JP5071987B2 - パラメトリック較正方法 - Google Patents
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Description
本願は、米国仮特許出願第60/737,334号(2005年11月14日出願)に基づく利益を主張する。この先の出願の開示全体は、本明細書によって参考として援用される。
本発明は、生命工学の分野に関する。より詳しくは、本発明は、核酸増幅技術を用いる分析物ポリヌクレオチドの定量化に関し、さらにより詳しくは、分析物ポリヌクレオチドと同時に増幅する内部標準物質の使用に関する。
インビトロ核酸増幅の動態解析を含む方法は、分析物ポリヌクレオチドを定量化するための重要なツールとなってきた。「リアルタイム」増幅手順と呼ばれることもあるこれらの手順では、核酸増幅反応混合物中に存在するアンプリコンの量を、増幅手順の過程にわたって時間の関数としてモニタリングする。完全に自動化されたリアルタイム核酸アッセイには、反応の間に得られた時間依存性データを解析できる機械が実行可能なアルゴリズムが必要である。これに関連して、観察される増幅結果をもたらす核酸の量または濃度を正確に出力するデータ処理アルゴリズムが必要である。
本発明の第1の態様は、試験サンプルに含まれる分析物ポリヌクレオチドを定量化するためのパラメトリック較正曲線を作成する方法に関する。この方法によれば、まず、各々、一定量の核酸標準物質と既知出発量の分析物ポリヌクレオチド標準とを含む複数の標準サンプルを形成する工程がある。次に、複数の標準サンプルの各々について、核酸標準物質と分析物ポリヌクレオチド標準とをインビトロ核酸増幅反応において同時に増幅させる工程がある。次に、同時に増幅させる工程の各インビトロ核酸増幅反応において同時に増幅された核酸標準物質および分析物ポリヌクレオチド標準の増幅の兆候を決定する工程がある。これによって、既知出発量の分析物ポリヌクレオチド標準の関数としての、核酸標準物質の決定された増幅の兆候の収集物と、既知出発量の分析物ポリヌクレオチド標準の関数としての、分析物ポリヌクレオチド標準の決定された増幅の兆候の収集物とが得られる。次に、第1の曲線を、既知出発量の分析物ポリヌクレオチド標準の関数としての、核酸標準物質の決定された増幅の兆候の収集物と適合するよう第1のパラメトリック方程式を最適化し、これにより第1の適合された方程式を得る工程がある。次に、第2の曲線を、既知出発量の分析物ポリヌクレオチド標準の関数としての、分析物ポリヌクレオチド標準の決定された増幅の兆候の収集物と適合するよう第2のパラメトリック方程式を最適化し、これにより第2の適合された方程式を得る工程がある。次に、既知出発量の分析物ポリヌクレオチド標準の増分値で、第1および第2の適合された方程式を解き、(a)既知出発量の分析物ポリヌクレオチド標準の関数としての、核酸標準物質の適合された増幅の兆候と、(b)既知出発量の分析物ポリヌクレオチド標準の関数としての、分析物ポリヌクレオチド標準の適合された増幅の兆候とを得る工程がある。最後に、(a)第1の次元に、既知出発量の分析物ポリヌクレオチド標準の関数として、分析物ポリヌクレオチド標準の適合された増幅の兆候、(b)第2の次元に、既知出発量の分析物ポリヌクレオチド標準の関数として、核酸標準物質の適合された増幅の兆候、および(c)第3の次元に既知出発量の分析物ポリヌクレオチド標準の関数を関連づけることによって三次元パラメトリック較正曲線を作成する工程がある。好ましい実施形態では、発明の方法は、第1および第2の次元によって規定される測定面上に三次元パラメトリック較正曲線を射影し、それによって測定面での2次元較正曲線射影を作製する工程をさらに含む。この場合には、同時に増幅させる工程は、第1のセットの増幅オリゴヌクレオチドを用いて核酸標準物質を増幅する手順と、第2のセットの増幅オリゴヌクレオチドを用いて分析物ポリヌクレオチド標準を増幅する手順とを含み得る。この場合、第1および第2のセットの増幅オリゴヌクレオチドは、互いに異なっていることが好ましい。あるいは、増幅の兆候を決定する工程は、増幅の閾値に基づいた兆候を決定することを含み得る。