対応する濃度に変換または調整され得る。したがって、単一のアッセイケミストリー（例えば、単一のタイプの増幅および検出反応混合物、または単一のタイプのアッセイキット）を、試料タイプ（例えば、全血、血漿、再構成されたＤＢＳなど）に関係なく増幅し定量化するために使用することができる。
本技術の重要な特徴は、ＣＦが決定される様式を含む。本技術の開発中に、必要なＣＦがアッセイの定量的ダイナミックレンジにわたって一定ではないことが発見された。代わりに、ＣＦは、液体試料を使用して較正された核酸分析器の出力の関数として変化する（例えば、出力を濃度単位で測定することができる場合）。再構成および試験中の乾燥試料（ＤＢＳなど）に存在する分析物の量が減少すると、正確な定量化に必要なＣＦが増加する。
いくつかの実施形態では、数値乗数として使用されるＣＦは、データの収集に適合された方程式を使用して計算される。いくつかの実施形態では、方程式は非線形方程式である。他の実施形態では、方程式は、１つ以上の線形方程式を含むことができる。適合された方程式を取得するために使用されるデータは、液体試料（血漿など）を処理するために較正された核酸分析器から導かれる定量的出力値の関数として計算された補正係数を表す。いくつかの実施形態では、１つの機器で使用されるＣＦを決定するために使用される適合された方程式は、その同じ機器で決定することができる。ただし、１つ以上の機器を使用して適合された方程式を決定し、次にその適合された方程式を別の機器（つまり、適合された方程式の決定に使用されなかった機器）で使用する方がより便利であり、そのため好ましい。例えば、適合された方程式は、アッセイキットの製造元が作成し、顧客またはエンドユーザが別の機器（「ローカル」機器と称されることもある）に転送して使用することができる。
いくつかの実施形態では、ＣＦは、複数の近似曲線または線から計算され、ＣＦ決定に適切な曲線または線は、ＣＦ乗数を適用する前の分析器の出力に依存する。この場合も、ＣＦは、再構成後に乾燥試料（ＤＢＳ試料など）を試験するときに存在することが示されている分析物の測定濃度または量の関数として選択される。次に、選択されたＣＦにその測定濃度を掛けて、分析物を定量化する調整済みの定量的結果を生成する。
定義
以下の用語は、異なる意味を有することが明示的に示されない限り、本明細書で指定された意味を有する。
「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」という用語は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。例えば、本明細書で使用される場合、「１つのポリヌクレオチド（ａ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」は、１つ以上のポリヌクレオチドを表すと理解される。したがって、「１つ（ａ）」（または「１つ（ａｎ）」）、「１つ以上の」、および「少なくとも１つの」という用語は、本明細書で互換的に使用され得る。
本明細書で使用される場合、「乾燥体液試料」は、流体の水成分が実質的に除去された、全血または他の血液生成物の試料などの体液の試料である。通常、体液は、水成分を除去する前に、固体マトリックス（例えば、濾紙、ガラス繊維フィルター、布、植毛綿棒、スポンジ材料など）に塗布される。
本明細書で使用される場合、「乾燥血液スポット」（ときには「ＤＢＳ」）は、分析物の存在または量について分析する前に乾燥される血液または血液生成物の試料を指す。好ましくは、血液の試料を固体マトリックスに適用し、次に乾燥させてＤＢＳを作成または生成する。いくつかの実施形態では、固体マトリックスは、紙フィルターまたはガラス繊維フィルターなどのフィルター、布、植毛綿棒、またはスポンジ材料である。好ましくは、ＤＢＳは乾燥した全血の試料を含む。ＤＢＳ試料を使用する試験に好ましい分析物には、ポリヌクレオチド分析物が含まれる。
本明細書で使用される場合、「再構成された」試料は、乾燥した生物学的試料（例えば、ＤＢＳ）を、乾燥した生物学的試料を溶解、液化、または再懸濁する液体（例えば、抽出溶液）と組み合わせた結果として生じる液体または流体試料である。いくつかの実施形態では、再構成された試料は、固体支持マトリックス（例えば、濾紙「カード」）上の乾燥血液スポットを、ｐＨ緩衝液および界面活性剤を含み得る抽出緩衝液と組み合わせまたは接触させることから生じる。したがって、乾燥血液スポットは、再構成された試料の分析物が検出に使用されるときに検出される分析物（例えば、ポリヌクレオチド分析物）の供給源として役立つことができる。いくつかの実施形態において、再構成された試料のポリヌクレオチド分析物を検出するための手順は、インビトロ核酸増幅手順を含み得る。
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡ、ＤＮＡのいずれか、またはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含有するキメラ分子を意味する。この用語は、ＲＮＡまたはＤＮＡのヌクレオチド類似体を含有する分子も含む。
本明細書で使用される場合、「試験試料」は、特定のポリヌクレオチド配列の存在について調査される任意の試料である。試験試料には、ヒト、動物、環境、または実験室由来または合成試料から得られたポリヌクレオチド含有材料が含まれる。好ましい試験試料には、体液試料が含まれる。全血、血漿、および血清は、試験試料の特に好ましい例である。他の試験試料には、唾液、尿などが含まれる。
本明細書で使用される場合、「分析物」は、検出および／または定量化されるべき化学的または生化学的種である。例えば、「ポリヌクレオチド分析物」は、試験手順で検出または定量化されるポリヌクレオチド（例えば、ＨＩＶ－１ポリヌクレオチドのセグメント）を指す。
本明細書で使用される場合、「核酸分析器」（または「ポリヌクレオチド分析器」）は、ポリヌクレオチド分析物を増幅、検出、および定量化する装置である。特定の好ましい核酸分析器は、温度制御されたインキュベータ（例えば、ブロック、プレート、またはチャンバー）、温度制御されたインキュベータの内容物と光通信する蛍光光度計、および関心のポリヌクレオチド分析物を定量化するための蛍光光度計によって収集されたデータを処理する１つ以上のコンピュータまたはプロセッサを含む。
「分析物ポリヌクレオチド標準」とは、既知量のポリヌクレオチド分析物またはその断片を含む組成物を意味する。例えば、ＨＩＶ－１分析物ポリヌクレオチド標準は、ＨＩＶ－１ゲノム、ＨＩＶ－１転写物、またはウイルスゲノムの一部分を表すインビトロで合成された転写物の既知の数のコピーを含み得る。「ＷＨＯ」標準（例えば、ＨＩＶ－１ＷＨＯ標準）は、世界保健機関によって提供される確立された濃度の分析物ポリヌクレオチド標準である。
「較正標準」とは、既知または所定量の分析物ポリヌクレオチド標準を、既知の一定量の内部キャリブレータポリヌクレオチドと組み合わせて含む組成物を意味する。２つの異なる較正標準には、異なる量のポリヌクレオチド分析物またはその断片を含めることができるが、同じ量の内部キャリブレータポリヌクレオチドが含まれるであろう。分析物ポリヌクレオチド標準のポリヌクレオチド分析物、および内部キャリブレータポリヌクレオチドは、例えば、異なるヌクレオチド塩基配列を有することによって、互いに区別可能である。試験機器（例えば、核酸分析器）は、機器が正確な結果を提供することを保証するために較正標準が使用されている場合に「較正された」と言われる。例えば、血漿試料を処理するときに正確な結果を提供するように機器を較正することができる。
「アンプリコン」（ときには「増幅産物」）は、増幅反応のポリヌクレオチド産物であり、ポリヌクレオチド分析物の標的ポリヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチドコピーまたは増幅産物の合成のためのテンプレートとして機能した。
「増幅」または「核酸増幅」または「ポリヌクレオチド増幅」などとは、標的ポリヌクレオチド配列またはその補体またはその断片の、ＲＮＡおよびＤＮＡ同等物を可能にする複数のコピーを得るための任意の既知の手順を意味する。「その断片」の増幅は、完全な標的領域未満の核酸配列またはその補体を含有する増幅された核酸（すなわち、ポリヌクレオチド）の産生を指す。そのような断片は、例えば、標的ポリヌクレオチドの内部位置にハイブリダイズし、そこから重合を開始する増幅オリゴヌクレオチドを使用することによって、標的核酸の一部分を増幅することによって生成され得る。
本明細書で使用される場合、「同時増幅」および「同時増幅すること」という用語およびそれらの変形は、異なる標的ポリヌクレオチド配列が単一の（すなわち、同じ）増幅反応で増幅されるプロセスを指す。例えば、ポリヌクレオチド分析物と無関係の内部キャリブレータポリヌクレオチドは、両方のポリヌクレオチドが単一のチューブで行われる反応で増幅される場合、および両方の増幅反応が少なくとも１つの試薬（例えば、デオキシリボヌクレオチド三リン酸、酵素、プライマーなど）を共有するときに、「同時増幅される」。
本明細書で使用される場合、「熱サイクル」は、反応混合物における温度の繰り返される変化（すなわち、温度の上昇または低下）を指す。熱サイクルを受けている試料は、ある温度から別の温度にシフトし、その温度で安定し、２番目の温度に移行し、または開始温度に戻る場合がある。温度サイクルは、関心の特定の化学反応を研究または完了するために必要な回数だけ繰り返すことができる。
「標的」または「標的核酸」または「標的ポリヌクレオチド」とは、増幅、検出および定量化される配列を含有するポリヌクレオチドを意味する。増幅される標的ポリヌクレオチド配列は、好ましくは、２つの反対に配置されたオリゴヌクレオチドの間に配置され、各オリゴヌクレオチドに相補的である標的ポリヌクレオチドの部分を含むであろう。
「標的核酸配列」または「標的配列」または「標的領域」、とは、一本鎖ポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列のすべてまたは一部を含む特定のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド配列、およびそれらに相補的なデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド配列を意味する。
