CN101970686B - 靶标量化的方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了方法和软件应用，其用于通过收集并处理来自实验样本和包含已知靶标拷贝数的至少两个标准对照样本的初始信号数据，来量化实验样本中的靶标。在这方面，本发明允许量化在实验样本中的靶标拷贝数。

Description

靶标量化的方法和应用
本申请要求2007年9月7日提交的序列号为60/970,707的美国临时申请的优先权，其在这里通过引用被全部并入。
发明领域
本公开涉及用于量化实验样本中的靶标的方法和软件应用。优选地，该靶标是通过核酸检测分析法检测的核酸序列。
发明背景
核酸的量化在生物和医学领域中起重要作用。例如，核酸的量化在癌诊断和预后以及治疗效果(例如，对HCV和HIV)的病毒诊断和判断中很重要。HCV RNA量化对采用IFN的患者很重要。通过在IFN治疗期间监控病毒的数量可直接发现IFN治疗的效果。这能够使适应每个患者的临床条件的IFN治疗更有效。靶核酸的量化在未来对疾病的诊断很重要。例如，通过检查mRNA的表达水平可影响早期诊断，mRNA在从外源刺激产生的疾病的情况下对外源刺激做出反应。
聚合酶链反应可用于核酸量化。然而，当使用PCR时，扩增的核酸的绝对数量并不准确地反映当扩增开始时存在的靶核酸的数量。首先，通过PCR扩增的产物的数量通常每周期指数地增加，然而，增加的速率慢下来并接着在扩增产物的数量超过某个水平时停止。因此，扩增产物的最终数量是恒定的，而不考虑当反应开始时靶核酸的数量。该现象称为平台效应，在量化通过PCR扩增的产物时应考虑该效应。
称为实时PCR的技术广泛用于靶序列量化。在该技术中，靶核酸的连续稀释被准备，每个样本经受PCR，且时间进程接着被实时地记录。确定阈值循环(Ct值)，在达到平台效应的水平之前使用该阈值循环，在扩增指数地出现的区域中获得给定数量的扩增产物。在垂直轴上标出所确定的值，并在水平轴上标出核酸的数量。因此，校准曲线被制定。所关注的未知样本在相同的条件下经受PCR，且Ct值被确定。这实现在未知样本中的核酸的数量的量化。用于实时检测的设备通常是昂贵的。如果使用一般商业热循环器执行该技术，则必须在每个周期分析样本，以便确定产生给定数量的扩增产物所使用的阈值循环。因此，该技术需要大量的工作。
量化的竞争性PCR也是广泛使用的技术。在该技术中，具有类似于靶核酸序列的序列的竞争核酸以逐步方式被稀释，且生成物被添加到包含待量化的靶核酸的样本。根据所添加的竞争核酸的数量，来自靶核酸的扩增产物的数量与来自所添加的竞争核酸的扩增产物的数量之比被确定。因此，来自被添加的靶核酸的扩增产物的数量变得等于来自竞争核酸的扩增产物的数量的点表示靶核酸的数量。虽然该技术相对简单，但为每个引物准备竞争物的必要性复杂化了操作。此外，存在靶核酸的扩增效率可能不同于竞争核酸的扩增效率的问题。
根据上述内容，所需要的是用于量化样本中的核酸和其它靶标的相对简单和廉价的方法。
发明概述
本发明提供了方法和软件应用，其用于通过收集并处理来自实验样本和包含已知靶标拷贝数的至少两个标准对照样本的初始信号数据，来量化实验样本中的靶标。在特定的实施方式中，初始信号数据能够被绘制为实验曲线(例如，s形曲线或其它曲线)和至少两个标准对照曲线(例如，s形曲线或其它曲线)。在某些实施方式中，初始信号数据使用阈值信号线被处理，以产生对照和实验相交时间值，这些值可被进一步处理以产生包括对数/对数坐标图或线性/对数坐标图的坐标的对数坐标图数据。在一些实施方式中，可处理对数坐标图数据，以产生可通过实验时间值使用的用于量化实验样本中的靶标拷贝数的斜率方程。
在一些实施方式中，本发明提供了量化实验样本中的靶标的方法，其包括：a)提供：i)包括以多个时间间隔从实验样本和包含不同的已知靶标拷贝数的至少两个标准对照样本所检测的分析信号水平的初始信号数据，其中初始信号数据能够被绘制为实验曲线和至少两个标准对照曲线；以及ii)阈值信号线，其具有i)在时间零处的初始信号值，以及ii)阈值斜率；其中阈值信号线在背景水平之上并与实验曲线和两个或多个所述至少两个标准对照曲线相交；以及b)处理初始信号数据和阈值信号线以产生实验相交时间值和至少两个标准对照相交时间值；c)处理所述至少两个标准对照相交时间值和已知靶标拷贝数，以产生包括相交时间值与已知靶标拷贝数的关系曲线的对数/对数坐标图或线性/对数坐标图的坐标的对数坐标图数据；d)处理对数坐标图数据，以产生描述与对数坐标图数据拟合的因而产生的斜率的斜率方程；以及e)使用斜率方程处理实验相交时间值，以对实验样本产生量化的靶标拷贝数。
在其它实施方式中，本发明提供了量化实验样本中的靶标的方法，其包括：a)提供：i)用户接口，其配置成接收初始信号数据，以及ii)计算机系统，其中储存靶标量化软件应用，以及b)将初始信号数据从用户接口传输到计算机系统，其中初始信号数据包括以多个时间间隔从实验样本和包含不同的已知靶标拷贝数的至少两个标准对照样本所检测的分析信号水平，其中信号数据能够被绘制为实验曲线和至少两个标准对照曲线；c)使用靶标量化软件应用来处理信号数据，以便靶标量化软件：i)产生阈值信号线，其具有i)在时间零处的初始信号值，以及ii)阈值斜率；其中阈值信号线在背景水平之上并与实验曲线和两个或多个所述至少两个标准对照曲线相交；ii)处理信号数据和阈值信号线，以产生实验相交时间值和至少两个标准对照相交时间值；iii)处理所述至少两个标准对照相交时间值和已知靶标拷贝数，以产生包括相交时间值与已知靶标拷贝数的关系曲线的对数/对数坐标图或线性/对数坐标图的坐标的对数坐标图数据；iv)处理对数坐标图数据，以产生描述与对数坐标图数据拟合的因而产生的斜率的斜率方程；以及v)使用斜率方程处理实验相交时间值，以对实验样本产生量化的靶标拷贝数。
在另外的实施方式中，本发明提供了用于量化实验样本中的靶标的系统，其包括：a)设备，其配置成以多个时间间隔从实验样本和包含不同的已知靶标拷贝数的至少两个标准对照样本检测分析信号水平，以产生初始信号数据；b)靶标量化软件应用，其配置成：i)处理初始信号数据，以产生能够被绘制为实验曲线和至少两个标准对照曲线的信号数据；ii)产生阈值信号线，其具有i)在时间零处的初始信号值，以及ii)阈值斜率；其中阈值信号线在背景之上并与实验曲线和两个或多个所述至少两个标准对照曲线相交；iii)处理信号数据和阈值信号线，以产生实验相交时间值和至少两个标准对照相交时间值；iv)处理所述至少两个标准对照相交时间值和已知靶标拷贝数，以产生包括相交时间值与已知靶标拷贝数的关系曲线的对数/对数坐标图或线性/对数坐标图的坐标的对数坐标图数据；v)处理对数坐标图数据，以产生描述与对数坐标图数据拟合的因而产生的斜率的斜率方程；以及vi)使用斜率方程处理实验相交时间值，以对实验样本产生量化的靶标拷贝数；以及c)计算机系统，其中储存了靶标量化软件应用，其中计算机系统包括计算机存储器和计算机处理器。
