ES2370169T3 - Composiciones y métodos para detectar el virus de la hepatitis b. - Google Patents

Abstract

Un kit para amplificar ácidos nucleicos dianas del VHB que pueden estar presentes en un muestra biológica, que comprende: un primer cebador seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NO: 26, que compren- den opcionalmente en su extremo 5' una primera secuencia de cebador situada hacia el extremo 5' que no es comple- mentaria de los ácidos nucleicos del VHB; un segundo cebador que consiste en la SEQ ID NO: 23, que comprende opcionalmente en su extremo 5' una segunda secuencia de cebador situada hacia el extremo 5' que no es complementaria de los ácidos nucleicos del VHB; un tercer cebador que consiste en la SEQ ID NO: 15, que comprende opcionalmente en su extremo 5' una tercera secuencia de cebador situada hacia el extremo 5' que no es complementaria de los ácidos nucleicos del VHB; y un cuarto cebador que consiste en la SEQ ID NO: 11, que comprende opcionalmente en su extremo 5' una cuarta secuencia de cebador hacia el extremo 5' que no es complementaria de los ácidos nucleicos del VHB.

Description

Composiciones y métodos para detectar el virus de la hepatitis B

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de la biotecnología. Más específicamente, la invención se refiere a kits de diagnóstico para detectar los ácido nucleicos del virus de la hepatitis B y opcionalmente del virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 y del virus de la hepatitis C.

Fundamento de la invención

La infección por el virus de la hepatitis B (VHB) está mundialmente extendida y es causa importante de la hepatitis viral tanto aguda como crónica. El VHB es un virus de DNA circular parcialmente bicatenario que tienen un tamaño de la partícula viral de 42 nm. Esta partícula incluye un revestimiento lipoproteínico exterior y el antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg). El HBsAg circula en la sangre unido a partículas virales o como proteína libre no infecciosa, agregada a partículas esféricas y tubulares, de 22 nm. La transmisión del VHB se realiza principalmente por contacto sanguíneo y/o sexual. El periodo de incubación de este virus puede ser de hasta 180 días (Gitlin, Clin. Chem. 43:1500 (1997)).

El HBsAg, que puede ser detectado de 2 a 12 semanas después de una infección con VHB, es el primer marcador serológico de una infección por VHB. La presencia de este marcador precede con frecuencia en 6-8 semanas a los síntomas o anomalías de la bioquímica hepática. Los anticuerpos específicos del antígeno del núcleo de la hepatitis B, que está contenido en la partícula viral, aparecen generalmente 2 semanas después de la detección del HBsAg y permanecen detectables hasta 6 meses después del inicio de la hepatitis aguda (Gitlin, Supra).

El riesgo de transmisión del virus de la hepatitis por transfusiones ha disminuido drásticamente desde 1940 en que fue reconocida por primera vez la hepatitis postransfusional (HPT). Por ejemplo, en 1970 los científicos del NIH (National Institute of Health) publicaron los resultados de un estudio prospectivo para determinar la incidencia de la hepatitis ictérica y anictérica en pacientes que habían sido operados a corazón abierto y recibido sangre de donantes de sangre comerciales o voluntarios. Se desarrolló una hepatitis ictérica y anictérica en el 51% de los receptores de sangre comercial, pero en ninguno de los pacientes que recibieron sangre de donantes voluntarios.

En 1970 se reveló también en una Conferencia del NIH que el antígeno "Australia" (conocido ahora como el antígeno de superficie de la hepatitis B) formaba parte de un agente infeccioso, presumiblemente un virus de la hepatitis. Solo un par de años más tarde, la exclusión simultánea de donantes de sangre comerciales y de donantes positivos al HBsAg redujo la incidencia de la HPT aproximadamente un 7% de la tasa anterior (Tobler et al., Clin. Chem. 43:1487 (1997)). Estas medidas mejoraron espectacularmente la seguridad del suministro de sangre donada.

Más recientemente se ha implementado el análisis de ácidos nucleicos para aumentar la sensibilidad de los ensayos, garantizando con ello un nivel incluso mayor de seguridad en el suministro de sangre donada. Ensayos y reactivos para detectar el VHB han sido descritos anteriormente en, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. Nº 5.780.219 y 4.562.159; y en las Solicitudes de Patente Internacional publicadas Nº WO94/08032 y WO95/02690. El documento WO01/77317 describe generalmente el uso de cuatro cebadores para la amplificación del VHB.

Sumario de la invención

La invención se refiere a un kit para amplificar los ácidos nucleicos dianas del VHB que pueden estar presentes en una muestra biológica, que comprende:

un primer cebador seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NO: 26, que comprenden opcionalmente en su extremo 5' una primera secuencia de cebador situada hacia el extremo 5' que no es complementaria de los ácidos nucleicos del VHB;

un segundo cebador que consiste en la SEQ ID NO: 23, que comprende opcionalmente en su extremo 5' una segunda secuencia de cebador situada hacia el extremo 5' que no es complementaria de los ácidos nucleicos del VHB; un tercer cebador que consiste en la SEQ ID NO: 15, que comprende opcionalmente en su extremo 5' una tercera secuencia de cebador situada hacia el extremo 5' que no es complementaria de los ácidos nucleicos del VHB; y un cuarto cebador que consiste en la SEQ ID NO: 11, que comprende opcionalmente en su extremo 5' una cuarta secuencia de cebador hacia el extremo 5' que no es complementaria de los ácidos nucleicos del VHB.

En una realización muy preferida de esta invención, el kit incluye además al menos una sonda marcada detectablemente que se hibrida con un amplicón del VHB que se produce en una reacción de amplificación realizada utilizando el cebador de la primera cadena y el cebador de la segunda cadena. La sonda marcada detectablemente puede incluir la secuencia SEQ ID NO:50 o su complemento, la SEQ ID NO:57 o su complemento o la SEQ ID NO:55 o su complemento. En una realización alternativa, la sonda marcada detectablemente es una baliza molecular que incluye una secuencia de nucleótidos con forma de bucle complementaria de la diana. Esta secuencia de nucleótidos con forma de bucle complementaria de la diana consiste típicamente en 12-20 nucleótidos contiguos contenidos en la secuencia SEQ ID NO:126 o su complemento, teniendo en cuenta la presencia de análogos de nucleótidos y bases equivalentes de RNA y DNA. El kit incluye además tanto un cebador adicional de la primera cadena como un cebador adicional de la segunda cadena. En este kit la secuencia situada hacia el extremo 3' complementaria de el VHB del cebador de la primera cadena incluye la SEQ ID NO:22, en donde el cebador adicional de la primera cadena incluye la SEQ ID NO:23, en donde la secuencia situada hacia el extremo 3' complementaria de el VHB del cebador de la segunda cadena incluye la SEQ ID NO:15 y en donde el cebador adicional de la segunda cadena incluye la SEQ ID NO:11. En una realización muy preferida de este kit, está incluida además una seudodiana del VHB que está constituida por RNA. En otra realización la secuencia situada hacia el extremo 3' complementaria de el VHB del cebador de la primera cadena puede incluir la SEQ ID NO:23, el cebador adicional de la primera cadena puede incluir la SEQ ID NO:26, la secuencia situada hacia el extremo 3’ complementaria de el VHB del cebador de la segunda cadena puede incluir la SEQ ID NO:15 y el cebador adicional de la segunda cadena puede incluir la SEQ ID NO:11. En términos generales, los kits de acuerdo con la invención pueden incluir además uno o ambos cebadores para amplificar un ácido nucleico diana del VIH-1 y cebadores para amplificar un ácido nucleico diana del VHC.

Definiciones

Las siguientes expresiones tienen los siguientes significados para los fines de esta descripción, salvo si se indica expresamente lo contrario.

Como se usa en la presente memoria, una "muestra biológica" es cualquier tejido o material que contiene polinucleótidos obtenido de un ser humano Las muestras biológicas de acuerdo con la invención incluyen sangre periférica, plasma, suero, médula ósea, tejido de biopsias incluyendo ganglios linfáticos, tejido o exudados de las vías respiratorias, tejido gastrointestinal, muestras de exudados cervicales, semen u otros líquidos, tejidos o materiales corporales. Una muestra biológica se puede tratar para romper el tejido o la estructura celular, liberando con ello los componentes intracelulares en una solución que puede contener enzimas, tampones, sales, detergentes y similares.

Como se usa en la presente memoria, "polinucleótido" significa RNA o DNA, junto con análogos sintéticos de nucleótidos u otras moléculas que pueden estar presentes en la secuencia y que no impiden la hibridación del polinucleótido con una segunda molécula que tiene una secuencia complementaria. El término incluye polímeros que contienen análogos de nucleótidos que existen en la naturaleza y particularmente incluye análogos que tienen un grupo metoxi en la posición 2' de la ribosa (OMe).

Como se usa en la presente memoria, una "marcador detectable" es una especie química que puede ser detectada o puede conducir a una respuesta detectable. Los marcadores detectables de acuerdo con la invención se pueden unir a sondas polinucleotídicas directa o indirectamente e incluyen radioisótopos, enzimas, haptenos, cromóforos, tales como colorantes o partículas que imparten un color detectable (por ejemplo, perlas de látex o partículas metálicas), compuestos luminiscentes (por ejemplo, restos bioluminiscentes, fosforescentes o quimioluminiscentes) y compuestos fluorescentes.

Un "marcador detectable homogéneo" se refiere a un marcador que puede ser detectado de manera homogénea determinando si el marcador está sobre una sonda hibridada con una secuencia diana. Es decir, los marcadores detectables homogéneos se pueden detectar sin separar físicamente las formas hibridadas de las no hibridadas del marcador o de la sonda marcada. Estos marcadores han sido descritos con detalle por Arnold et al., Patente de EE.UU. Nº 5.283.174; Woodhead et al., Patente de EE.UU. Nº 5.656.207; y Nelson et al., Patente de EE.UU. Nº 5.658.737. Los marcadores preferidos para utilizar en ensayos homogéneos incluyen compuestos quimioluminiscentes (por ejemplo, véase Woodhead et al., Patente de EE.UU. Nº 5.656.207; Nelson et al., Patente de EE.UU. Nº 5.658.737; y Arnold, Jr., et al., Patente de EE.UU. Nº 5.639.604). Los marcadores quimioluminiscentes preferidos son compuestos de éster de acridinio (en lo sucesivo abreviadamente "AE" por la expresión inglesa Acridinium Ester), tales como AE estándar o sus derivados (por ejemplo, naftil-AE, orto-AE, 1- o 3-metil-AE, 2,7-dimetil-AE, 4,5-dimetil-AE, orto-dibromo-AE, orto-dimetil-AE, metadimetil-AE, orto-metoxi-AE, orto-metoxi(cinamil)-AE, orto-metil-AE, ortofluoro-AE, 1- o 3-metil-orto-fluoro-AE, 1- o 3metil-meta-difluoro-AE y 2-metil-AE).

Como se indica en la presente memoria, "amplificación" se refiere a un procedimiento in vitro para obtener múltiples copias de una secuencia de ácido nucleico diana, su complemento o sus fragmentos.

Por "ácido nucleico diana" o "diana" se entiende un ácido nucleico que contiene una secuencia de ácido nucleico diana.

Por "secuencia de ácido nucleico diana", "secuencia de nucleótidos diana", "secuencia diana" o "región diana" se entiende una secuencia de desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos que comprende toda o parte de la secuencia de nucleótidos de una molécula de ácido nucleico monocatenario y la secuencia de desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos complementario de ella.

Por "amplificación asociada a la transcripción" (abreviadamente en lo sucesivo AAT por la expresión inglesa Transcription Associated Amplification) se entiende cualquier tipo de amplificación de ácidos nucleicos que usa una RNApolimerasa para producir múltiples transcritos de RNA a partir de un molde de ácido nucleico. Un ejemplo de un método de amplificación asociada a la transcripción, denominada “Amplificación mediada por transcripción” (abreviadamente en lo sucesivo TMA por la expresión inglesa Transcription Mediated Amplification), emplea generalmente una RNApolimerasa, una DNA-polimerasa, trifosfatos de desoxirribonucleósidos, trifosfatos de ribonucleósidos y un oligonucleótido complementario del promotor-molde y opcionalmente puede incluir uno o más oligonucleótidos análogos. Las variaciones de la TMA son muy conocidas en la técnica como las descritas con detalle en Burg et al., Patente de EE.UU. Nº 5.437.990; Kacian et al., Patente de EE.UU. Nº 5.399.491 y 5.554.516; Kacian et al., PCT Nº WO 93/22461; Gingeras et al., PCT Nº WO 88/01302; Gingeras et al., PCT Nº WO 88/10315; Malek et al., Patente de EE.UU. Nº 5.130.238; Urdea et al., Patente de EE.UU. Nº 4.868.105 y 5.124.246; McDonough et al., PCT Nº WO 94/03472; y Ryder et al., PCT Nº WO 95/03430. Para realizar los procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos del tipo descrito en la presente memoria se prefieren los métodos de Kacian et al.

Como se indica en la presente memoria, un "oligonucleótido" u "oligómero" es una cadena polímera de al menos dos, generalmente entre aproximadamente cinco y aproximadamente 100 subunidades químicas, comprendiendo cada subunidad un resto de base nucleotídica, un resto de azúcar y un resto enlazante que une las subunidades en una configuración espacial lineal. Los restos de bases nucleotídicas comunes son guanina (G), adenina (A), citosina (C), timina (T) y uracilo (U), aunque otras bases nucleotídicas raras o modificadas capaces de unirse por puentes de hidrógeno son muy conocidas por los expertos en la técnica. Los oligonucleótidos pueden incluir opcionalmente análogos de cualquiera de los restos de azúcares, los restos de bases y los constituyentes de la cadena principal. Los oligonucleótidos preferidos de la presente invención tienen un tamaño en el intervalo de aproximadamente 10 a aproximadamente 60 residuos. Los oligonucleótidos se pueden purificar a partir de fuentes que existen en la naturaleza, pero preferiblemente se sintetizan usando cualquiera de una variedad de métodos enzimáticos o químicos muy conocidos.

Como se indica en la presente memoria, una "sonda" es un oligonucleótido que se hibrida específicamente con una secuencia diana en un ácido nucleico, preferiblemente en un ácido nucleico amplificado, en condiciones que promuevan la hibridación, para formar un híbrido detectable. Una sonda puede contener un resto detectable que se puede unir al(a los) extremo(s) de la sonda o puede ser interno Los nucleótidos de la sonda que se combinan con el polinucleótido diana necesitan estar estrictamente contiguos, como puede ser el caso de un resto detectable interno en la secuencia de la sonda. La detección puede ser directa (es decir, resultante de una sonda que se hibrida directamente con la secuencia diana o a un ácido nucleico amplificado) o indirecta (es decir, resultante de una sonda que se hibrida con una estructura molecular intermedia que une la sonda a la secuencia diana o a un ácido nucleico amplificado). La "diana" de una sonda se refiere generalmente a una secuencia contenida en una secuencia de ácidos nucleicos amplificados que se hibrida específicamente con al menos una porción de un oligonucleótido sonda utilizando enlaces por puentes de hidrógeno estándares (es decir, apareamiento de bases). Una sonda puede comprender secuencias específicas de la diana y otras secuencias que contribuyen a la conformación tridimensional de la sonda (por ejemplo, como ha sido descrito por Lizardi et al., en las Patentes de EE.UU. Nº 5.118.801 y 5.312.728). Las secuencias que son "suficientemente complementarias" permiten la hibridación estable de un oligonucleótido sonda a una secuencia diana que no es completamente complementaria de la secuencia específica de la diana de la sonda.

Como se indica en la presente memoria, un "cebador de amplificación " es un oligonucleótido que se hibrida con un ácido nucleico diana, o su complemento, y participa en una reacción de amplificación de ácidos nucleicos. Los cebadores de amplificación, o más sencillamente "cebadores" pueden ser un oligonucleótido opcionalmente modificado que sea capaz de hibridarse con un ácido nucleico molde y que tenga un extremo 3' que pueda ser prolongado por una actividad de DNA-polimerasa.

Por "sustancialmente homólogo," "sustancialmente correspondiente" o "corresponde sustancialmente" se entiende que el oligonucleótido sujeto tiene una secuencia de bases que contiene una región de al menos 10 bases contiguas que es al menos 70% homóloga, preferiblemente al menos 80% homóloga, más preferiblemente al menos 90% homóloga y más preferiblemente 100% homóloga a una región de al menos 10 bases contiguas presente en una secuencia de bases de referencia (excluyendo los equivalentes de RNA y DNA). Los expertos en la técnica apreciarán fácilmente las modificaciones que podrían realizarse en las condiciones del ensayo de hibridación en los diversos porcentajes de homología para permitir la hibridación del oligonucleótido con la secuencia diana aunque evitando niveles inaceptables de hibridación no específica. El grado de similitud se determina comparando el orden de las núcleobases que componen las dos secuencias y no considerando otras diferencias estructurales que pueden existir entre las dos secuencias, siempre que las diferencias estructurales no impidan el enlace por puentes de hidrógeno con las bases complementarias. El grado de homología entre dos secuencias que se comparan se puede expresar también en términos del número de desapareamientos de bases presentes en cada conjunto de al menos 10 bases contiguas, que puede variar en 0-2 diferencias de bases.

Por "sustancialmente complementario" se entiende que el oligonucleótido sujeto tiene una secuencia de bases que contiene una región de al menos 10 bases contiguas que es al menos 70% complementaria, preferiblemente al menos 80% complementaria, más preferiblemente al menos 90% complementaria y más preferiblemente 100% complementaria de una región de al menos 10 bases contiguas en una secuencia de ácidos nucleicos diana (excluyendo los equivalentes de RNA y DNA). (Los expertos en la técnica apreciarán fácilmente las modificaciones que podrían realizarse en las condiciones del ensayo de hibridación en los diversos porcentajes de complementariedad para permitir la hibridación del oligonucleótido con la secuencia diana aunque evitando niveles inaceptables de hibridación no específica). El grado de complementariedad se determina comparando el orden de núcleobases que componen las dos secuencias y no tiene en consideración otras diferencias estructurales que puedan existir entre las dos secuencias, siempre que las diferencias estructurales no impidan el enlace por puentes de hidrógeno con las bases complementarias. El grado de complementariedad entre dos secuencias que se comparan se puede expresar también en términos del número de desapareamientos de bases presentes en cada conjunto de al menos 10 bases contiguas, que puede variar en 0-2 desapareamientos de bases.

Por "suficientemente complementaria" se entiende una secuencia de bases de ácidos nucleicos contiguos capaces de hibridarse con otra secuencia de bases por enlace por puentes de hidrógeno entre una serie de bases complementarias. Las secuencias de bases complementarias pueden ser complementarias en cada posición en la secuencia de bases de un oligonucleótido utilizando el apareamiento de bases estándar (por ejemplo, apareamiento G:C, A:T o A:U) o pueden contener uno o más residuos que no son complementarios usando enlaces por puentes de hidrógeno estándares (incluyendo "nucleótidos" abásicos), pero en los que la secuencia de bases complementaria completa es capaz de hibridarse específicamente con otra secuencia de bases en condiciones de hibridación apropiadas. Las bases contiguas son preferiblemente al menos alrededor del 80%, más preferiblemente al menos alrededor del 90%, y más preferiblemente alrededor del 100% complementarias de una secuencia a la que está destinado a hibridarse específicamente un oligonucleótido. Las condiciones de hibridación apropiadas son muy conocidas por los expertos en la técnica, se pueden predecir fácilmente basándose en la composición de las secuencia de bases o se puede determinar empíricamente con ensayos habituales (por ejemplo, véase Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) en los párrafos 1.90-1.91, 7.37-7.57, 9.47-9.51 y 11.47-11.57 particularmente en los párrafos 9.50-9.51, 11.12-11.13, 11.45-11.47 y 11.55-11.57).

Por "oligonucleótido de captura" se entiende al menos un oligonucleótido de ácidos nucleicos que proporciona medios para unir específicamente una secuencia diana y un oligonucleótido inmovilizado debido a la hibridación de pares de bases. Un oligonucleótido de captura incluye preferiblemente dos regiones de unión: una región que se une a una secuencia diana y una región que se une a una sonda inmovilizada, generalmente contigua en el mismo oligonucleótido, aunque el oligonucleótido de captura puede incluir una región que se une a una secuencia diana y una región que se une a una sonda inmovilizada que estén presentes en dos oligonucleótidos diferentes unidos entre sí por uno o más enlazadores. Por ejemplo, una región que se une a una sonda inmovilizada puede estar presente en un primer oligonucleótido, la región que se une a una secuencia diana puede estar presente en un segundo oligonucleótido y los dos oligonucleótidos diferentes se unen por un enlace por puentes de hidrógeno con un enlazador que es un tercer oligonucleótido que contiene secuencias que se hibridan específicamente a las secuencias del primer y segundo oligonucleótidos.

Por "sonda inmovilizada" o "ácido nucleico inmovilizado" se entiende un ácido nucleico que une, directa o indirectamente, un oligonucleótido de captura a un soporte inmovilizado. Una sonda inmovilizada es un oligonucleótido unido a un soporte sólido que facilita la separación de una secuencia diana unida de un material no unido en una muestra.

Por "separación" o "purificación" se entiende que uno o más componentes de la muestra biológica se separan de otro u otros componentes más de la muestra. Los componentes de la muestra incluyen ácidos nucleicos en una fase en solución generalmente acuosa que puede incluir también materiales tales como proteínas, hidratos de carbono, lípidos y sondas marcadas. Preferiblemente, la etapa de separación o purificación elimina al menos alrededor del 70%, más preferiblemente al menos alrededor del 90% e incluso más preferiblemente, al menos alrededor del 95% de los otros componentes presentes en la muestra.

Por "equivalentes de RNA y DNA" o "bases equivalentes de RNA y DNA" se entiende moléculas de RNA y DNA que tienen las mismas propiedades de hibridación de pares de bases complementarias. Los equivalentes de RNA y DNA tienen restos azúcares diferentes (es decir, ribosa frente a desoxirribosa) y pueden diferir en la presencia de uracilo en RNA y timina en DNA. Las diferencias entre equivalentes de RNA y DNA no contribuyen a las diferencias de homología debido a que los equivalentes tienen el mismo grado de complementariedad de una secuencia particular.

Por “consistente esencialmente en” se entiende que el(los) componente(s), la o las composiciones o la(s) etapa(s) del método adicionales que no cambian materialmente las características básicas y nuevas de la presente invención se pueden incluir en las composiciones o kits o métodos de la presente invención. Dichas características incluyen la capacidad de detectar selectivamente ácido nucleicos del VHB en muestras biológicas, tales como sangre completa o plasma, en aproximadamente 100 copias del ácido nucleico del VHB. Cualquier componente(s), composición o composiciones o etapa(s) del método que tengan un efecto material sobre las características básicas y nuevas de la presente invención no estarían incluidas en esta expresión.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es un diagrama esquemático que ilustra los diversos polinucleótidos que se pueden usar para detectar una región diana del ácido nucleico del VHB (representada por una línea horizontal). Se muestran las posiciones de los siguientes ácidos nucleicos con relación a la región diana: "Oligonucleótido de captura" se refiere al ácido nucleico usado para hibridarse con y capturar el ácido nucleico diana antes de su amplificación, donde "T" se refiere a una secuencia de cola usada para hibridarse con un oligonucleótido inmovilizado que tiene una secuencia complementaria (no mostrada); "Cebador no de T7" y "Promotor-Cebador de T7" representan dos cebadores de amplificación usados para realizar la TMA, donde "P" indica la secuencia promotora del promotor-cebador de T7; y "Sonda" se refiere a la sonda usada para detectar el ácido nucleico amplificado.