別の代替法では、増幅の兆候を決定する工程は増幅の閾値に基づいた兆候を決定することを含まない。さらに別の代替法では、第1および第2の適合された方程式の各々は、4つの係数を有する。発明の方法の別の好ましい実施形態では、同時に増幅させる工程におけるインビトロ核酸増幅反応は、等温インビトロ核酸増幅反応である。例えば、等温インビトロ核酸増幅反応は、転写関連増幅反応であり得る。異なる好ましい実施形態では、発明の方法が、測定面上に三次元パラメトリック較正曲線を射影する工程を含む場合には、(a)試験サンプルと一定量の核酸標準物質とを含む試験反応混合物を形成する工程、(b)インビトロ核酸試験増幅反応において、試験反応混合物中に含まれる核酸標準物質と任意の分析物ポリヌクレオチドとを同時に増幅する工程、および(c)インビトロ核酸試験増幅反応において同時に増幅された、核酸標準物質および分析物ポリヌクレオチドの増幅の兆候を決定する工程がさらに含まれる。試験サンプル中に含まれる分析物ポリヌクレオチドを定量化するさらなる工程があることがより好ましい。定量化工程が、インビトロ核酸試験増幅反応において同時に増幅された核酸標準物質および分析物ポリヌクレオチドの決定された増幅の兆候を、測定面における二次元較正曲線射影と比較することを含むことがさらにより好ましい。あるいは、定量化工程は、まず、測定面において、インビトロ核酸試験増幅反応において同時に増幅された核酸標準物質および分析物ポリヌクレオチドの決定された増幅の兆候の座標を有する試験サンプルデータ点を指定することと、次いで、試験サンプルデータ点と測定面における二次元較正曲線射影上の点とを隔てる距離を最小化する、三次元パラメトリック較正曲線の三次元座標の値を決定することを含み得る。この場合、三次元パラメトリック較正曲線の三次元座標の値を決定する工程は、直角三角形斜辺の長さを算出することを含み得る。あるいは、同時に増幅させる工程が、第1のセットの増幅オリゴヌクレオチドを用いて核酸標準物質を増幅することと、第2のセットの増幅オリゴヌクレオチドを用いて分析物ポリヌクレオチド標準を増幅することとを含み、第1および第2のセットの増幅オリゴヌクレオチドが互いに異なっている。さらに別の代替法では、増幅の兆候を決定する工程は、増幅の閾値に基づいた兆候を決定することを含む。さらに別の代替法では、増幅の兆候を決定する工程は、増幅の閾値に基づいた兆候を決定することを含まない。さらなる別の代替法では、第1および第2の適合された方程式は、4つの係数を有する。別の代替法では、同時に増幅させる工程におけるインビトロ核酸増幅反応は、等温インビトロ核酸増幅反応である。別の代替法では、等温インビトロ核酸増幅反応は、転写関連増幅反応である。
以下の用語は、明示的に別段の定めをした場合を除き、この開示内容の目的上、以下の意味を有する。
本明細書には、リアルタイム核酸増幅を用いて分析物ポリヌクレオチドの定量化を改善する方法が開示されている。より詳しくは、本発明は、リアルタイム増幅アッセイにおいて内部較正結果を評価する方法、内部較正結果を考慮する分析物ポリヌクレオチドの定量化における調整、これによりアッセイ精度および確度を改善することに関する。これらの方法によって、標的量が同一であるが、増幅条件がわずかに異なるサンプル間のばらつきの補正が可能となる。空間曲線パラメトリック較正を用いて、分析物ポリヌクレオチドと内部標準物質との両方の増幅プロフィールから得た測定された兆候を用いて、未知試験サンプル中に存在する分析物ポリヌクレオチドコピー数を推定する。
