ITMO20120015A1

ITMO20120015A1 - Metodo di perfezionamento per la determinazione quantitativa degli acidi nucleici

Info

Publication number: ITMO20120015A1
Application number: IT000015A
Authority: IT
Inventors: Michele Guescini; Renato Panebianco; Davide Sisti; Vilberto Stocchi
Original assignee: Guescini Michele Proprieta Al 25; Panebianco Renato Proprieta Al 25; Sisti Davide Proprieta Al 25; Stocchi Vilberto Proprieta Al 25
Priority date: 2012-01-26
Filing date: 2012-01-26
Publication date: 2013-07-27

Description

DESCRIZIONE

Annessa a domanda di brevetto per invenzione industriale avente per titolo:

“ Metodo Perfezionato per la determinazione quantitativa degli acidi nucleici”.

DESCRIZIONE

La presente invenzione concerne un metodo adatto per determinare la quantità di acidi nucleici in un campione biologico. Il campo dell’invenzione è quello della diagnosi molecolare di campioni di acidi nucleici, per esempio in diagnostica, in biotecnologia, in medicina forense e simili. In questo settore di attività si rende necessario amplificare il campione di partenza, in modo da ottenere quantità rilevabili dallo strumento. A tale scopo è noto sfruttare la reazione a catena della polimerasi (PCR), attraverso la quale la quantità iniziale di acidi nucleici viene amplificata. La determinazione della quantità degli acidi nucleici così amplificati è eseguita in presenza di reagenti chimici fluorescenti, i quali emettono una fluorescenza proporzionale alla quantità dell’acido nucleico amplificata e rilevata in tempo reale dallo strumento. Una volta ottenute le fluorescenze corrispondenti a ciascun ciclo di amplificazione, esistono diverse procedure per ottenere una stima della quantità di acidi nucleici presenti nel campione iniziale, tradizionalmente conosciute con le denominazioni "cycle-threshold", Ct" e "crossing-point, cp". In particolare è noto il metodo denominato "CyO", ideato dagli stessi inventori designati nella presente domanda di brevetto, il quale prevede la ricostruzione matematica della funzione di Richards che meglio approssima le fluorescenze sperimentali (“A new real-time PCR method to overcome significa quantitative inaccuracy due to slight amplification inhibition", Guescini et al., BMC Bioinformatics, 2008; nel seguito “CyO”). Questo metodo noto, efficace per dare dei risultati più attendibili rispetto alla tecnica preesistente, può essere soggetto agli errori di scostamento dei dati reali rispetto al modello matematico utilizzato. Costituisce lo scopo principale della presente invenzione quello di fornire un nuovo metodo per determinare la quantità di acidi nucleici in un campione biologico di partenza il quale, rispetto ai metodi della tecnica nota (Cy0), permetta di ottenere sempre una eccellente approssimazione del dato sperimentale, indipendentemente dall’andamento di questi dati. Questi ed altri scopi sono raggiunti con il metodo della rivendicazione 1. Dei modi preferiti di realizzare l’invenzione risultano dalle restanti rivendicazioni. Rispetto ai metodi tradizionali per la determinazione quantitativa degli acidi nucleici, quello secondo l’invenzione offre il vantaggio di quantificare l’acido nucleico, presente nel campione iniziale, tenendo conto dell’efficienza puntuale della reazione di PCR ed evitando gli errori derivanti dalla nota adozione di un modello di approssimazione o di modellizzazione matematica globale. Questi ed altri scopi, vantaggi e caratteristiche risultano dalla descrizione che segue di un preferito modo di realizzare il metodo della presente invenzione illustrato, a titolo di esempio non limitativo, nelle figure delle allegate tavole di disegno.

In esse:

la figura 1 illustra il modello di approssimazione matematica delle fluorescenze sviluppato secondo la tecnica nota; e

la figura 2 illustra il metodo dell’invenzione per la determinazione quantitativa degli acidi nucleici.