在特定的实施方式中，本发明提供了计算机存储设备，其中储存了靶标量化软件应用，其中靶标量化软件应用配置成：a)处理初始信号数据以产生能够被绘制为实验曲线和至少两个标准对照曲线的信号数据，其中初始信号数据包括以多个时间间隔从实验样本和包含不同的已知靶标拷贝数的至少两个标准对照样本所检测的分析信号水平；b)产生阈值信号线，其具有i)在时间零处的初始信号值，以及ii)阈值斜率；其中阈值信号线在背景之上并与实验曲线和两个或多个所述至少两个标准对照曲线相交；c)处理信号数据和阈值信号线，以产生实验相交时间值和至少两个标准对照相交时间值；d)处理所述至少两个标准对照相交时间值和已知靶标拷贝数，以产生包括相交时间值与已知靶标拷贝数的关系曲线的对数/对数坐标图或线性/对数坐标图的坐标的对数坐标图数据；e)处理对数坐标图数据，以产生描述与对数坐标图数据拟合的因而产生的斜率的斜率方程；以及f)使用斜率方程处理实验相交时间值，以对实验样本产生量化的靶标拷贝数。
在某些实施方式中，本发明提供了量化实验样本中的靶标的方法，其包括：a)使实验样本和至少两个标准对照样本遭受核酸检测分析法，其中至少两个标准对照样本包含不同的已知靶标拷贝数；b)从下列样本检测分析信号水平：i)实验样本，ii)至少两个标准对照样本，以及iii)至少两个内部染料对照样本，其中分析信号水平以多个时间间隔被检测以产生原始信号数据；c)规范化(normalize)原始信号数据以产生：i)规范化实验信号数据，ii)规范化标准对照信号数据，以及iii)规范化内部染料对照信号值；d)处理规范化实验信号数据和规范化标准对照信号数据，以产生能够被绘制为实验曲线和至少两个标准对照曲线的信号数据；e)确定具有在时间零处的初始信号值和阈值斜率的至少一个阈值信号线，其中阈值信号线：i)在规范化内部染料对照值之上；ii)与实验曲线相交；以及iii)与两个或多个所述至少两个标准对照曲线相交；f)处理信号数据和阈值信号线以产生实验相交时间值和至少两个标准对照相交时间值；g)处理所述至少两个标准对照相交时间值和已知靶标拷贝数，以产生包括相交时间值与已知靶标拷贝数的关系曲线的对数/对数坐标图或线性/对数坐标图的坐标的对数坐标图数据；h)处理对数坐标图数据，以产生描述与对数坐标图数据拟合的因而产生的斜率的斜率方程；以及i)使用斜率方程处理实验相交时间值，以对实验样本产生量化的靶标拷贝数。
在其它实施方式中，本发明提供了量化实验样本中的靶标的方法，其包括：a)提供：i)包括以多个时间间隔从实验样本和包含不同的已知靶标拷贝数的至少两个标准对照样本所检测的分析信号水平的初始信号数据，其中初始信号数据能够被绘制为实验曲线和至少两个标准对照曲线；以及ii)多个不同的阈值信号线，每个阈值信号线具有i)在时间零处的初始信号值，以及ii)阈值斜率；其中每个阈值信号线在背景水平之上并与实验曲线和两个或多个所述至少两个标准对照曲线相交；b)处理初始信号数据和所述多个阈值信号线，以对每个不同的阈值信号线产生实验相交时间值和标准对照相交时间值；c)处理标准对照相交时间值和已知靶标拷贝数，以对多个不同的阈值信号线中的每个产生对数坐标图数据，其中对数坐标图数据包括相交时间值与已知靶标拷贝数的关系曲线的对数/对数坐标图或线性/对数坐标图的坐标；d)处理对数坐标图数据，以产生描述与对数坐标图数据拟合的多个因而产生的斜率的多个斜率方程，其中所述多个因而产生的斜率中的每个具有拟合值(例如，R2值)；以及e)使用至少一个所述多个斜率方程处理实验相交时间值，以对实验样本产生量化的靶标拷贝数。
在特定的实施方式中，本发明提供了量化实验样本中的靶标的方法，其包括：a)提供：i)用户接口，其配置成接收初始信号数据，以及ii)计算机系统，其中储存了靶标量化软件应用，以及b)将初始信号数据从用户接口传输到计算机系统，其中初始信号数据包括以多个时间间隔从实验样本和包含不同的已知靶标拷贝数的至少两个标准对照样本所检测的分析信号水平，其中信号数据能够被绘制为实验曲线和至少两个标准对照曲线；c)使用靶标量化软件应用来处理信号数据，以便靶标量化软件：i)产生多个不同的阈值信号线，每个阈值信号线具有i)在时间零处的初始信号值，以及ii)阈值斜率；其中每个阈值信号线在背景水平之上并与实验曲线和两个或多个所述至少两个标准对照曲线相交；ii)处理信号数据和多个阈值信号线，以对每个不同的阈值信号线产生实验相交时间值和标准对照相交时间值；iii)处理标准对照相交时间值和已知靶标拷贝数，以对多个不同的阈值信号线中的每个产生对数坐标图数据，其中对数坐标图数据包括相交时间值与已知靶标拷贝数的关系曲线的对数/对数坐标图或线性/对数坐标图的坐标；iv)处理对数坐标图数据以产生描述与对数坐标图数据拟合的多个因而产生的斜率的多个斜率方程，其中所述多个因而产生的斜率中的每个具有拟合值(例如，R2值)；以及v)使用至少一个所述多个斜率方程处理实验相交时间值，以对实验样本产生量化的靶标拷贝数。
在一些实施方式中，本发明提供了用于量化实验样本中的靶标的系统，其包括：a)设备，其配置成以多个时间间隔从实验样本和包含不同的已知靶标拷贝数的至少两个标准对照样本检测分析信号水平，以产生初始信号数据；b)靶标量化软件应用，其配置成：i)处理初始信号数据，以产生能够被绘制为实验曲线和至少两个标准对照曲线的信号数据；ii)产生多个不同的阈值信号线，每个阈值信号线具有i)在时间零处的初始信号值，以及ii)阈值斜率；其中每个阈值信号线在背景之上并与实验曲线和两个或多个所述至少两个标准对照曲线相交；iii)处理信号数据和多个阈值信号线，以对每个不同的阈值信号线产生实验相交时间值和标准对照相交时间值；iv)处理标准对照相交时间值和已知靶标拷贝数，以对多个不同的阈值信号线中的每个产生对数坐标图数据，其中对数坐标图数据包括相交时间值与已知靶标拷贝数的关系曲线的对数/对数坐标图或线性/对数坐标图的坐标；v)处理对数坐标图数据，以产生描述与对数坐标图数据拟合的多个因而产生的斜率的多个斜率方程，其中所述多个因而产生的斜率中的每个具有拟合值(例如，R2值)；以及vi)使用至少一个所述多个斜率方程处理实验相交时间值，以对实验样本产生量化的靶标拷贝数；以及c)计算机系统，其中储存了靶标量化软件应用，其中计算机系统包括计算机存储器和计算机处理器。
在其它实施方式中，本发明提供了计算机存储设备，其中储存了靶标量化软件应用，其中靶标量化软件应用配置成：a)处理初始信号数据以产生能够被绘制为实验曲线和至少两个标准对照曲线的信号数据，其中初始信号数据包括以多个时间间隔从实验样本和包含已知不同的靶标拷贝数的至少两个标准对照样本所检测的分析信号水平；b)产生多个不同的阈值信号线，每个阈值信号线具有i)在时间零处的初始信号值，以及ii)阈值斜率；其中每个阈值信号线在背景之上并与实验曲线和两个或多个所述至少两个标准对照曲线相交；c)处理信号数据和多个阈值信号线，以对每个不同的阈值信号线产生实验相交时间值和标准对照相交时间值；d)处理标准对照相交时间值和已知靶标拷贝数，以对多个不同的阈值信号线中的每个产生对数坐标图数据，其中对数坐标图数据包括相交时间值与已知靶标拷贝数的关系曲线的对数/对数坐标图或线性/对数坐标图的坐标的对数坐标图数据；e)处理对数坐标图数据，以产生描述与对数坐标图数据拟合的多个因而产生的斜率的多个斜率方程，其中所述多个因而产生的斜率中的每个具有拟合值(例如，R2值)；以及f)使用至少一个所述多个斜率方程处理实验相交时间值，以对实验样本产生量化的靶标拷贝数。