パラメトリック較正方法に関連して有用な増幅法の例として、限定されないが、以下が挙げられる:転写媒介性増幅(TMA)、単一プライマー核酸増幅、核酸配列に基づく増幅(NASBA)、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、鎖置換増幅(SDA)、自律的配列複製(Self−Sustained Sequence Replication)(3SR)、DNAリガーゼ連鎖反応(LCR)ならびに自己複製ポリヌクレオチド分子および複製酵素、例えば、MDV−1 RNAおよびQ−β酵素を用いる増幅法。これらの種々の増幅技術を実施する方法はそれぞれ、米国特許第5,399,491号、公開米国特許出願番号第11/213,519号、公開欧州特許出願EP0525882、米国特許第4,965,188号、同5,455,166号、Guatelliら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:1874〜1878頁(1990)、国際公開番号WO89/09835、米国特許第5,472,840号およびLizardiら、Trends Biotechnol.9:53〜58頁(1991)に見出すことができる。核酸増幅反応の実施方法を説明するこれらの文書の開示内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
種々の増幅の兆候を、開示される方法と関連して使用できる。例えば、当業者によく知られる数学的手法およびコンピュータ計算手法を用いて、リアルタイム実施曲線の第1の導関数の最大の出現回数、または第2の導関数の最大の出現回数を同定できる。増殖曲線のこれらの特徴を決定するためのアプローチは、米国特許第6,503,720号においてWittwerらによって詳述されており、その開示内容は参照により本明細書に組み込まれる。他の有用なアプローチは、増殖曲線の導関数を計算することと、増殖曲線の特徴を同定することと、次いで、導関数の特徴に対応する閾値時間またはサイクル数を決定することとを含む。このような技術は、米国特許第6,783,934号に開示されており、その開示内容は参照により組み込まれる。さらに他の有用な増幅の兆候として、「TTime」、「TArc」および「OTArc」が挙げられる。
簡単に言えば、TTime値によって、リアルタイム増幅反応においてアンプリコン生成を示す特定の閾値を通過する時間を推定する。TTime値を計算して用いるアルゴリズムは、米国特許出願番号第60/659,874号に記載されており、その開示内容は参照により組み込まれる。図2は、リアルタイム実施曲線のセグメントでTTime値を決定する方法を示す。
(RFU(t)−RFU(t−1))/Δt(t→t−1)。固定的な傾きの値よりも小さい最初の傾きの値(すなわち、RFU(t)曲線がその上方への傾きを始める前の値、例えば、−0.0001)を見出すことによって、RFU(t)の傾きが平坦化する場所を見出す。ひとたび、この傾きを見出すと、負でない次の傾きを見出す;この値がHindexである。次に、最初のデータ点で出発し、Hindex値に対応するRFU値に進むRFU(t)値の全範囲の平均をとる。このデータの平均は、0.15という固定的バックトリム値を用いてデータのこの範囲に対してEXCEl表計算ソフト(Microsoft Corporation;Redmond,WA)のTRIMMEAN関数を用いてとることが好ましい。この平均値がバックグラウンド、BGである。
「TArc」および「OTArc」と呼ばれる時間依存性の増幅の兆候は、リアルタイム実施曲線のベクトルベースの分析を用いて決定する。TArc値は、増殖曲線が曲がるか、上方に「逸れ」始める時間において点を同定する。この決定された点を、標準曲線を作成するために、または試験サンプル中の分析物ポリヌクレオチドの量または濃度に関連する増幅反応のパラメータを定めるために用いることができる。ベクトル分析は、実質的に均一な時間間隔にわたって分布するデータ点を有する増殖曲線を用いて実施することが最も好都合である。TArcおよびOTArc値の決定および使用に関する詳細な提示は、米国特許出願番号11/474,698に記載されており、この出願の明細書および図面に含まれる開示内容は参照により本明細書に組み込まれる。ベクトル分析の根底にある本質的な概念は、図3A〜3Bに簡単に示されている。
TArc値を決定するための1つのアプローチは、方向的に同様であるベクターの対を形成するセットを用いる。これは、ベクトルはそのx成分において同一の方向を共有するということを意味する。したがって、方向的に同様であるベクトルは、x値が増大する方に向けられたx成分を有する。これは、方向的に反対のベクトルを特徴とする状況と区別され、これでは、一方のベクトルが、x成分において他方の反対を向いている。