Il metodo illustrato in figura 1 (metodo Cy0), in cui sull’asse X sono riportati i cicli di amplificazione dell’acido nucleico e sull’asse Y le corrispondenti quantità di fluorescenza generate dallo strumento, prevede la determinazione dei valori a,b,c utilizzati per la determinazione della quantità di acidi nucleici nei rispettivi campioni biologici di partenza, approssimando le corrispondenti fluorescenze sperimentali delle curve A,B e C attraverso il modello definito dalle seguenti equazioni matematiche (3) e (6):

di cui alla già ricordata pubblicazione Cy0. Questa approssimazione non è tuttavia sempre ottimale e praticabile, soprattutto quando i dati sperimentali A, B e C hanno un andamento crescente nella fase finale (ad esempio Curva B), oppure quando il loro punto di flesso è estremamente vicino all’asse X (ad esempio Curva C). Anche piccoli errori, indicati in figura 1 dagli intervalli (a-b) e rispettivamente (b-c), si traducono infatti in errori macroscopici di quantificazione degli acidi nucleici, perché in rapporto esponenziale con l'entità di questi intervalli di scostamento. Allo scopo di superare questi inconvenienti, il metodo dell’invenzione prevede di rinunciare a priori al tradizionale modello matematico globale, riferendosi invece al dato sperimentale, successivamente approssimato per mezzo di funzioni matematiche locali, calcolate ciclo per ciclo di amplificazione e dalle quali è possibile ottenere i valori quantitativi di acido nucleico. Il metodo dell’invenzione prevede di costruire la funzione matematica di ciascun intervallo i; i+1 dell’andamento del dato sperimentale descritto dalla curva B (presa come esempio) e così rilevato dallo strumento in termini di fluorescenza. Questa funzione matematica è costruita fino a coprire quanto meno l’intervallo 1 della curva B all'interno del quale cade, non come estremo superiore, il suo punto di flesso 3. In particolare l’indice / dell’intervallo suddetto corrisponde al ciclo iesimo di amplificazione del processo PCR (fig. 2). A titolo di esempio si fornisce nel seguito l’algoritmo utilizzato, secondo l'invenzione, per il calcolo della funzione relativa all'intervallo i; i+1, calcolo che dovrà essere ripetuto fino a coprire almeno l'intero intervallo 1 sopra descritto. La parametrizzazione delle fluorescenze si ottiene tramite l’utilizzo delle funzioni spline, ovvero quelle funzioni relative ad ogni intervallo che hanno continuità in ordinata e relative derivate di ordine n:

(i) per ogni intervallo di punti si deve calcolare una funzione polinomiale completa di 3° grado, per 7’ che va da i=l a i=n per un totale di ( n-1 ) diverse funzioni (con n = numero dei cicli di amplificazione PCR della reazione considerata);

(ii) ogni funzione è rappresentata dalla equazione

(iii) la prima funzione, relativa all’intervallo

(iv) la funzione successiva è definibile calcolando i quattro parametri con la risoluzione del seguente sistema:

dove i= 2;

(v) le successive funzioni si definiscono ricorsivamente, fino a raggiungere il valore: ì=n-l;

(vi) è possibile considerare nel sistema anche ulteriori vincoli, come il passaggio per i punti successivi, che consiste nellinserire un’ulteriore equazione nel sistema, come ad esempio:

con n=2, 3, ecc... In questi casi il sistema non è più risolvibile, per cui si trova la funzione cubica che minimizza la somma del quadrato degli scarti del sistema riportato sopra, con l'aggiunta dell’ulteriore equazione (metodo dei minimi quadrati);

(vii) una volta trovate tutte le funzione spline si cerca il punto di flesso 3 nell’intervallo 1 nel quale esso ricade (tramite le differenze seconde finite), sulla base della specifica funzione spline, relativa a quello stesso intervallo. Così costruito analiticamente il modello (curva 4), si procede al calcolo della tangente 2 nel suo punto di flesso 3 per mezzo della formula:

dove Xflexe Yflexsono le coordinate X;Y del punto di flesso 3 e f(Xfiex) è il valore della derivata prima nel punto di flesso 3. Ottenuto quindi l’intervallo 1 della curva 4, il ciclo frazionario X1da utilizzare nella determinazione della quantità ricercata degli acidi nucleici è rappresentato dall'intersezione, con l'asse X, della tangente 2 al citato punto di flesso 3 del tratto 1 della curva 4. In particolare questo valore X1 è espresso dalla seguente equazione:

utilizzata per determinare la quantità iniziale dell’acido nucleico. Il medesimo valore X1 può essere espresso anche in termini di efficienza, ovvero il tasso o il rapporto incrementale della fluorescenza Yi ad ogni ciclo Xi. In particolare, data la seguente funzione dell’efficienza:

la precedente equazione

può essere espressa anche nel seguente modo:

dove nel caso sopra descritto n=1, ma si può estendere considerando n= numero reale. Nella tabella che segue il procedimento dell'invenzione è messo a confronto con la tecnica nota (metodo Cy0).