在某些实施方式中，本发明提供了量化实验样本中的靶标的方法，其包括：a)使实验样本和至少两个标准对照样本遭受核酸检测分析法，其中至少两个标准对照样本包含不同的已知靶标拷贝数；b)从下列样本检测分析信号水平：i)实验样本，ii)至少两个标准对照样本，以及iii)至少两个内部染料对照样本，其中分析信号水平以多个时间间隔被检测以产生原始信号数据；c)规范化原始信号数据以产生：i)规范化实验信号数据，ii)规范化标准对照信号数据，以及iii)规范化内部染料对照信号值；d)处理规范化实验信号数据和规范化标准对照信号数据，以产生能够被绘制为实验曲线和至少两个标准对照曲线的信号数据；e)确定多个阈值信号线，每个都具有在时间零处的初始信号值和阈值斜率，其中每个阈值信号线：i)在规范化内部染料对照值之上；ii)与实验曲线相交；以及iii)与两个或多个所述至少两个标准对照曲线相交；f)处理信号数据和多个阈值信号线，以对每个不同的阈值信号线产生实验相交时间值和标准对照相交时间值；g)处理标准对照相交时间值和已知靶标拷贝数，以对多个不同的阈值信号线中的每个产生对数坐标图数据，其中对数坐标图数据产生包括相交时间值与已知靶标拷贝数的关系曲线的对数/对数坐标图或线性/对数坐标图的坐标；h)处理对数坐标图数据，以产生描述与对数坐标图数据拟合的多个因而产生的斜率的多个斜率方程，其中所述多个因而产生的斜率中的每个具有拟合值(例如，R2值)；以及i)使用至少一个所述多个斜率方程处理实验相交时间值，以对实验样本产生量化的靶标拷贝数。
在一些实施方式中，至少一个斜率方程具有所述多个因而产生的斜率中的任何一个的最佳拟合值。在其它实施方式中，所述多个不同的阈值信号线是至少两个不同的阈值信号线(例如，至少2、3、4…10…15…25…100…1000…10,000…个可由计算机产生的所有可能的阈值信号线)。
在某些实施方式中，阈值斜率为零(水平线)。在另外的实施方式中，阈值斜率为负(向下倾斜的线)。在特定的实施方式中，阈值斜率为正(向上倾斜的线)。
在特定的实施方式中，在实验样本中的量化的靶标拷贝数在从分析信号水平首次从实验样本被检测到时起的大约150秒或更少的时间内(例如，在大约75秒…大约100秒…大约125秒…或大约150秒内)产生。在一些实施方式中，在实验样本中的量化的靶标拷贝数在从分析信号水平首次从实验样本被检测到时起的大约45分钟或更少的时间内(例如，在大约5分钟…大约15分钟…大约30分钟…或大约45分钟内)产生。在某些实施方式中，在实验样本中的量化的靶标拷贝数在从分析信号首次从实验样本被检测到时起的大约2分钟和大约35分钟之间产生。
在一些实施方式中，分析信号水平通过核酸检测分析法产生。在其它实施方式中，核酸检测分析法包括侵入性裂解分析法。在另外的实施方式中，在等温条件下执行或配置成执行核酸检测分析法。在特定的实施方式中，靶标包括核酸序列。在额外的实施方式中，核酸序列包括RNA或DNA序列。在其它实施方式中，核酸序列包括微RNA或siRNA序列。在一些实施方式中，分析信号水平通过蛋白质、碳水化合物或小分子检测分析法(例如，能够随着时间的过去产生可被绘制为曲线的数据)产生。
在某些实施方式中，多个时间间隔是有规律地间隔开的时间间隔(例如，每秒…每5秒…每30秒…每分钟…每5分钟)。在其它实施方式中，多个时间间隔包括至少5个时间间隔(例如，至少7…15…25…50…100…200…400…600…800…1000…5000个时间间隔)。在特定的实施方式中，时间间隔为每5到30秒。
在一些实施方式中，实验样本中的靶标数量是未知的。在特定的实施方式中，至少两个标准对照样本包括彼此不同至少大约10倍的量的已知靶标拷贝数(例如，它们不同10倍…15倍…20倍…50倍…100倍…或更多的量)。在其它实施方式中，至少两个标准对照样本包括2到100个标准对照样本或更多(例如，2…5…10…25…50…或100个标准对照样本)。
在某些实施方式中，至少两个、三个、四个或更多的实验样本在一起被分析。在其它实施方式中，多个实验样本被使用且这些样本被连续地用数量表示，即使它们在拷贝数上彼此不同4、5或6个对数的量(例如，方法的动态范围允许具有极大地不同的拷贝数的实验样本在一起被分析)。
在一些实施方式中，阈值信号线与实验曲线和两个或多个所述至少两个标准对照曲线在这些曲线的线性部分处相交。在特定的实施方式中，初始信号数据包括规范化信号数据(例如，自动地由配置成规范化信号的分析信号读取设备或通过使分析信号除以来自内部信号对照样本的信号来规范化)。在额外的实施方式中，初始信号数据还包括以多个时间间隔从内部信号对照样本检测到的化验信号水平。在另外的实施方式中，初始信号数据根据内部信号对照样本或其它内部信号对照样本被规范化。
在特定的实施方式中，使用线性回归产生斜率方程。在其它实施方式中，斜率是最佳拟合斜率。
在一些实施方式中，初始信号数据还包括以多个时间间隔从至少一个额外的实验样本检测到的分析信号水平。在其它实施方式中，在任一、所有或一些步骤中的处理由计算机或部分地由计算机(例如，由计算机的处理器)执行。在特定的实施方式中，在任一、所有或一些步骤中的处理至少部分地被人工执行。
在一些实施方式中，本发明提供了用于在单个屏幕上同时显示输出结果的系统，其包括：a)计算机系统，其中储存了靶标量化软件应用，其中计算机系统包括计算机存储器和计算机处理器，且其中靶标量化软件配置成产生输出结果；以及b)用户接口，其包括配置成显示来自靶标量化软件应用的输出结果的屏幕，其中输出结果同时显示在屏幕上，且其中输出结果包括：i)随着时间的过去绘制信号的第一图形，其中第一图形包括：A)基于规范化标准对照样本的至少两个曲线，以及B)阈值信号线，其与所述至少两个曲线(以及基于实验样本的至少一个曲线)相交；以及ii)随着时间的过去绘制信号的第二图形，其中第二图形包括与数据点拟合的因而产生的斜率，所述数据点由第一图形上的阈值信号线与所述至少两个曲线相交的位置确定。
在特定的实施方式中，输出结果还包括：iii)平板显示器，其中平板显示器提供多个样本孔的视觉表示，其中多个样本孔的至少一部分包括规范化标准对照样本。在某些实施方式中，输出结果还包括：统计汇总框，其中统计汇总框包括下列项中的至少一个：A)阈值信号线的初始信号值；B)阈值信号线的阈值斜率；或C)来自规范化标准对照样本的数值。
附图说明
图1示出用于实现本发明的方法和软件应用的一个示例性实施方式的流程图。
图2示出具有不同的靶标拷贝数的、双份运行的、来自多个标准对照样本的249个时间间隔(11秒间隔)的规范化信号数据。图2A、2B和2C示出时间间隔1-29的数据，图2D、2E和2F示出时间间隔30-58的数据，图2G、2H和2I示出时间间隔59-87的数据，图2J、2K和2L示出时间间隔88-116的数据，图2M、2N和20示出时间间隔117-145的数据，图2P、2Q和2R示出时间间隔146-174的数据，图2S、2T和2U示出时间间隔175-203的数据，图2V、2W和2X示出时间间隔204-232的数据，以及图2Y、2Z和2AA示出时间间隔233-249的数据。