OTArc値を決定するために使用できる代替ベクトルベースアルゴリズムは、増殖曲線に沿ってベクトルの対のセットを確立する反復プロセスを同様に含むが、方向的に同様のベクトルの代わりに方向的に反対のベクトルを用いる。方向的に同様のベクトルを用いるアルゴリズムと対照的に、方向的に反対のベクトルを用いるアルゴリズムは、x次元において異なる大きさを有するために対のセットにおけるベクトルの両方を必要とせず、2つのベクトル間の角度が最大ではなく最小になる点をx軸に沿って同定することを含む。この後者のアプローチにしたがって、2つのベクトルの対のセットは、それらが、2つのベクトルの共有される始点に関してx次元において方向的に反対であるように確立できる。一般に、一対の方向的に反対のベクトルの一方のメンバーは、共有される始点からx値が減少する方向に延在し、対の他方のメンバーはx値が増大する方向に延在する。
本明細書に開示される較正アルゴリズムは、コンピュータまたは類似の処理デバイス(本明細書では以下「コンピュータ」)を用いて実施することが好都合である。種々の好ましい実施形態では、アルゴリズムを実施するためのソフトウェアまたは機械によって実行可能な指示をロードするか、そうでなければフリースタンディングコンピュータのメモリー要素に、もしくは、解析を受けている生成物の量を好ましくは時間の関数としてモニタリングするのに用いられるデバイスと連結しているコンピュータのメモリー要素に入れることができる。高度に好ましい実施形態では、較正アルゴリズムを実行するためのソフトウェアは、反応混合物中に存在するアンプリコンの量を時間の関数としてモニタリングできるデバイスと連結しているか、もしくは、その不可欠の一部であるコンピュータのメモリー要素中に入っている。
パラメトリック較正曲線の作成は、各々、一定量の核酸標準物質(すなわち、内部標準物質ポリヌクレオチド)と、種々の既知量の分析物ポリヌクレオチド標準とを含む、複数の標準サンプルを形成する工程ではじまる。例えば、複数の標準サンプルの各々は、10,000コピーの内部標準物質ポリヌクレオチドを含み得る。種々のサンプルはまた、既知量の分析物ポリヌクレオチド標準を、例えば、あるサンプルから次のもので10倍異なる標準の量で含み得る。
以下、空間較正曲線を用いる工程を説明する。
以下の実施例によって、リアルタイム核酸増幅システムにおける分析物アンプリコンおよび内部標準物質アンプリコンの生成の間の相互依存が実証された。このシステムでは、内部標準物質コピー数は一定に保持され、分析物ポリヌクレオチド標準のコピー数は変更された。この例示に用いられた転写関連増幅法は、DNAポリメラーゼによって延在可能な3’末端を有する1種のプライマーと、DNAポリメラーゼによって延在し得ないブロックされた3’末端を有する1種のT7プロモーター・プロバイダー・オリゴヌクレオチドの組み合わせを用いたが(本質的に、公開米国特許出願第11/213,519号において、Beckerらによって記載されるような)、本明細書に記載されるパラメトリック較正方法はまた、本質的に、任意のその他のインビトロ核酸増幅システム、例えば、DNAポリメラーゼによって延在可能な3’末端を有する反対に配置されたプライマーの対のセットを用いるものとともに使用できる。実際、増幅オリゴヌクレオチドまたはプライマーの共有されるセットを用いる分析物ポリヌクレオチドおよび内部標準物質の同時に増幅に起因する競合増幅システムは、本明細書に開示されるパラメトリック較正方法を用いて優れた結果を与え、そのため、好ましい増殖反応のカテゴリーに相当する。増幅反応時間の関数として集められた蛍光発光結果を、バックグラウンドを上回る「出現の時間」と呼ばれることもある、蛍光シグナルが所定の閾値を越える点を求めるために数学的アルゴリズムを用いて処理した。この処理工程の性質は、決定的とは考えらず、増殖曲線上の点を求めるためには多数の代替処理アプローチを使用できる。時間依存性の増殖の兆候を調べる方法の例として、米国特許出願第60/659,874号の110〜116頁に記載されるTTimeならびに両方とも米国特許出願第11/474,698号及び他のものに記載されるTArcおよびOTArcが挙げられる。発明のパラメトリック較正アルゴリズムを例示するために、以下の実施例において得られた時間依存性蛍光結果を、時間依存性の増幅の兆候を定めるためにTTimeアルゴリズムによって処理した。