「転写関連増幅」とは、ＲＮＡポリメラーゼを使用してポリヌクレオチドテンプレートから複数のＲＮＡ転写物を生成する任意のタイプのポリヌクレオチド増幅を意味する。従来、これらの増幅反応は、ＤＮＡポリメラーゼの活性によって伸長することができる３’末端を有する少なくとも１つのプライマーを用いる。「転写媒介性増幅」（ＴＭＡ）と呼ばれる転写関連増幅法の一例は、一般に、ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、リボヌクレオシド三リン酸、および標的ポリヌクレオチドに相補的なプロモーター含有オリゴヌクレオチドを用いる。ＴＭＡの変形は、Ｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，４３７，９９０号、Ｋａｃｉａｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，３９９，４９１号および同第５，５５４，５１６号、Ｋａｃｉａｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＴ Ｎｏ．ＷＯ９３／２２４６１、Ｇｉｎｇｅｒａｓ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＴ Ｎｏ．ＷＯ８８／０１３０２、Ｇｉｎｇｅｒａｓ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＴ Ｎｏ．ＷＯ８８／１０３１５、Ｍａｌｅｋ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，１３０，２３８号、Ｕｒｄｅａ ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，８６８，１０５号および同第５，１２４，２４６号、ＭｃＤｏｎｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＴ Ｎｏ．ＷＯ９４／０３４７２、およびＲｙｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＴ Ｎｏ．ＷＯ９５／０３４３０に詳細に開示されているように、当技術分野でよく知られている。米国特許第７，３７４，８８５号に開示されているように、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長することができる単一のプライマーのみを用いる他の転写関連増幅方法は、定義に特に包含され、本明細書に開示される方法に関連して使用するのに非常に好ましい。
本明細書で使用される場合、「オリゴヌクレオチド」または「オリゴマー」は、少なくとも２つ、一般的には約５個～約１００個の化学サブユニットのポリマー鎖であり、各サブユニットは、ヌクレオチド塩基部分、糖部分、およびサブユニットを線形空間配置に結合する連結部分を含む。一般的なヌクレオチド塩基部分は、グアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、およびウラシル（Ｕ）であるが、水素結合することができる他の希少なまたは修飾されたヌクレオチド塩基は当業者に周知である。オリゴヌクレオチドは、任意選択的に、糖部分、塩基部分、および骨格成分のいずれかの類似体を含み得る。本発明の好ましいオリゴヌクレオチドは、約１０～約１００残基のサイズ範囲に属する。オリゴヌクレオチドは、天然に存在する供給源から精製されてもよいが、好ましくは種々の周知の酵素的または化学的方法のいずれかを使用して合成される。
「増幅オリゴヌクレオチド」または「増幅オリゴマー」とは、標的ポリヌクレオチドまたはその補体にハイブリダイズし、ポリヌクレオチド増幅反応に関与するオリゴマーを意味する。増幅オリゴマーの例には、増幅プロセスの一部として伸長される３’末端を含むプライマーが含まれるが、ポリメラーゼによって伸長されない（例えば、３’ブロックオリゴマー）が、関与する、またはプライマーからの効率的な増幅を促進する可能性のあるオリゴマーも含まれる。増幅オリゴマーの好ましいサイズ範囲には、長さが約１０～約８０ヌクレオチド、または長さが１０～約６０ヌクレオチドであり、少なくとも約１０個の連続する塩基、より好ましくは、標的ポリヌクレオチド配列の領域に相補的な少なくとも１２個の連続する塩基を含むものが含まれる。（またはその相補鎖）。隣接する塩基は、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、および最も好ましくは約１００％、増幅オリゴマーが結合する標的配列に相補的である。増幅オリゴマーは、任意選択的に、修飾されたヌクレオチドまたは類似体、あるいは増幅反応に関与するが、標的ポリヌクレオチドに相補的でも含有されてもいない、さらなるヌクレオチドを含んでもよい。３’ブロックされているが、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズし、転写を開始するのに役立つ上流プロモーター配列を提供することができる増幅オリゴマーは、「プロモータープロバイダー」オリゴマーと称される。
「プライマー」は、テンプレートポリヌクレオチドにハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長することができる３’－ＯＨ末端を有する増幅オリゴマーである。プライマーの５’領域は、標的ポリヌクレオチド（例えば、プロモーター配列）に対して非相補的であり得、「プロモータープライマー」と称されるオリゴマーをもたらす。当業者は、プライマーとして機能することができる任意のオリゴマーを改変して５’プロモーター配列を含むことができ、したがってプロモータープライマーとして機能することができることを理解するであろう。同様に、いかなるプロモータープライマーも、プロモーター配列の除去、またはプロモーター配列なしの合成によって修飾されてもよく、それでもなおプライマーとして機能する。
本明細書で使用する場合、「プローブ」は、ハイブリダイゼーションを促進する条件下でポリヌクレオチド、好ましくは増幅されたポリヌクレオチドの標的配列に特異的にハイブリダイズして検出可能なハイブリッドを形成するオリゴヌクレオチドである。特定の好ましいプローブには、検出可能な標識（例えば、蛍光標識または化学発光標識）が含まれる。
本明細書で使用する場合、ポリヌクレオチド増幅の「時間依存的」モニタリングまたは「リアルタイム」でのポリヌクレオチド増幅モニタリングは、ポリヌクレオチド増幅反応において存在するアンプリコンの量が、反応時間またはサイクル数の関数として測定され、次いで、増幅反応が開始された時点で反応混合物中に存在したテンプレートの出発量を決定するために使用されるプロセスを指す。例えば、アンプリコンの量は、ＰＣＲなどの熱サイクルを含む増幅反応の個々の全サイクルを開始する前に測定され得る。あるいは、増幅サイクル間の移行を開始するのに物理的介入を必要としない等温増幅反応は、時間の関数として存在するアンプリコンの量に関する情報を得るために継続的にまたは一定の時間間隔でモニタリングされ得る。
本明細書で使用される場合、「成長曲線」は、時間またはサイクル数の関数としての反応における、アンプリコンなどの合成生成物の出現の特徴的なパターンを指す。実行曲線は、蛍光測定値（ｙ軸）などの産出量のある指標に対する時間またはサイクル数（ｘ軸）のいずれかの二次元プロットとして便利に表される。すべてではないが、一部の実行曲線は、シグモイド形状を有する。
本明細書で使用される場合、成長曲線の「ベースラインフェーズ」は、生成物（アンプリコンなど）の量が実質的に一定の速度で増加する曲線の初期フェーズを指し、この速度は、成長曲線の成長フェーズ（対数線形プロファイルを有する場合がある）の増加特性の速度よりも小さい。成長曲線のベースラインフェーズは通常、非常に浅い勾配を持ち、しばしばゼロに近づく。
本明細書で使用される場合、成長曲線の「成長フェーズ」は、測定可能な産物が時間とともに実質的に増加する曲線の部分を指す。典型的なポリヌクレオチド増幅反応におけるベースラインフェーズから成長フェーズへの移行は、時間とともに増加する速度でのアンプリコンの出現を特徴とする。成長曲線の成長フェーズからプラトーフェーズへの移行は、アンプリコンの出現速度が低下し始める変曲点で始まる。
本明細書で使用される場合、３フェーズ実行曲線の「プラトーフェーズ」とは、曲線の最終フェーズを指す。プラトーフェーズでは、測定可能な産物の形成速度は、一般に、対数線形フェーズでのアンプリコン産生の速度よりも大幅に低く、ゼロに近づくことさえある。
本明細書で使用される場合、「増幅の兆候」という句は、ポリヌクレオチド増幅反応における所定のレベルの進行を示すリアルタイム実行曲線の特徴を指す。このような兆候は、一般に、「成長曲線」と称されることもある実行曲線の数学的分析によって決定される。この曲線は、時間、サイクル数などの関数として反応混合物に存在するアンプリコンの量に関連する測定可能な強度の信号（蛍光読み取り値など）を表示する。
本明細書で使用される場合、「閾値ベースの増幅の兆候」は、成長曲線シグナルが任意の値または閾値と交差するときの時間またはサイクル数を測定する増幅の兆候を指す。ＴＴｉｍｅの決定は、閾値ベースの増幅の兆候の例であるが、ＴＡｒｃおよびＯＴＡｒｃの決定は、非閾値ベースの増幅の兆候の例である。
本明細書で使用される場合、「時間依存」増幅の兆候は、一般に、時間単位（例えば、分）で測定される増幅の兆候（例えば、反応進行パラメータ）を指す。時間依存の増幅の兆候は、明確な「サイクル」によって特徴付けられない等温ポリヌクレオチド増幅反応の進行をモニタリングするために一般的に使用される。ＴＴｉｍｅ、ＴＡｒｃ、ＯＴＡｒｃはすべて、時間に依存する増幅の兆候の例である。