La Figura 2 es un gráfico lineal que muestra una curva calibradora cuantitativa del VHB que pone de manifiesto la relación lineal entre la cantidad de molde de entrada y la intensidad de la señal de hibridación en un amplio intervalo de cantidades de calibrado.

La Figura 3 es un gráfico lineal que relaciona la cantidad de entrada estándar de VHB en una reacción de amplificación de ácidos nucleicos en tiempo real (eje x) y el tiempo de aparición de la señal fluorescente medida por encima de un umbral del ruido de fondo (eje y).

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a kits para detectar selectivamente los ácidos nucleicos del virus de la hepatitis B (VHB) y opcionalmente del virus de la inmunodeficiencia humana 1 (VIH-1) y/o del virus de la hepatitis C (VHC). Las composiciones descritas en la presente memoria son útiles para amplificar y detectar estos ácidos nucleicos en muestras biológicas, tales como sangre, suero, plasma u otros líquidos o tejidos corporales humanos, en los que se analiza la presencia de ácidos nucleicos virales. Muchos de los cebadores de amplificación descritos en la presente memoria se pueden usar ventajosamente como componentes de reacciones de amplificación múltiple, en las que se pueden producir diversas especies de amplicones a partir de una distribución compleja de cebadores y polinucleótidos accesorios. Por ejemplo, los cebadores específicos del VHB más preferidos descritos en la presente memoria se pueden usar en reacciones de amplificación múltiple que sean capaces de amplificar polinucleótidos de los virus no relacionados sin comprometer sustancialmente las sensibilidades de estos ensayos.

Las sondas, cebadores y métodos descritos en la presente memoria se pueden usar en aplicaciones diagnósticas o para cribar sangre y productos sanguíneos u otros tejidos donados que puedan contener partículas infecciosas. Adicionalmente, se describe un ensayo cuantitativo que emplea técnicas de amplificación de ácidos nucleicos para medir el número de copias de ácido nucleico del VHB en una muestra biológica. Este ensayo cuantitativo representa una importante herramienta para controlar la carga viral en pacientes que están sometidos a una terapia antiviral.

Introducción y visión general

En la presente memoria se describen composiciones (oligonucleótidos de captura de ácidos nucleicos, oligonucleótidos y sondas de amplificación), métodos y kits para detectar ácidos nucleicos de VHB en una muestra biológica. Para diseñar secuencias de oligonucleótidos apropiadas para dichos usos se alinearon en primer lugar secuencias de VHB conocidas, incluyendo subtipos, por medio de regiones de apareamiento que tuvieran secuencias similares y comparando a continuación las secuencias para identificar las regiones candidatas del genoma viral que pudieran servir como reactivos en un ensayo de diagnóstico. Basándose en estas comparaciones, se seleccionó para la detección la región “gen S/gen pol” del genoma del VHB utilizando los oligonucleótidos de captura, cebadores y sondas mostrados esquemáticamente en la Figura 1. Se eligieron como puntos de partida porciones de secuencias que contenían relativamente pocos variantes entre las secuencias comparadas para diseñar oligonucleótidos sintéticos adecuados para utilizar en la captura, amplificación y detección de las secuencias amplificadas. Otras consideraciones en el diseño de oligonucleótidos incluyeron el contenido relativo de GC de la secuencia (que varía desde aproximadamente 30% a aproximadamente 55%), y la ausencia relativa de estructura secundaria predicha (por ejemplo, vueltas de horquillas que forman híbridos intramoleculares) dentro de una secuencia.

Basándose en estos análisis, se diseñaron las secuencias del oligonucleótidos de captura, de los cebadores de amplificación y de la sonda presentadas más adelante. Los que tengan una experiencia normal en la técnica apreciarán que se pueden utilizar como cebadores las secuencias del cebador específicas del VHB, con o sin una secuencia de promotor de T7, en los diversos métodos de amplificación in vitro basados en los cebadores descritos más adelante. Adicionalmente, se considera también que las sondas de hibridación descritas en la presente memoria podrían utilizarse como cebadores de amplificación y que los cebadores de amplificación descritos en la presente memoria podrían utilizarse como sondas de hibridación. Aún más, se prevé que las sondas de hibridación descritas en la presente memoria podrían utilizarse como oligonucleótidos de captura y que los oligonucleótidos de captura descritos en la presente memoria podrían utilizarse como sondas de hibridación. Incluso todavía más, se prevé que los cebadores de amplificación descritos en la presente memoria podrían utilizarse como oligonucleótidos de captura y que los oligonucleótidos de captura descritos en la presente memoria podrían utilizarse como cebadores de amplificación.

Métodos de amplificación útiles

Los métodos de amplificación útiles relacionados con la presente invención incluyen: amplificación mediada por transcripción (TMA), Amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos (abreviadamente NASBA por la expresión inglesa Nucleic Acid Sequence-Based Amplification), la reacción en cadena de la polimerasa (abreviadamente PCR por Polymerase Chain Reaction), Amplificación por desplazamiento de cadenas (abreviadamente SDA por Strand Displacement Amplification) y métodos de amplificación que utilizan moléculas de polinucleótidos auto-replicantes y enzimas de replicación, tales como RNA de MDV-1 y la enzima Q-beta. Los métodos para realizar estas diversas técnicas de amplificación se pueden encontrar respectivamente en la Patente de EE.UU. Nº 5.399.491, la Solicitud de Patente europea publicada EP 0525882, las Patentes de EE.UU. Nº 4.965.188, Nº 5.455.166, Patente de EE.UU. Nº 5.472.840 y Tizardi et al., BioTechnology 6:1197 (1988).

Las secuencias de ácidos nucleicos del VHB se pueden amplificar utilizando un protocolo de TMA. De acuerdo con este protocolo, la transcriptasa inversa que proporciona la actividad de DNA-polimerasa posee también una actividad RNasa H endógena. Uno de los cebadores usados en este procedimiento contiene una secuencia de promotor situada hacia el extremo 5' de una secuencia que es complementaria de una cadena de un ácido nucleico diana que ha de ser amplificado. En la primera etapa de amplificación, un promotor-cebador se hibrida con el DNA diana del VHB en un sitio definido. La transcriptasa inversa crea una copia del DNA complementaria de el DNA diana por extensión del extremo 3' del promotor-cebador. Después de la interacción de un cebador de cadena opuesta con la cadena de DNA recién sintetizada, se sintetiza una segunda cadena de DNA desde el extremo del cebador por transcriptasa inversa, creando con ello una molécula de DNA bicatenario. La RNA-polimerasa reconoce la secuencia de promotor en este molde de DNA bicatenario e inicia la transcripción. Cada uno de los amplicones de RNA recién sintetizados vuelve a entrar en el proceso de la TMA y sirve como molde para una nueva ronda de replicaciones, conduciendo con ello a una expansión exponencial del amplicón de RNA. Puesto que cada uno de los moldes de DNA puede realizar 100-1000 copias de amplicón de RNA, esta expansión puede dar como resultado la producción de 10 mil millones de amplicones en menos de una hora. Todo el proceso es autocatalítico y se realiza a temperatura constante.

Características estructurales de los cebadores

Como se ha indicado anteriormente, un "cebador" se refiere a un oligonucleótido opcionalmente modificado que es capaz de hibridarse con un ácido nucleico molde y que tienen un extremo 3' que puede ser prolongado por una actividad de DNA-polimerasa. La región 5’ del cebador puede no ser complementaria de el ácido nucleico diana. Si la región 5’ no complementaria incluye una secuencia promotora, se denomina "promotor-cebador". Los expertos en la técnica apreciarán que un oligonucleótido que pueda actuar como cebador (es decir, un oligonucleótido que se hibrida específicamente a una secuencia diana y tiene un extremo 3' capaz de ser prolongado por una actividad de DNA-polimerasa) puede ser modificado para que incluya una secuencia de promotor en 5' y por consiguiente pueda actuar como promotor-cebador. Igualmente, un promotor-cebador se puede modificar por eliminación de una secuencia de promotor o por síntesis sin dicha secuencia y actuar todavía como cebador.

Los restos de bases nucleotídicas de cebadores se pueden modificar (por ejemplo, por adición de grupos propino), siempre que el resto de bases modificado mantenga su capacidad para formar una asociación no covalente con G, A, C, T o U y siempre que un oligonucleótido que comprenda al menos un resto de bases nucleotídicas modificado no esté estéricamente impedido de hibridarse con un ácido nucleico monocatenario. Como se indica a continuación en relación con la composición química de sondas útiles, las bases nitrogenadas de los cebadores de acuerdo con la invención pueden ser bases convencionales (A, G, C, T, U), sus análogos conocidos (por ejemplo, inosina o "T"; véase The Biochemistry of the Nucleic Acids 5-36, Adams et al., ed., 11ª ed., 1992), derivados conocidos de bases purínicas o pirimidínicas (por ejemplo, N4-metil-desoxiguanosina, desaza- o aza-purinas y desaza- o aza-pirimidinas, bases pirimidinas que tienen grupos sustituyentes en la posición 5 o 6, bases purínicas que tienen un sustituyente alterado o reemplazado en las posiciones 2, 6 u 8, 2-amino-6-metilaminopurina, O6-metilguanina, 4-tio-pirimidinas, 4-amino-pirimidinas, 4dimetilhidrazina-pirimidinas y O4-alquil-pirimidinas (véase, Cook, Publicación de Patente internacional PCT Nº WO 93/13121) y residuos "abásicos" en los que la cadena principal incluye bases no nitrogenadas en uno o más residuos del polímero (véase Arnold et al., Patente de EE.UU. Nº 5.585.481). Restos de azúcares comunes que comprenden la cadena principal del cebador incluyen ribosa y desoxirribosa, aunque también se pueden usar 2'-O-metil-ribosa (OMe), azúcares halogenados y otros restos azúcares modificados. Generalmente, el grupo enlazador de la cadena principal del cebador es un resto que contiene fósforo, más generalmente un enlace fosfodiéster, aunque también se utilizan en el ensayo descrito en la presente memoria otros enlazadores, tales como por ejemplo, fosforotioatos, metilfosfonatos y enlazadores que no contienen fósforo, tales como enlazadores similares a péptidos encontrados en "ácidos nucleicos peptídicos" (abreviadamente PNA por Peptide Nucleic Acids).

Sistemas para marcaje de sondas y restos detectables útiles

Esencialmente se puede usar cualquier sistema de marcaje y detección para monitorizar la hibridación de ácidos nucleicos específicos junto con la presente invención. Incluidos entre el conjunto de marcadores útiles están los radiomarcadores, enzimas, haptenos, oligonucleótidos enlazados, moléculas quimioluminiscentes y restos redox activos que pueden ser empleados en métodos de detección electrónicos. Las moléculas quimioluminiscentes preferidas incluyen ésteres de acridinio del tipo descrito por Arnold et al., en la Patente de EE.UU. Nº 5.283.174 para uso con ensayos de protección homogéneos y del tipo descrito por Woodhead et al., en la Patente de EE.UU. Nº 5.656.207 para uso con ensayos que cuantifican múltiples dianas en una sola reacción. Los métodos de marcaje y detección electrónicos preferidos están descritos en las Patentes de EE.UU. Nº 5.591.578 y 5.770.369 y en la Solicitud de Patente Internacional publicada WO 98/57158. Los restos redox activos útiles como marcadores en la presente invención incluyen metales de transición, tales como Cd, Mg, Cu, Co, Pd, Zn, Fe y Ru.

Los marcadores detectables particularmente preferidos para sondas de acuerdo con la presente invención son detectables en sistemas de ensayo homogéneos (es decir, donde, en una mezcla, la sonda marcada unida presenta un cambio detectable, tal como degradación diferencial o de la estabilidad, en comparación con una sonda marcada no unida). Un marcador preferido para utilizar en ensayos homogéneos es un compuesto quimioluminiscente (por ejemplo, como el descrito por Woodhead et al., en la Patente de EE.UU. Nº 5.656.207; por Nelson et al., en la Patente de EE.UU. Nº 5.658.737; o por Arnold et al., en la Patente de EE.UU. Nº 5.639.604). Los marcadores quimioluminiscentes particularmente preferidos incluyen compuestos de éster de acridinio ("AE"), tal como AE estándar o sus derivados, tales como naftil-AE, orto-AE, 1- o 3-metil-AE, 2,7-dimetil-AE, 4,5-dimetil-AE, orto-dibromo-AE, ortodimetil-AE, meta-dimetil-AE, orto-metoxi-AE, orto-metoxi(cinamil)-AE, ortometil-AE, orto-fluoro-AE, 1-o 3-metil-orto-fluoro-AE,1-o 3-metil-metadifluoro-AE y 2-metil-AE.

En algunas aplicaciones, son deseables sondas que presenten al menos algún grado de auto-complementariedad para facilitar la detección de los dúplex sonda:diana en una muestra de ensayo sin requerir en primer lugar la retirada de la sonda no hibridada antes de la detección. A modo de ejemplo, se diseñan estructuras denominadas “antorchas moleculares” para incluir distintas regiones de auto-complementariedad (denominadas "el dominio que se une a la diana" y "el dominio de cierre de la diana") que están conectadas por una región de unión y que se hibridan entre sí en condiciones de ensayo de hibridación predeterminadas. Cuando se exponen a condiciones de desnaturalización, las dos regiones complementarias (que pueden ser total o parcialmente complementarias) de la antorcha molecular funden, dejando el dominio de unión a la diana disponible para la hibridación con una secuencia diana cuando se restablecen las condiciones de ensayo de hibridación predeterminadas. Las antorchas moleculares se diseñan de modo que el dominio de unión a la diana favorezca la hibridación con la secuencia diana sobre el dominio de cierre de la diana. El dominio de unión a la diana y el dominio de cierre de diana de una antorcha molecular incluyen marcadores interactuantes (por ejemplo, agente luminiscente/extintor de fluorescencia) situados de modo que se produzca una señal diferente cuando la antorcha molecular se auto-hibrida de modo opuesto a cuando la antorcha molecular se hibrida con un ácido nucleico diana, permitiendo con ello la detección de los dúplex sonda:diana en una muestra de ensayo en presencia de una sonda no hibridada que tenga un marcador viable asociado a ella. Las antorchas moleculares están completamente descritas en la Publicación de patente Internacional Nº WO 00/01850.

Otro ejemplo de sonda auto-complementaria en un ensayo de hibridación que se puede utilizar en la invención es una estructura denominada generalmente “baliza molecular”. Las balizas moleculares comprenden moléculas de ácido nucleico con una secuencia complementaria de la diana, un pareja de afinidad (o brazos de ácido nucleico) que mantienen la sonda en una conformación cerrada en ausencia de una secuencia de ácidos nucleicos diana y una pareja de marcadores que interactúan cuando la sonda está en conformación cerrada. La hibridación del ácido nucleico diana y la secuencia complementaria de la diana separa los miembros de la pareja de afinidad, cambiando así la conformación de la sonda a una posición abierta. El cambio a la conformación abierta es detectable debido a la interacción reducida de la pareja de marcadores, que pueden ser, por ejemplo, un fluoróforo y un agente extintor de la fluorescencia. Las balizas moleculares están descritas en la Patente de EE.UU. Nº 5.925.517. Pueden crearse balizas moleculares útiles para la detección de secuencias de ácidos nucleicos específicas del VHB añadiendo a cada extremo de una de las secuencias sonda descritas en la presente memoria, un primer brazo de ácidos nucleicos que comprenda un fluoróforo y un segundo brazo de ácidos nucleicos que comprenda un resto extintor de la fluorescencia. En esta configuración, la secuencia de sonda específica del VHB descrita en la presente memoria sirve como porción “bucle” complementaria de la diana de la baliza molecular resultante.

Las balizas moleculares están marcadas preferiblemente con un par interactivo de marcadores detectables. Los ejemplos de marcadores detectables que son preferibles como miembros de un par interactivo de marcadores interactúan entre sí mediante mecanismos de transferencia de energía por resonancia (abreviadamente FRET por la expresión inglesa Fluorescence Resonance Energy Transfer) o no FRET. La FRET implica la transmisión sin radiación de cuantos de energía desde el sitio de absorción al sitio de su utilización en la molécula o sistema de moléculas, mediante la interacción de la resonancia entre cromóforos, a distancias considerablemente mayores que las distancias interatómicas, sin conversión a energía térmica, y sin que el donador y el aceptor sufran una colisión cinética. El "donador" es el resto que absorbe inicialmente la energía y el "aceptor" es el resto al que se transfiere la energía posteriormente. Además del FRET, existen al menos otros tres procesos de transferencia de energía "no FRET" mediante los que la energía de excitación puede ser transferida desde una molécula donadora a una aceptora.

Cuando dos marcadores se mantienen suficientemente próximos para que la energía emitida por un marcador pueda ser recibida o absorbida por el segundo marcador, ya sea por un mecanismo FRET o no FRET, se dice que los dos marcadores están en "relación de transferencia de energía" entre ellos. Éste es el caso, por ejemplo, en el que una baliza molecular se mantiene en estado cerrado por formación de un dúplex madre y la emisión de fluorescencia desde un fluoróforo unido a un brazo de la sonda ha sido extinguida por un resto extintor de la fluorescencia en el brazo opuesto.

Los restos marcadores muy preferidos para las balizas moleculares inventadas incluyen un fluoróforo y un segundo resto con propiedades de extinción de la fluorescencia (es decir, un "agente extintor de la fluorescencia"). En esta realización, la señal característica es probablemente la fluorescencia de una longitud de onda particular, pero alternativamente podría ser una señal de luz visible. Cuando está implicada la fluorescencia, los cambios en la emisión son debidos preferiblemente a FRET o a modos de transferencia de energía radiante o no FRET. Cuando una baliza molecular con un par de marcadores interactivos en estado cerrado es estimulada por una frecuencia de luz apropiada, se genera una señal fluorescente en un primer nivel, que puede ser muy bajo. Cuando esta misma sonda está en estado abierto y es estimulada por una frecuencia de luz apropiada, los restos fluoróforo y extintor de la fluorescencia están suficientemente separados entre sí que la transferencia de energía entre ellos está sustancialmente excluida. En tal caso, el resto extintor de la fluorescencia no puede extinguir la fluorescencia del resto fluoróforo. Si el fluoróforo es estimulado por energía lumínica de una longitud de onda apropiada, se generará una señal fluorescente de un segundo nivel, mayor que el primer nivel. La diferencia entre los dos niveles de fluorescencia es detectable y medible. Utilizando los restos fluoróforo y extintor de la fluorescencia de este modo, la baliza molecular solo está “activa" en la conformación "abierta" e indica que la sonda está unida a la diana emitiendo una señal fácilmente detectable. El estado conformacional de la sonda altera la señal generada por la sonda regulando la interacción entre los restos marcadores.

Ejemplos de parejas de marcadores donador/aceptor que pueden utilizarse en la invención, sin que se pretenda distinguir las parejas FRET de las no FRET, incluyen los colorantes fluoresceína/ tetrametilrodamina, IAEDANS/fluoresceína, EDANS/DABCYL, cumarina/DABCYL, fluoresceína/fluoresceína, BODIPY FL/BODIPY FL, fluoresceína/DABCYL, amarillo lucifer/DABCYL, BODIPY/DABCYL, eosina/DABCYL, eritrosina/DABCYL, tetrametilrodamina/DABCYL, rojo Texas/DABCYL, CY5/BH1, CY5/BH2, CY3/BH1, CY3/BH2 y fluoresceína/QSY7. Los que tengan una experiencia normal en la técnica comprenderán que cuando los colorantes donador y aceptor son diferentes, la transferencia de energía puede ser detectada por la aparición de fluorescencia sensibilizada del aceptor o por extinción de la fluorescencia del donador. Cuando el donador y el aceptor son de la misma especie, la energía se puede detectar por la despolarización de la fluorescencia resultante. Los aceptores no fluorescentes, tales como los colorantes DABCYL y QSY 7 eliminan de forma ventajosa el problema potencial de la fluorescencia de fondo resultante de la excitación directa (es decir, no sensibilizada) del aceptor. Los restos fluoróforos preferidos que pueden utilizarse como uno de los miembros de la pareja donador-aceptor incluyen los colorantes fluoresceína, ROX y CY (tal como CY5). Los restos extintores de la fluorescencia más preferidos que se pueden utilizar como el otro miembro de una pareja donador-aceptor incluyen los restos DABCYL y BLACK HOLE QUENCHER disponibles en Biosearch Technologies, Inc., (Novato, CA).

Las técnicas y métodos sintéticos de unión de marcadores a ácidos nucleicos y los marcadores detectores son muy conocidos en la técnica (por ejemplo, véanse Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), Capítulo 10; Nelson et al., Patente de EE.UU. Nº 5.658.737; Woodhead et al., Patente de EE.UU. Nº 5.656.207; Hogan et al., Patente de EE.UU. Nº 5.547.842; Arnold et al., Patente de EE.UU. Nº 5.283.174; Kourilsky et al., Patente de EE.UU. Nº 4.581.333) y Becker et al., Solicitud de Patente Europea. Nº 0747706.

Composición química de las sondas

Las sondas de acuerdo con la invención comprenden polinucleótidos o análogos de polinucleótido y pueden llevar un marcador detectable unido covalentemente a ellos. Los nucleósidos o análogos de nucleósidos de la sonda comprenden bases heterocíclicas nitrogenadas, o análogos de dichas bases, en las que los nucleósidos están unidos, por ejemplo mediante enlaces fosfodiéster para formar un polinucleótido. Por consiguiente, una sonda puede comprender ácidos ribonucleicos (RNA) y/o ácidos desoxirribonucleicos (DNA) convencionales, pero también pueden comprender análogos químicos de estas moléculas. La "cadena principal" de una sonda puede estar constituida por una variedad de enlaces conocidos en la técnica, incluyendo uno o más enlaces azúcar-fosfodiéster, enlaces péptido-ácidos nucleicos (algunas veces denominados "ácidos nucleicos peptídicos" tal como ha sido descrito por Hyldig-Nielsen et al., en la Solicitud de Patente Internacional Publicada PCT Nº WO 95/32305), enlaces fosforotioato, enlaces metilfosfonato o sus combinaciones. Los restos de azúcar de la sonda pueden ser ribosa o desoxirribosa, o compuestos similares con sustituciones conocidas, tal como por ejemplo, sustituciones 2'-O-metil-ribosa y 2'-haluro (por ejemplo, 2'-F). Las bases nitrogenadas pueden ser bases convencionales (A, G, C, T, U), sus análogos conocidos (por ejemplo, inosina o "I"; véase The Biochemistry of the Nucleic Acids 5-36, Adams et al., ed., 11ª Ed., 1992), derivados conocidos de las pases púricas o pirimidínicas (por ejemplo, N4-metil-desoxiguanosina, desaza- o aza-purinas y desaza- o aza-pirimidinas, bases pirimidínicas con grupos sustituyentes en la posición 5 o 6, bases púricas con un sustituyente alterado o reemplazado en las posiciones 2, 6 u 8, 2-amino-6-metilaminopurina, O6-metilguanina, 4-tio-pirimidinas, 4-amino-pirimidinas, 4-dimetilhidrazina-pirimidinas y O4-alquil-pirimidinas (véase, Cook, Solicitud de Patente Internacional Publicada PCT Nº WO 93/13121) y residuos "abásicos" en los que la cadena principal incluye bases no nitrogenadas para uno o más residuos del polímero (véase Arnold et al., Patente de EE.UU. Nº 5.585.481). Un ácido nucleico puede comprender sólo azúcares, bases y enlaces convencionales encontrados en el RNA y DNA, o puede incluir ambos componentes y sustituciones convencionales (por ejemplo, bases convencionales unidas mediante una cadena principal de metoxi o un ácido nucleico que incluye bases convencionales y uno o más análogos de dichas bases).