图3示出来自三个实验样本(B4、E4和F4)的249个时间间隔(11秒间隔)的规范化信号数据。图3A示出时间间隔1-44的数据，图3B示出时间间隔45-90的数据，图3C示出时间间隔91-136的数据，图3D示出时间间隔137-182的数据，而图3E示出时间间隔183-228的数据，以及图3F示出时间间隔229-249的数据。
图4示出从规范化信号数据产生的曲线。图4A示出从规范化标准对照信号数据产生的曲线，而图4B示出从规范化实验信号数据产生的曲线。
图5A示出从具有增加的阈值信号线(被绘制为水平线)的规范化标准对照信号数据产生的曲线，而图5B示出从具有增加的阈值信号线(被绘制为水平线)的实验信号数据产生的曲线。
图6示出在时间值域与靶标拷贝数的关系曲线的对数/对数坐标图中的标准对照相交时间值和与对数/对数坐标图上的值拟合的斜率(以及斜率方程)。
图7示出来自实例2的屏幕截图，其显示来自靶标量化软件应用的输出结果，包括：i)具有与大部分曲线相交的阈值信号线的随着时间的过去绘制信号的第一图形；ii)随着时间的过去绘制信号的第二图形(在双对数基础上)，其中第二图形包括与数据点拟合的因而产生的斜率，所述数据点由第一图形上的阈值信号线与曲线相交的位置确定；以及iii)平板显示器，其示出每个样本孔的染料和内容物(例如，对照孔的样本数内容物)。
图8示出与图7相同的屏幕截图，只是没有示出平板显示器且阈值信号线在较高的水平示出。将阈值信号线设置在较高的水平导致因而产生的斜率的差异R2的产生。
图9示出与图8相同的屏幕截图，只是示出两条阈值信号线，其产生并排示出的两个因而产生的斜率。如可在右上角中的面板中看到的，这两个因而产生的斜率具有不同的R2值。在某些实施方式中，用户选择使用具有最高R2值的因而产生的斜率。
图10示出与图8相同的屏幕截图，只是阈值信号线具有负(向下的)斜率。如可看到的，该负斜率与所示的所有曲线相交。使用负斜率而不是零斜率(水平)的阈值信号线产生不同的R2值，其可与所得到的其它R2值比较以选择例如最高值。
图11示出与图8相同的屏幕截图，只是阈值信号值的斜率改变了，且因而产生的斜率拟合在对数-线性基础上而不是双对数基础上被绘制。
图12示出与图8相同的屏幕截图，只是示出七个不同的倾斜的阈值信号值以及七个因而产生的斜率，其中每个斜率具有可被比较的不同R2值。该屏幕截图例如说明，搜索计算机软件可通过尝试很多(例如，数千或数百万)不同的阈值来执行，以找到产生具有在两个或多个(例如，全部)数据点之间的最高R2值的因而产生的斜率的一个阈值。
本发明的描述
本发明提供了方法和软件应用，用于通过收集并处理来自实验样本和包含已知靶标拷贝数的至少两个标准对照样本的初始信号数据，来量化实验样本中的靶标。在特定的实施方式中，初始信号数据能够被绘制为实验曲线和至少两个标准对照曲线。在某些实施方式中，初始信号数据使用阈值信号线被处理，以产生对照和实验相交时间值，这些值可被进一步处理以产生包括对数/对数坐标图或线性/对数坐标图(或类似的坐标图)的坐标的对数坐标图数据。在一些实施方式中，可处理对数坐标图数据以产生斜率方程，其可与实验时间值一起使用来量化实验样本中的靶标拷贝数。
I.示例性靶序列量化方法和应用
图1示出可如何在实验样本中使用核酸检测分析法以及采用从标准对照曲线产生的阈值信号线和对数/对数坐标图的方法，来量化靶序列的示例性实施方式。在该示例性实施方式中，核酸检测分析法是可产生时间-进程数据的方法，该时间-进程数据可使用局部化线性模型或其它模块被拟合以与曲线拟合(例如，INVADER检测分析法或其它基于裂解的分析法)。下面描述图1中的十个示例性步骤。
图1：步骤1
在图1的步骤1中，核酸检测分析法用于检测在实验和对照样本中的靶序列。当检测到可随着时间的过去被测量的靶标时，核酸检测分析法产生信号。所使用的核酸检测分析法(例如，INVADER检测分析法)也是可随着时间的过去产生数据的方法，该数据可被拟合到曲线(例如，s形或类似s形的曲线)。在某些实施方式中，核酸检测分析法是在等温条件下运行的。实验和标准对照样本可在检测之前或期间被PCR扩增。设备用于检测所产生的信号(例如，配置成读取并记录多个样本中的荧光信号的设备)。该设备设置成在每个样本中的不同时间点处(例如，每5秒、每10秒、每30秒或每分钟)检测并记录信号。
使用至少两个标准对照样本，每个样本包含不同的已知数量的靶序列。在某些实施方式中，使用两个和十个之间的对照样本。优选地，也包括没有靶标的标准对照样本。在一些实施方式中，标准对照样本中的靶标拷贝数范围从数百到数百万以及其间的值。优选地，对照样本彼此不同大约10倍的量。
在一些实施方式中，每个标准对照样本具有相应的内部染料对照样本，其包含与对照样本相同(或大约相同)的靶标拷贝数，但略去核酸检测分析法的操作所必需的组成部分。在使用没有靶标的标准对照样本的某些实施方式中，也使用没有靶标的相应的内部染料对照样本。优选地，内部染料对照样本使用与在标准对照样本中使用的不同的染料。通常，内部染料对照样本用于测量核酸检测分析法所产生的背景信号。如果例如使用INVADER分析法，则内部染料对照样本可以没有INVADER寡核苷酸，但仍然包含探针寡核苷酸、裂解酶和链接到不同于标准对照样本中的染料的染料的FRET盒。在某些实施方式中，使用每个标准对照样本和每个内部染料对照样本的双份样本。在某些实施方式中，检测第二内部持家型序列以允许例如相对的量化。
检测到的靶序列可为所期望的任何靶序列，包括例如微RNA、siRNA序列、DNA序列、病毒序列或与病原体有关的其它序列。在某些实施方式中，靶序列是与癌有关的基因或病毒序列，例如HCV、HPV或HIV。染料或所使用的其它标记可为任何适当的染料或标记，包括例如FAM、Yakima黄色内部规范化染料、Cy3、Cy5和本领域中已知的其它染料。
图1：步骤2
通常，如果在不能够规范化信号的设备上获得结果，则如图1的步骤2A所示，通过分开来自标准对照样本和实验样本的信号与来自内部染料对照样本的相应信号，可获得规范化信号。如果在能够自动规范化信号的设备上获得结果，如步骤2B所示，则不需要额外的处理来获得规范化结果。在图2中示出标准对照样本的规范化结果的一个实例，而在图3中示出实验样本的规范化结果的一个实例。
图1：步骤3
在某些实施方式中，以信号与时间的关系曲线的方式在X-Y图形上绘制规范化标准对照和实验样本。
图1：步骤4
规范化标准对照和实验样本信号可接着使用任何数量的已知数学方程(例如，存在可用于这样的目的的大约50个公知的数学方程)与曲线拟合。优选地，该功能由配置成产生这样的曲线的计算机程序执行。在某些实施方式中，使用使每两个信号数据点与线拟合的方程来产生曲线，而在其它实施方式中，使用样条插值。在图4中示出了使信号数据与曲线拟合的一个实例，在图4A中示出为标准对照曲线，而在图4B中示出为实验曲线。