本明細書で使用される場合、「内部キャリブレータ」（本明細書ではときには「ＩＣ」）は、インビトロポリヌクレオチド増幅反応で増幅され得、同じ反応で同時増幅されたポリヌクレオチド分析物と区別可能であるポリヌクレオチドである。「内部」とは、ポリヌクレオチド分析物またはその断片と同じ反応混合物内で、キャリブレータポリヌクレオチドが増幅、検出、および定量化されることを意味する。一般的に言えば、内部キャリブレータの量または濃度は、検量線の作成およびポリヌクレオチド分析物の定量化に使用される様々な反応で一定になる。好ましくは、一定量または濃度の内部キャリブレータは、既知の量の内部キャリブレータ、または既知の濃度の内部キャリブレータである。特定の好ましい実施形態において、内部キャリブレータおよびポリヌクレオチド分析物は、１つ以上の異なる増幅オリゴマーまたはプライマーを使用するインビトロポリヌクレオチド増幅反応において同時増幅される。例えば、以下に詳述する実施例で用いられる分析物および内部キャリブレータポリヌクレオチドは、共有されなかった増幅オリゴヌクレオチドを使用して増幅された。他の好ましい実施形態において、内部キャリブレータおよびポリヌクレオチド分析物は、１つ以上の同一の増幅オリゴマーまたはプライマーを使用するインビトロポリヌクレオチド増幅反応において同時増幅される。
本明細書で使用される場合、「の関数として」という句は、従属変数（すなわち、１つ以上の他の変数に依存する変数）と独立変数（すなわち、他の変数の値を考慮することなくその値を自由に選択し得る変数）との間の関係を表し、独立変数の各入力値は、従属変数の１つの出力値に正確に関連している。ｘ値（つまり、独立変数）の「関数として」ｙ値（つまり、従属変数）を関連付ける方程式の従来の表記法はｙ＝ｆ（ｘ）である。
本明細書で使用される場合、「コンピュータ」は、入力情報を受信および処理して、出力を生成することができる電子デバイスである。コンピュータは、スタンドアロンデバイス（例えば、パーソナルコンピュータ）であり得るか、または機器の統合されたコンポーネント（例えば、ポリヌクレオチド標的を増幅し、反応サイクル数または時間の関数として増幅産物の合成をモニタリングする核酸分析器）であり得る。この用語に特に含まれるのは、分析器機器内に常駐し、組み込みソフトウェア命令（「ファームウェア」と称されることもある）を収容する組み込まれたプロセッサである。
本明細書で使用される場合、方程式を「最適化する」または「フィッティングする」とは、数理モデリングまたは曲線フィッティング手順で一般的に行われているように、方程式において係数の数値を取得して、実験測定値に「フィットする」か、または測定値を近似する表現を求めるためのプロセスを指す。典型的には、最適化された方程式は、最適にフィッティングされた曲線を定義するであろう。
本明細書で使用される場合、「最適化された方程式」および「適合された方程式」という用語は、最適化手順の結果としての係数の固定数値を含む方程式への代替的な言及である。「近似」曲線は、方程式を最適化することから生じる。
「ローカル」とは、エンドユーザに関連することを意味する。例えば、ローカル機器はエンドユーザの機器を指す。ローカル較正プロットとは、エンドユーザによって、例えば、ローカル機器で増幅反応を行うことによって得られた結果を使用する較正プロットを指す。
「キット」とは、通常、互いに組み合わせて使用することを意図した、パッケージ化された材料の組み合わせを意味する。本発明によるキットは、「有形の」形態の指示または他の情報（例えば、印刷された情報、コンピュータ可読媒体に電子的に記録された、または数値を格納するためのバーコードなどの機械可読媒体に記録された）を含み得る。
「から本質的になる」とは、本発明の基本的な特徴および新規の特徴を実質的に変化させない追加の構成要素、組成物、または方法ステップが、本発明に含まれ得ることを意味する。本発明の基本的な特徴および新規の特徴に実質的な影響を及ぼすいかなる構成要素、組成物、または方法ステップも、この用語の適用外であろう。
ＨＩＶ－１ポリヌクレオチド分析物（横軸）の「観察」または「測定」濃度（コピー／ｍｌで測定）の関数として計算された補正係数（ＣＦ）値（縦軸）のプロットである。白丸のデータポイントは、再構成されたＤＢＳ試料からポリヌクレオチド分析物を増幅した手順で測定された様々な標的濃度で計算されたＣＦ値を表す。４－ＰＬ方程式を数学的に最適化することにより、収集されたデータポイントに実線の曲線が当てはめられている。
特定の実施形態の説明
現在開示されている技術は、モデルシステムとしてＨｏｌｏｇｉｃ、Ｉｎｃ．（Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）のＡｐｔｉｍａ（商標）ＨＩＶ－１ＱｕａｎｔＤｘアッセイを使用して実証された。このウイルス量モニタリングアッセイは、感度が高く、かつ特異的である両方であり、ＨＩＶ－１ＲＮＡの濃度の変化をモニタリングすることで抗レトロウイルス治療に対する応答を評価するために使用され得る。このアッセイは、完全に自動化されたＰａｎｔｈｅｒ（商標）システム（Ｈｏｌｏｇｉｃ、Ｉｎｃ．）で実行され得る、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ－１）ＲＮＡグループＭ、Ｎ、およびＯの検出と定量化のためのインビトロポリヌクレオチド増幅試験である。ウイルス量アッセイを実行するシステムは、５００μｌの試験試料を使用してコピー／ｍｌで測定されたウイルスの濃度を出力するように調整されている。例えば、モデルアッセイは、血漿中のＨＩＶ－１ＲＮＡの濃度の変化を測定することによって抗ウイルス治療の効果をモニタリングするために使用され得る。ＤＢＳ試料と血漿試料を使用して得られた定量的結果を、同じ較正と試薬、および標的の捕捉、増幅、検出のプロトコルを使用して正確に相関させることには利点がある。
モデルアッセイには、ポリヌクレオチド分析用の自動Ｐａｎｔｈｅｒシステム上の単一のチューブで行われる３つの主要なステップが含まれる。標的の捕捉、転写媒介性増幅による標的の増幅、および蛍光標識されたハイブリダイゼーションプローブ（トーチ）による増幅産物（アンプリコン）の検出である。標的の捕捉中、検体は界面活性剤で処理され、ウイルスエンベロープを可溶化し、タンパク質を変性させ、ウイルスゲノムＲＮＡを放出させる。捕捉オリゴヌクレオチドは、試験検体に存在する場合、ＨＩＶ－１ゲノムの高度に保存された領域にハイブリダイズする。次に、ハイブリダイズした標的は、磁場内で検体から分離された磁性微粒子に捕捉される。洗浄ステップにより、反応チューブから余分な成分が除去される。次に、標的増幅は、ＭＭＬＶ（モロニーマウス白血病ウイルス）逆転写酵素とＴ７ＲＮＡポリメラーゼの２つの酵素を利用する転写媒介ポリヌクレオチド増幅法であるＴＭＡを介して行われる。逆転写酵素は、標的配列のＤＮＡコピー（Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を含有する）を生成するために使用される。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡコピーテンプレートからＲＮＡアンプリコンの複数のコピーを生成する。モデルアッセイは、ＴＭＡ法を利用して、ＨＩＶ－１ ＲＮＡの２つの領域（ｐｏｌおよびＬＴＲ）を増幅する。これらの特定の領域の増幅は、ＨＩＶ－１グループＭ、Ｎ、およびＯを増幅するように設計された特定のプライマーを使用して達成される。プライマー設計とデュアル標的アプローチにより、ＨＩＶ－１の正確な検出と定量が保証される。検出は、標的の増幅中に存在し、リアルタイムでアンプリコンに特異的にハイブリダイズする一本鎖ポリヌクレオチドトーチを使用して達成される。各トーチは、フルオロフォアおよびクエンチャーを有する。トーチがアンプリコンにハイブリダイズしていない場合、クエンチャーは、フルオロフォアに近接しており、蛍光を抑制する。トーチがアンプリコンに結合すると、クエンチャーはフルオロフォアからさらに離れて移動し、光源によって励起されると特定の波長のシグナルを放出する。より多くのトーチがアンプリコンにハイブリダイズするにつれて、より高い蛍光シグナルが生成される。蛍光シグナルが指定された閾値に達するまでにかかる時間は、開始時のＨＩＶ－１濃度に比例する。各反応には、ＨＩＶ－１分析物と同時増幅する内部キャリブレータ／内部コントロール（ＩＣ）があり、検体の処理、増幅、および検出の変動を制御する。試料の濃度は、各反応のＨＩＶ－１およびＩＣシグナルを使用し、それらを較正情報と比較して、Ｐａｎｔｈｅｒシステムソフトウェアによって決定される。決定された濃度は、血漿試料中のＨＩＶ－１に対して較正されており、再構成されたＤＢＳ試料に対しては較正されていない。ここで決定された濃度は、代替的に「観察された」結果または「測定された」結果と称されることもある。
ＤＢＳには様々なタイプがあり、本明細書で説明する定量的手法を実行するために、各々を使用することができる。血液試料は、標準的なヒールスティックまたはフィンガースティック技術を使用して乳児から得ることができる。ここでは、乳児の皮膚表面を消毒してから、滅菌針またはランセットで刺す。次に、ＤＢＳ「カード」上の複数（例えば５）のスポットの各々に３～５滴の血液を追加して、円の表面全体が完全に満たされることを確実にする。フィンガースティック技術は、成人でもＤＢＳ試料を取得するために使用され得る。好都合に、全血は、ＤＢＳカードに塗布する前に、２℃～３０℃で最大２４時間保存され得る。この場合、例えば較正された２００μｌのピペットを使用して、７０μｌの保存された全血をＤＢＳカードのフィルターサークルの中心に塗布することができる。スポットされた血液試料は、どのように得られたものであれ、周囲温度で４～２４時間で乾燥させることができる。乾燥した試料が入っている個々のカードは、保管または輸送のために封筒（グラシン封筒など）に入れることができる。複数のグラシン封筒を、１つ以上の乾燥剤パックとともに再封可能なビニール袋にパッケージ化することができる。パッケージ化されていても、ＤＢＳ試料は、後続の処理のために周囲温度で保持または出荷され得る。
好ましいポリヌクレオチド増幅法