(分析物および内部標準物質アンプリコン合成の時間依存性モニタリング)
HIV−1サブタイプBおよび核酸標準物質配列を、米国特許出願第11/213,519号に記載される転写関連増幅法を用いて増幅した。HIV−1分析物ポリヌクレオチドアンプリコンおよび内部標準物質アンプリコンの時間依存性合成を、識別可能な分子トーチハイブリダイゼーションプローブを用いてモニタリングした。これらの手順では、2つのマルチプレクス化増幅反応は共通のプライマーまたはプローブのいずれかを共有していなかった。したがって、HIV−1標的は、T7プロバイダーオリゴヌクレオチド、非T7プライマー、ブロッカーオリゴヌクレオチドを用いて増幅し、各々がHIV−1標的に特異的であり、核酸標準物質には特異的でない分子トーチを用いて検出した。同様に、内部標準物質を、T7プロバイダーオリゴヌクレオチド、非T7プライマー、ブロッカーオリゴヌクレオチドを用いて増幅し、各々が核酸標準物質に特異的であり、HIV−1標的に特異的でない分子トーチを用いて検出した。増幅反応は、一定温度(すなわち、熱サイクルなし)で実施し、アンプリコン形成は、時間の関数として蛍光発光によってモニタリングした。異なるハイブリダイゼーションプローブによって生じたシグナルは、その蛍光発光スペクトルによって互いに識別可能であった。すべての反応が、30,000コピーの内部標準物質を含んでおり、12の複製で実施した。HIV−1標的のコピー数は、0〜500,000コピー/反応の範囲であった。増幅反応および検出工程は、CHROMO4 REAL−TIME DETECTOR機器(MJ Research/Bio−Rad Laboratories,Inc.;Hercules,CA)を用いて実施した。アンプリコン合成の程度に比例する時間依存性蛍光シグナルを、あるものの最大相対蛍光単位(RFU)に対して正規化した。反応混合物中に存在するアンプリコンの量を示す蛍光読み取り値は、約20秒毎にとった。種々の標的のバックグラウンド閾値を上回る蛍光シグナルの発生時期を示すTTime値を、本質的に米国特許出願第60/659,874号に開示されるように決定した。
(増幅反応に投入された分析物ポリヌクレオチド標準の量に対する時間依存性の増幅の兆候の関連付け)
前述の実施例の増幅反応において得られた、分析物ポリヌクレオチド標準および内部標準物質アンプリコンの合成について決定された時間依存性の増幅の兆候の数値(すなわち、TTime値)を、電子スプレッドシートに入力し、x軸に、投入した分析物ポリヌクレオチド標準(例えば、log10コピーで測定された)を有し、y軸に、増幅された標的の各々の時間依存性の増幅の兆候を有する二次元グラフ形式で可視化した。次いで、当業者によく知られる標準手順を用いて、曲線を測定されたデータ点に適合させた。これは、適合された曲線と測定されたデータとの間の偏差を最小にするようパラメトリック方程式を最適化することを含んでいた。これらの関係を、定量化可能な方法で確立するために種々のアプローチを用い、曲線適合手順に種々のモデルパラメトリック方程式を使用できた。この技術は、パラメータSの関数として表される一般方程式を用いて特に示し、Sは投入された分析物ポリヌクレオチド標準の量とした。分析物ポリヌクレオチドおよび内部標準物質データセットを別個に処理することによって、方程式6〜7中のan〜dnの数値を、Microsoft Corporation(Redmond,WA)製の、EXCEL表計算ソフトウェアアドインツールとして入手可能である市販のSOLVERソフトウェアを用いて最適化した。この操作の結果は、それぞれ、分析物ポリヌクレオチドおよび内部標準物質の測定された時間依存性の増幅の兆候に適合された曲線を規定する最適化された係数の固定されたセット(an〜dn)を各々有する2つの方程式であった。これらの方程式は以下の形を有していた:
(三次元でのパラメトリック較正曲線の確立)
MATLABソフトウェア(The MathWorks;Natick,MA)を用いて作成した電子スプレッドシートを用い、前述の実施例に記載の、適合された曲線を規定する方程式を用いて三次元較正曲線を確立した。この関係を確立するために用いた3つの関数は以下のとおりであった:(1)反応に投入された分析物ポリヌクレオチド標準の量の関数としての分析物ポリヌクレオチド標準の時間依存性の増幅の兆候;(2)反応に投入された分析物ポリヌクレオチド標準の量の関数としての内部標準物質の時間依存性の増幅の兆候;および(3)分析物ポリヌクレオチド標準の量をz次元に関連させる数学的関数。較正曲線を示すために用いたグラフプロットの3つの軸は以下のように割り当てた:
(リアルタイム核酸増幅プロトコールを用いてパラメトリック較正方法によって分析物ポリヌクレオチドの定量化を改善した)
上記の核酸増幅反応から得られた結果の統計分析を用いて、パラメトリック較正方法の適用から得られた較正曲線の精度および正確度の改善を評価した。反応中に投入された分析物ポリヌクレオチドの量の関数として、実施例1において、HIV−1分析物ポリヌクレオチドの増幅の兆候について決定された値を用い、常套の線形最小二乗曲線適合手順によって最良適合の線を確立した。HIV−1分析物のlog10コピーの平均数、HIV−1分析物のlog10コピーの数の標準偏差、最良適合の線から求められる平均log10コピー差異を計算し、内部較正を用いた何らかの調整の不在下で得られた較正プロットの質を評価した。分析物ポリヌクレオチドおよび内部標準物質の両方について決定された増幅の兆候、ならびに(a)分析物ポリヌクレオチドの増幅のTTime、(b)内部標準物質ポリヌクレオチドの増幅のTTime値、および(c)反応に投入された分析物ポリヌクレオチのコピー数を関連付ける図5に示されるパラメトリック較正曲線を用いて並行決定を行った。この情報の要約は表2に提示している。
(パラメトリック較正方法は、核酸増幅の阻害を示す試験サンプルにおける分析物ポリヌクレオチドの定量化を改善する)
三次元パラメトリック較正曲線(例えば、図5に示されるような)を、同一のデータセットを並行して処理し、異なる曲線解析アルゴリズムを用いて増幅の兆候として同定するという点を除き、前述の実施例に記載される手順を用いて作成した。パラメトリック較正曲線を作成するために用いた増幅反応は、意図的に阻害されなかった。実験用試験サンプルの増幅反応は、既知量のHIV−1分析物ポリヌクレオチドを、30,000コピーの無関係の内部較正ポリヌクレオチドと組み合わせて含むよう調製した。試験サンプル反応にはその後に実施される転写関連増幅反応の効率を阻害するために、5〜20容積%のHEPESベースの洗浄バッファーを含むよう補給した。増幅反応を、前述の実施例に記載されるように実施し、アンプリコン生成に比例する蛍光読み取り値を、分析物および内部標準物質ポリヌクレオチドの両方について反応時間の関数としてモニタリングした。すべての反応は、10の複製で実施した。得られたデータセットを並行して処理し、TTime、TArcおよびOTArcアルゴリズムを用いて増幅の兆候を同定した。阻害された試験サンプル中に含まれる分析物ポリヌクレオチドの量を、2つの異なる方法によって計算した。第1のアプローチでは、分析物ポリヌクレオチドの量を、内部較正データを用いずに推定した。これらの決定は、試験サンプル中に含まれる分析物ポリヌクレオチドについて決定された増幅の兆候と、標準反応の投入された分析物ポリヌクレオチド標準の量の関数としての分析物ポリヌクレオチド標準の増幅の兆候の直線適合のみを含んでいた。第2のアプローチでは、分析物ポリヌクレオチドの量は、三次元パラメトリック較正曲線を用いて推定し、この手順は、上記のように、測定面にプロットされた実験データ点を、測定面上の三次元パラメトリック較正曲線から隔てるユークリッドノルムを最小化することを含む。すべての例において、増幅の兆候は一致しており、このことは、TTime値を用いて作成された較正データを、TTimeを同定するために処理したデータを用いて試験サンプル中の分析物ポリヌクレオチの量を評価するために用いたということを意味する。同様に、TArcおよびOTArc値を用いて作成した較正データを、それぞれ、TArcおよびOTArcを同定するために処理したデータを用いて試験サンプル中の分析物ポリヌクレオチドの量を評価するために用いた。これらの手順の要約した結果が表3−5に提示されている。