图1：步骤5
然后，在某些实施方式中(而在其它实施方式中不是必需的)，一种方法用于例如使用样本位置ID或其它相关的数据区分实验曲线与标准对照曲线。
图1：步骤6
接着，(例如，自动地由软件应用或由用户)确定阈值信号线。为了方便起见，如图5所示，该阈值信号线在标准对照和实验曲线图形上可被绘制为水平线。注意，可使用其它非水平线(例如，倾斜的阈值和/或弯曲的线)。应理解，阈值信号线实际上可不被显示(例如，在计算机屏幕上)为线，而替代地可在计算机存储器中被表示为方程，如果该方程被绘制并显示(例如，在计算机屏幕上)给用户，则它将描述线。在某些实施方式中，阈值信号线是曲线(即，不是直线)。
阈值信号线将有在时间零处的初始信号值。即使线现在被拉回到零(例如，直到大约15秒之前第一个未被读取)，阈值信号线可延伸回来，直到碰到Y轴，以确定对于在时间零处的线将存在什么信号值。阈值信号线也有斜率，且可为零(水平线)、负(向下倾斜的线)或正(向上倾斜的线)。信号线可为线性的或可为曲线。所显示的阈值线可通过使用而被移动到任何期望的位置或斜率。
阈值信号线可例如被设置在任何水平，该水平：1)在背景水平之上(例如，在规范化内部染料对照值之上)；2)与实验曲线相交；以及3)与至少两条标准对照曲线相交。在某些实施方式中，可使用额外的标准。例如，阈值信号线被选择成使得它与多于两个的标准对照曲线相交，如果存在多于两个的曲线。在某些实施方式中，阈值信号线被选择成使得它与全部或大部分标准对照曲线相交。在其它实施方式中，如果存在多个实验曲线，则阈值信号线被选择成使得它与这些曲线中的至少两个、优选地所有这些曲线相交。
在特定的实施方式中，阈值信号线被选择成使得成双的标准对照曲线(如果成双的样本被分析)之间的任何可变性被最小化。在其它实施方式中，阈值信号线被选择成使得大部分或全部曲线的线性部分(例如，所关注的曲线)相交。在某些实施方式中，在其余步骤中选择并使用多个阈值信号线。在一些实施方式中，多个阈值信号线被选择成(例如，通过使用或计算机软件)使得所产生的R2值可被比较。在特定的实施方式中，给出较高的R2值(例如，最接近于1.0)的阈值信号线被选择为用于计算未知样本中的拷贝数的值。可使用曲线或其子集中的所有点来测量R2。例如，两个极端的数据点可被取消选定，以便不包括在最佳拟合计算中。这得到使用，例如，其中对特定浓度范围内的样本的子集期望最准确的预测。
在某些实施方式中，使用倾斜的阈值信号线。在特定的实施方式中，使用倾斜的阈值信号线，使得很多或全部曲线(例如，对照和实验曲线)相交。在一些实施方式中，如下所解释的，因而产生的相交点被绘制在对数/线性图表(拷贝数与时间的关系曲线)而不是对数/对数图表上。
图1：步骤7
阈值信号线(或值)接着用于确定每条相关的标准对照和实验曲线与阈值相交的时间值。这可例如通过使用标准对照曲线(例如，图5A)和实验曲线(例如，图5B)的图形并查看在什么时间点阈值与每个曲线相交来进行。这也可使用自动计算相交点的软件应用来进行。该确定的结果可例如在表格中制成图表，该表格列出每个标准对照曲线的靶标拷贝数以及标准对照和实验曲线与阈值相交的时间值。
图1：步骤8
每个标准对照曲线的相交时间值可接着相对于每个标准对照的靶标拷贝数被绘制在对数/对数坐标图或对数/线性曲线(拷贝数与时间的关系曲线)中，以产生可按通常线性斜率排列的对数坐标图数据。优选地，产生具有沿着X轴的拷贝数和沿着Y轴的时间的曲线。在图6中示出在图形上绘制的六个标准对照的实例。
图1：步骤9
接着，标准线性回归方法用于确定对来自步骤8的所绘制的数据点之间的斜率的最佳拟合。确定该斜率产生描述斜率的斜率方程以及用于因而产生的斜率的R2值。在某些实施方式中，阈值信号线(其可由斜率方程描述)在很多不同的位置处(例如，由计算机自动)被测试，以便确定多个R2值。在某些实施方式中，选择具有最高的R2值(例如，最接近于或等于1.0)的阈值信号线，以用于确定实验样本(例如，在下面的步骤10中使用的)中的拷贝数。
图1：步骤10
将对实验样本确定(从步骤7)的相交时间值插入在步骤9中确定的斜率方程中，这允许在实验样本中的靶标拷贝数的反算(backcalculation)。在样本被实时地读取的某些实施方式(例如，计算机软件辅助的实施方式)中，一旦对给定的实验样本(或所有的实验样本)确定了靶标拷贝数，就可停止数据采集(例如，一旦获得答案就不需要继续信号的样本读取)。这是有用的，因为通过停止实时读取可节省额外的时间和资源(例如，另一组样本可被加载到读取设备中)。这在软件配置成使用多个阈值信号线，包括成角度的阈值的场合特别有用，其中答案被快速获得(例如，10-20分钟)，例如当对给定阈值获得某个R2值时。
在使用多个阈值信号线的某些实施方式中，软件可配置成一旦特定的R2值根据任何阈值被获得就报告实验拷贝数结果。在其它实施方式中，多个阈值信号值(例如，所有被使用的值或所有满足因而产生的斜率的最小R2值的值)的使用允许报告实验样本(未知)的一系列结果。例如，当使用多个阈值信号值时，可能五个结果产生具有高于0.98的R2值的因而产生的斜率。这五个结果可导致在29、36、38、42和45的样本中的实验拷贝数。这又允许软件报告实验样本的范围(例如，在未知样本中的29-45个拷贝)。同样，范围的产生可结合设定的限制(例如，FDA要求的限制)例如在血液筛查中使用。具有特定靶标的太多靶标拷贝数的任何特定的血液样本可被认为“失败的”(例如，如果截断范围是30，且29-45的范围被报告，则该样本被认为失败了，即使将阈值设置在其它较高的R2值水平将使样本“通过”)。因此，在一些实施方式中，最低预测的拷贝数结果用于选择行动的进程。在需要最少数量的靶标的其它实施方式中，系统要求每个曲线在选择行动的进程中报告高于预定拷贝数的结果。
II.快速量化结果
本发明的方法和应用允许在实验样本中的拷贝数的非常快速的量化。在本领域中已知的方法常常需要一小时或数小时来提供可靠的量化结果。然而，本发明允许在以秒或分钟测量的时间值中获得可靠的量化结果。例如，在特定的实施方式中，在实验样本中的量化的靶标拷贝数在从分析信号水平首次从实验样本被检测到时起的大约150秒或更少的时间内(例如，在大约75秒…大约100秒…大约125秒…或大约150秒内)产生。在一些实施方式中，在实验样本中的量化的靶标拷贝数在从分析信号水平首次从实验样本被检测到时起的大约45分钟或更少的时间内(例如，在大约5分钟…大约15分钟…大约30分钟…或大约45分钟内)产生。在某些实施方式中，在实验样本中的量化的靶标拷贝数在从分析信号首次从实验样本被检测到时起的大约2分钟和大约35分钟之间产生。