本技術に関連して有用なインビトロのポリヌクレオチド増幅方法の例として、限定するものではないが、転写媒介性増幅（ＴＭＡ）、単一プライマー核酸増幅、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、自家持続配列複製法（３ＳＲ）ＤＮＡリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）ならびに自己複製ポリヌクレオチド分子および複製酵素（ＭＤＶ－１ＲＮＡおよびＱ－β酵素等）を使用する増幅方法が挙げられる。これらの各種の増幅技術を実施する方法は、それぞれ、米国特許第５，３９９，４９１号、米国特許出願第１１／２１３，５１９号、欧州特許出願第ＥＰ０５２５８８２号、米国特許第４，９６５，１８８号、同第５，４５５，１６６号、Ｇｕａｔｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１８７４－１８７８（１９９０）、国際特許出願第８９／０９８３５号、米国特許第５，４７２，８４０号、およびＬｉｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９：５３－５８（１９９１）に見出すことができる。核酸増幅反応を行う方法を記載するこれらの文書の開示は、参照により本明細書に組み込まれる。したがって、補正係数調整技術を実証するために使用されたモデルシステムは、増幅反応メカニズムとしてＴＭＡを用いたが、代替の増幅反応メカニズムも同様に良好な結果で使用することができる。
好ましいリアルタイム定量的手法の例
一般的に言えば、リアルタイムのポリヌクレオチド増幅および検出手順は、増幅反応が起こっているときに増幅反応生成物の産生をモニタリングすることを含む。上に示したように、増幅産物を作成するために、任意の数の異なる増幅方法を使用することができる。いくつかの実施形態において、時間またはサイクル数の関数としての増幅産物の合成は、増幅反応混合物において生成された蛍光シグナルの検出によって示される。リアルタイム増幅反応を実施する機器を較正するのに有用な方法の例は、米国特許第９，９３２，６２８号および第９，９７６，１７５号に記載されており、これらの特許の開示は、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。これらの方法の成功は、リアルタイム手順の実行曲線を取得する様式とは無関係である。別の言い方をすれば、増幅の異なる兆候を使用して、増幅反応が増幅の進行の所望の閾値レベルをいつ達成したかを確立することができる。
ＣＦ調整をデータに適用する前に、種々の増幅の兆候を使用して分析物を定量化することができる。ポリヌクレオチド分析物を定量化するためのリアルタイム増幅および検出は、開示されるＣＦ調整技術に関連して使用するために非常に好ましく、各場合に良好な結果をもたらす代替のデータ処理手順の対象となる。例えば、当業者が精通しているであろう数学的およびコンピューティング技術を使用して、一次導関数の最大値の発生時刻、またはリアルタイム実行曲線の二次導関数の最大値の発生時刻を特定することができる。成長曲線のこれらの特色を決定するためのアプローチは、Ｗｉｔｔｗｅｒ ｅｔ ａｌ．，米国特許第６，５０３，７２０号に詳述されており、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。他の有用なアプローチは、実行曲線の導関数を計算すること、成長曲線の特徴を特定すること、次いで導関数の特徴に対応する閾値時間またはサイクル数を決定することを含む。そのような技術は、米国特許第６，７８３，９３４号に開示されており、その開示は、参照により組み込まれる。さらに他の有用な増幅の兆候には、「ＴＴｉｍｅ」および「ＴＡｒｃ」が含まれる。ＴＡｒｃ値を決定するための異なるアプローチでは、方向的に類似したベクトル（つまり、単に「ＴＡｒｃ」で特定される値をもたらす）および方向的に反対のベクトル（つまり、「ＯＴＡｒｃ」として特定される値をもたらす）を用いる。さらなる他の技術は、シグナル、好ましくは蛍光シグナルが静的閾値（例えば、所定の静的閾値）に等しい反応中の時間またはサイクル数としてサイクル閾値（例えば、「Ｃｔ」）を特定することを含む。
好ましいシステムおよび装置
本明細書に開示される方法は、コンピュータまたは同様の処理デバイス（以下、「コンピュータ」）を使用して都合よく実施される。異なる好ましい実施形態では、アルゴリズムを実行するためのソフトウェアまたは機械実行可能命令は、自立型コンピュータのメモリコンポーネント、またはモニタリングに使用されるデバイスにリンクされたコンピュータのメモリコンポーネントに、好ましくは時間、分析を受ける生成物の量の関数としてロードまたは保持することができる。非常に好ましい実施形態では、補正係数調整手順を実行するためのソフトウェアは、時間の関数として反応混合物中に存在するアンプリコンの量をモニタリングすることができるデバイスにリンクされているか、またはデバイスの不可欠な部分であるコンピュータのメモリコンポーネントに保持される。これには、自動核酸分析器の電子回路基板上の処理デバイスコンポーネント（例えば、組み込みソフトウェア）が含まれる。
いくつかの実施形態では、コンピュータは、有線または無線の手段のいずれかによって、蛍光信号を検出する蛍光光度計と通信することができ、蛍光光度計は、温度制御されたインキュベータ内に収容される１つ以上の反応容器で生成される蛍光シグナルをモニタリングするように配置または構成される。インキュベータは、温度制御されたブロック（例えば、１つ以上のチューブ、またはマルチウェルプレートを受け入れて収容するように構成された金属ブロック）、または１つ以上の反応容器を制御された温度条件にさらすチャンバーであり得る。
いくつかの実施形態では、リアルタイム増幅デバイスを制御するためのコントローラシステムおよび／またはリアルタイム増幅デバイスの検出システムのいずれかまたは両方を、事前にプログラムされた、またはユーザ入力の指示に従ってこれらの機器の動作を指示するように機能する適切にプログラムされたコンピュータに結合することができる。コンピュータは、好ましくは、これらの機器からデータおよび情報を受信し、この情報を解釈し、操作し、およびユーザに報告することができる。
いくつかの実施形態では、コンピュータはまた、パラメータフィールドのセットへのユーザ入力の形態で、または事前にプログラムされた命令の形態（例えば、種々の異なる特定の操作のために事前にプログラムされた）のいずれかで、ユーザ命令を受信するための適切なソフトウェアを含むことができる。次に、ソフトウェアは、所望の操作を実行するように、リアルタイム増幅コントローラの操作を指示するためにこれらの命令を適切な言語に変換する。好ましくは、コンピュータはまた、システム内に含まれる１つ以上のセンサ／検出器からデータを受信することができ、プログラミングに従ってデータを解釈する。システムは、好ましくは、検出器によって検出された、時間の関数としての関心のポリヌクレオチドの増幅されたコピーの量を表す成長曲線の特徴を、試験試料に存在する関心のポリヌクレオチドのコピーの数に相関させるソフトウェアを含む。
好ましくは、開示されたＣＦ決定および調整手順を実行するために使用されるコンピュータが、リアルタイムポリヌクレオチド増幅反応を実行および分析するための装置の不可欠なコンポーネントである場合、装置は、好ましくは、温度制御されたインキュベータ、シグナルを収集するための検出デバイス（例えば、蛍光光度計）、および信号を分析するための分析デバイス（例えば、コンピュータまたはプロセッサ）を含む。装置は、任意選択的に、取得または生成されたデータを表示するための出力デバイスをさらに含むことができる。分析デバイスは、当技術分野で知られている入力デバイスを介して温度制御されたインキュベータに接続され得、および／またはデータ表示のために当技術分野で知られている出力デバイスに接続され得る。一実施形態では、温度制御されたインキュベータは、温度サイクルが可能である。
一般的に言えば、開示された方法に関連して有用なリアルタイムポリヌクレオチド増幅を実行するための装置の様々なコンポーネントは、当業者が精通しているであろう従来のコンポーネントである。リアルタイムのポリヌクレオチド増幅を実行および分析するために使用される温度制御されたインキュベータは、複数の反応チューブ、または標準的な増幅反応チューブまたはマルチウェルのウェルの温度制御されたブロックに反応試料を保持することができる従来の設計のものであり得る。一態様では、検出システムは、１つ以上の蛍光標識からの光信号を検出するのに好適である。検出システムの出力（例えば、増幅反応中に生成されたものに対応する信号）は、データの保存および操作のためにコンピュータに供給することができる。一実施形態では、システムは、複数の異なるタイプの蛍光標識などの複数の異なるタイプの光信号を検出し、マイクロプレート蛍光リーダーの機能を有する。検出システムは、好ましくは、可視光レーザーまたは紫外線ランプまたはハロゲンランプである励起光源、励起光を個々の反応チューブに分配し反応チューブから蛍光を受けるためのマルチプレクサデバイス、励起光から蛍光を波長により分離するフィルタリング手段、および蛍光強度を測定するための検出手段を含む多重蛍光計である。好ましくは、温度制御されたインキュベータの検出システムは、フルオロフォア選択の柔軟性、高感度、および優れた信号対雑音比を可能にする広い検出範囲を提供する。検出システムによって受信された光信号は、一般に、プロセッサによって操作され得る信号に変換されて、プロセッサと通信しているユーザデバイスのディスプレイ上でユーザによって見られ得るデータを提供する。ユーザデバイスは、ユーザインターフェースを備え得るか、またはキーボードおよびビデオモニタを備える従来の市販のコンピュータシステムであり得る。ユーザデバイスで表示され得るデータの例には、増幅プロット、散布図、アセンブリ内のすべてのチューブまたは反応容器、および使用されるすべてのラベルの試料値スクリーン、光信号強度スクリーン（蛍光シグナル強度スクリーンなど）、最終結果、テキストレポートなどが含まれる。
コンピュータプログラム製品
本発明の範囲内に含まれるのは、データ処理方法を実行するために使用することができるソフトウェアベースの製品（例えば、コンピュータに様々な手順ステップを実行するように指示するためのソフトウェアの有形の実施形態）である。これらには、磁気メディア、光学メディア、「フラッシュ」メモリデバイス、コンピュータネットワークまたはクラウドストレージなどのコンピュータ可読メディアに保存されたソフトウェア命令が含まれる。同様に、本発明は、ポリヌクレオチドを増幅し、ポリヌクレオチド増幅産物を検出し、結果を処理して、試験試料中の標的の定量的結果を示すシステムまたは装置を包含する。装置の様々なコンポーネントは、好ましくは協調的に機能するが、コンポーネントが統合されたアセンブリの一部である必要はない（例えば、単一のシャーシ上で）。しかしながら、好ましい実施形態では、装置のコンポーネントは一緒に接続されている。「接続された」の意味には、有線および無線接続を介した接続が含まれる。