Selección de cebadores de amplificación y sondas de detección específicos para el VHB

Las directrices útiles para diseñar los cebadores y las sondas de amplificación con características deseadas son describen en la presente memoria. Los sitios óptimos para amplificar y sondar ácidos nucleicos del VHB contienen dos, y preferiblemente tres, regiones conservadas con una longitud mayor que aproximadamente 15 bases, en aproximadamente 200 bases, y preferiblemente en 110 bases, de secuencia contigua. El grado de amplificación observado con el conjunto de cebadores o promotores-cebadores depende de varios factores, incluyendo la capacidad de los oligonucleótidos de hibridarse con sus secuencias complementarias y su capacidad de ser prolongados enzimáticamente. Debido a que la extensión y especificidad de las reacciones de hibridación están afectadas por una serie de factores, la manipulación de estos factores determinará la sensibilidad y especificidad exactas de un oligonucleótido particular, tanto si es perfectamente complementario de su diana o no Los efectos de la variación de las condiciones de ensayo son conocidos por los expertos en la técnica y están descritos por Hogan et al., en la Patente de EE.UU. Nº 5.840.488.

La longitud de la secuencia de ácidos nucleicos diana y, por consiguiente, la longitud de la secuencia del cebador o de la secuencia de la sonda puede ser importante. En algunos casos, puede haber varias secuencias procedentes de una región diana particular, variando la localización y longitud, lo que proporcionará cebadores o sondas con las características de hibridación deseadas. Aunque es posible hibridar ácidos nucleicos que no son perfectamente complementarios, el tramo más largo de secuencia de bases perfectamente homóloga determinará en general principalmente la estabilidad del híbrido.

Los cebadores y la sonda de amplificación se deben colocar para minimizar la estabilidad del híbrido oligonucleótido:ácido nucleico no diana (es decir, ácido nucleico con secuencia similar al ácido nucleico diana). Se prefiere que los cebadores de amplificación y las sondas de detección sean capaces de distinguir entre secuencia diana y no diana. En el diseño de cebadores y sondas, las diferencias en los valores de Tm deben ser tan grandes como sea posible (por ejemplo, al menos 2ºC y preferiblemente 5ºC).

Las regiones del ácido nucleico que se sabe que forman estructuras internas fuertes inhibidoras de la hibridación son menos preferidas como los cebadores o sondas. Ejemplos de dichas estructuras incluyen bucles con forma de horquilla. Igualmente, se deben evitar los oligonucleótidos con amplia auto-complementariedad.

El grado de extensión no específica (copia de cebador-dímero o no diana) puede afectar también a la eficacia de la amplificación. Por esta razón, se seleccionan cebadores que tengan baja auto-complementariedad o complementariedad cruzada, particularmente en los extremos 3' de la secuencia. Se evitan tractos largos de homopolímeros y alto contenido de GC para reducir la prolongación engañosa del cebador. Programas informáticos comercialmente disponibles pueden ayudar en este aspecto del diseño. Los programas informáticos disponibles incluyen MacDNASIS™ 2.0 (Hitachi Software Engineering American Ltd.) y OLIGO ver. 4.1 (National Bioscience).

Los que tengan una experiencia normal en la técnica apreciarán que la hibridación implica la asociación de dos cadenas sencillas de ácido nucleico complementario para formar una doble cadena unida por puentes de hidrógeno Queda implícito que si una de las dos cadenas está total o parcialmente implicada en un híbrido, entonces dicha cadena tendrá menos capacidad de participar en la formación de un nuevo híbrido. Al diseñar los cebadores y las sondas de forma que porciones sustanciales de las secuencias de interés sean monocatenarias, se puede aumentar mucho la tasa y extensión de la hibridación. Si la diana es una secuencia genómica integrada, entonces se encontrará de modo natural en forma bicatenaria (como es el caso del producto de la reacción en cadena de la polimerasa). Estas dianas bicatenarias inhiben de forma natural la hibridación con una sonda y requieren de la desnaturalización antes de la etapa de hibridación.

La tasa en la que un polinucleótido se hibrida con su diana es una medida de la estabilidad térmica de la estructura secundaria de la diana en la región de unión a la diana. La medida estándar de la tasa de hibridación es C0t1/2 que se mide en moles de nucleótido por litro multiplicado por segundos. Así, es la concentración de la sonda multiplicada por el tiempo en el que ocurre el 50% de hibridación máxima a dicha concentración. Este valor se determina hibridando varias cantidades de polinucleótido con una cantidad constante de diana durante un tiempo fijado. La C0t1/2 se encuentra gráficamente mediante procedimientos estándares familiares a los que tengan una experiencia normal en la técnica.

Cebadores de amplificación preferidos

Muchos de los oligonucleótidos, incluyendo cebadores y sondas, descritos en la presente memoria fueron obtenidos de la secuencia del VHB, subtipo ADW. A la secuencia de nucleótidos completa del DNA del virus de la hepatitis B clonado, subtipo ADW se puede acceder a través de GENBANK Nº de acceso V00866.

En términos generales, los cebadores útiles para llevar a cabo las reacciones de amplificación de acuerdo con la invención tienen una secuencia complementaria de el VHB situada hacia el extremo 3’ y opcionalmente una secuencia situada hacia el extremo 5’ que no es complementaria de la diana del VHB. Las secuencias complementarias de el VHB de ciertos cebadores que son complementarias de una cadena del ácido nucleico diana del VHB (es decir, cebadores de la "primera cadena") tienen preferiblemente una longitud de 20 - 50 bases y tienen 20 - 50 bases contiguas de la SEQ ID NO:2, teniendo en cuenta los equivalentes de RNA y DNA y la sustitución de análogos de nucleótidos. Las secuencias complementarias de el VHB de ciertos cebadores que son complementarios de la segunda cadena o cadena opuesta del ácido nucleico diana del VHB (es decir, cebadores de la "segunda cadena") tienen preferiblemente una longitud de 20 - 54 bases y tienen 20 - 54 bases contiguas de la SEQ ID NO:4, teniendo en cuenta los equivalentes de RNA y DNA y la sustitución de análogos de nucleótidos. Naturalmente, las secuencias opcionales situadas hacia el extremo 5’ que no son complementarias de la diana de VHB se añadirán a las longitudes totales de los cebadores. Un ejemplo de una secuencia opcional situada hacia el extremo 5’ sería un promotor para una RNA-polimerasa.

Los cebadores útiles para llevar a cabo las reacciones de amplificación pueden tener diferentes longitudes. Por ejemplo, los oligonucleótidos de amplificación complementarios de una cadena de la secuencia de ácidos nucleicos diana de VHB (es decir, cebadores de la primera cadena) tienen preferiblemente longitudes de hasta 100 bases, más preferiblemente 18-60 bases y tienen secuencias complementarias de el VHB con una longitud de 18-27 bases, o más preferiblemente de 20-23 bases e incluyen al menos 18 bases contiguas, teniendo en cuenta la sustitución de uno o más análogos de bases nitrogenadas, que corresponden sustancialmente a la secuencia dada por

GTGTCTTGGCCAAAATTCGCAGTCCCCAACCTCCAATCACTCACCAACCTCCTGTCCTCCAATTTGTCCTGGTTATCGC TGGATGTGTCTGCGGCGTTTTATCATATTCCTCTTCATCCTGCTGCTAT (SEQ ID NO:1).

Ejemplos de cebadores, incluyendo promotores-cebadores, en este grupo incluyen las SEQ ID NO:16-49. Incluso cebadores mucho más preferidos para amplificar ácidos nucleicos del VHB tienen longitudes de hasta 100 bases, más preferiblemente de 20-60 bases, y tienen secuencias complementarias de el VHB que incluyen al menos 20 bases contiguas, más preferiblemente 20-24 bases, teniendo en cuenta la sustitución de uno o más análogos de bases nitrogenadas, contenidas en una secuencia que corresponde sustancialmente a

CTGGATGTGTCTGCGGCGTTTTATCATATTCCTCTTCATCCTGCTGCTAT (SEQ ID NO:2).

Ejemplos de cebadores de este grupo incluyen las SEQ ID NO:22-28, y los promotores-cebadores de T7 respectivos de las SEQ ID NO:39-45. Otra colección de cebadores muy preferida para amplificar ácidos nucleicos del VHB tienen longitudes de hasta 100 bases, más preferiblemente de 20-60 bases, y tienen secuencias complementarias de el VHB que incluyen al menos 23 bases contiguas, más preferiblemente 23-24 bases contiguas, teniendo en cuenta la sustitución de uno o más análogos de bases nitrogenadas, contenidos en una secuencia que corresponde sustancialmente a

ATCATATTCCTCTTCATCCTGCTGCTAT (SEQ ID NO:3).

Ejemplos de cebadores en este grupo incluyen las SEQ ID NO:24-28, y los promotores-cebadores de T7 respectivos de las SEQ ID NO:41-45. Cuando se utiliza una reacción de TMA para amplificar las secuencias del VHB, los cebadores que tienen estas características se usan muy preferiblemente como promotores-cebadores, tales como los promotorescebadores de T7. Naturalmente, si el cebador es un promotor-cebador de T7 estará incluida en el extremo 5’ una secuencia de promotor de T7 que añade típicamente alrededor de 27-33 bases a la longitud del cebador. Ejemplos de promotores-cebadores incluyen oligonucleótidos que tienen las secuencias dadas por las SEQ ID NO:33-49. Los promotores-cebadores descritos en la presente memoria son particularmente deseables para llevar a cabo las reacciones de amplificación de ácidos nucleicos utilizando el procedimiento TMA antes citado.

Otros cebadores (es decir, cebadores de la segunda cadena) que se pueden usar con los cebadores antes descritos en cualquier combinación para llevar a cabo las reacciones de amplificación son complementarios de la cadena opuesta de la secuencia de ácidos nucleicos diana del VHB. Los cebadores de amplificación complementarios de esta cadena opuesta de la secuencia de ácidos nucleicos diana del VHB tienen preferiblemente longitudes de hasta 100 bases, o más preferiblemente 20-31 bases, o incluso más preferiblemente 20-21 bases. Estos cebadores se usan más preferiblemente como cebadores no promotores (es decir, cebadores que son complementarios de la cadena opuesta del molde de VHB cuando se comparan con los promotores-cebadores). Como se describe en la presente memoria, estos cebadores tienen al menos 20 bases contiguas, teniendo en cuenta la sustitución de análogos de bases nitrogenadas, a partir de una secuencia que corresponde sustancialmente a

GGAATTAGAGGACAAACGGGCAACATACCTTGATAATCCAGAAGAACCAATAAG (SEQ ID NO:4).

Ejemplos de cebadores de amplificación particulares que cumplen estos criterios incluyen oligonucleótidos que tienen las secuencias dadas por las SEQ ID NO:5-15. Incluso más preferidos son los cebadores que tienen al menos 20 bases contiguas, teniendo en cuenta la sustitución de análogos de bases nitrogenadas, a partir de una secuencia que corresponde sustancialmente a

AGGACAAACGGGCAACATACCTTGATAATCCAGAAGAACCAATAAG (SEQ ID NO:142).

Ejemplos de cebadores de amplificación particulares que cumplen estos criterios incluyen oligonucleótidos que tienen las secuencias dadas por las SEQ ID NO:5-9, 11 y 15.

Se debe entender que las longitudes variables antes especificadas de los cebadores de amplificación acomoden la presencia de secuencias extrañas que no participan en la unión a la diana y que no pueden afectar sustancialmente a los procedimientos de amplificación o detección. Por ejemplo, los promotores-cebadores útiles para llevar a cabo las reacciones de amplificación de acuerdo con la invención tienen al menos una secuencia mínima que se hibrida al ácido nucleico diana del VHB y una secuencia de promotor situada hacia el extremo 5’ de dicha secuencia mínima. Sin embargo, la inserción de secuencias entre la secuencia que se une a la diana y la secuencia de promotor podría cambiar la longitud del cebador sin comprometer su utilidad en la reacción de amplificación. Adicionalmente, las longitudes de los cebadores de amplificación y las sondas de detección son cuestiones a decidir siempre que las secuencias de estos oligonucleótidos cumplan los requisitos mínimos esenciales para hibridarse con la secuencia complementaria deseada.

Las Tablas 1 y 2 presentan ejemplos específicos de secuencias de oligonucleótidos que se usaron como cebadores para amplificar ácido nucleicos de VHB. La Tabla 1 presenta la secuencia de cebadores complementaria de las secuencias del VHB en una cadena de ácido nucleico. La Tabla 2 presenta tanto las secuencias complementarias diana del VHB como las secuencias completas de los promotores-cebadores que se utilizaron durante el desarrollo de la invención. Comparándolas con las secuencias de oligonucleótidos de la Tabla 1, las secuencias de oligonucleótidos de la Tabla 2 son complementarias de la cadena opuesta de los ácidos nucleicos del genoma del VHB.

Tabla 1 Secuencias de polinucleótidos de cebadores de amplificación

La Tabla 2 presenta secuencias complementarias de oligonucleótidos de dianas del VHB diana (SEQ ID NO:16-32) y las secuencias correspondientes de promotores-cebadores (SEQ ID NO:33-49). Como se ha indicado antes, todos los promotores-cebadores incluían secuencias complementarias de la secuencia diana del VHB en sus extremos 3', y una secuencia del promotor de T7 en sus extremos 5’.

Tabla 2 Secuencias de polinucleótidos de cebadores de amplificación

Conjuntos preferidos de cebadores para amplificar secuencias del VHB en una reacción de TMA incluyen un primer cebador que se hibrida con una secuencia diana del VHB (tal como uno de los cebadores recogidos en la Tabla 2) y un segundo cebador que es complementario de la secuencia de un producto de prolongación del primer cebador (tal como una de las secuencias de cebador recogidas en la Tabla 1). En una realización muy preferida, el primer cebador es un promotor-cebador que incluye una secuencia del promotor de T7 en su extremo 5'.

Sondas de detección preferidas

Otro aspecto de la invención se refiere a oligonucleótidos que se pueden usar como sondas de hibridación para detectar ácidos nucleicos del VHB. Los métodos para amplificar una secuencia de ácido nucleico diana presente en el ácido nucleico del VHB pueden incluir una etapa opcional adicional para detectar amplicones. Este método de detectar ácidos nucleicos del VHB incluye una etapa de poner en contacto una muestra de ensayo con una sonda para ensayo de hibridación que preferiblemente se hibrida con la secuencia del ácido nucleico diana o con su complemento, en condiciones de hibridación rigurosas, formando de este modo un dúplex sonda:diana que es estable para su detección. A continuación viene una etapa para determinar si el híbrido está presente en la muestra de ensayo como indicación de la presencia o ausencia de ácidos nucleicos del VHB en la muestra de ensayo. Esto puede implicar detectar el dúplex sonda:diana.

Las sondas para ensayos de hibridación útiles para detectar secuencias de ácidos nucleicos del VHB incluyen una secuencia de bases sustancialmente complementarias a una secuencia de ácido nucleico diana del VHB. Por tanto, las sondas de la invención se hibridan con una cadena de la secuencia diana del ácido nucleico del VHB, o su complemento. Estas sondas pueden tener opcionalmente bases adicionales fuera de la región del ácido nucleico que actúa como diana que puede o no ser complementaria de el ácido nucleico del VHB.

Las sondas preferidas son suficientemente homólogas al ácido nucleico diana para hibridarse en condiciones de hibridación rigurosas correspondientes a aproximadamente 60ºC cuando la concentración de sal está en el intervalo de 0,60,9 M. Las sales preferidas incluyen cloruro de litio, pero también se pueden usar otras sales, tal como cloruro de sodio y citrato de sodio en la solución de hibridación. Ejemplo de condiciones de hibridación altamente rigurosas son alternativamente proporcionadas por tampón de fosfato de sodio 0,48 M, dodecil-sulfato de sodio al 0,1%, y EDTA y EGTA cada uno 1 mM, o por LiCI 0,6 M, lauril-sulfato de litio al 1%, succinato de sodio 60 mM y EDTA y EGTA cada uno a 10 mM.

Ciertas sondas que son preferidas para detectar de secuencias de ácidos nucleicos del VHB tienen secuencias complementarias de la diana en el intervalo de longitud de 17-23 nucleótidos. Las sondas altamente preferidas que se pueden usar para detectar ácidos nucleicos del VHB tienen secuencias complementarias de la diana de una longitud de 23 nucleótidos, más preferiblemente 22, más preferiblemente 20, más preferiblemente 19, más preferiblemente 18, o más preferiblemente 17 nucleótidos. Naturalmente, estas secuencias complementarias de dianas pueden ser secuencias lineales, o pueden estar contenidas en la estructura de un baliza molecular u otra construcción que tenga una o más secuencias opcionales de ácidos nucleicos que no son complementarias de la secuencia diana del VHB que ha de ser detectada. Como se ha indicado antes, las sondas pueden estar hechas de DNA, RNA, una combinación de DNA y RNA, un análogo de ácido nucleico o contienen uno o más nucleósidos modificados (por ejemplo, un ribonucleósido que tiene una sustitución de 2'-O-metil en el resto de ribofuranosilo).

Ejemplos de sondas que se pueden usar para llevar a cabo los ensayos descritos en la presente memoria incluyen al menos 17, más preferiblemente 17-23 o incluso más preferiblemente 17-19 nucleótidos contiguos contenidos dentro de la secuencia dada por

ACGGGCAACATACCTTGATAGTCCAGAAGAACCAACAAGAAGATGAGGCATAGCAGCAGGATGCAGAGGAA (SEQ ID NO:67)

o su complemento, teniendo en cuenta la presencia de equivalentes de RNA y DNA y la sustitución de análogos de nucleótidos. Ciertas sondas preferidas de acuerdo con la presente invención incluyen un marcador detectable. En una realización este marcador es un éster de acridinio que está unido a la sonda por medio de un enlazador no nucleotídico. Por ejemplo, las sondas de detección pueden estar marcadas con compuestos de ésteres de acridinio quimioluminescentes que están unidos mediante un enlazador sustancialmente como se describe en la Patente de EE.UU. 5.585.481; y en la patente de EE.UU. 5.639.604, particularmente como se describe en la columna 10, línea 6 hasta la columna 11, línea 3 y en el Ejemplo 8. Cuando la sonda de hibridación está marcada con un resto de éster de acridinio mediante un enlazador dispuesto internamente, la sonda se conserva preferiblemente en presencia de una "sonda de protección" de acuerdo con la Patente de EE.UU. 6.245.519. Por ejemplo, si la sonda tiene una longitud de 19 bases y tiene un éster de acridinio unido entre las posiciones 6 y 7, la sonda de protección correspondiente puede tener una longitud de 16 bases para proporcionar la Tm diferencial necesaria. En este caso los inventores usamos una sonda de protección que tenía 3 bases complementarias en un lado, y 13 bases complementarias en el otro lado de un marcador de un éster de acridinio que estaba unida a la sonda. Naturalmente, se pueden considerar otras variaciones de secuencias.

La Tabla 3 presenta las secuencias de sonda de hibridación que se usaron para detectar amplicones del VHB. Puesto que las sondas alternativas para detectar secuencias de ácidos nucleicos del VHB se pueden hibridar a la cadena de sentido opuesto del VHB, la presente invención incluye también incluyen oligonucleótidos que son complementarios de las secuencias presentadas en la tabla.

Tabla 3 Secuencias de polinucleótidos de sondas de detección del VHB

La secuencia de la sonda usada para detectar amplicones del VHB puede incluir una cadena principal (backbone) con 5 metoxi o al menos un enlace por metoxi en la cadena principal del ácido nucleico.

Selección y uso de oligonucleótidos de captura

Los oligonucleótidos de captura preferidos incluyen una primera secuencia que es complementaria de una secuencia del VHB (es decir, una "secuencia diana del VHB ") unida covalentemente a una segunda secuencia (es decir, una "secuencia de cola") que sirve como diana para la inmovilización en un soporte sólido. Se puede usar cualquier cadena

10 principal para unir la secuencia de bases de un oligonucleótido de captura. En ciertas realizaciones preferidas el oligonucleótido de captura incluye al menos un enlace por metoxi en la cadena principal. La secuencia de cola, que preferiblemente está en el extremo 3 'de un oligonucleótido de captura, se usa para hibridarla con una secuencia de bases complementaria para proporcionar medios para capturar el ácido nucleico del VHB hibridado con preferencia a otros componentes de la muestra biológica.

15 Aunque en la secuencia de cola se puede usar cualquier secuencia de bases que se hibride con una secuencia de bases complementarias se prefiere que las secuencias hibridantes abarquen una longitud de aproximadamente 5-50 residuos de nucleótidos. Las secuencias de colas particularmente preferidas son secuencias de colas sustancialmente homopolímeras, que contienen aproximadamente 10 a aproximadamente 40 residuos de nucleótidos o más preferiblemente aproximadamente 14 a aproximadamente 30 residuos. Un oligonucleótido de captura de acuerdo con la presente

20 invención puede incluir una primera secuencia que se une específicamente a un polinucleótido diana del VHB, y una segunda secuencia que específicamente se une a un tramo de oligo(dT) inmovilizado en un soporte sólido.

Usando los componentes ilustrados en la Figura 1, un ensayo para detectar secuencias de VHB en una muestra biológica incluye las etapas de capturar el ácido nucleico diana usando el oligonucleótido de captura, amplificar la región diana capturada usando al menos dos cebadores, y detectar el ácido nucleico amplificado hibridando primeramente la sonda marcada con una secuencia contenida en el ácido nucleico y detectar luego una señal resultante de la sonda marcada unida.

La etapa de captura usa preferiblemente un oligonucleótido de captura en donde, en condiciones de hibridación, una porción del oligonucleótido de captura se hibrida específicamente con una secuencia en el ácido nucleico diana y una porción de cola sirve como un componente de una pareja de unión, tal como un ligando (por ejemplo, una pareja de unión biotina-avidina) que permite que la región diana sea separada de los otros componentes de la muestra. Preferiblemente, la porción de cola del oligonucleótido de captura es una secuencia que se hibrida con una secuencia complementaria inmovilizada en una partícula de soporte sólida. Preferiblemente, primeramente, el oligonucleótido de captura y el ácido nucleico diana están en solución para aprovechar la cinética de hibridación en fase de solución. La hibridación produce un complejo oligonucleótido de captura:ácido nucleico diana que puede unirse a una sonda inmovilizada a través de la hibridación de la porción de cola del oligonucleótido de captura con una secuencia complementaria inmovilizada. Por tanto, en las condiciones de hibridación se forma un complejo que comprende un ácido nucleico diana, oligonucleótido de captura y sonda inmovilizada. Preferiblemente, la sonda inmovilizada es una secuencia repetitiva, y más preferiblemente una secuencia homopolímera (por ejemplo, poli-A, poli-T, poli-C o poli-G), que es complementaria de la secuencia de cola y está unida a un soporte sólido. Por ejemplo, si la porción de cola del oligonucleótido de captura contiene una secuencia de poli-A, entonces la sonda inmovilizada contendría una secuencia de poli-T, aunque se puede usar cualquier combinación de secuencias complementarias. El oligonucleótido de captura puede contener también residuos "espaciadores", que son una o más bases localizadas entre la secuencia de bases que se hibrida con la diana y la secuencia de bases de la cola que se hibrida con la sonda inmovilizada. Se puede usar cualquier soporte sólido para unir el complejo ácido nucleico diana:oligonucleótido de captura. Los soportes útiles pueden ser matrices o partículas libres en solución (por ejemplo, nitrocelulosa, nilón, vidrio, poliacrilato, polímeros mixtos, poliestireno, silano, polipropileno y, preferiblemente, partículas atraíbles magnéticamente). Los métodos de unir una sonda inmovilizada al soporte sólido son bien conocidos. El soporte es preferiblemente una partícula que se puede recuperar de la solución usando métodos estándares (por ejemplo, centrifugación, atracción magnética de partículas y similares). Los soportes preferidos son partículas paramagnéticas monodispersas (es decir, de tamaño uniforme ± aproximadamente 5%).