快速量化可使用本发明的方法实现，因为一旦至少两个标准对照s形曲线和实验曲线通过阈值信号线，就可产生可靠的量化信息，这常常对很多实验样本发生得非常早。例如，图5示出来自实例1的标准对照和实验曲线。实验样本B4(在图5B中示出)被看到在大约110秒处通过阈值。如图5A所示，三个标准对照曲线都在大约120-130秒通过阈值。因此，实验样本B4中的靶标拷贝数可在大约130秒之后从实验样本中的初始信号检测计算出。如果阈值信号线设置成低于图5所示的1.6，则该快速量化可甚至对B4样本进一步减小。例如，阈值可设置在1.0(其表示背景信号)之上的任何地方并仍然与三个标准对照曲线和B4实验曲线中的每个相交。例如，阈值信号线可被设置在大约1.1，这将允许在大约105-110秒处实现量化结果。
在某些实施方式中，阈值信号线被设置为非水平斜率(例如，向下的斜率)，其可允许更多的曲线相交得更快。在这样的实施方式中，可获得快速的量化结果，因为不必等待所关注的曲线达到水平阈值信号线。在这样的实施方式中，可在20分钟或更少的时间或15分钟或更少的时间(例如，在12和15分钟之间、或在5-10分钟之间、或在1-5分钟之间)内获得结果。
优选地，本发明的方法包括在可操作地链接到信号检测设备的计算机上的软件应用中。在这方面，曲线可自动(并快速地)产生，且一旦必要的曲线通过阈值信号线，就可很快(例如，在一秒或更少的时间内)计算出实验样本中的最终量化拷贝数，从而允许用户尽可能快地拥有量化拷贝数。
III.示例性核酸检测分析法
本发明的方法和系统可与可随着时间的过去产生可拟合到曲线的结果的任何核酸检测分析法一起使用。例如，本发明的方法、系统和应用可在检测分析法中得到使用，包括但不限于酶错配裂解方法(例如，Variagenics，美国专利号6,110,684、5,958,692、5,851,770，其在这里通过引用被全部并入)；聚合酶链反应；分支杂交方法(例如，Chiron，美国专利号5,849,481、5,710,264、5,124,246和5,624,802，其在这里通过引用被全部并入)；滚环复制(例如美国专利号6,210,884、6,183,960和6,235,502，其在这里通过引用被全部并入)；NASBA(例如，美国专利号5,409,818，其在这里通过引用被全部并入)；分子信标技术(例如，美国专利号6,150,097，其在这里通过引用被全部并入)；E传感器技术(Motorola，美国专利号6,248,229、6,221,583、6,013,170和6,063,573，其在这里通过引用被全部并入)；循环探针技术(例如，美国专利号5,403,711、5,011,769和5,660,988，其在这里通过引用被全部并入)；DadeBehring信号扩增方法(例如，美国专利号6,121,001、6,110,677、5,914,230、5,882,867和5,792,614，其在这里通过引用被全部并入)；连接酶链反应(Barnay Proc.Natl.Acad.Sci USA 88，189-93(1991))；FULL-VELOCITY分析；以及夹心杂交方法(例如，美国专利号5,288,609，其在这里通过引用被全部并入)。
优选地，核酸检测分析法配置成在等温条件下运行。这样的核酸检测分析法的一个例子是侵入性裂解分析法，例如INVADER分析法。在I NVADER分析法中，当两个核酸链或寡核苷酸(探针寡核苷酸和INVADER寡核苷酸)链都杂交到靶核酸链使得它们形成重叠的侵入裂解结构时，如下所述，侵入裂解可能出现。通过裂解剂(例如，5’核酸酶)与上游寡核苷酸(INVADER寡核苷酸)的交互作用，可使裂解剂在内部位置使下游寡核苷酸(探针)裂解，以此方式产生不同的片段。这样的实施方式称为INVADER分析法(第三波技术)并在美国专利号5,846,717、5,985,557、5,994,069、6,001,567和6,090,543、WO 97/27214、WO 98/42873(Lyamichey et al.，Nat.Biotech.，17：292(1999)，Hall et al.，PNAS，USA，97：8272(2000))中被描述，其中每个专利在这里为了所有目的通过引用被全部并入。INVADER分析法借助于结构特定的酶通过特定结构的酶裂解来检测探针与靶标的杂交。
INVADER分析法通过使用结构特定的酶(例如，FEN内切核酸酶)来检测特定的DNA和RNA序列，以使通过重叠的寡核苷酸探针的杂交形成的复合物裂解。对于每个存在的靶序列，高温和一个探针的超出量使多个探针能够裂解，而没有温度循环。在一些实施方式中，这些裂解的探针接着引导第二被标记的探针(例如，FRET盒)的裂解。次级探针寡核苷酸可使用由内部染料猝灭的荧光素被标记为5’端。当裂解时，使用标准荧光板读数器可检测去猝灭荧光素标记的产物。
INVADER分析法可检测在未扩增的以及扩增的包括基因组DNA的DNA和RNA中的特定突变和SNP。在某些实施方式中，INVADER分析使用两个级联式步骤(初级和次级反应)，这两个步骤都产生并接着扩增靶标特定的信号。为了方便起见，以下讨论中的等位基因被描述为野生型(WT)和突变型(MT)，即使该技术不适用于所有的基因变异。在初级反应中，WT初级探针和INVADER寡核苷酸一前一后地与靶核酸杂交，以形成重叠的结构。不成对的“片状物”包括在WT初级探针的5’端上。结构特定的酶(例如，裂解酶，第三波技术)识别重叠并劈开不成对的片状物，释放它作为靶标特定的产物。在次级反应中，该裂解的产物用作在WT荧光共振能量转移(WT-FRET)探针上的INVADER寡核苷酸，以再次产生结构特定的酶所识别的结构。当单个FRET探针上的两个染料通过裂解分离时，产生在背景荧光之上的可检测的荧光信号。结果，该第二结构的裂解导致荧光的增加，指示WT等位基因(或突变等位基因，如果分析法配置成用于突变等位基因以产生可检测的信号)的存在。在优选实施方式中，为待检测的每个等位基因或基因座提供具有不同标记(例如，通过发射或激发波长中的差异可分辨，或通过时间分辨的荧光检测可分辨)的FRET探针，以便不同的等位基因或基因座可在单次反应中被检测。在这样的实施方式中，初级探针组和不同的FRET探针可在单次分析中合并，允许比较来自同一样本中的每个等位基因或基因座的信号。
如果初级探针寡核苷酸和靶核苷酸序列在裂解位置不完全地匹配，则重叠结构不形成，且裂解被抑制。所使用的结构特定的酶(例如，裂解VIII酶，第三波技术)使重叠结构比非重叠结构更有效地(例如，至少340倍)裂解，允许良好地辨别等位基因。
在INVADER分析法中，探针可在没有温度循环的情况下翻转，以对每个靶标产生很多信号(即，线性信号扩增)。类似地，每个靶标特定的产物可实现很多FRET探针的裂解。对照正被检测的靶DNA(或RNA)引导初级INVADER分析反应。靶DNA或RNA是第一侵入裂解中的限制成分，因为INVADER和初级探针在摩尔过量中被提供。在第二侵入裂解中，释放的片状物是有限的。当连续执行这两个裂解反应时，来自复合反应的荧光信号相对于靶DNA量线性地累积。
IV.基因分型应用
除了确定样本中的拷贝数的本发明的方法、系统和软件应用的使用以外，本发明对基因分型也是有用的。这样的使用的一个示例性实施方式是使用INVADER检测分析法。如果两个探针在裂解的碱基不同并相应于靶标的碱基变化或基因型，通过使两个不同的5’片状物连接到探针可使用基因分型INVADER反应。当5’片状物裂解时，通过使用裂解的片状物作为FRET盒上的侵入oligo可获得FRET盒的次级裂解。FRET盒以相应于基因型特定的裂解的初级探针的不同染料(例如，FAM和RED)被标记。