特に本発明の範囲に含まれるのは、ポリヌクレオチドを増幅し、サイクル数または時間の関数としてアンプリコン合成をモニタリングするデバイスにリンクされたコンピュータを含む装置またはシステムであり、コンピュータは、本明細書に開示される定量的アルゴリズムを実行するようにプログラムされる。本発明による例示的なシステムは、温度制御されたインキュベータ、および蛍光発光の少なくとも２つの波長をモニタリングおよび区別することができる蛍光光度計を含むであろう。これらの発光は、標的アンプリコン合成およびＩＣアンプリコン合成を示すために使用される場合がある。
本開示のコンピュータ実装またはソフトウェア実装の実施形態に関連して、結果は、「非一時的」形式で記録または保存することができ、記録されるデータ分析が行われたまたは実行されたときよりも後で参照するためにアクセスすることができる。例えば、計算結果は、紙に印刷するか、コンピュータ可読メモリデバイス（ハードドライブ、フラッシュメモリデバイス、クラウドストレージ内のファイルなど）に保存することにより、非一時的な形態で記録され得る。
カーブフィッティング手順
補正係数を決定するための曲線、プロット、または適合された方程式を作成する開示された方法に従って、関連する手順またはステップは、好ましくは、データセットに適合するように最適化された１つ以上の方程式を取得することを含む。データセットは、既知の量の液体試料中の分析物の量を決定するために較正された核酸分析器によって生成された結果の関数として計算されたＣＦ値を含む。これは、標準の数学的カーブフィッティング手法を各データセットに適用して、それに関連付けられた曲線を定義する適合された方程式を作成することにより実現され得る。いくつかの実施形態では、再構成されたＤＢＳ試料以外のタイプの試料（例えば、血漿試料）の定量的結果を提供するように較正された核酸分析器の出力から適切なＣＦを決定するために、１つ以上の線形方程式を使用することができる。他の実施形態では、カーブフィッティング手順で使用される方程式は、カーブフィッティング手順中に最適化または決定することができる、好ましくは２つ以上、より好ましくは３つ以上、より好ましくは４つ以上の係数を含む非線形方程式である。一部の非常に好ましい方程式には正確に４つの係数があるが、他の非常に好ましい方程式には正確に５つの係数がある。測定された増幅の兆候に合うように方程式を最適化するには、数式の最適値を見つけるためのＥＸＣＥＬアドインツールとして利用できるＳＯＬＶＥＲプログラム、およびＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｒｅｄｍｏｎｄ，ＷＡ）の方程式の解法など、市販のソフトウェアパッケージを使用して簡単に実行することができる。この手順によって生成される特定の曲線は、反応に入力されるポリヌクレオチド分析物のレベルの増加がＣＦ値の減少と相関するように形作られ得る。
カーブフィッティング手順では他の方程式を使用することができるが、以下で説明する方法では、次の形態の４パラメーターロジスティック（４－ＰＬ）方程式を用いた。
Figure 2023503946000002
 この式では、ＣＦ従属変数は、ポリヌクレオチド分析物の対数スケールで観測または測定された濃度（ｘ）の関数としての補正係数を表す。この場合も、「観察された」または「測定された」濃度は、試験試料中のＨＩＶ－１ポリヌクレオチド分析物を検出するために較正されたアッセイの定量的出力であるが、再構成されたＤＢＳ試料中の分析物を定量化するために較正される必要はない。標準的な手順で最適化することができる方程式の４つの係数は、ｂからｅとして識別される。「ｅｘｐ」定数は、自然対数のベースである（つまり、約２．７１８３）。当然のことながら、本発明の使用の成功は、特定の方程式の使用を必要としないことを理解されたい。
カーブフィッティングを実行するための代替方程式
特に、開示された手法を説明するために４－ＰＬ方程式が使用されたが、他の数学関数を手順で使用して、ＣＦ値対測定出力の傾向をシミュレートすることもできる。
当業者は、本明細書に開示される手順において多くのタイプの方程式が使用され得ることを理解するであろう。対称変換関数の例には、シグモイド、ガウシアン累積、ローレンツ累積、および累積対称ダブルシグモイドが含まれるが、これらに限定されない。非対称変換関数の例には、ロジスティック用量応答（Ｌｏｇｉｓｔｉｃ Ｄｏｓｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ）（ＬＤＲ）、対数正規累積（Ｌｏｇ Ｎｏｒｍａｌ Ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ）、極値累積（Ｅｘｔｒｅｍｅ Ｖａｌｕｅ Ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ）、パルス累積（Ｐｕｌｓｅ Ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ）、累乗項を含むパルス累積（Ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ ｗｉｔｈ Ｐｏｗｅｒ Ｔｅｒｍ）、Ｗｅｉｂｕｌｌ累積（Ｗｅｉｂｕｌｌ Ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ）、非対称シグモイド（Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ Ｓｉｇｍｏｉｄ）、非対称シグモイド逆非対称（Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ Ｓｉｇｍｏｉｄ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ）、カスケード生成（Ｃａｓｃａｄｅ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、および累積指数修正ガウシアン（Ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌｌｙ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｇａｕｓｓｉａｎ）が含まれるが、これらに限定されない。さらに、本明細書で詳しく説明するように、多次多項式、べき乗、指数関数、対数関数などの単純な線形および非線形方程式を使用して、後にベースライン係数を調整しながらリアルタイムデータをモデル化することができる。ベースライン係数を持つ速度関数も同じ様式で使用され得る。ベースライン係数を含む例示的な基本的な速度方程式には、以下が含まれるが、これらに限定されない：半次減衰および生成（Ｈａｌｆ Ｏｒｄｅｒ Ｄｅｃａｙ ａｎｄ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、一次減衰および生成（Ｆｉｒｓｔ Ｏｒｄｅｒ Ｄｅｃａｙ ａｎｄ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、二次減衰および生成（Ｓｅｃｏｎｄ Ｏｒｄｅｒ Ｄｅｃａｙ ａｎｄ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、二次減衰および生成（双曲線形態）（Ｓｅｃｏｎｄ Ｏｒｄｅｒ Ｄｅｃａｙ ａｎｄ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ （Ｈｙｐｅｒｂｏｌｉｃ Ｆｏｒｍｓ））、および三次減衰および生成（Ｔｈｉｒｄ Ｏｒｄｅｒ Ｄｅｃａｙ ａｎｄ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、可変次減衰と生成（Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｏｒｄｅｒ Ｄｅｃａｙ ａｎｄ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）。ベースライン係数を含む例示的な複素（ｃｏｍｐｌｅｘ）速度方程式には、以下が含まれるが、これらに限定されない：同時一次および二次減衰および生成（Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ Ｆｉｒｓｔ ａｎｄ Ｓｅｃｏｎｄ Ｏｒｄｅｒ Ｄｅｃａｙ ａｎｄ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、一次連続生成（Ｆｉｒｓｔ Ｏｒｄｅｒ Ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、二成分一次減衰（Ｔｗｏ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｆｉｒｓｔ Ｏｒｄｅｒ Ｄｅｃａｙ）、２つの一次独立減衰および生成（Ｔｗｏ Ｆｉｒｓｔ Ｏｒｄｅｒ Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｄｅｃａｙ ａｎｄ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、２つの二次独立減衰および生成（Ｔｗｏ Ｓｅｃｏｎｄ Ｏｒｄｅｒ Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｄｅｃａｙ ａｎｄ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、一次および二次の独立した減衰と生成（Ｆｉｒｓｔ ａｎｄ Ｓｅｃｏｎｄ Ｏｒｄｅｒ Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｄｅｃａｙ ａｎｄ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）。ベースライン係数を含む例示的な速度平衡方程式には、単純平衡（順方向および逆方向速度）、単純平衡（正味速度および平衡濃度）、複合平衡Ａ＝Ｂ＋Ｃ、および複合平衡Ａ＋Ｂ＝Ｃ＋Ｄが含まれるが、これらに限定されない。ベースライン係数を含む例示的な中間体（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ）速度方程式には、以下が含まれるが、これらに限定されない：一次中間体および平衡を伴う一次中間体（Ｆｉｒｓｔ Ｏｒｄｅｒ Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ａｎｄ Ｆｉｒｓｔ Ｏｒｄｅｒ Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｗｉｔｈ Ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ）。当業者は、開示されたＣＦ調整方法の成功が、カーブフィッティングステップを実行するための特定の方程式の使用に依存しないことを容易に理解するであろう。実際、開示されたＣＦ調整手順のためのカーブフィッティング手順において最適化することができる係数を有する任意の方程式が考えられる。