Recuperando el complejo ácido nucleico diana:oligonucleótido de captura:sonda inmovilizada se concentra eficazmente el ácido nucleico diana (con respecto a su concentración en la muestra biológica) y se purifica el ácido nucleico diana de los inhibidores de amplificación que pueden estar presentes en la muestra biológica. El ácido nucleico diana capturado puede ser lavado una o más veces, purificando adicionalmente la diana, por ejemplo, volviendo a poner en suspensión las partículas con el complejo ácido nucleico diana:oligonucleótido de captura:sonda inmovilizada unido en una solución de lavado y recuperando luego las partículas con el complejo unido de la solución de lavado como se ha descrito antes. En una realización preferida, la etapa de captura tiene lugar hibridando secuencialmente el oligonucleótido de captura con el ácido nucleico diana y ajustando luego las condiciones de hibridación para permitir la hibridación de la porción de cola del oligonucleótido de captura con una secuencia complementaria inmovilizada (por ejemplo, como se describe en el documento PCT Nº WO 98/50583). Después de que se han completado la etapa de captura y las etapas opcionales de lavado, el ácido nucleico diana puede ser amplificado. Para limitar el número de etapas de manipulación, el ácido nucleico diana puede ser amplificado opcionalmente sin liberarlo del oligonucleótido de captura.

En la presente memoria se describen dos regiones diferentes de la secuencia de ácido nucleico de VHB como dianas para oligonucleótidos de captura, estando cada una de dichas regiones situadas fuera de uno de los límites dispuestos opuestamente que definen la secuencia del ácido nucleico del VHB que puede ser amplificada por los métodos descritos en la presente memoria. Las secuencias de oligonucleótido de captura que se hibridan con una de estas regiones están contenidas dentro de una secuencia sustancialmente correspondiente a

AGACTCGTGGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGGGGGATCACCCGTGTGTCTTGGCCAAAATTCGCAGTCCCCAACC TCCAATCACTCACCAAC (SEQ ID NO:68).

Las longitudes preferidas para las porciones complementarias al VHB del oligonucleótido de captura caen en el intervalo de 20-40 nucleótidos, más preferiblemente 25-30 nucleótidos. Ejemplos de oligonucleótidos de captura útiles de esta categoría incluyen oligonucleótidos que tienen las secuencias dadas por las SEQ ID NO:70-76. Las secuencias de oligonucleótidos de captura que se hibridan a la otra región de la secuencia del ácido nucleico del VHB están contenidas dentro de una secuencia sustancialmente correspondiente a

CGTTTCTCTTGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTCCCCCACTGTTTGGCTTT (SEQ ID NO:69).

Los tamaños preferidos para estos oligonucleótidos de captura caen en el intervalo de longitud de 25-50 nucleótidos, más preferiblemente 25-32 nucleótidos. Ejemplos de oligonucleótidos de captura que caen dentro de esta categoría incluyen oligonucleótidos que tienen secuencias complementarias de VHB de las SEQ ID NO:77-87. Los oligonucleótidos de captura útiles pueden contener desapareamientos con las secuencias antes indicadas, siempre que las secuencias desapareadas se hibriden al ácido nucleico del VHB que contenga la secuencia que ha de ser amplificada. Cada oligonucleótido de captura descrito en la presente memoria incluía una de las secuencias complementarias de el VHB presentadas en la Tabla 4 unida a una cola de poli-(dA) en su extremo 3'. Con la excepción de los oligonucleótidos identificados por las SEQ ID NO:71 y SEQ ID NO:80, la totalidad de los oligonucleótidos de captura también incluyen tres nucleótidos de timidina interpuestos entre la secuencia complementaria de el VHB y la cola de poli-(dA). Como se indica más adelante, la presencia de estos nucleótidos de timidina no se cree que sea esencial para el éxito del método de captura. Notablemente, la presencia de una núcleobase "C", en lugar de la núcleobase "G" que se presenta naturalmente, en la posición 16 del oligonucleótido de captura de la SEQ ID NO:86 demostró que al menos se permite una sustitución de bases en los oligonucleótidos de captura.

Tabla 4 Secuencias de polinucleótidos de porciones complementarias de el VHB de oligonucleótidos de captura

Métodos preferidos para amplificar y detectar secuencias de polinucleótidos del VHB

Los métodos preferidos se describen e ilustran en los Ejemplos presentados más adelante. La Figura 1 ilustra esquemáticamente un sistema que se puede usar para detectar una región diana del genoma del VHB (mostrado por una línea horizontal de trazo continuo). Este sistema incluye cuatro oligonucleótidos (mostrados por líneas de trazo continuo más 15 cortas): un oligonucleótido de captura que incluye una secuencia que se hibrida específicamente con una secuencia del VHB en la región diana y una cola ("T") que se hibrida con una secuencia complementaria inmovilizada en un soporte sólido para capturar la región diana presente en una muestra biológica; un promotor-cebador de T7 que incluye una secuencia que se hibrida específicamente con una secuencia del VHB en la región diana y una secuencia del promotor de T7 ("P") que, cuando está en forma bicatenaria, sirve como promotor funcional para RNA-polimerasa de T7; un ce

20 bador no de T7 que incluye una secuencia que se hibrida específicamente al cDNA de la primera cadena hecho de la secuencia de la región diana usando el promotor-cebador de T7; y una sonda marcada que incluye una secuencia que se hibrida específicamente con una porción de la región diana que se amplifica usando los dos cebadores.

Como se ha indicado antes, se puede conseguir amplificar la región diana capturada usando los dos cebadores mediante una variedad de reacciones de amplificación conocidas de amplificación de ácidos nucleicos que serán familiares a los expertos en la técnica con un dominio ordinario de la misma. En una realización preferida, se emplea una reacción de amplificación asociada a la transcripción, tal como TMA. En dicha realización, se producen muchas cadenas de ácido nucleico a partir de una sola copia de ácido nucleico diana, permitiendo por tanto la detección de la diana detectando las sondas que se unen a las secuencias amplificadas. Preferiblemente, la amplificación asociada a la transcripción usa dos tipos de cebadores (denominándose uno de ellos promotor-cebador porque contiene un secuencia de promotor, marcada "P" en la Figura 1, para una RNA-polimerasa), dos enzimas (una transcriptasa inversa y una RNA-polimerasa) y sustratos (trifosfatos de desoxirribonucleósidos, trifosfatos de ribonucleósidos) con sales y tampones apropiados en solución para producir múltiples transcritos de RNA a partir de un molde de ácido nucleico.

Con referencia a la Figura 1, durante la amplificación mediada por la transcripción, el ácido nucleico diana capturado se hibrida con un primer cebador mostrado como promotor-cebador de T7. Usando transcriptasa inversa se sintetiza una cadena de DNA complementaria a partir del promotor-cebador de T7 usando el DNA diana como molde. Un segundo cebador, mostrado como cebador no de T7 se hibrida con la cadena de DNA recientemente sintetizada y es prolongada por la acción de una transcriptasa inversa para formar un dúplex de DNA, formando con ello una región de promotor de T7 bicatenaria. La RNA-polimerasa de T7 genera luego múltiples transcritos de RNA usando el promotor de T7 funcional. El mecanismo autocatalítico de la TMA emplea etapas de hibridación y polimerización repetitivas siguiendo una etapa de síntesis de cDNA usando los transcritos de RNA como moldes para producir transcritos adicionales, amplificando con ello la región diana-ácido secuencias de nucleico específicas.

La etapa de detección usa al menos una sonda de detección que se une específicamente a los transcritos o amplicones de RNA amplificado antes descritos. Preferiblemente, la sonda de detección está marcada con un marcador que puede ser detectado usando un sistema de detección homogéneo. Por ejemplo, la sonda marcada puede estar marcada con un compuesto de éster de acridinio del cual se puede producir y detectar una señal quimioluminescente, como se ha descrito antes. Alternativamente, la sonda marcada puede comprender un fluoróforo y restos extintores de la fluorescencia). Una baliza molecular es una realización de dicha sonda marcada que se puede usar en un sistema de detección homogéneo.

Reacciones de amplificación múltiples

Un formato de ensayo conveniente para detectar polinucleótidos en analitos múltiples implica realizar reacciones de amplificación simultáneas usando diferentes conjuntos de cebadores, en donde los amplicones sintetizados en la reacción son detectados por hibridación. A este respecto, Gen-Probe Incorporated (San Diego, CA) ha desarrollado un ensayo VIH-1/VHC que detecta ácidos nucleicos del VIH-1 y/o VHC (Virus de la hepatitis C) en un formato múltiple en un solo tubo usando tres etapas claves. En una preparación de muestra inicial el plasma se trata con detergente para liberar el RNA genómico viral, los oligonucleótidos específicos de la diana se hibridan con la diana y se capturan sobre micropartículas magnéticas que se separan del plasma en un campo magnético. A continuación se emplea un sistema de amplificación de polinucleótidos basado en la transcripción para amplificar en una sola reacción RNA de VIH-1 y/o VHC diana. Finalmente la detección se consigue usando hibridación de ácidos nucleicos de sondas quimioluminiscentes que son complementarias de los amplicones del VIH-1 o VHC. Si el ensayo da un resultado positivo se realizan ensayos discriminatorios para diferenciar entre los dos virus.

Los oligonucleótidos que se usaron particularmente para amplificar y detectar ácidos nucleicos del VIH-1 en los métodos descritos más adelante tenían las secuencias siguientes. Los cebadores de amplificación específicos para una cadena del ácido nucleico del VIH-1 incluyen las secuencias siguientes:

CGGGCGCCACTGCTAGAGATTTT (SEQ ID NO:98) y GTTTGTATGTCTGTTGCTATTATGTCTA (SEQ ID NO:99),

incluyendo además cada cebador una secuencia de promotor opcional situada situada hacia el extremo 5’ para dar los correspondientes promotores-cebadores de

AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGACGGGCGCCACTGCTAGAGATTTT (SEQ ID NO:100) y AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGAGTTTGTATGTCTGTTGCTATTATGTCTA (SEQ ID NO:101).

Los cebadores de cadenas opuestas que se usaron durante el desarrollo de la invención tenían las secuencias de

GCCTCAATAAAGCTTGCC (SEQ ID NO:102) y ACAGCAGTACAAATGGCAG (SEQ ID NO:103).

Aunque no se usaron para obtener los datos múltiples presentados en esta memoria, los cebadores de cadenas opuestas alternativos incluyen

GACAGCAGTACAAATGGCAG (SEQ ID NO:104) y AGACAGCAGTACAAATGGCAG (SEQ ID NO:105).

Las sondas para detectar amplicones del VIH tenían las secuencias dadas por

CCACAATTTTAAAAGAAAAGGG (SEQ ID NO:106) (marcada con AE entre las posiciones de nucleótidos 7 y 8), CUG-GUAICUAGAGAUCCCUC (SEQ ID NO:107) (marcada con AE entre las posiciones de nucleótidos 9 y 10) y GGATTG-GIIIGTACAGTGC (SEQ ID NO:108) (marcada con AE entre las posiciones de nucleótidos 5 y 6).

Se usó una sonda que tiene la secuencia de

CCACAAGCUUAGAAGAUAGAGAGG (SEQ ID NO:109) (marcada con AE entre las posiciones de nucleótidos 10 y 11)

para detectar un amplicón de control interno Todas estas sondas se prepararon usando análogos 2'-OMe, excepto para la posición final que estaba ocupada por un nucleótido de DNA, confirmando de este modo que las sondas se pueden preparar flexiblemente usando una combinación de bases equivalentes de RNA y DNA, análogos de bases y análogos de cadenas principales de nucleótidos. Los oligonucleótidos de protección de sondas tenían las secuencias de

GGATCTCTAGCTACC (SEQ ID NO:110), CCCTTTTCTTTTAAAATTGTGG (SEQ ID NO:111) y CTATCTTCTAAGCTTG (SEQ ID NO:112).

Los oligonucleótidos de captura incluían secuencias complementarias de el VIH de

ACUGACGCUCUCGCACCCAUC (SEQ ID NO:113) y UCUGCUGUCCCUGUAAUAAACCCG (SEQ ID NO:114),

y se prepararon usando análogos de 2'-OMe y unidos en sus extremos 3' a una secuencia de cola de A30 con tres residuos de T interpuestos entre ellas.

Los oligonucleótidos preferidos usados para amplificar y detectar ácidos nucleicos del VHC tenían las siguientes secuencias. Un cebador de amplificación específico para una cadena del ácido nucleico del VHC incluía la secuencia de

AGTACCACAAGGCCTTTCGCIACCCAAC (SEQ ID NO:115),

e incluía además una secuencia opcional de promotor situada hacia el extremo 5’ para dar el correspondiente promotorcebador de

AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGTACCACAAGGCCTTTCGCIACCCAAC (SEQ ID NO:116).

Los cebadores de la cadena opuesta que se usaron durante el desarrollo de la presente invención tenían las secuencias de

CTAGCCATGGCGTTAGTA (SEQ ID NO:117) y CTACTGTCTTCACGCAGAAAGCG (SEQ ID NO:118).

Las sondas para detectar amplicones del VHC tenían las secuencias dadas por

CCCGGGAGAGCCAUAGUGGUCT (SEQ ID NO:119) (marcadas con AE entre las posiciones de los nucleótidos 14 y 15) y CTGCGGAACCGGTGAGTAC (SEQ ID NO:120) (marcadas con AE entre las posiciones de los nucleótidos 13 y 14).

La detección de los amplicones del VHC fue facilitada por el uso de una sonda auxiliar que tiene la secuencia de

AGCCUCCAGGACCCCCCCT (SEQ ID NO:121).

Como antes, estas sondas se prepararon usando análogos de 2'-OMe, excepto para la posición final que estaba ocupada por un nucleótido de DNA, confirmando con ello que las sondas se pueden preparar flexiblemente usando una combinación de bases equivalentes de RNA y DNA, análogos de bases y análogos de cadenas principales de nucleótidos. Los oligonucleótidos de protección de sonda tenían las secuencias de

GACCACTATGGCTC (SEQ ID NO:122) y GTACTCACCGGTTC (SEQ ID NO:123).

Los oligonucleótidos de captura incluían las secuencias complementarias de el VHC de

GGGCACUCGCAAGCACCCU (SEQ ID NO:124) y CAUGGUGCACGGUCUACG (SEQ ID NO:125),

y se prepararon usando análogos de 2'-OMe y se unieron por sus extremos 3' a una secuencia de cola de A20 con tres residuos de T interpuestos entre ellos.

Notablemente, los oligonucleótidos antes descritos se pueden usar en las condiciones descritas en la presente memoria para la detección de un solo analito. Realmente, los oligonucleótidos que se usaron para amplificar y detectar VIH-1 se pueden usar en un ensayo independiente para detectar el VIH-1, y los oligonucleótidos que se usaron para amplificar y detectar el VHC se pueden usar en un ensayo independiente para detectar el VHC. Cada uno de estos ensayos alternativos independientes representa una realización preferida de la presente invención. Además, los oligonucleótidos que se usaron para amplificar y detectar el VIH-1 se han usado en combinación con los oligonucleótidos que se usaron para amplificar y detectar el VHC en una reacción múltiple. De nuevo, esta combinación representa otra realización preferida de la presente invención. Finalmente, como se describe en numerosos ejemplos en la presente memoria, los oligonucleótidos para amplificar y detectar VHI-1 y VHC se han usado en combinación para preparar un ensayo capaz de amplificar y detectar cualquiera o la totalidad de los analitos del VIH-1, VHC y VHB.

A medida que aumenta el número de diferentes conjuntos de cebadores en una reacción de amplificación múltiple, siendo cada conjunto de cebadores específico para un polinucleótido analito diferente, hay una oportunidad creciente de interacción no deseable entre los cebadores, y entre cebadores y amplicones irrelevantes. Las secuencias de cebadores más altamente preferidas descritas en la presente memoria se pueden usar en reacciones que específicamente amplifican solamente ácidos nucleicos del VHB, y se pueden usar también como reactivos en una reacción de amplificación de un solo polinucleótido que es capaz adicionalmente de amplificar secuencias específicas de virus del VIH-1 y el VHC.

Kits para detectar ácidos nucleicos del VHB

La presente invención se refiere a kits para realizar reacciones de amplificación de polinucleótidos usando moldes de ácido nucleico viral de acuerdo con la reivindicación 1. Los kits pueden contener además una o más sondas de detección de oligonucleótidos. Estas sondas pueden incluir al menos 17 nucleótidos contiguos, más preferiblemente 17-23 nucleótidos contiguos o aún más preferiblemente 17-19 nucleótidos contiguos que están contenidos dentro de la secuencia dada por la SEQ ID NO:67 o su complemento, teniendo en cuenta la presencia de equivalentes de RNA y DNA y la sustitución de análogos de nucleótidos. Las sondas particularmente preferidas incluyen las que tienen las secuencias SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:57 y SEQ ID NO:54, aunque se pueden usar otras sondas descritas en la presente memoria y se pretenden que caigan dentro del alcance de invención. Naturalmente, los complementos de estas secuencias también se pueden usar como sondas para detectar secuencias del VHB. Otras sondas que pueden ser incluidas el kit son sondas de hibridación de balizas moleculares del tipo descrito en el Ejemplo 10. Incluso otros kits de acuerdo con la invención pueden incluir adicionalmente oligonucleótidos de captura para purificar ácidos nucleicos moldes del VHB fuera de otras especies antes de la amplificación. Oligonucleótidos de captura ilustrativos tienen longitudes de hasta 100 nucleótidos y porciones complementarias de el VHB que caen en el intervalo de al menos 20 nucleótidos contiguos, más preferiblemente 20-40 nucleótidos contiguos o aún más preferiblemente 25-30 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO:68. Ejemplos de oligonucleótidos de captura útiles que caen en esta categoría incluyen oligonucleótidos que tienen las secuencias dadas por las SEQ ID NO:70-76. Los oligonucleótidos de captura alternativos tienen longitudes de ondas de hasta 100 nucleótidos, y porciones complementarias de el VHB que caen en el intervalo de al menos 25 nucleótidos contiguos, más preferiblemente 25-50 nucleótidos contiguos o aún más preferiblemente 25-32 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO:69. Ejemplos de oligonucleótidos de captura útiles que caen dentro de esta categoría incluyen oligonucleótidos que tienen las secuencias dadas por las SEQ ID NO:77-87. Realmente, los kits útiles para practicar el método inventivo de detectar ácidos nucleicos del VHB pueden incluir, en combinación empaquetada con otra, las composiciones de oligonucleótidos de amplificación de acuerdo con la reivindicación 1 y esencialmente cualquiera de las composiciones de la sonda de detección y/o las composiciones de oligonucleótidos de captura descritas en la presente memoria.

Otros kits preferidos de acuerdo con la invención incluyen cebadores para amplificar ácidos nucleicos de dianas virales distintas del VHB, pero que pueden ser usadas en combinación con los cebadores para amplificar ácidos nucleicos dianas del VHB. Por ejemplo, los cebadores para amplificar ácidos nucleicos dianas del VHB pueden estar en combinación empaquetada con cebadores que se pueden usar para amplificar ácidos nucleicos dianas de VIH-1 y/o VHC. Los cebadores ilustrativos para amplificar VIH-1 y VHC están descritos en la presente memoria. En una realización particularmente preferida, el kit incluye cebadores para amplificar VHB, VIH-1 y VHC. Incluso otros kits incluyen cebadores que se pueden usar para amplificar solamente uno de ácidos nucleicos dianas de VIH-1 o VHC. Por tanto, debe quedar claro que están abarcadas por la presente invención muchas diferentes configuraciones de kits. Las sondas, los cebadores y las secuencias de oligonucleótidos de captura para amplificar y detectar ácidos nucleicos de VIH-1 y VHC están descritos en la presente memoria.

Los principios generales de la presente invención pueden ser apreciados más completamente por referencia a los siguientes ejemplos no limitativos, mientras que el alcance de la invención viene dado por las reivindicaciones anexas.

El Ejemplo 1 describe métodos que identifican sondas de hibridación que subsiguientemente se usaron en ensayos para detectar ácidos nucleicos del VHB. En este método uno de los siete oligonucleótidos sintéticos relacionados sirvió como diana para la unión de sondas candidatas.

Ejemplos

Ejemplo 1

Sondas oligonucleotídicas para detectar VHB

Se prepararon oligonucleótidos dianas del VHB de acuerdo con métodos estándares de laboratorio usando RNA o cadena principales de 2'-OMe. Estas dianas tenían las siguientes secuencias:

UUCCUCUUCAUCCUGCU (SEQ ID NO:88); UUCCUCUUCAUCCUGCUGCUAUGCCUCAUCUUCUU (SEQ ID NO:89); UUCCUCUGCAUCCUGCUGCUAUGCCUCAUCUUCUUGUUG (SEQ ID NO:90); GCCUCAUCUUCUUGUUGG (SEQ ID NO:91); CUCAUCUUCUUGUUGGUUCUUCUGGACUAUCAAGG (SEQ ID NO:92); UUGGUUCUUCUGGACUAU-CAAGG (SEQ ID NO:93); y CAAGGUAUGUUGCCCGU(SEQ ID NO:94).

Se prepararon sondas candidatas para hibridarse con las dianas del VHB sintéticas usando nucleótidos 2'-OMe y tenían las secuencias dadas en la Tabla 3. Notablemente, la posición 8 de la secuencia diana identificada por la SEQ ID NO:90 estaba ocupada por un resto de G que es característico de la secuencia del genotipo B del VHB.