Claims (5)
- インビトロ核酸増幅結果の内部較正調整によって、試験サンプル中に含まれる分析物核酸を定量化するコンピュータ実装方法であって、
該方法は、
(a)標準データセットおよび試験データセットを集める工程であって、
該標準データセットは、複数の標準核酸増幅反応から得られた結果を含み、各標準核酸増幅反応は、一定出発量の核酸標準物質と、異なる既知出発量の分析物核酸標準とを含み、
該複数の標準核酸増幅反応は、
該既知出発量の分析物核酸標準の関数としての分析物核酸標準の増幅の兆候であって、該増幅の兆候は、該複数の標準核酸増幅反応における所定のレベルの進行を示すリアルタイム実施曲線の特徴として定義される、兆候と、
該既知出発量の分析物核酸標準の関数としての該分析物核酸標準と同時に増幅された該核酸標準物質の増幅の兆候であって、該試験データセットは、該一定出発量の核酸標準物質と、未知出発量の分析物核酸とを含む、試験核酸増幅反応からの結果を含む、兆候と
をもたらし、
該試験核酸増幅反応は、
該試験サンプル中に含まれる該分析物核酸の増幅の兆候と、
該分析物核酸と一緒に同時に増幅された該核酸標準物質の増幅の兆候と
をもたらす、工程;と
(b)三次元パラメトリック較正曲線を作成する工程であって、
該三次元パラメトリック較正曲線は、
該既知出発量の分析物核酸標準の関数としての該分析物核酸標準の増幅の兆候を表す、第1の最適化されたパラメトリック方程式の解を含む第1の次元と、
該既知出発量の分析物核酸標準の関数としての核酸標準物質の増幅の兆候を表す、第2の最適化されたパラメトリック方程式の解を含む第2の次元と、
該複数の標準核酸増幅反応に用いた該既知出発量の分析物核酸標準を含む、該第1の最適化されたパラメトリック方程式および該第2の最適化されたパラメトリック方程式の第3の次元のパラメータと
を含み、
該三次元パラメトリック較正曲線の第1の次元および第2の次元は、測定面を規定し、
該測定面は、該三次元パラメトリック較正曲線の射影を含む、工程;と、
(c)該分析物核酸の増幅の兆候と、該試験核酸増幅反応において該分析物核酸と同時に増幅された該核酸標準物質の増幅の兆候との1セットの座標を含む、該測定面中の試験サンプルデータ点を指定する工程;と、
(d)該第3の次元のパラメータの値を変えることによって、該測定面中の指定された試験サンプルデータ点と、該測定面における三次元パラメトリック較正曲線の射影との間の最小距離を決定する工程であって、これにより、該決定された最小距離をもたらす該第3の次元のパラメータの値は、該試験サンプル中に含まれる該分析物核酸の量を推定する、工程;と
を含む、方法。 - 前記複数の標準核酸増幅反応および前記試験核酸増幅反応は、アンプリコンを合成するために熱サイクルを用いない等温増幅反応である、請求項1に記載の方法。
- 前記複数の標準核酸増幅反応および前記試験核酸増幅反応は、2種の増幅オリゴヌクレオチドのうちの第1のセットを用いて前記分析物核酸および前記分析物核酸標準を増幅し、2種の増幅オリゴヌクレオチドのうちの第2のセットを用いて前記核酸標準物質を増幅し、該第1のセットの増幅オリゴヌクレオチドおよび該第2のセットの増幅オリゴヌクレオチドは、互いに同一である、請求項1に記載の方法。
- インビトロ核酸増幅結果の内部較正調整によって、試験サンプル中に含まれる分析物核酸を定量化するためのシステムであって、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法を実行するように適合された手段を含む、システム。
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