上記のすべての方程式タイプを使用して、開示された方法を実行することができる。これは、手順が成功するかどうかは、使用する特定の方程式ではなく、データを最適に適合させる能力に依存するためである。
実施例
上記のように、開示された技術は、乾燥試料を作成するために使用された開始試料中のポリヌクレオチド分析物の濃度と相関する信頼できる結果を提供することによって、乾燥体液試料を使用して実行されるアッセイの定量的能力を改善した。以下に示す例は、説明を意図したものであり、本開示を制限することを意図したものではない。
当業者は、アッセイにおける定量化の下限（「ＬＬＯＱ」）が、特定のレベルの精度および精度で定量化することができ、少なくとも９５％の反応性を有する分析物の最低濃度であることを理解するであろう。同様に、当業者は、アッセイにおける検出限界（「ＬＯＤ」）が、試験試料の少なくとも９５％で一貫して検出され得る分析物の最低濃度であることを理解するであろう。
アッセイのＬＬＯＱは、次の２つの要件が満たされる最小濃度である：（１）反応性は少なくとも９５％である必要がある（２）合計誤差（ＴＥ）は、アッセイ精度の仕様を満たす必要がある。現在のＣＦ調整技術を説明するために使用されるモデルウイルス量アッセイの場合、ＴＥ仕様はＬＬＯＱにおいて１ｌｏｇ以下の精度である。２つの異なる「合計誤差」評価アプローチを使用して、定量化の下限（ＬＬＯＱ）での異なる補正係数アプローチの影響を測定した。これらのアプローチは、Ｗｅｓｔｇａｒｄが推奨するＣＬＳＩ ＥＰ－１７－Ａ２ガイドライン、およびＬＬＯＱの計算のための二乗平均平方根（ＲＭＳ）モデルであった。手順には、分析物の供給源として再構成されたＤＢＳ試料を使用して、低ＨＩＶ濃度での定量化の精度と精度を決定することが含まれていた。定量化の「ゴールドスタンダード」として機能する、割り当てられた濃度値を持つ希釈されたＷＨＯ ＨＩＶ標準のストックを使用して、ＤＢＳ試料を作成した。より具体的には、様々な量のＨＩＶ ＷＨＯ標準ストックを全血の様々なアリコートにスパイクし、得られた希釈液を使用してＤＢＳ試料を調製した。
ＴＥは、上記のＷｅｓｔｇａｒｄモデルに従って次の式を使用して計算することができる。
バイアス＋（２×標準偏差）≦１ｌｏｇ （式２）
上記引用のＲＭＳモデルに従って、ＴＥは次の式を使用して計算することができる。
Figure 2023503946000003
これらの方程式の文脈では、「バイアス」は、期待される（つまり、実際の）アッセイ結果と「回復された」アッセイ結果の差である。本明細書で使用されるように、「回復された」結果は、ＣＦ乗数を使用して調整されており、したがって、ＣＦ乗数を使用して調整されていない測定結果とは異なる。簡単に言えば、回復された結果は、測定結果にＣＦを掛けることによって計算され得る。ＣＦ調整は、バイアスを減らし（精度を向上させ）、精度を向上させる（標準偏差を下げることにより）ことにより、低分析物濃度でのアッセイの定量化を向上させることができる。
ＤＢＳの定量化を改善するための最初のアプローチには、静的な（つまり一定の）ＣＦ値の乗数の使用が含まれていた。より具体的には、１５～３３の範囲で事前に選択された定数に、５００μｌの液体試料（血漿など）の定量的結果を提供するために較正されたリアルタイムポリヌクレオチド増幅アッセイの測定値を掛けた。１，０００コピー／ｍｌ以下の濃度で精度の目標を達成することが、ＨＩＶウイルス量を測定するアッセイにとって重要である。これは、抗レトロウイルス治療の有効性をモニタリングするためにＷＨＯが推奨する医学的決定ポイントが１，０００コピー／ｍｌであるためである。したがって、アッセイの臨床感度と特異性は、様々な静的ＣＦを使用して計算されたＤＢＳの回収されたアッセイ結果を使用して、１，０００コピー／ｍｌの医学的決定ポイントで計算された。２５～３３の範囲のＣＦを使用した場合、アッセイの感度や特異性に有意差は見られなかった。１つのアプローチによれば、再構成されたＤＢＳ試料（つまり、８７３コピー／ｍｌ）に対して決定されたＬＯＤを、同じアッセイケミストリーの血漿試料（つまり、３０コピー／ｍｌ）のＬＬＯＱで割って、乗数として使用する２９．１の一定のＣＦ値を確立した。したがって、再構成されたＤＢＳ試料の５００μｌアリコート（例えば、７０μｌの全血でスポットされ、その後乾燥され、その後１ｍｌの緩衝液で再構成されたフィルター）を使用して実施されたアッセイでは、３５コピー／ｍｌの「測定」または観察出力が得られ、２９．１を掛けると、１，０１９コピー／ｍｌの修正された（つまり「回復された」）結果が得られる。
実施例１は、再構成されたＤＢＳ試料を使用してＨＩＶ－１ポリヌクレオチドを定量化したリアルタイムポリヌクレオチド増幅アッセイを説明している。手順で使用された自動核酸分析器は、血漿試料のコピー／ｍｌで測定された結果を提供するように較正された。
実施例１
静的補正係数は、過剰な誤差を有するポリヌクレオチド分析物を定量化する
既知量のＨＩＶ－１ポリヌクレオチドを含むＤＢＳ試料は、当業者が精通しているであろう実験手順を使用して調製された。全血に、ＷＨＯ標準ウイルスストックに割り当てられた値からＨＩＶ－１をスパイクして、５０コピー／ｍｌから１，２００コピー／ｍｌの範囲の濃度の試料を生成した。様々なＨＩＶ濃度の全血試料（各７０μｌ）を個別に標準濾紙カードに塗布し、乾燥させた。カードから乾燥血液スポットを打ち抜き、各ＤＢＳを１ｍｌの緩衝化界面活性剤溶液（すなわち、ＤＢＳ抽出緩衝液）と組み合わせた。次に、各試料の半分（５００μｌ）を、Ｐａｎｔｈｅｒ自動核酸分析器（Ｈｏｌｏｇｉｃ，Ｉｎｃ．；Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）でのＡｐｔｉｍａ ＨＩＶ－１ Ｑｕａｎｔ Ｄｘリアルタイムウイルス量アッセイでの試験に使用した。プラットフォーム上で異なるＨＩＶ－１試薬ロットを使用して試験されたＤＢＳ試料の少なくとも９０個の複製物は、本質的に同等の結果をもたらした。表１は、試薬ロットの１つを使用して得られた例示的な結果を示している。列１と２は、ＤＢＳ試料の作成のために使用された全血中の分析物の実際のストック濃度を列挙している。列３（「反応性」）は、陽性の結果（すなわち、ＨＩＶ－１分析物が検出された）をもたらした試験のパーセンテージを示している。列４（「平均回収率」）は、静的ＣＦに自動分析器によって出力された分析物の測定濃度を掛けた平均化した積を示している。列５（「バイアス」）は、実際の分析物濃度から得られた平均回収濃度の結果の偏差の大きさを示している。列６（「標準偏差Ｌｏｇコピー」）は、列４に示されている回復された結果の標準偏差を示している。列７（「合計誤差（Ｗｅｓｔｇａｒｄ）」）は、標準のＷｅｓｔｇａｒｄ分析プロトコルに従って計算された結果を示している。列８（「合計誤差（ＲＭＳ）」）は、上記のＲＭＳ分析プロトコルに従って計算された結果を示している。
Figure 2023503946000004
表１に示されている結果は、決定に使用された方法に関係なく、合計誤差が許容可能な１．０閾値の目標を超えていることを示しており、望ましくない。示されていないが、２９．１の代わりに置き換えられた異なる定数ＣＦ値も、許容できない結果をもたらした。
実施例２は、特により低い分析物濃度において、アッセイのダイナミックレンジにわたって分析物を定量化するために単一の（すなわち、一定の）ＣＦを使用することができないことを示す実験結果を提示する。以下に示す結果から明らかなように、血漿試料を処理するために較正された核酸分析器によって出力されるより低い濃度値は、ＤＢＳ試料の調製に使用された正しい開始濃度を回復するためにより高いＣＦで乗算する必要があった。同様に、ＤＢＳ試料の調製に使用された正しい開始濃度を回復するには、出力値を高くしてＣＦを低くする必要があった。
実施例２
補正係数は、定量的リアルタイムアッセイのダイナミックレンジにわたって一定ではない
実施例１に本質的に記載された手順に従って、異なるレベルのＨＩＶ－１分析物をスパイクした全血を使用してＤＢＳ試料を調製した。ＤＢＳ試料を上記のように処理し、溶出したポリヌクレオチドを増幅し、自動Ｐａｎｔｈｅｒ核酸分析器（Ｈｏｌｏｇｉｃ、Ｉｎｃ．）でＡｐｔｉｍａ ＨＩＶ－１ Ｑｕａｎｔ Ｄｘリアルタイムウイルス量アッセイを使用して検出した。ＤＢＳの調製に使用された目標ＨＩＶ－１濃度は、アッセイで測定された濃度と比較され、式４に従って入力された各ＨＩＶ－１濃度に適切なＣＦが計算された。
Figure 2023503946000005
Figure 2023503946000006
表２に示した結果は、アッセイのダイナミックレンジにわたってポリヌクレオチド分析物を正しく定量化するために、単一、固定、または静的ＣＦ値を使用することができないことを明確に示した。表の最後の列は、一般に、ポリヌクレオチド分析物の濃度が低い試料を正しく定量化するために、より高いＣＦ値が必要になった傾向を示している。
実施例３は、試験中の液体試料（つまり、抽出されたＤＢＳ試料）とは異なる液体試料（例えば、血漿）に対して較正された測定結果の関数として変化するＣＦ値を使用する定量的アプローチの開発について説明する。このタイプの変数ＣＦは、「非静的」と称されることもある。
実施例３
非静的補正係数の開発