Las reacciones de hibridación consistían en volúmenes de 100 µl volúmenes de tampón de hibridación que contenía cantidades de sonda marcada con AE correspondientes a 5 x 105 ULR (Unidades de luz relativas) y 10 µl que contenían 100 fmoles del oligonucleótido diana sintético del VHB. Las reacciones de control negativo omitían el oligonucleótido diana del VHB. Las sondas recogidas en la Tabla 5 fueron marcadas cada una con un resto de AE unido a la estructura del oligonucleótido por un enlazador no nucleotídico dispuesto internamente de acuerdo con los procedimientos descritos en las Patentes de EE.UU. Nº. 5.585.481 y 5.639.604. El uso de diferentes posiciones del enlazador confirmó la versatilidad de esta técnica de marcado. Más particularmente, el enlazador en la sonda de la SEQ ID NO:50 estaba localizado entre las posiciones 8 y 9, el enlazador en la sonda de la SEQ ID NO:51 estaba localizado entre las posiciones 5 y 6, el enlazador en la sonda de la SEQ ID NO:52 estaba localizado entre las posiciones 5 y 6, el enlazador en la sonda de la SEQ ID NO:53 estaba localizado entre las posiciones 11 y 12, el enlazador en la sonda de la SEQ ID NO:54 estaba localizado entre las posiciones 6 y 7 o entre las posiciones 13 y 14, el enlazador en la sonda de la SEQ ID NO:55 estaba localizado entre las posiciones 17 y 18 o entre las posiciones 8 y 9, el enlazador en la sonda de la ID NO:56 estaba localizado entre las posiciones 14 y 15, el enlazador en la sonda de la SEQ ID NO:57 estaba localizado entre las posiciones 8 y 9, el enlazador en la sonda de la SEQ ID NO:58 estaba localizado entre las posiciones 10 y 11, el enlazador en la sonda de la SEQ ID NO:59 estaba localizado entre las posiciones 13 y 14, el enlazador en la sonda de la ID NO:60 estaba localizado entre las posiciones 8 y 9, el enlazador en la sonda de la SEQ ID NO:61 estaba localizado entre las posiciones 9 y 10, el enlazador en la sonda de la SEQ ID NO:62 estaba localizado entre las posiciones 6 y 7, el enlazador en la sonda de la SEQ ID NO:63 estaba localizado entre las posiciones 14 y 15, el enlazador en la sonda de la ID NO:64 estaba localizado entre las posiciones 17 y 18, el enlazador en la sonda de la SEQ ID NO:65 estaba localizado entre las posiciones 5 y 6, y el enlazador en la sonda de la SEQ ID NO:66 estaba localizado entre las posiciones 8 y 9. La hibridaciones de sondas se realizaron en 200 µl de una solución que contenía succinato de litio 0,05 M (pH 5), LiCl 0,6 M, lauril-sulfato de litio al 1% (p/v), EDTA 10 mM, EGTA 10 mM, a 60ºC durante 15 minutos. Las reacciones de hibridación fueron seguidas por adición de 300 µl de tetraborato sódico 0,15 M (pH 8,5), y TRITON X-100 al 1% (Unión Carbide Corporation; Danbury, CT). Estas mezclas se incubaron primeramente a 60ºC durante 10 minutos para inactivar la sonda no hibridada y a continuación se enfrió a temperatura ambiente.

La quimioluminiscencia debida a la sonda hibridante en cada muestra fue analizada usando un luminómetro LEADER I (Gen-Sonda Incorporated) configurado para inyección automática de ácido cítrico 1 mM y peróxido de hidrógeno al 0,1% (v/v), seguido por inyección de una solución que contenía hidróxido de sodio 1 N. Los resultados para las reacciones quimioluminiscentes se midieron en unidades de luz relativas (ULR). Los resultados de las muestras de este método se presentan en la Tabla 5.

Tabla 5 Resultados de la hibridación de sondas

5 Los resultados presentados en la Tabla 5 mostraron que cada sonda dio una señal baja de ruido de fondo y al menos un nivel moderado de reacción positiva con los oligonucleótidos dianas del VHB. Sin embargo, algunas de las sondas dieron unos resultados que fueron sustancialmente mejores que otros, definiendo con ello una región diana preferida para la unión de las sondas en la secuencia del VHB. Más particularmente, con la excepción de las sondas de las SEQ ID NO:65-66, la totalidad de las sondas dieron valores de control negativos que fueron menores que 0,5% de las señales

10 de hibridación de las sondas correspondientes. Basándose en este modelo, las sondas preferidas para hibridar y detectar amplicones del VHB incluyen 17-23 nucleótidos contiguos contenidos dentro de la secuencia dada por

CCTTGATAGTCCAGAAGAACCAACAAGAAGATGAGGCATAGCAGCAGGATGCAGAGGAA (SEQ ID NO:95)

o su complemento, teniendo en cuenta los equivalentes de RNA y DNA y la presencia de los análogos de nucleótidos. Notablemente, aunque el resultado presentado par la sonda de la SEQ ID NO:54 fue para el oligonucleótido que tiene 15 un enlazador localizado entre las posiciones 6 y 7, se obtuvieron resultados sustancialmente idénticos para una sonda que tiene una secuencia de núcleobases idéntica con un enlazador localizado entre las posiciones 13 y 14. Cada una de estas alternativas representa una realización preferida de la sonda de la invención. Además, aunque el resultado presentado en la tabla para la sonda de la SEQ ID NO:55 fue para el oligonucleótido que tiene un enlazador localizado entre las posiciones 17 y 18, se obtuvieron valores buenos, pero algo inferiores para una sonda que tiene una secuencia

20 de núcleobases idénticas con un enlazador localizado entre las posiciones 8 y 9. Cada una de estas alternativas representa también una realización preferida de la sonda de la invención. Realmente, puede ser variado el posicionamiento de cualquier marcador detectable unido a cualquiera de las sondas antes descritas y todavía cae dentro del alcance de la invención.

Las sondas para el ensayo de hibridación que tienen las secuencias SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52 y SEQ ID NO:54 (que usan una combinación de oligonucleótidos separados que tienen las dos posiciones del marcador antes descritas), las SEQ ID NO:57, y SEQ ID NO:58 se usaron subsiguientemente para demostrar que una gama de cebadores de amplificación y oligonucleótidos de captura podían detectar ácidos nucleicos del VHB en muestras biológicas. Las sondas que tienen estas secuencias o sus complementos, teniendo en cuenta la presencia de equivalentes de RNA y DNA y sustituciones de análogos de nucleótidos, representan cada una realizaciones particularmente preferidas de la invención.

Las combinaciones de cebadores preferidas para amplificar ácidos nucleicos del VHB fueron identificadas en una serie de métodos que empleaban viriones de VHB como fuente de los moldes de ácidos nucleicos. Los promotorescebadores y los cebadores de cadenas opuestas se cribaron en combinación usando el método descrito más adelante. Aunque estos métodos se llevaron a cabo particularmente usando un protocolo de amplificación mediada por transcripción (TMA), los cebadores descritos en la presente memoria se pueden usar para producir amplicones mediante métodos alternativos de amplificación de ácidos nucleicos in vitro que serán familiares para los que tienen un nivel normal de experiencia en la técnica.

El Ejemplo 2 describe los métodos que identificaron cebadores de amplificación útiles. Además de los oligonucleótidos de captura de dianas específicos del VHB, los cebadores de amplificación y las sondas descritos en este método, las reacciones incluyeron también los oligonucleótidos descritos antes para los analitos de VIH-1 y VHC. Los oligonucleótidos de VIH-1 y VHC no contribuyeron sustancialmente a la detección del analito del VHB.

Ejemplo 2

Identificación de cebadores de amplificación

Viriones de genotipo A del VHB sirvieron como fuente de las secuencias moldes del VHB en reacciones de amplificación que empleaban conjuntos apareados de cebadores. Las reacciones de TMA se llevaron a cabo esencialmente como se ha descrito por Kacian et al., en la Patente de EE.UU. Nº 5.399.491, habiéndose incorporado como referencia a lo que antecede en esta memoria la descripción de esta patente de EE.UU. Cada promotor-cebador incluía una secuencia de promotor de T7

AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGA (SEQ ID NO:96)

situada hacia el extremo 5’ de una secuencia complementaria de el VHB. Las reacciones de amplificación se realizaron para varias combinaciones de cebador usando entre aproximadamente 7 y 33 copias del molde del VHB, y 1-20 pmoles de cada cebador en 100 µl de tampón de reacción. Los ácidos nucleicos experimentaron procesamiento de la muestra y captura de dianas antes de la amplificación esencialmente de acuerdo con los métodos descritos en la solicitud de patente internacional publicada Nº. PCT/US2000/18685, excepto que el molde se capturó usando oligonucleótidos específicos del VHB. Significativamente, de la totalidad de los oligonucleótidos de captura usados en el método se sabía que eran capaces de capturar moldes de VHB moldes que podían ser amplificados. Por consiguiente, este método se enfocó en la capacidad de las diferentes combinaciones de cebador y sonda en cooperar en un ensayo de amplificación múltiple. Todos los métodos se realizaron usando partes alícuotas de 500 µl de muestras madres de suero infectado que contenían 5-25 unidades internacionales/ml (UI/ml) de VHB. Notablemente, hay aproximadamente 3 copias del genoma del VHB en una UI de la preparación de virión usada en este método. Los ácidos nucleicos dianas y los cebadores se calentaron a 60ºC durante 10 minutos y luego se enfriaron a 42ºC para facilitar la reasociación de los cebadores. A las mezclas se añadió transcriptasa inversa del virus de la leucemia Moloney de múridos (MMLV) (5.600 unidades/reacción) y RNA-polimerasa de T7 (3.500 unidades/reacción). Las reacciones de amplificación final contenían Tris HCl 50 mM (pH 8,5), KCl 35 mM, GTP 4 mM, ATP 4 mM, UTP 4 mM, CTP 4 mM, dATP 1 mM, dTTP 1 mM, dCTP 1 mM, dGTP 1 mM, MgCI2 20 mM, N-acetil-L-cisteína 20 mM, y 5% (p/v) de glicerol. Después de una hora de incubación a 42ºC, la mezcla de reacción de amplificación de 100 µl completa se sometió a un ensayo de hibridación esencialmente como se ha descrito en el Ejemplo 1. Más particularmente, una o más de seis sondas diferente enumeradas en la Tabla 3 se marcaron con éster de acridinio hasta una actividad de aproximadamente 1-1,2 x 108 ULR/pmol y luego se usaron en una cantidad equivalente a 7,5 x 105 ULR para cada sonda usada en la reacción de hibridación. Para que un resultado sea considerado como positivo, la señal quimioluminiscentes que indica la hibridación de la sonda debe haber excedido 50.000 ULR en un ensayo

La Tabla 6 presenta los resultados de los métodos de amplificación que se realizaron usando diferentes combinaciones de cebadores, sondas y niveles de entrada del molde del VHB. Se muestran los resultados de la última columna de la Tabla como % de detección positiva, e indican adicionalmente el número pruebas usadas en el método. Estos resultados se recogieron a partir de cierto número de métodos que necesariamente no se llevaron a cabo contemporáneamente.

Tabla 6 Amplificación de secuencias de polinucleótidos del VHB usando combinaciones de cebador

Los resultados presentados en la Tabla 6 mostraron que muchas de las combinaciones de cebadores dieron muy altos niveles de detectabilidad del VHB, incluso a niveles de molde tan bajos como 7 copias/reacción. Significativamente, los 5 resultados que indicaban que los moldes del VHB podían ser detectados en estos ensayos, demostraron que las combinaciones de cebadores relevantes podían cooperar para amplificar secuencias de ácidos nucleicos del VHB, y demostraron además que otros constituyentes de la reacción múltiple VIH/VHC no interferían con la capacidad de las combinaciones del cebadores del VHB de funcionar en la mezcla de reacción compleja. Los resultados positivos que significan que se observó un nivel de detectabilidad del VHB no cero en una prueba, indicaban que una combinación de cebado10 res era útil en un ensayo que amplificaba solamente VHB, así como en un ensayo múltiple que era capaz de amplificar moldes de VIH-1 y VHC. Los resultados negativos que indicaban que no tuvieron lugar amplificación y detección de secuencias de VHB fueron relevantes solamente para los ensayos múltiples. Los resultados negativos pueden haber sido debidos, por ejemplo, a una interactuación indeseable entre los cebadores del VHB y los cebadores usados para amplificar una de las otras dianas virales en la reacción múltiple. Como es apoyado por los datos de sensibilidad que

15 aparecen más adelante, las combinaciones de cebador que dan niveles bajos, pero medibles de detectabilidad del VHB en los resultados presentados en la presente memoria indicaban la amplificación satisfactoria de moldes de VHB y establecía la combinación como un componente útil de un ensayo de amplificación de ácidos nucleicos del VHB. Otros cebadores contenidos en los dominios situados hacia el extremo 5’ y hacia el extremo 3' definidos por estos cebadores útiles se pueden usar también para amplificar las secuencias del VHB.

20 Los resultados presentados en la Tabla 6 indicaron además que los promotores-cebadores que incluían las secuencias complementarias de el VHB de las SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18 o SEQ ID NO:19 participaban en las reacciones de amplificación que dieron buenos niveles de detectabilidad, incluso cuando las reacciones incluían solamente un único promotor-cebador y cuando un clon M13 monocatenario fue la fuente de los moldes del genotipo A del VHB. Este resultado difería algo del requisito aparente para los dos promotores-cebadores cuando un clon M13 monocatenario servía como fuente de los moldes del genotipo G del VHB moldes, como indicaban los resultados que aparecen en la Tabla 9. Aunque los inventores desean no vincularse a ninguna teoría particular, los resultados comparativamente buenos observados en solamente algunos casos cuando se usaron promotores-cebadores únicos junto con moldes de M13 monocatenarios pueden haber reflejado niveles diferentes de sensibilidad para el ensayo.

Las secuencias opcionales que no son complementarias de la secuencia diana del VHB, tal como una secuencia de promotor que no está presente en el genoma del VHB, puede ser añadida a los cebadores en las posiciones localizadas hacia el extremo 5’ de las secuencias complementarias de dianas descritas en la presente memoria, en donde el primer cebador de amplificación es un promotor-cebador que comprende un oligonucleótido que tiene o corresponde sustancialmente a la secuencia de bases de la SEQ ID NO:23 (por ejemplo, la SEQ ID NO:40), y el segundo cebador de amplificación cebador comprende un oligonucleótido que tiene o corresponde sustancialmente a la secuencia bases de la SEQ ID NO:11.

Al igual que en el Ejemplo previo, los métodos que identifican oligonucleótidos de captura empleaban también reservas de plasma del genotipo A del VHB positivo como fuente del ácido nucleico del VHB. Cada oligonucleótido que se sometió a ensayo incluía una secuencia específica del VHB unida a una secuencia de cola de oligo-(dA). Cuando se combinan con la diana del VHB y partículas magnéticas que presentan oligo-(dT), los oligonucleótido de captura funcionales unían por un puente el DNA del VHB y la partícula, inmovilizando la diana del VHB. Separar los complejos de partículas de la solución representaba un medio de enriquecer el molde del VHB. En el método descrito más adelante los oligonucleótidos de captura se pusieron en contacto con el DNA del VHB y las partículas magnéticas modificadas con oligo(dT). Las partículas recogidas se lavaron, las secuencias de VHB unidas se amplificaron en una reacción de amplificación de ácidos nucleicos in vitro, y los productos de amplificación resultantes se detectaron en ensayos de protección homogéneos. Los resultados positivos indicaban que el oligonucleótido de captura tenía inmovilizado el DNA diana del VHB en la partícula magnética durante la etapa de captura de la diana, y que fueron satisfactorias las etapas de amplificación y detección.

El siguiente Ejemplo describe los métodos usados para analizar los oligonucleótidos de captura del VHB candidato. Además de la captura de la diana específica del VHB, el cebador de amplificación y las sondas descritas en este método, las reacciones incluyen también los oligonucleótidos específicos para los analitos del VIH-1 y VHC. Los oligonucleótidos del VIH-1 y VHC no contribuyeron sustancialmente a la detección del analito del VHB.

Ejemplo 3

Detección de secuencias del VHB usando diferentes oligonucleótidos de captura

Muestras de plasma infectado con el virus VHB que tenían volúmenes de 500 µl y que contenían 6-20 copias del genoma del VHB se dispersaron en 400 pl de reactivo de lisis/captura que contenía un total de 1,6 pmoles de oligonucleótido de captura (1,6 pmoles de un solo oligonucleótido de captura, 0,8 pmoles de cada uno de los dos oligonucleótidos de captura o 0,53 pmoles de cada uno de tres oligonucleótidos de captura) y aproximadamente 40 µg de partículas paramagnéticas de 0,7-1,05 µg (Seradyn, Indianapolis, IN) unidas covalentemente a poli-(dT14). Los oligonucleótidos de captura usados en este método tenían las secuencias dadas en la Tabla 4. El reactivo de lisis/captura incluía además un molde de control de amplificación interno del VIH-1, oligonucleótidos de captura específicos del VHC, y una solución tamponada con HEPES 100 mM que contenía lauril-sulfato de litio 294 mM, cloruro de litio 730 mM, e hidróxido de litio 50 mM. Como se ha indicado antes, se interpuso una secuencia espaciadora 5’-TTT-3' entre la secuencia complementaria de el VHB y la región de cola oligo-(dA) para cada uno de los oligonucleótidos de captura mostrados en la Tabla 4, excepto para los que incluían las secuencias SEQ ID NO:71 y SEQ ID NO:80. Notablemente, el análisis de algunos oligonucleótidos de captura que tienen secuencias idénticas excepto por la presencia o ausencia de la secuencia 5’-TTT-3' dieron resultados sustancialmente similares, indicando con ello que la secuencia espaciadora era opcional. Las mezclas se calentaron a 55-60ºC durante aproximadamente 15-30 minutos, y luego se enfriaron temperatura ambiente para permitir la hibridación. Se aplicó un campo magnético para recoger los complejos de partículas que contenían el oligonucleótido de captura inmovilizado y DNA del VHB usando métodos tales como los descritos por Wang en la Patente de EE.UU. Nº 4.895.650. Las partículas se lavaron dos veces con 1 ml de un tampón de lavado (HEPES 10 mM, NaOH 6,5 mM, EDTA 1 mM, etanol al 0,3% (v/v), (p/v), metil-parabene al 0,02% (p/v),) propil-parabene al 0,01% (p/v), NaCl 150 mM, lauril-sulfato de sodio al 0,1% (p/v)). Las partículas lavadas se volvieron a suspender luego en 75 µl del reactivo de amplificación descrito en el Ejemplo 2. Este reactivo incluía sales, nucleótidos, ribonucleótidos, cebadores específicos del VHB, así como cebadores capaces de amplificar secuencias dianas de VIH-1 y VHC. El ácido nucleico diana del VHB se amplificó luego y los productos de amplificación se detectaron usando un ensayo de protección homogéneo, esencialmente como se ha descrito en el Ejemplo 1. Las reacciones que dieron señales positivas cuando se hibridaron con una sonda específica para el amplicón de control interno, o con una sonda específica para el amplicón del VHB, fueron puntuadas con experimentos válidos. Para que un experimento válido sea considerado positivo para la presencia de amplicones del VHB, la señal quimioluminiscente que indica la hibridación de la sonda debe haber excedido 50.000 ULR en un ensayo.

La Tabla 7 presenta los resultados de muestras correlacionando la identidad del (de los) oligonucleótido(s) de captura específico(s) del VHB y la capacidad del sistema para amplificar eficientemente secuencias del VHB. Para conseguir un resultado positivo en las reacciones de amplificación, el oligonucleótido de captura del VHB debe haber sido capaz de actuar cooperativamente con los cebadores de amplificación y la(s) sonda(s) para capturar los ácidos nucleicos moldes del VHB, amplificar los ácidos nucleicos moldes del VHB y detectar luego los ácidos nucleicos amplificados. Sin embargo, el diseño experimental requirió también que los cebadores usados para amplificar los ácidos nucleicos dianas del

5 VIH-1 y VHC no interfirieran con la captura, amplificación y detección de molde del VHB. Por tanto, los resultados positivos identificaron combinaciones de oligonucleótidos de captura, cebadores de amplificación y sondas de detección que eran funcionales no solamente en un ensayo específico para el VHB, sino también en el contexto de una reacción múltiple capaz de amplificar ácidos nucleicos dianas del VIH-1 y VHC.

Notablemente, los promotores-cebadores usados en este método y recogidos en la Tabla 7 se identifican por la secuen

10 cia completa que incluía el promotor de T7. Sin embargo, ha de entenderse que las porciones complementarias de el VHB de los promotores-cebadores representan secuencias esenciales para realizar reacciones de amplificación por protocolos alternativos, tal como la reacción en cadena de la polimerasa, siendo opcional la secuencia de promotor. Por tanto, ha de entenderse que la SEQ ID NO:33-49 poseen secuencias de promotor opcionales, y que las correspondientes SEQ ID NO:16-32 representan las secuencias complementarias de el VHB esenciales respectivas. Estas últimas

15 secuencias complementarias de las secuencias del VHB son útiles junto con cebadores de las cadenas opuestas para amplificar ácidos nucleicos del VHB.

Tabla 7

Eficiencia de la detección del VHB usando diferentes combinaciones de oligonucleótidos de captura, cebadores de amplificación y sondas de detección

Los resultados presentados en la Tabla 7 confirmaron que ciertas combinaciones de oligonucleótidos de captura, cebadores de amplificación y sondas de detección dieron unos resultados que fueron sustancialmente mejores que otros. Por ejemplo, el promotor-cebador que contenía la secuencia complementaria de el VHB de la SEQ ID NO:23 (es decir, la SEQ ID NO:40) y el cebador de la cadena opuesta de la SEQ ID NO:15 fueron capaces de producir resultados positivos en el 100% de las reacciones de amplificación que contenían solamente 20 copias del molde del VHB. Estos cebadores representan una combinación particularmente preferida para amplificar ácidos nucleicos del VHB. Similarmente, las sondas antes descritas de la SEQ ID NO:54, y la combinación de las sondas SEQ ID NO:50 y SEQ ID NO:57 fueron capaces de detectar los amplicones del VHB de una manera altamente eficaz. Las sondas que tienen estas secuencias

o las sondas que tienen secuencias complementarias a ellas, son preferidas para detectar ácidos nucleicos del VHB.

Los resultados presentados en la Tabla 7 mostraron además que ciertas combinaciones de oligonucleótidos de captura, cebadores de amplificación y sondas de detección trabajaban sinérgicamente en el sistema de amplificación múltiple. Por ejemplo, los resultados mostrados para la prueba realizada usando los oligonucleótidos de captura de las SEQ ID NO:74 y SEQ ID NO:86, el cebador de amplificación de la SEQ ID NO:15 y el promotor-cebador que contiene las secuencias del VHB complementarias de el VHB de la SEQ ID NO:23 (es decir, la SEQ ID NO:40), junto con las sondas de SEQ ID NO:50 y SEQ ID NO:57 que usan 20 copias de ácido nucleico molde del VHB demostraron que cada uno de estos cebadores y sondas fue capaz de amplificar y detectar ácidos nucleicos de moldes del VHB en 100% de los experimentos válidos. Cuando los mismos cebadores y sondas se usaron en combinación con solamente uno de los oligonucleótidos de captura identificado por las SEQ ID NO:71 y SEQ ID NO:80 en reacciones que contenían 20 copias de ácido nucleico molde del VHB, se obtuvieron resultados positivos solamente en aproximadamente 30% de los experimentos válidos. Sin embargo, cuando los oligonucleótidos de captura que incluían las secuencias SEQ ID NO:71 y SEQ ID NO:80 se usaron en combinación con cada uno de los otros, estando presente cada oligonucleótido en la mitad de la cantidad total usada en las teniendo solamente un único oligonucleótido de captura, se consiguieron resultados espectacularmente superiores que se aproximaban al 100%. Esto demostró como ciertas combinaciones de los reactivos de ensayo dieron inesperadamente buenos resultados, incluso a muy bajos niveles de entrada diana.