通过监控作为时间的函数的FAM和RED荧光信号可执行一般的基因分型实时INVADER分析法。指定在背景水平之上的每个染料的阈值，并确定每个样本与阈值相交的时间点。绘制FAM的阈值时间与RED的关系曲线的散点图将导致可用于确定未知样本的基因型的散点图。具有低FAM时间和高RED时间的样本相应于FAM探针或等位基因，而具有高FAM时间和低RED时间的样本相应于RED探针或等位基因。类似地，具有中等FAM和RED时间(即，落在散点图的中部)的样本是杂合样本。此同一方法也可与其它核酸检测分析法一起使用。
实验
下列实例被提供以便演示并进一步说明本发明的某些优选实施方式和方面且不应被解释为限制其范围。
在接下来的实验公开中，下列缩写适用：N(常态)；M(摩尔)；mM(毫摩尔)；μM(微摩尔)；mol(克分子)；mmol(毫克分子)；μmol(微克分子)；nmol(毫微克分子)；pmol(皮可克分子)；g(克)；mg(毫克)；μg(微克)；ng(毫微克)；l或L(升)；ml(毫升)；μl(微升)；C(摄氏度)；以及R2(R2)。
实例1
使用阈值和对数/对数坐标图的靶序列量化
该实例描述了使用可产生检测曲线的核酸检测分析法并使用采用从标准对照曲线产生的阈值和对数/对数坐标图的方法，来量化三个未知实验样本中的靶序列的拷贝数。在该实例中的靶序列是微RNAmiR-21，且核酸检测分析法是使用具有FAM标记的FRET盒的INVADER核酸检测分析法。
所使用的七个已知标准品具有下列靶标拷贝数：1)6x106；2)857,143；3)122,449；4)17,493；5)2,499；6)357；以及7)51。
规范化染料标记的寡核苷酸被添加到反应，以说明由于滴管吸取误差的机器噪声造成的信号波动。此染料标记的寡核苷酸在INVADER反应中不干扰或起作用，并在光谱上是不同的且与在INVADER反应FRET盒中使用的染料区分开。Yakima黄色标记的寡核苷酸(T10)用作内部规范化染料(25nM)并包括在所有反应的孔中。所测试的三个实验样本被标为B4、E4和F4。样本使用FAM标记的FRET以及使用内部黄色染料运行。
最初使用表1中示出的参数对标准品和实验执行PCR：
表1
Figure GPA00001084490300241
INVADER分析试剂(例如，探针oligo、INVADER oligo、FRET盒和裂解酶)接着被添加到实验、标准对照和内部对照样本。反应在50摄氏度运行，且对249个循环每11秒取一次荧光信号读数。
在图2A-22D中示出来自标准对照和内部对照(根据内部染料对照被规范化)的结果。在图3A-3E中示出三个实验样本(根据内部染料对照被规范化)的结果。来自图2和3的规范化结果接着被绘制(荧光与时间的关系曲线)在X-Y图形中。来自图2和3的规范化图接着使用将每两个数据点与线拟合的程序被拟合到曲线。在图4中示出其结果。为了方便起见，在图4A中示出标准对照曲线，而在图4B中示出实验曲线。
接着，确定阈值信号线，其可被绘制到图4所示的曲线图上。阈值信号线根据下面的示例性标准设置在荧光信号水平处。首先，阈值被设置在大于由规范化内部染料对照(具有黄色内部染料的那些样本)所表示的背景的信号水平处。在该实例中，来自内部染料对照的规范化信号为1.0，因为将得到的原始数字除以本身导致了1.0的值。接着，阈值信号线设置成使得它与在背景之上(在该实例中为在1.0之上)的所有标准对照和实验曲线相交。在该实例中，实验样本F4只向上延伸到1.7。因此，为了与该曲线和所有其它曲线相交，阈值被选择成在大约1.7之下。可使用的但在该实例中不影响阈值的另一参数是为每个标准选择最小化两个成双的曲线之间的可变性的阈值。根据上面的标准，对该实例的阈值信号线可被设置在1.0和大约1.7之间的任何地方。然而，优先使用的一个额外的参数是设置阈值，使得大部分或全部曲线的信号增长部分相交。在该实例中，为了确保所有标准和未知曲线的信号增长部分在曲线中的未饱和点处相交，最终阈值设置在1.6左右。图5示出对标准对照曲线(图5A)和实验曲线(图5B)被描绘为水平线、设置在大约1.6的阈值信号线。
一旦设置了阈值信号线，这就允许确定每个标准对照曲线与阈值信号线相交的时间点。在该实例中，确定了阈值信号线在以下表2中示出的时间点处与标准对照曲线相交。
表2
  时间1(秒)   时间2(秒)   平均时间(秒)   Stdev
  miR-21拷贝数/rxn
  6,000,000   63.0   64.1   63.6   0.4
  857,143   108.7   112.0   110.4   1.2
  122,449   169.4   163.6   166.5   2.1
  17,493   307.5   332.0   319.7   8.7
  2,499   722.9   731.5   727.2   3.0
  357   1934.8   2036.1   1985.4   35.8
令人惊异地发现，六个标准品中的每个的平均相交时间值可相对于标准的靶标拷贝数以对数与对数的关系曲线的格式被绘制，以产生通常线性的斜率。特别是，每个标准对照(以对数格式)的拷贝数和时间首先被绘制在图形上(见图6中的六个数据点)。接着，标准线性回归方法用于确定对这些数据点之间的斜率的最佳拟合(见图6)。该斜率由根据线性回归确定的斜率方程描述。在该实例中，斜率由下面的斜率方程描述：y＝11647X-0.3453。
接着，确定阈值信号线与实验曲线相交的位置。在该实例中，确定了阈值信号线在以下表3中示出的时间点处与三条实验曲线相交。
表3
  样本ID   时间(秒)   miR-21的反算拷贝数
  B4   126.0   493,158
  E4   795.2   2,377
  F4   2367.2   101
使用上面确定的斜率方程(y＝11647X-0.3453)和在表3中被表示为该方程中的X的相交时间点，允许在实验样本中存在的miR-21的拷贝数的反算。在表3中示出三个实验样本中的每个的计算量。
实例2
具有交替阈值的靶序列量化
该实例以与实例1类似的方式运行。在该实例中，所有数据相应于miR-21(FAM)或U6 snRNA(ROX)的已知拷贝数。FAM数据相应于每个水平的双份样本中的miR-21。靶标水平(即，拷贝数)在图7中的平板显示器中示出并且如下：6,000,000；1,200,000；240,000；48,000；9,600；1,920；384；以及0。ROX数据相应于每个水平的双份样本中的U6和/或U24snRNA，且靶标水平(即，拷贝数)如下：36,000,000；7,200,00；1,440,000；288,000；57,600；11,520；2,304；以及0。