モデルリアルタイム定量アッセイの定量化範囲にわたる、様々な既知の分析物ＨＩＶ－１濃度を持つ全血ストックを使用して、合計７４７のＤＢＳ試料を調製した。完全を期すために、ＤＢＳ試料の作成に使用された既知の分析物ＨＩＶ－１濃度は、表２の最初の列に示されているものと同じとした。ＤＢＳ試料を１ｍｌの緩衝化界面活性剤溶液（すなわち、ＤＢＳ抽出緩衝液）で再構成し、得られた溶液５００μｌを、モデルリアルタイム定量アッセイによる核酸の単離と標的の増幅および検出に使用した。目標（すなわち、実際の）ＨＩＶ－１濃度をアッセイで測定された濃度と比較し、式４を使用して各ＨＩＶ－１濃度に適切なＣＦを計算した。次に、ＨＩＶ－１の測定された分析物濃度値を既知の入力分析物濃度と等しくなるように調整するために必要なＣＦ乗数を、測定されたコピー値の関数としてプロットした。次に、得られたデータを使用して、当業者が精通しているであろう標準的な数学的カーブフィッティング技術に従って非線形方程式を最適化した。この目的のために多くの異なる非線形方程式を使用することができるが、この手法は、近似された４－ＰＬ方程式を使用して図１に示されている。二相またはシグモイド曲線特性を示すデータを処理するために、４－ＰＬ方程式を使用したカーブフィッティングが頻繁に使用されることが認識される。
図１に示した結果は、ＣＦ値が静的または一定ではなく、血漿試料の処理用に較正された核酸分析器によって出力された測定濃度値の非線形関数として変化することを図を用いて確認した。間隔を空けた三日月形として表示されるデータポイントのクラスターは、単一レベルの入力量に対して計算されたＣＦ結果のばらつきを示している。別の言い方をすれば、実質的に同量のポリヌクレオチド分析物を含むＤＢＳ試料の収集（すなわち、希釈された分析物の単一のストックを使用して調製された乾燥血液スポット）は、自然に一連のＣＦ値をもたらした。図１に近似曲線として示される最適化された４－ＰＬ方程式（つまり、方程式１）の係数は、次のとおりである。ｂ＝３．７０５１７８、ｃ＝４７．２１２７９、ｄ＝４８６．６６５７およびｅ＝０．５０６８８９。特に、次の例に示すように、この場合のデータがシグモイド形状に特に適合していなかったという事実は、４－ＰＬ方程式の有用性を妨げなかった。
実施例４は、近似された非線形曲線によって決定されたＣＦ値の使用を示している。より具体的には、決定されたＣＦ値に、リアルタイム核酸分析器から出力された測定された定量的結果（コピー／ｍｌで測定）を掛けて、乾燥血液スポットを調製するために使用された液体試料中の分析物濃度を示した。
実施例４
非線形カーブフィットの改善した分析物の定量化から計算された補正係数
実施例１に本質的に記載された手順に従って、異なるレベルのＨＩＶ－１分析物をスパイクした全血を使用してＤＢＳ試料を調製した。ＤＢＳ試料を上記のように処理し、溶出したポリヌクレオチドを増幅し、Ｐａｎｔｈｅｒ自動核酸分析器でＡｐｔｉｍａ ＨＩＶ－１ Ｑｕａｎｔ Ｄｘリアルタイムウイルス量アッセイを使用して検出した。出力された（つまり、測定された）定量的結果に、図１に示す近似曲線から取得したＣＦ値を掛けた。より具体的には、図に示す近似曲線の方程式を解き、横軸に出力された定量的結果を方程式の独立変数（ｘ値）として使用してＣＦ値を求めた。次に、決定されたＣＦ値に、同じ出力された定量的結果（つまり、ｘ値）を掛けて、「回復した」（つまり、調整された）濃度を計算した。結果を表３に示す。
Figure 2023503946000007
表３に示した結果により、フィッティングされた非線形方程式から計算されたＣＦを使用すると、アッセイの定量的能力が大幅に向上することが確認された。表の最後の２列に示されているように、表１に示されている結果と比較すると、ＴＥ値は大幅に減少している。別の言い方をすれば、フィッティングされた非線形方程式から計算されたＣＦを使用すると、固定値（ＣＦ＝２９．１）を用いる同様のプロセスと比較して大幅な改善が得られた。この実施例におけるアッセイのＬＬＯＱは８１３コピー／ｍｌ（すなわち、２．９１Ｌｏｇコピー／ｍｌ）であった。３つの異なる試薬ロットを使用して得られたすべての結果の中で、図１に示す近似曲線から取得した計算ＣＦ値を使用して決定された最高のＬＬＯＱは、８８３コピー／ｍｌ（つまり、２．９５Ｌｏｇコピー／ｍｌ）であった。
実施例５
補正係数方程式の使用はアッセイを改善する
精度および正確度
本明細書に開示される手順を使用して、９００コピー／ｍｌ、１，０００コピー／ｍｌ、または１，２００コピー／ｍｌでＨＩＶ－１分析物をスパイクした全血ストックからＤＢＳ試料を調製した。試料から溶出されたポリヌクレオチドは、Ｐａｎｔｈｅｒ自動核酸分析器でＡｐｔｉｍａ ＨＩＶ－１ Ｑｕａｎｔ ＤＸリアルタイムウイルス量アッセイを使用して増幅された。報告された結果は、医学的に関連する決定点（１，０００コピー／ｍｌ）付近のパフォーマンスを分析することを意図して、我々の研究所で実行された手順を使用して得られた。３つの異なる試薬ロットを使用して得られた平均結果を表４に示す。
Figure 2023503946000008
表４に示す結果は、非線形方程式から計算されたＣＦに、血漿試料のコピー／ｍｌで測定された結果を掛けると、有利なことに、より高い正確度での定量的割り当てでより高い精度が得られることを示している。表の列１と２は、ＤＢＳ試料の作成するために使用されたストック試料のＨＩＶ－１標的濃度を示している。列３と４は、ＣＦ（列３の場合は２９．１、列４の場合は図１の近似曲線からの式を使用して計算された値）に、ＤＢＳ試料ではなく、血漿試料を定量化するために較正されていたモデルウイルス量アッセイの出力結果を掛けることにより決定された調製されたＨＩＶ濃度を示す。列２の下に表示された値と、列３および４の下に表示された値の違いは、異なる補正係数アプローチを用いるアッセイの精度を反映している。いずれの場合も、静的ＣＦの代わりにＣＦ方程式を使用した場合、差の大きさはより小さかった。これらのより小さな違いは、より正確な定量化を示している。列５と６は、精度の測定値（つまり、複製物間の測定濃度の標準偏差）を示している。繰り返しになるが、静的ＣＦの代わりにＣＦ方程式を使用した場合、いずれの場合も標準偏差はより低くなった。これは、ＣＦ方程式の使用が、定量的結果のより高い精度と関連していることを示した。
実施例５は、図１に示す近似曲線の式を使用して計算されたＣＦ乗数を用いることにより、ＨＩＶ－１に対する１，０００コピー／ｍｌの医学的決定点でより高い臨床感度をもたらす改善されたアッセイ定量化がどのように達成されたかを示す臨床データを示している。特に、近似曲線を取得するために使用されたデータは、実施例で処理されたものと同じ臨床データではなかった。これは、どのように１つのデータセットを使用して近似曲線（またはその方程式）を作成し、次いで、ＣＦ値を決定し、別のデータセット（例えば、アッセイを実行するために異なる機器を使用して取得したデータセット）を処理するために使用することができることをさらに示した。
実施例５
ＷＨＯが推奨するＨＩＶ－１ウイルス量モニタリングの１，０００コピー／ｍｌの医学的決定点での臨床成績の改善
血漿とＤＢＳのペアの検体は、抗レトロウイルス療法を受けているＨＩＶ－１陽性患者から収集された。血漿検体について２つの複製物を試験し、本明細書で説明する手順を使用して得られたウイルス量の結果を平均して、参照として使用した。各患者からの約５つの再構成されたＤＢＳ試料も試験され、測定された定量的結果に静的ＣＦ（つまり、２９．１）を掛けるか、図１に示す近似曲線の非線形方程式を使用して計算されたＣＦを掛けて、回復した濃度値を求めた。次に、結果を、１，０００コピー／ｍｌの医学的に関連する決定点で血漿参照標準と比較した。この研究の結果の９０％は、血漿ウイルス量が１０，０００コピー／ｍｌ未満であり、このデータセットは約１，０００コピー／ｍｌのＨＩＶの臨床成績の評価に理想的であることに注意されたい。
表５および６に示されている結果に示されているように、１，０００コピー／ｍｌでのアッセイ感度は、静的値と比較して非線形方程式からＣＦを決定した場合、７９．８３％から９０．５６％に向上した。あるＣＦ値から別のＣＦ値への変更は、特異性に重大な悪影響を及ぼさなかった。これは、２９．１の静的ＣＦを使用して得られた９４．３０％の特異性と、ＣＦ方程式を使用して得られた９１．３６％の特異性から明らかであろう。これらの後者の値の間の密接な対応は、特異性への影響が最小限であることを示した。
Figure 2023503946000009
Figure 2023503946000010
本開示が、特徴の様々な組み合わせおよび部分的な組み合わせを含むある特定の説明的な実施形態を参照してかなり詳細に説明および図示されているが、当業者であれば、本開示の範囲内に包含される他の実施形態ならびにその変形および修正を容易に理解するであろう。さらに、かかる実施形態、組み合わせ、および部分的な組み合わせの説明は、本開示が特許請求の範囲に明示的に列挙されるもの以外の特徴または特徴の組み合わせを必要とすることを伝えることを意図するものではない。したがって、本開示は、以下の番号付けされた実施形態の趣旨および範囲内に包含されるすべての修正および変形を含むとみなされる。
本開示の種々の実施形態が詳細に図示および記載されたが、本開示または添付の請求の範囲から逸脱しない範囲で様々な改変がなされ得ることが当業者にとって容易に明らかとなるであろう。

Claims (48)

  1. 乾燥されて乾燥血液スポット（ＤＢＳ）を生成する流体血液試料に存在するポリヌクレオチド分析物を定量化する方法であって、
    （ａ）前記ＤＢＳをテンプレートの供給源として使用して核酸増幅反応を実行して、増幅産物を生成し、測定結果を取得するステップであって、前記測定結果が、前記ポリヌクレオチド分析物の濃度または量を示す、ステップと、
    （ｂ）前記測定結果に補正係数を掛けて、補正結果を得るステップと、を含み、
    前記補正係数が、前記測定結果の関数として前記補正係数を指定する方程式の解であり、
    それによって、前記流体血液試料に存在する前記ポリヌクレオチド分析物を定量化する、方法。
  2. 乾燥血液スポット（ＤＢＳ）を作成した流体血液試料に存在するポリヌクレオチド分析物を定量化する方法であって、
    （ａ）前記ＤＢＳをテンプレートの供給源として使用して核酸増幅反応を実行して、増幅産物を生成し、測定結果を取得するステップであって、前記測定結果が前記ポリヌクレオチド分析物の濃度または量を示す、ステップと、
    （ｂ）方程式を解いて補正係数を決定するステップであって、