El Ejemplo 4 describe un método que usó un conjunto particular de los oligonucleótidos descritos para ilustrar como los diferentes ensayos de amplificación descritos en la presente memoria se caracterizaron por diferentes intervalos de sensibilidad. Los hallazgos de este método establecieron que se podían obtener resultados de detección del VHB 100% positivos en un ensayo amplificado cuando el nivel del molde usado en la reacción de amplificación excedía un cierto valor umbral. Como será evidente de la comparación de los resultados presentados más adelante con los de otros Ejemplos de la presente memoria, este valor umbral dependía de la combinación particular de oligonucleótidos usada en la reacción de amplificación. Notablemente, el ensayo descrito en este Ejemplo detectó los genotipos A-G del VHB, incluso cuando la sonda de la SEQ ID NO:57 era la única sonda usada en la etapa de detección.

Ejemplo 4

Detección de ácidos nucleicos del VHB

Se llevaron a cabo reacciones de amplificación de ácidos nucleicos esencialmente como se ha descrito en los ejemplos precedentes, excepto que se omitieron los cebadores necesarios para amplificar secuencias del VIH y del VHC. Los oligonucleótidos de captura usados en el método incluyen las secuencias complementarias de el VHB de las SEQ ID NO:71 y SEQ ID NO:80. Los cebadores de amplificación incluyeron las secuencias SEQ ID NO:22 y SEQ ID NO:23, teniendo cada una de estas secuencias una secuencia de promotor de T7 añadida en su extremo 5’. Las secuencias completas de los promotores-cebadores fuero dadas por las SEQ ID NO:39, y SEQ ID NO:40. Los cebadores de las cadenas opuestas tenían las secuencias dadas por las SEQ ID NO:15 y SEQ ID NO:11. Las sondas marcadas con éster de acridinio usadas en este método tenía las secuencias dadas por las SEQ ID NO:50 y SEQ ID NO:57, como se ha descrito antes. 500 µl de partes alícuotas de plasma que contenía viriones se sometieron al método de lisis por detergente y captura de dianas antes descrito. Se llevaron a cabo reacciones de amplificación y se detectaron los productos de amplificación usando los métodos antes descritos. Las concentraciones de viriones de las muestras tratadas por este

método variaban en el intervalo de 0-100 UE/ml, donde 1 UE (unidad equivalente) corresponde a aproximadamente 3 copias del genoma del VHB. La detección positiva de las secuencias dianas del VHB en las reacciones de amplificación se determinó esencialmente como se ha descrito en los Ejemplos precedentes.

Los resultados presentados en la Tabla 8 indicaron que el 100% de las reacciones realizadas usando 300 copias del molde del VHB dieron resultados positivos, y que el 95% de la positividad se consiguió en algún nivel entre 75 y 150 copias por reacción. Significativamente, se obtuvieron resultados sustancialmente similares cuando las reacciones de amplificación se realizaron en ausencia del cebador identificado como la SEQ ID NO:15. Una combinación preferida de cebadores para amplificar ácidos nucleicos del VHB tiene las secuencias complementarias de el VHB dadas por las SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:11, y SEQ ID NO:15. Una composición de sonda preferida para detectar productos de amplificación del VHB incluye la sonda de la SEQ ID NO:57, con la inclusión adicional de la sonda de la SEQ ID NO:50 que es opcional.

Tabla 8

El ensayo de la sensibilidad establece un intervalo para el nivel de moldes detectados en un ensayo

Genotipo A de VHB (copias)

% de positivos

300

100,0

150

99,0

75

91,7

36

71,0

18

43,9

0

0,3

Los resultados de la Tabla 8 confirmaron además que incluso las combinaciones de cebador recogidas en las Tablas 6 y 7 que no dieron como resultado altos niveles de detección del VHB al nivel especificado del molde de entrada fueron capaces de identificar las muestras que contenían el VHB a niveles que se aproximan al 100% de detectabilidad cuando la cantidad del molde fue suficientemente alta. Basándose en estos hallazgos, se concluyó que las combinaciones de cebador, que dieron al menos alguna medida de la detección del VHB cuando la cantidad del entrada variaba de 6-20 copias por reacción, fueran consideradas útiles en métodos para amplificar ácidos nucleicos del VHB in vitro. Aunque puede ser deseable en algunas circunstancias usar combinaciones de cebadores que den como resultado ensayos altamente sensibles, otras circunstancias pueden beneficiarse de usar ensayos caracterizados por sensibilidades algo más bajas. Por tanto, cualquiera de las combinaciones de cebadores descritas en la presente memoria que diera resultados medibles en las Tablas 6 y 7 puede ser usada como componente de ensayos amplificación de ácidos nucleicos del VHB.

El Ejemplo 5 ilustra como el ensayo cualitativo del Ejemplo precedente puede ser adaptado a un formato cuantitativo. La recuperación por palitos (spikes) de tres controles positivos del genotipo A del VHB proporcionó una determinación cuantitativa de la prestación del ensayo. El ensayo se basa en el uso de una seudodiana de acuerdo con la patente de EE.UU. Nº 6.294.338. Aunque en ensayos cuantitativos se pueden usar seudodianas de RNA o DNA el siguiente método fue realizado usando una seudodiana de RNA.

Ejemplo 5

Ensayo cuantitativo para medir el VHB

Los componentes oligonucleotídicos usados en el ensayo cuantitativo eran idénticos a los reactivos usados en el Ejemplo precedente, excepto que se omitió la sonda de la SEQ ID NO:50. Cada reacción de amplificación incluyó adicionalmente una seudodiana de RNA que tenía la secuencia SEQ ID NO:97 en una cantidad correspondiente a aproximadamente 80 x 106 copias. Se usaron calibradores del genotipo A del VHB que tenían concentraciones que variaban de 380-12.000 UI/ml de VHB como fuente de los moldes del VHB en reacciones separadas para producir curvas patrones. Las reacciones de TMA se realizaron durante un periodo de 60 minutos, sustancialmente como se ha descrito antes. La detección de las secuencias del VHB amplificadas se llevó a cabo usando un ensayo de protección homogéneo estándar que empleó la sonda de la ID NO:57 antes descrita como una combinación de especies marcadas con éster de acridinio y no marcadas en una relación de 1:6,25. El uso de una sonda no marcada permitió que todas las señales quimioluminiscentes cayeran dentro del intervalo de respuesta fiable del luminómetro que midió específicamente la sonda hibridada. Los amplicones de la seudodiana no fueron detectados por la sonda que se usó en este método.

Los resultados presentados en la Figura 2 mostraron que el ensayo cuantitativo dio una relación sustancialmente lineal entre cantidad de molde del VHB de entrada y la intensidad de la señal de hibridación en un amplio intervalo de concentraciones del VHB que se extendía desde 0-12.000 UI/ml. El límite inferior de detección en este ensayo fue aproximadamente 1 UI/ml o entre 1 y 2 copias de ácido nucleico del VHB en una sola reacción de amplificación. Por tanto, este ensayo cuantitativo fue altamente sensible y tuvo la capacidad de medir las concentraciones del VHB o números de copias del molde en un amplio intervalo de un modo preciso.

El Ejemplo 6 describe un método que demostró como el uso de un segundo promotor-cebador en una reacción de TMA pudo influenciar positivamente la detectabilidad de diferentes genotipos del VHB. Además de oligonucleótidos de captura de dianas específicos del VHB, cebador de amplificación, y las sondas descritas en este método, las reacciones incluyen también los oligonucleótidos antes descritos específicos para los analitos del VIH-1 y VHC. Los oligonucleótidos de VIH-1 y VHC no contribuyeron sustancialmente a la detección del analito del VHB.

Ejemplo 6

Detectabilidad mejorada de genotipos de VHB

Muestras que contenían VHB a los que se les había determinado el genotipo (genotipos A-F) se obtuvieron de Millenium Biotech, Inc., (Ft. Lauderdale, FL) o Boston Biomedica (West Bridgewater, MA). Los valores de cuantificación fueron suministrados por el certificado del vendedor del análisis y estaban basados en los resultados del ensayo AMPLICOR HBV1 MONITOR (Roche Diagnostics Corp.). En ausencia de muestras de plasma que contuvieran viriones del genotipo G del VHB, un clon de M13 monocatenario que incluía secuencias de ácidos nucleicos del genotipo G del VHB correspondientes a todos los oligonucleótidos relevantes, excepto para el oligonucleótido de captura que incluía la SEQ ID NO:87, sirvió como el molde para los métodos que amplificaban secuencias de este genotipo. Los miembros del panel fueron preparados por dilución en serie de muestras de plasma de pacientes usando plasma humano negativo. 400 µl de reactivo de captura de diana (solución en detergente tamponada con HEPES que contenía el oligonucleótido de captura antes descrito que tenía las secuencias complementarias de el VHB de las SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:80 y SEQ ID NO:87, junto con partículas magnéticas) que contenía control interno y 500 µl de cada muestra o miembro del panel fueron pipeteados manualmente en unidades de diez tubos (UDT). Después de la adición del reactivo de captura de diana y la muestra, las UDT fueron sometidas a agitación con vórtice e incubadas en un baño de agua a 60ºC durante 20 minutos, seguido por incubación a temperatura ambiente (15-30ºC) durante 14-20 minutos. La rejilla de las UDT fue colocada en una plataforma de separación magnética durante 9-20 minutos. Se aspiró líquido de cada tubo y luego se reemplazó con 1 ml de de solución de lavado. La rejilla se sometió a agitación con vórtice y se colocó de nuevo en la plataforma de separación durante 4-10 minutos. De cada tuvo se aspiró la solución de lavado y se repitieron las etapas de lavado y separación, finalizando con una aspiración final. Después de la etapa de aspiración final, se añadieron a cada tubo 75 µl de reactivo de amplificación (incluyendo una de dos diferentes formulaciones de cebador, los dNTP, los NTP y cofactores en solución tamponada con Tris). La formulación de cebador A incluía un promotor-cebador que tenía la secuencia complementaria de el VHB de la SEQ ID NO:23 (es decir, la SEQ ID NO:40), así como cebadores de las cadenas opuestas identificados por SEQ ID NO:15 y SEQ ID NO:11. La formulación del cebador B incluía adicionalmente un promotor-cebador que tenía la secuencia complementaria de el VHB de la SEQ ID NO:26 (es decir, la SEQ ID NO:43). Cada mezcla fue revestida con 200 µl de aceite inerte para impedir la evaporación durante la etapa de amplificación, y la rejilla de las UDT fue sometida a agitación con vórtice para volver a poner en suspensión las micropartículas. Antes de la adición de 25 µl del reactivo enzimático, (transcriptasa inversa de MMLV y RNA-polimerasa de T7 en solución tamponada con HEPES/Tris), la rejilla se incubó en un baño de agua a 60ºC durante 10 minutos, seguido por equilibración a 41,5ºC durante 9-20 minutos. Inmediatamente después de añadir el reactivo enzimático la rejilla de las UDT se retiró del incubador y se agitó para mezcla. La rejilla se incubó luego en un baño de agua a 41,5ºC durante 60 minutos. Después de amplificación se añadieron a cada tubo 100 µl de reactivo de sonda, que incluía las sondas marcadas con el éster de acridinio antes descrito de la SEQ ID NO:54 en solución en detergente tamponada con fosfato, los tubos se sometieron a agitación con vórtice y se incubaron en un baño de agua a 60ºC durante 15 minutos. Tras completarse la etapa de hibridación de sondas se añadieron a cada tubo 250 µl de reactivo de selección (solución tamponada con borato con tensioactivo). Los tubos se sometieron a agitación con vórtice y se incubaron a 60ºC durante 10 minutos. Después de la retirada del baño de agua a 60ºC, la rejilla de las UDT se enfrió en un baño de agua a 19-27ºC durante 10-75 minutos y se colocó luego en un luminómetro LEADER HC+ (Gen-Sonda Incorporated; San Diego, CA) configurado para la inyección automática de 200 µl de una solución de peróxido de hidrógeno al 0,1% y ácido nítrico 1 mM; y 200 µl de NaOH 1 N. Para determinar la reactividad, la quimioluminiscencia resultante se comparó con un valor de corte generado a partir de los calibradores positivo y negativo que habían sido incluidos en cada experimento de 100 tubos. Para monitorizar el comportamiento del ensayo para cada reacción de muestra, se añadió a cada muestra de ensayo un control interno contenido en el reactivo de captura de diana. El control interno consistía en un transcrito sintetizado in vitro que contenía una porción de VIH-1 y una secuencia única que actuaba como diana para la sonda de control interno La señal de control interno en cada reacción fue discriminada de la señal del VHB por la cinética diferencial de emisión de luz de sondas con diferentes marcadores. El producto de amplificación del control interno fue detectado usando una sonda con emisión rápida de luz mientras que el amplicón específico para VHB fue detectado usando sondas con una menor cinética de emisión de luz. El programa informático que recibía las entradas del luminómetro diferenciaba entre las dos señales. Los resultados de estos métodos se muestran en la Tabla 9.

1 Acrónimo inglés para el VHB

Tabla 9 Detectabilidad mejorada de genotipos de VHB

Genotipo del VHB

Copias/Reacción Formulación de cebador A (% de positivos) Formulación de cebador B (% de positivos)

A

50 100 100

15

100 100

A

50 100 100

15

100 100

B

50 85 100

15

60 80

C

50 95 100

15

83 100

D

50 95 100

15

60 95

E

50 100 100

15

70 100

F

50 100 100

15

100 100

G

50 0 100

15

0 85

Como se indica por los resultados presentados en la Tabla 9, la formulación de cebador que incluía dos promotorescebadores detectó ventajosamente el VHB en el 100% de las muestras que contenían cada uno de los diferentes genotipos del VHB al nivel de 50 copias. Esto no fue cierto cuando se usaron los moldes de los genotipos B, C, D, E o G del VHB en el mismo nivel de copias de moldes en las reacciones de amplificación que incluían solamente un promotorcebador. Los resultados negativos obtenidos para las reacciones de TMA realizadas que usaban un solo promotorcebador y el molde del genotipo G clonado del VHB fueron artefactos debido al uso de un molde que era enteramente monocatenario. Ensayos separados realizados usando viriones del genotipo G del VHB como fuente de moldes, y formulación de cebador B como fuente de cebadores, dieron 100% de detectabilidad tanto a 15 como 50 copias/reacción. Cuando es deseable amplificar los ácidos nucleicos de los genotipos A-G del VHB de una manera altamente sensible, se prefiere usar en la reacción dos cebadores de la primera cadena y al menos un cebador de la segunda cadena. En un caso particular, cuando es deseable amplificar los ácidos nucleicos de los genotipos A-G del VHB en una reacción de TMA altamente sensible, se prefiere usar dos promotores-cebadores y al menos un no-promotor-cebador en la reacción. Naturalmente se pueden realizar reacciones de amplificación de ácidos nucleicos in vitro basadas en protocolos de ciclos térmicos o métodos que implican una etapa para separar físicamente cadenas de ácidos nucleicos recientemente sintetizadas de sus moldes usando solamente un cebador situado hacia el extremo 5’ y un cebador situado hacia el extremo 3'.

Los siguientes Ejemplos presentan pruebas que muestran que las combinaciones de los oligonucleótidos descritos en la presente memoria podían ser usadas en reacciones múltiples que también eran capaces de detectar cada uno de ácidos nucleicos de VIH-1 y VHC de un modo altamente sensible.

El Ejemplo 7 describe un método en donde se detectaron los ácidos nucleicos dianas del VIH-1 usando los oligonucleótidos específicos para el VIH-1 y los protocolos de amplificación y detección descritos en la presente memoria.

Ejemplo 7

Detección del VIH-1 en una reacción de amplificación múltiple

Se diluyeron muestras del patrón de la Organización Mundial de la Salud (OMS) del VIH-1, Subtipo B (97/656) en plasma humano negativo para dar títulos virales que variaban de 0-300 UI/ml. Muestras de 500 µl de este panel de dilución se sometieron luego a procesamiento, captura de dianas, amplificación y detección de acuerdo con los procedimientos descritos en el Ejemplo 2 usando oligonucleótidos específicos del VIH-1 de las SEQ ID NO:100-114 junto con los oligonucleótidos específicos del VHC de las SEQ ID NO:115-125 y oligonucleótidos específicos del VHB. Los oligonucleótidos de captura específicos del VIH-1 tenían las secuencias SEQ ID NO:113-114. Los promotores-cebadores específicos del VIH-1 de las SEQ ID NO:100-101 tenían las secuencias complementarias de el VIH esencial de las SEQ ID NO:9899 respectivamente añadidas a la secuencia de promotor situada hacia el extremo 5’. Los cebadores de las cadenas opuestas tenían las secuencias SEQ ID NO:102-103. Las sondas tenían las secuencias SEQ ID NO:106-108. Los oligo

nucleótidos de captura específicos del VHC tenían las secuencias SEQ ID NO:124-125. El promotor-cebador específico del VHC de la SEQ ID NO:116 tenía la secuencia complementaria de el VHC esencial de la SEQ ID NO:115 añadida a la secuencia de promotor situada hacia el extremo 5’. Los cebadores de las cadenas opuestas tenían las secuencias de la SEQ ID NO:117-118. Las sondas tenían las secuencias SEQ ID NO:120 y 122. Los oligonucleótidos específicos del VHB en este método incluían los oligonucleótidos de captura que tenían las secuencias complementarias de el VHB de las SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:80 y SEQ ID NO:87; los cebadores de amplificación de las SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:15 y SEQ ID NO:11; y las sondas de detección por hibridación antes descritas de la SEQ ID NO:54. Los promotores-cebadores específicos del VHB de las SEQ ID NO:40 y 43 tenían respectivamente las secuencias complementarias de el VHB esencial de las SEQ ID NO:23 y 26 añadidas a la secuencia de promotor situada hacia el extremo 5’. Se llevaron a cabo veinte duplicados, y se determinó la probabilidad de detección del 95% en un intervalo de confianza del 95%. Los resultados del método se recogen en la Tabla 10.

Tabla 10 Detección de ácidos nucleicos del VIH-1 sin reacción de amplificación múltiple

Título (UI/ml)

% de positivos Probabilidad de 95% de detección

300

100 13,0 (10,1 a 19,5)

100

100

33,3

100

11,1

84

3,7

53

1,23

21

0

0

Los resultados mostrados en la Tabla 10 indicaron claramente que los ácidos nucleicos del VIH-1 fueron detectados en la reacción múltiplex que fue capaz también de detectar los ácidos nucleicos del VHC y del VHB. Además, el análisis adicional indicó que la detectabilidad de tipo/grupo del VIH-1 en este ensayo incluía A, B, C, D, E, F, G, el grupo N y grupo O a niveles que se aproximan al 100% de positividad cuando las reacciones contenían 100 copias/ml o más del VIH-1. Como se ha indicado antes, la recogida de oligonucleótidos específicos del VIH-1 se usó en ensayos independientes para detectar VIH-1 o en combinación con los oligonucleótidos específicos para el VHC o alternativamente el VHB para crear ensayos dúplex.

El Ejemplo 8 describe un método en donde los ácidos nucleicos dianas del VHC fueron detectados usando los oligonucleótidos específicos para el VHC y los protocolos de amplificación y detección descritos en la presente memoria.

Ejemplo 8

Detección del VHC en una reacción de amplificación múltiplex

Se diluyeron muestras del patrón de la Organización Mundial de la Salud (OMS) del VIH-1, genotipo 1 (96/790) en plasma humano negativo para dar títulos que variaban de 0-100 UI/ml. Muestras de 500 µl de este panel de dilución se sometieron luego a procesamiento, captura de dianas, amplificación y detección usando los oligonucleótidos y los métodos descritos en el Ejemplo previo. Se llevaron a cabo veinte duplicados, y se determinó la probabilidad de detección del 95% en un intervalo de confianza del 95%. Los resultados del método se recogen en la Tabla 11.

Tabla 11 Detección de ácidos nucleicos del VHC en una reacción de amplificación múltiplex

Título (UI/ml)

% de positivos Probabilidad de 95% de detección

100

100 1,6 (1,2 a 2,3)

33,3

100

11,1

100

3,7

100

1,23

80

0,41

47

0

0

Los resultados mostrados en la Tabla 11 indicaron claramente que los ácidos nucleicos del VHC fueron detectados en la reacción múltiple que también fue capaz de detectar los ácidos nucleicos del VIH-1 y del VHB. Además, el ensayo adicional indicó que los genotipos 1, 1b, 2b, 2a/c, 3, 3e, 4, 4a, 4b/c, 5, 5a, 6, 6a del VHC fueron todos detectados con 100% de positividad cuando las reacciones contenían 100 copias/ml o más del VHC. Como se ha indicado antes la recogida de oligonucleótidos específicos del VHC usada en este método se puede usar en ensayos independientes para detectar el VHC o en combinación con los oligonucleótidos específicos para el VIH o alternativamente el VHB para crear ensayos dúplex.

El Ejemplo 9 describe un método en donde los ácidos nucleicos dianas del VHB fueron detectados usando los oligonucleótidos específicos para el VHB y los protocolos de amplificación y detección descritos en la presente memoria. Los resultados experimentales presentados cuantitativamente ilustran la sensibilidad de este ensayo.

Ejemplo 9

Detección del VHB en una reacción de amplificación múltiplex

Se diluyeron muestras del patrón de la Organización Mundial de la Salud (OMS) del VHB, genotipo A (97/746) en plasma humano negativo para dar títulos que variaban de 0-100 UI/ml. Muestras de 500 µl de este panel de dilución se sometieron luego a procesamiento, captura de dianas, amplificación y detección usando los oligonucleótidos y los métodos descritos en el Ejemplo 7. Se llevaron a cabo ochenta duplicados, y se determinó la probabilidad de detección del 95% en un intervalo de confianza del 95%. Los resultados del método se recogen en la Tabla 12

Tabla 12 Detección de ácidos nucleicos del VHB en una reacción de amplificación múltiplex

Título (UI/ml)

% de positivos Probabilidad de 95% de detección

45

100 5,7 (4,8 a 7)

15

100

5

90

1,67

45

0,56

15

0

0

Los resultados mostrados en la Tabla 12 indicaron claramente que los ácidos nucleicos del VHB fueron detectados en la reacción múltiple que también fue capaz de detectar los ácidos nucleicos del VIH-1 y del VHC. Además, el ensayo adicional indicó que los genotipos A-G del VHB eran todos detectables en este ensayo. Como se ha indicado antes la recogida de oligonucleótidos específicos del VHB usada en este método se puede usar en ensayos independientes para detectar VHB o in combinación con los oligonucleótidos específicos para el VIH o alternativamente el VHC para crear ensayos dúplex.

Para ilustrar más la versatilidad del sistema de detección de analitos antes descrito, la producción de amplicones se monitorizó en función del tiempo en métodos de amplificación en "tiempo real". Las balizas moleculares específicas de amplicones que estaban incluidas en las reacciones de amplificación proporcionaron un medio para monitorizar en continuo la síntesis de amplicones. Las emisiones fluorescentes que aumentaban con el tiempo indicaban la producción de amplicones que se hibridaban con la baliza molecular y causaban una transición detectable a la conformación "abierta" de la sonda.

Las balizas moleculares comprenden moléculas de ácidos nucleicos que tienen una secuencia con forma de bucle complementaria de la diana, una pareja de afinidad (o "brazos" de ácidos nucleicos) que interactúan para formar la estructura original/madre ("stem") por apareamiento de bases complementarias en ausencia de una diana (es decir, la conformación "cerrada") y un conjunto apareado de marcadores que interactúan cuando la sonda está en la conformación cerrada. La hibridación del ácido nucleico diana y la secuencia complementaria de la diana de la sonda hace que los miembros de la pareja de afinidad se separen, cambiando de esto modo la sonda a la conformación abierta. Este cambio es detectable en virtud de la interactuación reducida entre los miembros del par del marcador, que pueden ser, por ejemplo, un fluoróforo y un agente de extinción de la fluorescencia. Las balizas moleculares están descritas completamente en la patente de EE.UU. Nº 5.925.517.