该实例示出不同阈值信号值的选择可如何影响结果和结果的质量，这些结果由本发明的方法和应用的实施方式产生。图7示出显示标准对照曲线的屏幕截图。还示出与大部分曲线相交的水平信号阈值。相交时间点被绘制(在双对数基础上)在图7的右下角中示出的第二图形上。这些相交时间点被拟合到具有特定的R2值的因而产生的斜率。在图7的左下面板中还示出显示每个样本孔的染料和内容物(例如，对照孔的样本数内容物)的平板显示器。如图8所示，阈值信号线可被调节得更高，这允许R2的实时变化。在图8的屏幕中的阈值水平具有比图7的屏幕中的阈值水平更差的拟合(R2更低)。
在一些情况下，单个(线性)阈值不能与所有的样本曲线相交，使它仅仅是可局部适用的。在这样的情况下，多于一个的阈值可被添加到系统，且每个阈值被分开地调节和应用，如图9所示。在某些实施方式中，应用和方法允许充分调节阈值信号线的斜率。例如，可使用向下倾斜的阈值信号线来代替水平阈值信号线。如图10所示，阈值信号线现在具有甚至更高的R2(与图7所示的最佳拟合平坦阈值比较)，且它现在与所有样本曲线相交，使它在预测每个测试样本中的靶标的数量中是有用的。此外，双对数“最佳拟合”图表(右下)可被制成对数-线性的，常常导致甚至更好的优良拟合(例如，R2值)或至少(如图11的屏幕所示)对最佳拟合阈值的大得多的斜率-意味着所需要的总运行时间极大地减少了。
最后，图12示出与图8相同的屏幕截图，除了示出七个不同的倾斜的阈值信号值连同七个因而产生的斜率，其中每个斜率具有可被比较的不同R2值。该屏幕截图例如说明，搜索计算机软件可通过尝试很多(例如，数千或数百万)不同的阈值以找到产生具有最高R2值的因而产生的斜率的一个阈值来执行。
在以上说明书中提到的所有出版物和专利在这里通过引用被并入。本发明的所述方法和系统的各种更改和变化对本领域的技术人员是明显的，而不偏离本发明的范围和精神。虽然结合特定的优选实施方式描述了本发明，应理解，所要求权利的本发明不应过度地被限制到这样特定的实施方式。实际上，对分子生物学、数学或相关领域中的技术人员明显的用于实现本发明的所述方式的各种更改被规定为在下列权利要求的范围内。

Claims (11)

1.一种方法，其用于量化实验样本中的靶标，所述方法包括：
a)提供：
i)初始信号数据，其包括以多个时间间隔从实验样本和包含不同的已知靶标拷贝数的至少两个标准对照样本检测的分析信号水平，其中所述初始信号数据能够被绘制为实验曲线和至少两个标准对照曲线；以及
ii)阈值信号线，其具有i)在时间零处的初始信号值，以及ii)阈值斜率；其中所述阈值信号线在背景水平之上并与所述实验曲线和所述至少两个标准对照曲线中的两个或多个标准对照曲线相交；以及
b)处理所述初始信号数据和所述阈值信号线，以产生实验相交时间值和至少两个标准对照相交时间值；
c)处理所述至少两个标准对照相交时间值和所述已知靶标拷贝数，以产生包括所述相交时间值与所述已知靶标拷贝数的关系曲线的对数/对数坐标图或线性/对数坐标图的坐标的对数坐标图数据；
d)处理所述对数坐标图数据，以产生描述与所述对数坐标图数据拟合的因而产生的斜率的斜率方程；以及
e)使用所述斜率方程处理实验相交时间值，以对所述实验样本产生量化的靶标拷贝数，
其中所述靶标为核酸序列，并且所述分析信号水平由侵入性裂解分析法产生。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述阈值斜率为零，或其中所述阈值斜率为负。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述侵入性裂解分析法在等温条件下执行。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述核酸序列包括微RNA或siRNA序列。
5.一种方法，其用于量化实验样本中的靶标，所述方法包括：
a)提供：
i)用户接口，其配置成接收初始信号数据，以及
ii)计算机系统，其中储存了靶标量化软件应用，以及
b)将所述初始信号数据从所述用户接口传输到所述计算机系统，其中所述初始信号数据包括以多个时间间隔从实验样本和包含不同的已知靶标拷贝数的至少两个标准对照样本检测的分析信号水平，其中所述信号数据能够被绘制为实验曲线和至少两个标准对照曲线；
c)使用所述靶标量化软件应用来处理所述信号数据，以便所述靶标量化软件：
i)产生阈值信号线，所述阈值信号线具有i)在时间零处的初始信号值，以及ii)阈值斜率；其中所述阈值信号线在背景水平之上并与所述实验曲线和所述至少两个标准对照曲线中的两个或多个标准对照曲线相交；
ii)处理所述信号数据和所述阈值信号线，以产生实验相交时间值和至少两个标准对照相交时间值；
iii)处理所述至少两个标准对照相交时间值和所述已知靶标拷贝数，以产生包括所述相交时间值与所述已知靶标拷贝数的关系曲线的对数/对数坐标图或线性/对数坐标图的坐标的对数坐标图数据；
iv)处理所述对数坐标图数据，以产生描述与所述对数坐标图数据拟合的因而产生的斜率的斜率方程；以及
v)使用所述斜率方程处理所述实验相交时间值以对所述实验样本产生量化的靶标拷贝数，
其中所述靶标为核酸序列，并且所述分析信号水平由侵入性裂解分析法产生。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述阈值斜率为零，或其中所述阈值斜率为负。
7.如权利要求5所述的方法，其中所述侵入性裂解分析法在等温条件下执行。
8.如权利要求5所述的方法，其中所述核酸序列包括微RNA或siRNA序列。
9.一种系统，其用于量化实验样本中的靶标，所述系统包括：
a)设备，其配置成以多个时间间隔从实验样本和包含不同的已知靶标拷贝数的至少两个标准对照样本检测分析信号水平，以产生初始信号数据；
b)靶标量化软件应用，其配置成：
i)处理所述初始信号数据，以产生能够被绘制为实验曲线和至少两个标准对照曲线的信号数据；
ii)产生阈值信号线，所述阈值信号线具有i)在时间零处的初始信号值，以及ii)阈值斜率；其中所述阈值信号线在背景之上并与实验曲线和所述至少两个标准对照曲线中的两个或多个标准对照曲线相交；
iii)处理所述信号数据和所述阈值信号线，以产生实验相交时间值和至少两个标准对照相交时间值；
iv)处理所述至少两个标准对照相交时间值和所述已知靶标拷贝数，以产生包括所述相交时间值与所述已知靶标拷贝数的关系曲线的对数/对数坐标图或线性/对数坐标图的坐标的对数坐标图数据；
v)处理所述对数坐标图数据，以产生描述与对所述数坐标图数据拟合的因而产生的斜率的斜率方程；以及
vi)使用所述斜率方程处理所述实验相交时间值，以对所述实验样本产生量化的靶标拷贝数；以及
c)计算机系统，其中储存了所述靶标量化软件应用，其中所述计算机系统包括计算机存储器和计算机处理器。
其中所述靶标为核酸序列，并且所述分析信号水平由侵入性裂解分析法产生。
10.如权利要求9所述的系统，其中所述侵入性裂解分析法在等温条件下运行。
11.如权利要求9所述的方法，其中所述核酸序列包括RNA或DNA序列。
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