    前記方程式が、前記測定結果の関数として前記補正係数を指定する、ステップと、
    （ｃ）前記測定結果に前記補正係数を掛けて、補正結果を得るステップと、を含み、
    それによって、前記流体血液試料に存在する前記ポリヌクレオチド分析物を定量化する、方法。
  3. ステップ（ｂ）の前記方程式が非線形方程式を含む、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記非線形方程式が、近似曲線を定義するために数学的カーブフィッティング手順で最適化された係数を含む、請求項３に記載の方法。
  5. 前記非線形方程式が４つの係数を含む、請求項４に記載の方法。
  6. ステップ（ａ）が、前記ポリヌクレオチド分析物を増幅し、前記核酸増幅反応が起こっているときに増幅産物を検出する自動核酸分析器を用いて実施することを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. ステップ（ｂ）の前記方程式が、ステップ（ａ）の前記核酸増幅反応を実施するために使用された自動核酸分析器とは異なる前記自動核酸分析器から得られた結果を使用して作成された非線形方程式である、請求項６に記載の方法。
  8. ステップ（ａ）が、前記ポリヌクレオチド分析物を単離し、次いで前記単離されたポリヌクレオチド分析物を増幅する自動核酸分析器を用いて実施することを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記自動核酸分析器は、前記核酸増幅反応が起こっているときに増幅産物の合成をさらに検出する、請求項８に記載の方法。
  10. 前記測定結果が血漿試料中の前記ポリヌクレオチド分析物の濃度を示す、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記核酸増幅反応が等温核酸増幅反応である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記等温核酸増幅反応が、転写関連核酸増幅反応である、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記転写関連核酸増幅反応が、転写媒介性増幅（ＴＭＡ）反応を含む、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記ポリヌクレオチド分析物がウイルスゲノムのセグメントを含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記ウイルスゲノムがＲＮＡを含む、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記ポリヌクレオチド分析物がＨＩＶ－１ゲノムのセグメントを含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記流体血液試料が全血を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 乾燥されて乾燥血液スポット（ＤＢＳ）を生成する流体血液試料に存在するポリヌクレオチド分析物を定量化するためのソフトウェア命令でプログラムされたコンピュータであって、前記ソフトウェア命令が、前記コンピュータによって実行されると、前記コンピュータに、
    （ａ）測定結果を受け取ることと、
    （ｂ）方程式を解いて、補正係数を決定することであって、
    前記方程式が、前記測定結果の関数として前記補正係数を指定する、決定することと、
    （ｃ）前記測定結果に前記補正係数を掛けて、補正結果を計算することと、
    （ｄ）前記補正結果を非一時的な形態で記録し、それによって前記ポリヌクレオチド分析物を定量化することと、を行わせる、コンピュータ。
  19. 前記測定結果が、リアルタイム核酸増幅反応の結果から決定され、
    前記リアルタイム核酸増幅反応が、増幅産物を生成するためのテンプレートの供給源として前記ＤＢＳを使用して行われ、
    前記測定結果が、前記ポリヌクレオチド分析物の濃度または量を示す、請求項１８に記載のコンピュータ。
  20. 前記測定結果および前記補正結果の両方が濃度単位で表される、請求項１８または１９に記載のコンピュータ。
  21. 前記方程式が非線形方程式である、請求項１８～２０のいずれか一項に記載のコンピュータ。
  22. 前記非線形方程式が、近似曲線を定義するために数学的カーブフィッティング手順で最適化された係数を含む、請求項２１に記載のコンピュータ。
  23. 前記非線形方程式が４つの係数を含む、請求項２２に記載のコンピュータ。
  24. 前記非一時的な形態が、コンピュータ可読メモリデバイス上への記憶を含む、請求項１８～２３のいずれか一項に記載のコンピュータ。
  25. 前記流体血液試料が全血を含む、請求項１８～２４のいずれか一項に記載のコンピュータ。
  26. コンピュータによって実行されると、前記コンピュータに請求項１８に記載の方法を行わせる命令を含む、コンピュータ可読記憶媒体。
  27. 試験試料に存在し得るポリヌクレオチド分析物を定量化するためのシステムであって、
    温度制御されたインキュベータと、
    前記温度制御されたインキュベータと光通信する蛍光光度計であって、
    前記蛍光光度計が、時間またはサイクル数の関数として前記温度制御されたインキュベータに収容された核酸増幅産物の産生を測定するように構成されている、蛍光光度計と、
    前記蛍光光度計と通信するコンピュータであって、
    前記コンピュータが、
    （ａ）前記蛍光光度計による測定値を使用して測定結果を計算することと、
    （ｂ）方程式を解いて、補正係数を決定することであって、
    前記方程式が、前記測定結果の関数として前記補正係数を指定する、決定することと、
    （ｃ）前記測定結果に前記補正係数を掛けて、補正結果を計算することと、
    （ｄ）前記補正結果を非一時的な形態で記録し、それによって前記試験試料に存在する前記標的ポリヌクレオチド分析物を定量化することと、を前記コンピュータに行わせるようにソフトウェア命令でプログラムされているコンピュータと、を含む核酸分析器を含む、システム。
  28. 前記温度制御されたインキュベータが一定の温度を維持するように構成されている、請求項２７に記載のシステム。
  29. 前記温度制御されたインキュベータが温度サイクル用に構成されている、請求項２７に記載のシステム。
  30. 前記蛍光光度計が、複数の異なる波長の光を検出するように構成されている、請求項２７～２９のいずれか一項に記載のシステム。
  31. 前記温度制御されたインキュベータ、前記蛍光光度計、および前記コンピュータがすべて前記核酸分析器の不可欠なコンポーネントである、請求項２７～３０のいずれか一項に記載のシステム。
  32. 前記測定結果が前記ポリヌクレオチド分析物の濃度値を含む、請求項２７～３１のいずれか一項に記載のシステム。
  33. 乾燥されて乾燥試料を生成する体液試料に存在する分析物を定量化する方法であって、
    （ａ）分析物の供給源として前記乾燥試料を使用して反応を実行して、測定結果を取得するステップであって、前記測定結果が、前記分析物の濃度または量を示す、ステップと、
    （ｂ）前記測定結果に補正係数を掛けて、補正結果を得るステップと、を含み、
    前記補正係数が、前記測定結果の関数として前記補正係数を指定する方程式の解であり、
    それによって、前記体液試料に存在する前記分析物を定量化する、方法。
  34. ステップ（ｂ）の前記方程式が非線形方程式を含む、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記非線形方程式が、近似曲線を定義するために数学的カーブフィッティング手順で最適化された係数を含む、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記非線形方程式が４つの係数を含む、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記分析物がポリヌクレオチド分析物であり、ステップ（ａ）が、前記ポリヌクレオチド分析物を増幅し、核酸増幅反応が起こっているときに増幅産物を検出する自動核酸分析器を用いて実行することを含む、請求項３３～３６のいずれか一項に記載の方法。
  38. ステップ（ｂ）の前記方程式が非線形方程式を含み、前記非線形方程式が、近似曲線を定義するために数学的カーブフィッティング手順で最適化された係数を含み、前記非線形方程式が、ステップ（ａ）で前記核酸増幅反応を実行するために使用された自動核酸分析器とは異なる前記自動核酸分析器から得られた結果を使用して作成される、請求項３３または３７に記載の方法。
  39. ステップ（ａ）が、前記ポリヌクレオチド分析物を単離し、次いで、前記単離されたポリヌクレオチド分析物を増幅する自動核酸分析物を用いて実施することを含む、請求項３７に記載の方法。
  40. 前記自動核酸分析器は、前記核酸増幅反応が起こっているときに増幅産物の合成をさらに検出する、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記測定結果が、血漿試料中の前記ポリヌクレオチド分析物の濃度を示す、請求項３７、３９または４０のいずれか一項に記載の方法。
  42. 前記核酸増幅反応が等温核酸増幅反応である、請求項３７～４１のいずれか一項に記載の方法。
  43. 前記等温核酸増幅反応が転写関連核酸増幅反応である、請求項４２に記載の方法。
  44. 前記転写関連核酸増幅反応が転写媒介性増幅（ＴＭＡ）反応を含む、請求項４３に記載の方法。
  45. 前記ポリヌクレオチド分析物がウイルスゲノムのセグメントを含む、請求項３７～４４のいずれか一項に記載の方法。
  46. 前記ウイルスゲノムがＲＮＡを含む、請求項４５に記載の方法。
  47. 前記ポリヌクレオチド分析物がＨＩＶ－１ゲノムのセグメントを含む、請求項３７～４６のいずれか一項に記載の方法。
  48. 前記体液試料が、全血試料、血漿試料、尿試料、および唾液試料からなる群から選択される、請求項３３～４７のいずれか一項に記載の方法。
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