Se usó un programa informático comercialmente disponible para analizar los resultados obtenidos dependientes del tiempo usando balizas moleculares que eran específicas para los amplicones del VHB, VIH-1 o el VHC. Los resultados de estos análisis indicaron una fuerte relación entre el número de copias de dianas incluidas en una reacción de amplificación y el tiempo en el cual la señal fluorescente excedió el umbral del ruido de fondo (es decir, "el tiempo de aparición" por encima del ruido de fondo). Como confirmaron los resultados presentados más adelante, estos métodos fueron útiles para cuantificar las cantidades de la diana analito en un intervalo muy amplio. Más particularmente, cuando se usan cantidades conocidas de polinucleótidos analitos como patrones de calibración, es posible determinar la cantidad de analito presente en una muestra de ensayo comparando el tiempo de aparición medido con la gráfica patrón.

El hecho de que la reacción de amplificación usada en los métodos descritos más adelante realizados a temperatura constante y sin interrupción por una etapa de detección separada, de modo que la amplificación y detección tuvieron lugar simultáneamente, imponía requisitos muy estrictos a las sondas moleculares. Más específicamente, el éxito del método requería que la sonda molecular se uniera al amplicón sin inhibir el uso subsiguiente del amplicón como un molde en el mecanismo de amplificación exponencial. Realmente, el hallazgo de que una reacción de amplificación pudiera transcurrir eficientemente en presencia de una baliza molecular indicó que la interactuación de la sonda con su diana no inhibía irreversiblemente o envenenaba la reacción de amplificación.

El Ejemplo 10 describe métodos en donde las sondas balizas moleculares, cada una marcada con una pareja fluoróforo/ agente extintor de la fluorescencia interactiva, fueron usadas para monitorizar la producción de amplicones dependiente del tiempo en reacciones de TMA. Aunque las balizas moleculares descritas en este Ejemplo se hibridan a solamente una cadena del ácido nucleico producido, también sería de esperar que las secuencias de sondas complementarias se hibridaran a las cadenas opuestas de los ácidos nucleicos.

Ejemplo 10

Monitorización en tiempo real de la producción de amplicones

Se sintetizaron balizas moleculares que tienen especificidad para amplicones de VHB, VIH-1 o VHC por química estándar de triéster fosfito en fase sólida usando vidrio de poros controlados (abreviadamente CPG por la expresión inglesa Controlled Pore Glass) enlazado a un agente extintor de fluorescencia en 3' y fosforamidita marcada con un fluoróforo en 5’ en un sintetizador automático Perkin-Elmer (Foster City, CA) modelo EXPEDITE 8909. Los fluoróforos usados para construir las balizas moleculares incluyeron fluoresceína, colorantes ROX y CY5. Se usaron como agentes extintores de la fluorescencia BLACK HOLE QUENCHER 2 (Biosearch Technologies, Inc.; Novato, CA) y DABCYL. Todas la balizas moleculares se construyeron usando análogos de nucleótidos con 2'-metoxi. El vidrio CPG y el reactivo fosforamidita fueron comprados a Glen Research Corporation (Sterling, VA). Después de la síntesis, las sondas se desprotegieron y escindieron de la matriz de soporte sólida por tratamiento con hidróxido de amonio concentrado (30%) durante dos horas a 60ºC. A continuación, las sondas se purificaron usando electroforesis en gel de poliacrilamida seguido por HPLC usando métodos estándares que serán familiares a los que tienen un nivel ordinario de experiencia en la técnica.

Las ácidos nucleicos dianas de VHB, VIH-1 y VHC usados el método fueron dianas artificiales o sintética de concentración conocida. La diana del VHB fue un clon M13 monocatenario que contenía una porción del genoma del VHB que incluía secuencias correspondientes a, o complementarias con, cada uno de los cebadores. La diana del VIH-1 era un transcrito sintético. La diana del VHC era un RNA ARMORED (Ambion, Inc.; Austin, TX) que incluía secuencias genómicas del VHC. La tecnología ARMORED RNA® se usa para producir controles y patrones resistentes a ribonucleasa ensamblando secuencias específicas de RNA y proteína de la envolvente viral en partículas seudovirales. Las balizas moleculares se usaron aun nivel de aproximadamente 1,5 pmoles/reacción. Las reacciones para amplificar el VHB contenían 5 x 102 - 5 x 109 copias del molde/reacción. Las reacciones para amplificar el VIH-1 contenían 5 x 101 – 5 x 106 copias del molde/reacción. Las reacciones para amplificar el VHC contenían 5 - 5 x 108 copias del molde/reacción.

Tubos que contenían 15 µl de una solución tamponada que incluía sales y reactivos esencialmente como los descritos en el Ejemplo 2, un polinucleótido diana, y una baliza molecular fueron recubiertos primeramente con 15 µl de aceite inerte para impedir la evaporación. Los tubos se incubaron luego en un bloque térmico seco durante 10 minutos a 60ºC para facilitar la reasociación del cebador. Los cebadores para amplificar la diana del VHB tenían las secuencias complementarias de dianas de las SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:15 y SEQ ID NO:11. Los cebadores para amplificar la diana del VIH-1 tenían las secuencias complementarias de dianas de las SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:103 y SEQ ID NO:102. Los cebadores para amplificar la diana del VHC tenían las secuencias complementarias de dianas de SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:117 y SEQ ID NO:118. Notablemente, la reacciones de amplificación usadas para ensayar las balizas moleculares específicas del VHB incluían todos la totalidad de los cebadores para amplificar las tres dianas. Las reacciones de amplificación usadas para analizar las balizas moleculares específicas del VIH-1 y VHC incluían la totalidad de los cebadores para amplificar ambas dianas, pero no los cebadores para amplificar la diana de VHB. Naturalmente, se pretende que cualquiera de las balizas moleculares antes descritas pueda usarse en reacciones de amplificación que incluyan cualquier combinación de cebadores. Después de la etapa de incubación a 60ºC, los tubos fueron transferidos a un bloque térmico a 42ºC y luego incubados durante 10 minutos. Se añadieron a cada uno de los tubos, usando una pipeta multicanal, partes alícuotas de cinco microlitros de un reactivo enzimático que incluía tanto transcriptasa inversa de MMLV como la enzima RNA-polimerasa de T7. Los tubos fueron sometidos a agitación con vórtice brevemente y luego se transfirieron a un rotor ROTORGENE-2000 (Corbett Research; Sydney, Australia) rotor que había sido precalentado a 42ºC. Las reacciones de amplificación se llevaron a cabo a 42ºC, las lecturas de fluorescencia se tomaron cada 30 segundos, y los resultados se analizaron en tiempo real usando un programa informático estándar que fue suministrado con el instrumento ROTORGENE-2000.

La Tabla 13 presenta las secuencias con forma de bucle complementarias de la diana de balizas moleculares específicas del VHB que se usaron durante el desarrollo de la invención. Cada una de las balizas moleculares incluía una secuencia de brazo 5’ CCGAG añadida y una secuencia de brazo 3' CUCGG añadida. Cada sonda incluía un fluoróforo CY5 en su extremo 5’, y un resto de BLACK HOLE QUENCHER 2 en su extremo 3'. La totalidad de las balizas moleculares específicas del VHB tenían secuencias con forma de bucles complementarias a la diana que tenían una longitud de 12-20 nucleótidos e incluían 12-20 nucleótidos contiguos contenidos en la secuencia

AAGAAGATGAGGCATAGCAGCAGGATGAAGAGGAA (SEQ ID NO:126)

teniendo en cuenta la presencia de análogos de nucleótidos y equivalentes de RNA y DNA.

10 Los resultados presentados en la Tabla 14 confirmaron que las reacciones de amplificación que incluían una de las balizas moleculares específicas del VHB produjeron deseablemente una señal fluorescente que aumentó con el tiempo. Todos los resultados estuvieron basados en reacciones que se realizaron por triplicado. Significativamente, las diferentes balizas moleculares se comportaron algo diferentemente en el formato de ensayo en tiempo real. Por ejemplo, las reacciones que incluían una baliza molecular altamente preferida que tienen una secuencia con forma de bucle com

15 plementaria de la diana de la SEQ ID NO:127 dio una rápida detección de altos números de dianas y una fuerte relación lineal entre señal fluorescente y cantidad de diana en una representación logarítmica en el intervalo completo de niveles de dianas ensayados (véase la Figura 3). Los coeficientes de variación (CV) para las lecturas del tiempo de aparición obtenidos usando esta sonda fueron 3,2% o menos, lo que indicaba muy altos niveles de precisión entre los puntos de datos. Las reacciones que incluían la baliza molecular que tenía la secuencia con forma de bucle complementaria de la

20 diana de la SEQ ID NO:133 exhibieron diferentes características de respuesta que fueron algo menos lineales en el intervalo de niveles de entrada de diana debido a la respuesta de la sonda a niveles muy bajos de diana. Esta última sonda será particularmente útil para detectar y cuantificar cantidades de diana de VHB mayores que 5.000 copias de VHB.

Tabla 14 25 Tiempos de aparición medidos para diferentes balizas moleculares

Copias de la diana del VHC/rxn

Tiempo de aparición para diferentes balizas moleculares (minutos)

SEQ ID NO:127

SEQ ID NO:128 SEQ ID NO:129 SEQ ID NO:130 SEQ ID NO:131 SEQ ID NO:132 SEQ ID NO:133

5 x 109

4,4 NT NT 3,3 8,9 NT NT ,

5 x 108

6,7 NT NT 5,4** 14,9 NT NT

5 x 107

8,7 NT NT 6,2* 23,4 10,1 10,0

5 x 106

11,1 NT NT NT NT 12,3 12,2

5 x 105

13,4 16,3 20,9 NT NT 14,5 13,9

5 x 104

15,9 18,6 33,5* NT NT 17,2 17,6

5 x 103

18,3 29,7* ND NT NT 21,9* 21,5*

5 x 102

20,8** NT NT NT NT ND 49,7*

"NT" = no ensayado; "ND" = no detectado

* = solamente uno de tres duplicados reactivos; ** = solamente dos de tres duplicados reactivos

30 La Tabla 15 presenta las secuencias con forma de bucles complementarias de dianas de balizas moleculares del VIH que se usaron durante el desarrollo de la invención. La baliza molecular que tiene la secuencia con forma de bucle complementaria de la diana de SEQ ID NO:134 incluía una secuencia de brazo 5’ CCGAG añadida y una secuencia de brazo 3' CUCGG añadida. Esta sonda incluía un fluoróforo ROX en su extremo 5’, y un resto del agente extintor de la

fluorescencia BLACK HOLE QUENCHER 2 en su extremo 3'. Una baliza molecular relacionada tenía la secuencia con forma de bucle complementaria de la diana idéntica, pero tenía la secuencia global

5’-CCGAGAGGGUACAGUGCAGGGGUCUCGG-3' (SEQ ID NO:135).

Cuando se compara con la baliza molecular específica del VIH antes descrita, los brazos de esta sonda incluían cada uno un solo nucleótido adicional inmediatamente adyacente a la secuencia con forma de bucle complementaria de la diana de la sonda. Esta sonda incluía también un fluoróforo de fluoresceína (en lugar de ROX) en su extremo 5’ y un resto de agente extintor de la fluorescencia DABCYL (en lugar de BLACK HOLE 2 QUENCHER 2) en su extremo 3'. La baliza molecular que tiene la secuencia con forma de bucle complementaria de la diana de la SEQ ID NO:136 incluía una secuencia de brazo 5’ CCGAGA añadida, y una secuencia de brazo 3' UCUCGG añadida. Esta sonda incluía también un fluoróforo de fluoresceína en su extremo 5’, y un resto del agente extintor de la fluorescencia DABCYL en su extremo 3'. Las balizas moleculares usadas en estos métodos tenían secuencias con forma de bucle complementarias de la diana que tenían una longitud de 16-17 nucleótidos e incluían 16-17 nucleótidos contiguos contenidos dentro de la secuencia

GGGGTACAGTGCAGGGG (SEQ ID NO:137),

teniendo en cuenta la presencia de análogos de nucleótidos y de equivalentes RNA y DNA.

Tabla 15

Secuencias con forma de bucles complementarias de la diana de balizas moleculares específicas del VIH

Los resultados presentados en la Tabla 16 confirmaron que las reacciones de amplificación que incluían una de las balizas moleculares específicas del VIH produjo deseablemente una señal fluorescente que aumentó con el tiempo. La baliza molecular que incluía la secuencia con forma de bucle complementaria de la diana de la SEQ ID NO:134 permitió una rápida detección de bajos niveles de diana. Las reacciones que incluían esta sonda se realizaron por triplicado y exhibieron una fuerte relación lineal entre el nivel de diana de entrada y la señal fluorescente con al menos cuatro fases logarítmicas de intervalo dinámico útil que se extiende desde 5 x 101 - 5 x 105 copias/reacción de la diana del VIH-1. Aunque los resultados no se presentan en la Tabla, ensayos adicionales mostraron que el intervalo dinámico de reacciones que incluían esta baliza molecular se extendía hasta 5 x 101 o 5 x 108 copias/reacción de la diana del VIH-1. La baliza molecular que tiene la secuencia de la SEQ ID NO:135 exhibió una gráfica bifásica en un gráfico logarítmico de cantidad de diana de entrada frente al tiempo de aparición. Estas reacciones, que se realizaron por duplicado en grupos de cinco, exhibieron una fuerte relación lineal entre la cantidad de diana de entrada y el tiempo de aparición en el intervalo de 5 x 103 – 5 x 106, y una relación lineal algo más débil en el intervalo de 5 x 101 – 5 x 103 copias/reacción de la diana del VIH-1. Esta baliza molecular es particularmente útil para cuantificar el intervalo superior de cantidades diana en ensayos de tiempo real, pero exhibió un intervalo dinámico útil de al menos cinco fases logarítmicas que cubrían el intervalo que se extiende desde 5 x 101 – 5 x 106 copias/reacción del molde del VIH-1. Las reacciones que incluían esta baliza molecular que tiene la secuencia con forma de bucle complementaria de la diana de la SEQ ID NO:136 se realizaron por triplicado y exhibían una fuerte relación lineal entre el nivel de diana de entrada y la señal fluorescente con al menos tres fases logarítmicas de intervalo dinámico útil que se extiende desde 5 x 102 – 5 x 105 copias/reacción de la diana del VIH-1. Es interesante considerar que las reacciones de amplificación que incluían esta baliza molecular requerían ligeramente más tiempo para detectar bajas cantidades de diana cuando se compararon con las reacciones que incluían cualquiera de las otras dos balizas moleculares específicas del VIH.

Tabla 16 Tiempo de aparición medido para diferentes balizas moleculares

VHB diana (copias/rxn)

Tiempo de aparición para diferentes balizas moleculares (minutos)

SEQ ID NO:134

SEQ ID NO:135 SEQ ID NO:136

5 x 106

NT 4,0 NT

5 x 105

7,2 5,8 6,1

5 x 104

8,8 8,0 9,3

5 x 103

10,6 9,7 11,2

5 x 102

12,7 12,7 14,2

5 x 101

14,8 17,0 ND

"NT" = no analizado "ND" = no detectado

La Tabla 17 presenta las secuencias con forma de bucles complementarias de la diana de balizas moleculares específicas del VHC que se usaron durante el desarrollo de la invención. La baliza molecular que incluía la secuencia con forma de bucle complementaria de la diana de la SEQ ID NO:138 incluía una secuencia de brazo 5’ CGAGG en el extremo añadida y una secuencia de brazo 3' CCUCG añadida. Esta baliza molecular incluía adicionalmente un fluoróforo CY5 en su extremo 5’ y un resto del agente extintor de fluorescencia BLACK HOLE QUENCHER 2 en el extremo 3'. La baliza molecular que incluía la secuencia con forma de bucle complementaria de la diana de la SEQ ID NO:139 incluía una secuencia de brazo 5’ CCGAG añadida y una secuencia de brazo 3' CUCGG añadida. Esta baliza molecular fue marcada con un fluoróforo de fluoresceína en su extremo 5’ y con un resto del agente extintor de la fluorescencia DABCYL en su extremo 3'. La baliza molecular que incluía la secuencia con forma de bucle complementaria de la diana de la SEQ ID NO:140 incluía una secuencia de brazo 5’ CGGAC añadida y una secuencia de brazo 3' GUCCG añadida. Esta baliza molecular fue marcada en su extremo 5’ con un fluoróforo CY5 y en su extremo 3' con resto del agente extintor de la fluorescencia BLACK HOLE QUENCHER 2. Las balizas moleculares que alojaban secuencias con forma de bucle complementarias de la diana de las sondas que incluían secuencias con forma de bucle complementarias de la diana de SEQ ID NO:138, SEQ ID NO:139 y SEQ ID NO:140 fueron analizadas por duplicado, en grupos de cinco, tres y cuatro, respectivamente. La totalidad de las balizas moleculares usadas en estos métodos tenían secuencias con forma de bucle complementarias de la diana que tenían una longitud de 10-14 nucleótidos e incluían 10-14 nucleótidos contiguos contenidos dentro de las secuencia

TAGTATGAGTGTCGTGCAGCCTCCAGGACCCCCCCTCCCGGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTAC ACCGGAATTGC (SEQ ID NO:141),

teniendo en cuenta la presencia de análogos de nucleótidos y equivalentes de RNA y DNA.

Tabla 17 Secuencias con forma de bucles complementarias de la diana de balizas moleculares específicas del VHB

Los resultados presentados en la Tabla 18 confirmaron que las reacciones de amplificación que incluían una de las balizas moleculares específicas del VHC produjeron deseablemente una señal fluorescente que aumentó con el tiempo. Las reacciones que incluían la baliza molecular que tiene la secuencia con forma de bucle complementaria de la diana de la SEQ ID NO:138 exhibió un intervalo dinámico útil de aproximadamente seis fases logarítmicas, consiguiéndose buenos resultados en el intervalo de cantidades de diana que se extienden desde 5 x 101 – 5 x 107 copias/reacción del molde del VHC. Las reacciones que incluían la baliza molecular que tiene la secuencia con forma de bucle complementaria de la diana de la SEQ ID NO:139 exhibió un intervalo dinámico útil de aproximadamente siete fases logarítmicas, consiguiéndose buenos resultados en el intervalo de aproximadamente 5 x 101- 5 x 108 copias/reacción del molde de VHC. Las reacciones que incluían la baliza molecular que tiene la secuencia con forma de bucle complementaria de la diana de la SEQ ID NO:140 exhibió un intervalo dinámico útil de aproximadamente ocho fases logarítmicas, consiguiéndose buenos resultados en el intervalo de aproximadamente 5 – 5 x 108 copias/reacción del molde del VHC.

Tabla 18 Tiempo de aparición medido para diferentes balizas moleculares

VHC DIANA (copias/rxn)

Tiempo de aparición medido para diferentes balizas moleculares (min)

SEQ ID NO:138

SEQ ID NO:139 SEQ ID NO:140

5 x 108

NT 1,0 2,3

5 x 107

6,9 3,3 6,5

5 x 106

8,3 5,3 8,0

5 x 105

10,4 7,5 10,1

5 x 104

12,2 9,2 11,8

5 x 103

14,0 11,2 14,3

5 x 102

16,1 14,2 16,0

5 x 101

18,5 20,0 18,3

5

NT 27,4* 21,0**

"NT" = no ensayado

* = solamente uno de tres duplicados reactivos. ** = solarmente tres de cuatro duplicados reactivos.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Linnen, Jeffery M. Kolk, Daniel P. Dockter, Janel M. Getman, Damon K. Yoshimura, Tadashi Ho-Sing-Loy, Marcy Stringfellow, Leslie A.

<120> Composición y métodos para detectar el virus de la Hepatitis B

<130> GP134-02.UT

<150> 60/389,393

<151> 2002-06-14

<160> 142

<170> FastSEQ para Windows Versión 3.0

<210> 1

<211> 128

<212> DNA

<213> Virus de la Hepatitis B

<400> 1

<210> 2 <211> 50 <212> DNA <213> Virus de la Hepatitis B

<400> 2 ctggatgtgt ctgcggcgtt ttatcatatt cctcttcatc ctgctgctat

50

<210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Virus de la Hepatitis B

<400> 3 atcatattcc tcttcatcct gctgctat

28

<210> 4 <211> 54 <212> DNA <213> Virus de la Hepatitis B

<400> 4 ggaattagag gacaaacggg caacatacct tgataatcca gaagaaccaa taag

54

<210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Virus de la Hepatitis B

<400> 5 ttgataatcc agaagaacca a

21

<210> 6 <211> 21

<212> DNA <213> Virus de la Hepatitis B

<400> 6 cttgataatc cagaagaacc a

21

<210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Virus de la Hepatitis B

<400> 7 taccttgata atccagaaga acca

24

<210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Virus de la Hepatitis B

<400> 8 gataatccag aagaaccaat aa

22

<210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Virus de la Hepatitis B

<400> 9 ataatccaga agaaccaata ag

22

<210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Virus de la Hepatitis B

<400> 10 agaggacaaa cgggcaacat

20

<210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Virus de la Hepatitis B

<400> 11 aggacaaacg ggcaacatac

20

<210> 12 <211> 31 <212> DNA <213> Virus de la Hepatitis B

<400> 12 ggaattagag gacaaacggg caacatacct t

31

<210> 13 <211> 27 <212> DNA <213> Virus de la Hepatitis B

<400> 13 ttagaggaca aacgggcaac atacctt

27

<210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Virus de la Hepatitis B

<400> 14 gaggacaaac gggcaacata cctt

24

<210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Virus de la Hepatitis B

<400> 15 gacaaacggg caacatacct t

21

<210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Virus de la Hepatitis B

<400> 16 gtgtcttggc caaaattcgc agtc

24

<210> 17 <211> 26 <212> DNA <213> Virus de la Hepatitis B

<400> 17 gtccccaacc tccaatcact caccaa

26

<210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Virus de la Hepatitis B

<400> 18 cccaacctcc aatcactcac caac

24

<210> 19 <211> 26 <212> DNA <213> Virus de la Hepatitis B

<400> 19 ctgtcctcca atttgtcctg gttatc

26

<210> 20 <211> 27 <212> DNA <213> Virus de la Hepatitis B

<400> 20 ccaacctcct gtcctccaat ttgtcct

27

<210> 21 <211> 27 <212> DNA <213> Virus de la Hepatitis B

<400> 21 caacctcctg tcctccaatt tgtcctg

27

<210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Virus de la Hepatitis B

<400> 22 ctggatgtgt ctgcggcgtt

20

<210> 23 <211> 22 <212> DNA <213> Virus de la Hepatitis B

<400> 23 gatgtgtctg cggcgtttta tc

22

<210> 24 <211> 23 <212> DNA <213> Virus de la Hepatitis B

<400> 24 atcatattcc tcttcatcct gct

23

<210> 25 <211> 23 <212> DNA <213> Virus de la Hepatitis B

<400> 25 atattcctct tcatcctgct gct

23

<210> 26 <211> 23 <212> DNA <213> Virus de la Hepatitis B

<220> <221> base_modificada <222> (11)...(11) <223> I

<400> 26 atattcctct ncatcctgct gct

23

<210> 27 <211> 24 <212> DNA <213> Virus de la Hepatitis B

<400> 27 atattcctct tcatcctgct gcta

24

<210> 28 <211> 23 <212> DNA <213> Virus de la Hepatitis B

<400> 28 attcctcttc atcctgctgc tat

23

<210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> Virus de la Hepatitis B