Dall’esame dei risultati riportati nella tabella precedente si osserva che l’utilizzo delle funzione spline nella ricerca del valore del ciclo frazionario (chiamato Cy0 spline) permette di minimizzare l’errore relativo nella quantificazione (vedi confronto tra gli errori relativi (ER) del metodo noto e il metodo dell’invenzione), rendendo il metodo dell’invenzione molto più robusto. Inoltre il metodo dell’invenzione permette di determinare il valore X1sopra definito per ogni curva di reazione PCR considerata, indipendentemente dalla sua asimmetria e comportamento al plateau, mentre il metodo noto in questi ultimi casi potrebbe addirittura non essere capace di approssimare il dato sperimentale.

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Metodo per la determinazione quantitativa degli acidi nucleici, del tipo comprendente le seguenti fasi: (a) la reazione di amplificazione di almeno una molecola di acido nucleico, (b) la raccolta seriale dei dati nel corso della reazione di amplificazione, caratterizzato dal fatto di prevedere il calcolo della funzione di ogni ciclo di amplificazione fa almeno fino a coprire l'intervallo (1) contenente il punto di flesso (3) della curva (4) rappresentativa dell’andamento del dato sperimentale di amplificazione dell’acido nucleico, misurato dallo strumento in termini di fluorescenza. 2. Metodo secondo la rivendicazione 1 , caratterizzato dal fatto che il calcolo della detta funzione è eseguito con l’utilizzo delle funzioni “spline”, ovvero le funzioni relative ad ogni intervallo che ha continuità in (17) e relative derivate di ordine (n). 3. Metodo secondo la rivendicazione 2, caratterizzato dal fatto che si esegue inoltre il calcolo della tangente nel punto di flesso (3) della citata curva (4) con la formula:
dove Xflexe Yflexsono le coordinate (X;Y) del punto di flesso (3) e è il valore della derivata prima nel medesimo punto di flesso (3). 4. Metodo secondo la rivendicazione 2, caratterizzato dal fatto che il calcolo utilizzato nella citata fase (b) di raccolta dei dati con parametrizzazione delle fluorescenza e con l’utilizzo delle citate funzioni “spline”, prevede che: (i) per ogni intervallo di punti si deve calcolare una funzione polinomiale completa di 3° grado, per un totale di ( n-1 ) diverse funzioni; (ii) in cui ogni funzione è rappresentata dalla equazione
(iii) la prima funzione, relativa all'intervallo
(iv) la funzione successiva essendo definibile calcolando i quattro parametri con la risoluzione del seguente sistema:
dove i=2, (v) le successive funzioni calcolandosi in modo ricorsivo, fino a raggiungere il valore: i = n- 1. 5. Metodo secondo la rivendicazione 4, caratterizzato dal fatto di prevedere l’inserimento aggiuntivo di (vi) una equazione del tipo
con n = 2 o 3; la soluzione di tale sistema ottenendosi con il metodo dei minimi quadrati. 6. Metodo secondo le rivendicazioni 4 o 5, caratterizzato dal fatto di prevedere, una volta trovate tutte le funzioni spline: (vii) la ricerca, con il calcolo delle differenze seconde finite, del punto di flesso nell’intervallo (1) nel quale lo stesso ricade, sulla base della specifica funzione spline relativa a quello stesso intervallo; e viii) così costruita analiticamente la citata curva (4), si procede al calcolo della tangente nel punto di flesso 3 per mezzo della formula:
7. Metodo secondo la rivendicazione 6, caratterizzato dal fatto che il detto valore X1 , in termini di efficienza

risulta espresso dall’equazione

dove n è un numero reale positivo.
8. Metodo secondo la rivendicazione 2, caratterizzato dall’impiego delle dette funzioni spline per ricostruire l’andamento della cinetica di amplificazione della reazione della PCR al fine di determinare la retta tangente in qualunque punto della detta curva (4), per ottenere il valore X1della sua intersezione con l’asse delle X, rappresentativo della quantità iniziale di acido nucleico.