<400> 29 aatttgtcct ggttatcgct g

21

<210> 30 <211> 18 <212> DNA <213> Virus de la Hepatitis B

<400> 30 cctggttatc gctggatg

18

<210> 31 <211> 18 <212> DNA <213> Virus de la Hepatitis B

<400> 31 ctggttatcg ctggatgt

18

<210> 32 <211> 18 <212> DNA <213> Virus de la Hepatitis B

<400> 32 tggttatcgc tggatgtg

18

<210> 33 <211> 51 <212> DNA <213> Secuencia Artificial

<220> <223> cebador-promotor específico de HBV

<400> 33 aatttaatac gactcactat agggagagtg tcttggccaa aattcgcagt c

51

<210> 34 <211> 53 <212> DNA <213> Secuencia Artificial

<220> <223> cebador-promotor específico de HBV

<400> 34 aatttaatac gactcactat agggagagtc cccaacctcc aatcactcac caa

53

<210> 35 <211> 51 <212> DNA <213> Secuencia Artificial

<220> <223> cebador-promotor específico de HBV

<400> 35 aatttaatac gactcactat agggagaccc aacctccaat cactcaccaa c

51

<210> 36 <211> 53 <212> DNA <213> Secuencia Artificial

<220> <223> cebador-promotor específico de HBV

<400> 36 aatttaatac gactcactat agggagactg tcctccaatt tgtcctggtt atc

53

<210> 37 <211> 54

<212> DNA <213> Secuencia Artificial

<220> <223> cebador-promotor específico de HBV

<400> 37 aatttaatac gactcactat agggagacca acctcctgtc ctccaatttg tcct

54

<210> 38 <211> 54 <212> DNA <213> Secuencia Artificial

<220> <223> cebador-promotor específico de HBV

<400> 38 aatttaatac gactcactat agggagacaa cctcctgtcc tccaatttgt cctg

54

<210> 39 <211> 47 <212> DNA <213> Secuencia Artificial

<220> <223> cebador-promotor específico de HBV

<400> 39 aatttaatac gactcactat agggagactg gatgtgtctg cggcgtt

47

<210> 40 <211> 49 <212> DNA <213> Secuencia Artificial

<220> <223> cebador-promotor específico de HBV

<400> 40 aatttaatac gactcactat agggagagat gtgtctgcgg cgttttatc

49

<210> 41 <211> 50 <212> DNA <213> Secuencia Artificial

<220> <223> cebador-promotor específico de HBV

<400> 41 aatttaatac gactcactat agggagaatc atattcctct tcatcctgct

50

<210> 42 <211> 50 <212> DNA <213> Secuencia Artificial

<220> <223> cebador-promotor específico de HBV

<400> 42 aatttaatac gactcactat agggagaata ttcctcttca tcctgctgct

50

<210> 43 <211> 50

<212> DNA <213> Secuencia Artificial

<220> <223> cebador-promotor específico de HBV <221> base_modificada <222> (38)...(38) <223> I

<400> 43 aatttaatac gactcactat agggagaata ttcctctnca tcctgctgct

50

<210> 44 <211> 51 <212> DNA <213> Secuencia Artificial

<220> <223> HBV-specific promoter-primer

<400> 44 aatttaatac gactcactat agggagaata ttcctcttca tcctgctgct a

51

<210> 45 <211> 50 <212> DNA <213> Secuencia Artificial

<220> <223> cebador-promotor específico de HBV

<400> 45 aatttaatac gactcactat agggagaatt cctcttcatc ctgctgctat

50

<210> 46 <211> 48 <212> DNA <213> Secuencia Artificial

<220> <223> cebador-promotor específico de HBV

<400> 46 aatttaatac gactcactat agggagaaat ttgtcctggt tatcgctg

48

<210> 47 <211> 45 <212> DNA <213> Secuencia Artificial

<220> <223> cebador-promotor específico de HBV

<400> 47 aatttaatac gactcactat agggagacct ggttatcgct ggatg

45

<210> 48 <211> 45 <212> DNA <213> Secuencia Artificial

<220> <223> cebador-promotor específico de HBV

<400> 48 aatttaatac gactcactat agggagactg gttatcgctg gatgt

45

<210> 49 <211> 45 <212> DNA <213> Secuencia Artificial

<220> <223> cebador-promotor específico de HBV

<400> 49 aatttaatac gactcactat agggagatgg ttatcgctgg atgtg

45

<210> 50 <211> 17 <212> RNA <213> Virus de la Hepatitis B

<220> <221> característica_miscelánea <222> (1)...(16) <223> análogos del nucleótido 2’-OMe

<400> 50 agcaggauga agaggaa

17

<210> 51 <211> 18 <212> RNA <213> Virus de la Hepatitis B

<220> <221> característica_miscelánea <222> (1)...(17) <223> análogos del nucleótido 2’-OMe

<400> 51 gcagcaggau gaagagga

18

<210> 52 <211> 17 <212> DNA <213> Virus de la Hepatitis B

<220> <221> característica_miscelánea <222> (1)...(16) <223> análogos del nucleótido 2’-OMe

<400> 52 gcagcaggat gaagagg

17

<210> 53 <211> 18 <212> RNA <213> Virus de la Hepatitis B

<220> <221> característica_miscelánea <222> (1)...(17) <223> análogos del nucleótido 2’-OMe

<400> 53 ugaggcauag cagcagga

18

<210> 54 <211> 19

<212> DNA <213> Virus de la Hepatitis B

<220> <221> característica_miscelánea <222> (1)...(18) <223> análogos del nucleótido 2’-OMe

<400> 54 gaagatgagg catagcagc

19

<210> 55 <211> 23 <212> RNA <213> Virus de la Hepatitis B

<220> <221> característica_miscelánea <222> (1)...(22) <223> análogos del nucleótido 2’-OMe

<400> 55 acaagaagau gaggcauagc agc

23

<210> 56 <211> 19 <212> RNA <213> Virus de la Hepatitis B

<220> <221> característica_miscelánea <222> (1)...(18) <223> análogos del nucleótido 2’-OMe

<400> 56 agaagaugag gcauagcag

19

<210> 57 <211> 18 <212> RNA <213> Virus de la Hepatitis B

<220> <221> característica_miscelánea <222> (1)...(17) <223> análogos del nucleótido 2’-OMe

<400> 57 aagaagauga ggcauagc

18

<210> 58 <211> 18 <212> DNA <213> Virus de la Hepatitis B

<220> <221> característica_miscelánea <222> (1)...(17) <223> análogos del nucleótido 2’-OMe

<400> 58 acaagaagat gaggcata

18

<210> 59 <211> 18 <212> RNA

<213> Virus de la Hepatitis B

<220> <221> característica_miscelánea <222> (1)...(17) <223> análogos del nucleótido 2’-OMe

<400> 59 ccaacaagaa gaugaggc

18

<210> 60 <211> 23 <212> RNA <213> Virus de la Hepatitis B

<220> <221> característica_miscelánea <222> (1)...(22) <223> análogos del nucleótido 2’-OMe <221> base_modificada <222> (2)...(2) <223> I

<400> 60 anuccagaag aaccaacaag aag

23

<210> 61 <211> 23 <212> RNA <213> Virus de la Hepatitis B

<220> <221> característica_miscelánea <222> (1)...(22) <223> análogos del nucleótido 2’-OMe <221> base_modificada <222> (2)...(2) <223> I

<400> 61 anuccagaag aaccaacaag aag

23

<210> 62 <211> 20 <212> DNA <213> Virus de la Hepatitis B

<220> <221> característica_miscelánea <222> (1)...(19) <223> análogos del nucleótido 2’-OMe

<400> 62 ccagaagaac caacaagaag

20

<210> 63 <211> 22 <212> RNA <213> Virus de la Hepatitis B

<220> <221> característica_miscelánea <222> (1)...(21) <223> análogos del nucleótido 2’-OMe

<400> 63

ccuugauagu ccagaagaac ca

22

<210> 64 <211> 23 <212> RNA <213> Virus de la Hepatitis B

<220> <221> característica_miscelánea <222> (1)...(22) <223> análogos del nucleótido 2’-OMe

<400> 64 ccuugauagu ccagaagaac caa

23

<210> 65 <211> 17 <212> RNA <213> Virus de la Hepatitis B

<220> <221> característica_miscelánea <222> (1)...(16) <223> análogos del nucleótido 2’-OMe

<400> 65 acgggcaaca uaccuug

17

<210> 66 <211> 16 <212> RNA <213> Virus de la Hepatitis B

<220> <221> característica_miscelánea <222> (1) ... (15) <223> análogos del nucleótido 2’-OMe

<400> 66 cgggcaacau accuug

16

<210> 67 <211> 71 <212> DNA <213> Virus de la Hepatitis B

<400> 67

<210> 68

<211> 93

<212> DNA

<213> Virus de la Hepatitis B

<400> 68

<210> 69

<211> 73

<212> DNA

<213> Virus de la Hepatitis B

<400> 69

<210> 70 <211> 36 <212> DNA <213> Virus de la Hepatitis B

<400> 70 agactcgtgg tggacttctc tcaattttct aggggg

36

<210> 71 <211> 30 <212> DNA <213> Virus de la Hepatitis B

<400> 71 gtggtggact tctctcaatt ttctaggggg

30

<210> 72 <211> 20 <212> DNA <213> Virus de la Hepatitis B

<400> 72 ggatcacccg tgtgtcttgg '

20

<210> 73 <211> 25 <212> DNA <213> Virus de la Hepatitis B

<400> 73 gtgtcttggc caaaattcgc agtcc

25

<210> 74 <211> 40 <212> DNA <213> Virus de la Hepatitis B

<400> 74 gccaaaattc gcagtcccca acctccaatc actcaccaac

40

<210> 75 <211> 27 <212> DNA <213> Virus de la Hepatitis B

<400> 75 gccaaaattc gcagtcccca acctcca

27

<210> 76 <211> 27 <212> DNA <213> Virus de la Hepatitis B

<400> 76 ttcgcagtcc ccaacctcca atcactc

27

<210> 77 <211> 40 <212> DNA <213> Virus de la Hepatitis B

<400> 77 cgtttctcct ggctcagttt actagtgcca tttgttcagt

40

<210> 78 <211> 45 <212> DNA <213> Virus de la Hepatitis B

<400> 78 cgtttctcct ggctcagttt actagtgcca tttgttcagt ggtcg

45

<210> 79 <211> 32 <212> DNA <213> Virus de la Hepatitis B

<400> 79 tggctcagtt tactagtgcc atttgttcag tg

32

<210> 80 <211> 32 <212> DNA <213> Virus de la Hepatitis B

<400> 80 tggctcagtt tactagtgcc atttgttcag tg

32

<210> 81 <211> 34 <212> DNA <213> Virus de la Hepatitis B

<400> 81 tggctcagtt tactagtgcc atttgttcag tggt

34

<210> 82 <211> 36 <212> DNA <213> Virus de la Hepatitis B

<400> 82 ggctcagttt actagtgcca tttgttcagt ggttcg

36

<210> 83 <211> 42 <212> DNA <213> Virus de la Hepatitis B

<400> 83 ggctcagttt actagtgcca tttgttcagt ggttcgtagg gc

42

<210> 84 <211> 50 <212> DNA <213> Virus de la Hepatitis B

<400> 84 ggctcagttt actagtgcca tttgttcagt ggttcgtagg gctttccccc

50

<210> 85 <211> 33 <212> DNA <213> Virus de la Hepatitis B

<400> 85 gtgccatttg ttcagtggtt cgtagggctt tcc

33

<210> 86 <211> 25 <212> DNA <213> Virus de la Hepatitis B

<400> 86 gggctttccc ccactctttg gcttt

25

<210> 87 <211> 25 <212> DNA <213> Virus de la Hepatitis B

<400> 87 gggctttccc ccactgtttg gcttt

25

<210> 88 <211> 17 <212> RNA <213> Virus de la Hepatitis B

<400> 88 uuccucuuca uccugcu

17

<210> 89 <211> 35 <212> RNA <213> Virus de la Hepatitis B

<400> 89 uuccucuuca uccugcugcu augccucauc uucuu

35

<210> 90 <211> 39 <212> RNA <213> Virus de la Hepatitis B

<400> 90 uuccucugca uccugcugcu augccucauc uucuuguug

39

<210> 91 <211> 18 <212> RNA <213> Virus de la Hepatitis B

<400> 91 gccucaucuu cuuguugg

18

<210> 92 <211> 35 <212> RNA <213> Virus de la Hepatitis B

<400> 92 cucaucuucu uguugguucu ucuggacuau caagg

35

<210> 93 <211> 23 <212> RNA <213> Virus de la Hepatitis B

<400> 93 uugguucuuc uggacuauca agg

23

<210> 94

<211> 17

<212> RNA

<213> Virus de la Hepatitis B

5 <400> 94 caagguaugu ugcccgu 17

<210> 95

<211> 59 10 <212> DNA

<213> Virus de la Hepatitis B

<400> 95

ccttgatagt ccagaagaac caacaagaag atgaggcata gcagcaggat gcagaggaa 59 15

<210> 96

<211> 27

<212> DNA

<213> Bacteriófago T7 20

<400>

96 aatttaatac gactcactat agggaga 27

<212> DNA

<213> Virus de la Hepatitis B

<400> 97

<210> 98

<211> 23

<212> DNA 35 <213> HIV-1

<400> 98 cgggcgccac tgctagagat ttt

23

<210> 99 <211> 28 <212> DNA <213> HIV-1

<400> 99 gtttgtatgt ctgttgctat tatgtcta

28

<210> 100 <211> 50 <212> DNA <213> Secuencia Artificial

<220> <223> HIV-specific promoter-primer

<400> 100 aatttaatac gactcactat agggagacgg gcgccactgc tagagatttt

50

<210> 101 <211> 55 <212> DNA <213> Secuencia Artificial

<220> <223> HIV-specific promoter-primer

<400> 101 aatttaatac gactcactat agggagagtt tgtatgtctg ttgctattat gtcta

55

<210> 102 <211> 18 <212> DNA <213> HIV-1

<400> 102 gcctcaataa agcttgcc

18

<210> 103 <211> 19 <212> DNA <213> HIV-1

<400> 103 acagcagtac aaatggcag

19

<210> 104 <211> 20 <212> DNA <213> HIV-1

<400> 104 gacagcagta caaatggcag

20

<210> 105 <211> 21 <212> DNA <213> HIV-1

<400> 105 agacagcagt acaaatggca g

21

<210> 106 <211> 22 <212> DNA <213> HIV-1

<400> 106 ccacaatttt aaaagaaaag gg

22

<210> 107 <211> 20 <212> RNA <213> HIV-1

<220> <221> base_modificada <222> (7)...(7) <223> I

<400> 107 cugguancua gagaucccuc

20

<210> 108 <211> 19 <212> DNA <213> HIV-1

<220> <221> base_modificada <222> (8) ... (8) <223> I

<221> base_modificada <222> (9) ... (9) <223> I

<221> base_modificada <222> (10)...(10) <223> I

<400> 108 ggattggnnn gtacagtgc

19

<210> 109 <211> 24 <212> RNA <213> HIV-1

<400> 109 ccacaagcuu agaagauaga gagg

24

<210> 110 <211> 15 <212> DNA <213> HIV-1

<400> 110 ggatctctag ctacc

15

<210> 111 <211> 22 <212> DNA <213> HIV-1

<400> 111 cccttttctt ttaaaattgt gg

22

<210> 112

<211> 16

<212> DNA

<213> HIV-1

<400> 112 ctatcttcta agcttg 16

<210> 113

<211> 21

<212> RNA

<213> HIV-1

<400> 113 acugacgcuc ucgcacccau c 21

<210> 114

<211> 24

<212> RNA

<213> HIV-1

<400> 114 ucugcugucc cuguaauaaa cccg 24

<210> 115

<211> 28

<212> DNA

<213> Virus de la Hepatitis C

<220>

<221> base_modificada

<222> (21) ... (21)

<223> I

<400> 115 agtaccacaa ggcctttcgc nacccaac 28

<210> 116

<211> 55

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador-promotor específico de HCV

<221> base_modificada

<222> (48)...(48)

<223> I

<400> 116 aatttaatac gactcactat agggagaagt accacaaggc ctttcgcnac ccaac 55

<210> 117

<211> 18

<212> DNA

<213> Virus de la Hepatitis C

<400> 117 ctagccatgg cgttagta 18

<210> 118

<211> 23

<212> DNA

<213> Virus de la Hepatitis C

<400> 118 ctactgtctt cacgcagaaa gcg 23

<210> 119 <211> 22 <212> RNA <213> Virus de la Hepatitis C

<220> <221> base_modificada <222> (22)...(22) <223> t

<221> característica_miscelánea <222> (1)...(21) <223> análogos del nucleótido 2’-OMe

<400> 119 cccgggagag ccauaguggu cn

22

<210> 120 <211> 19 <212> DNA <213> Virus de la Hepatitis C

<400> 120 ctgcggaacc ggtgagtac

19

<210> 121 <211> 19 <212> DNA <213> Virus de la Hepatitis C

<400> 121 agccuccagg accccccct

19

<210> 122 <211> 14 <212> DNA <213> Virus de la Hepatitis C

<400> 122 gaccactatg gctc

14

<210> 123 <211> 14 <212> DNA <213> Virus de la Hepatitis C

<400> 123 gtactcaccg gttc

14

<210> 124 <211> 19 <212> RNA <213> Virus de la Hepatitis C

<400> 124 gggcacucgc aagcacccu

19

<210> 125 <211> 18 <212> RNA <213> Virus de la Hepatitis C

<400> 125 cauggugcac ggucuacg

18

<210> 126 <211> 35 <212> DNA <213> Virus de la Hepatitis B

<400> 126 aagaagatga ggcatagcag caggatgaag aggaa

35

<210> 127 <211> 18 <212> RNA <213> Virus de la Hepatitis B

<220> <221> característica_miscelánea <222> (1)...(18) <223> análogos del nucleótido 2’-OMe

<400> 127 gaagaugagg cauagcag

18

<210> 128 <211> 20 <212> RNA <213> Virus de la Hepatitis B

<220> <221> característica_miscelánea <222> (1)...(20) <223> análogos del nucleótido 2’-OMe

<400> 128 aagaagauga ggcauagcag

20

<210> 129 <211> 18 <212> RNA <213> Virus de la Hepatitis B

<220> <221> característica_miscelánea <222> (1) ... (18) <223> análogos del nucleótido 2’-OMe

<400> 129 cagcaggaug aagaggaa

18

<210> 130 <211> 14 <212> RNA <213> Virus de la Hepatitis B

<220> <221> característica_miscelánea <222> (1)...(14) <223> análogos del nucleótido 2’-OMe

<400> 130 caggaugaag agga

14

<210> 131 <211> 12 <212> RNA <213> Virus de la Hepatitis B

<220>

<221> característica_miscelánea <222> (1)...(12) <223> análogos del nucleótido 2’-OMe

<400> 131 aagaagauga gg

12

<210> 132 <211> 16 <212> RNA <213> Virus de la Hepatitis B

<220> <221> característica_miscelánea <222> (1)...(16) <223> análogos del nucleótido 2’-OMe

<400> 132 gaagaugagg cauagc

16

<210> 133 <211> 14 <212> RNA <213> Virus de la Hepatitis B

<220> <221> característica_miscelánea <222> (1) .. (14) <223> análogos del nucleótido 2’-OMe

<400> 133 gaagaugagg caua

14

<210> 134 <211> 16 <212> RNA <213> HIV-1

<220> <221> característica_miscelánea <222> (1)...(16) <223> análogos del nucleótido 2’-OMe

<400> 134 ggguacagug cagggg

16

<210> 135 <211> 28 <212> RNA <213> HIV-1

<220> <221> característica_miscelánea <222> (1) .. (28) <223> análogos del nucleótido 2’-OMe

<400> 135 ccgagagggu acagugcagg ggucucgg

28

<210> 136 <211> 19 <212> RNA <213> HIV-1

<220> <221> característica_miscelánea

<222> (1) ... (19) <223> análogos del nucleótido 2’-OMe

<400> 136 agggguacag ugcaggggu

19

<210> 137 <211> 17 <212> DNA <213> HIV-1

<400> 137 ggggtacagt gcagggg

17

<210> 138 <211> 10 <212> RNA <213> Virus de la Hepatitis C

<220> <221> característica_miscelánea <222> (1)...(10) <223> análogos del nucleótido 2’-OMe

<400> 138 aaccggugag

10

<210> 139 <211> 14 <212> RNA <213> Virus de la Hepatitis C

<220> <221> característica_miscelánea <222> (1)...(14) <223> análogos del nucleótido 2’-OMe

<400> 139 uacaccggaa uugc

14

<210> 140 <211> 13 <212> RNA <213> Virus de la Hepatitis C

<220> <221> característica_miscelánea <222> (1)...(13) <223> análogos del nucleótido 2’-OMe

<400> 140 uaguaugagu guc

13

<210> 141 <211> 86 <212> DNA <213> Virus de la Hepatitis C

<400> 141

<210> 142

<211> 46

<212> DNA

<213> Virus de la Hepatitis B

<400> 142

aggacaaacg ggcaacatac cttgataatc cagaagaacc aataag 46 5

Claims (12)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un kit para amplificar ácidos nucleicos dianas del VHB que pueden estar presentes en un muestra biológica, que comprende:

   un primer cebador seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NO: 26, que comprenden opcionalmente en su extremo 5’ una primera secuencia de cebador situada hacia el extremo 5’ que no es complementaria de los ácidos nucleicos del VHB;

   un segundo cebador que consiste en la SEQ ID NO: 23, que comprende opcionalmente en su extremo 5’ una segunda secuencia de cebador situada hacia el extremo 5’ que no es complementaria de los ácidos nucleicos del VHB; un tercer cebador que consiste en la SEQ ID NO: 15, que comprende opcionalmente en su extremo 5’ una tercera secuencia de cebador situada hacia el extremo 5' que no es complementaria de los ácidos nucleicos del VHB; y un cuarto cebador que consiste en la SEQ ID NO: 11, que comprende opcionalmente en su extremo 5’ una cuarta secuencia de cebador hacia el extremo 5’ que no es complementaria de los ácidos nucleicos del VHB.

2. 2.

   El kit de la reivindicación 1, en donde el primer cebador consiste en la SEQ ID NO: 22, que comprende opcionalmente en su extremo 5’ dicha primera secuencia de cebador situada hacia el extremo 5’.

3. 3. El kit de la reivindicación 2, que comprende además una seudodiana del VHB que comprende RNA.

4. 4.

   El kit de la reivindicación 1, en donde el primer cebador consiste en la SEQ ID NO: 26, que comprende opcionalmente en su extremo 5’ dicha primera secuencia de cebador situada hacia el extremo 5’.

5. 5.

   El kit de las reivindicaciones 2 o 4, en donde dicho primer cebador comprende la primera secuencia opcional de cebador situada hacia el extremo 5’, en donde el segundo cebador comprende la segunda secuencia opcional de cebador situada hacia el extremo 5’, y en donde cada una de las primera y segunda secuencias de cebador situadas hacia el extremo 5’ es una secuencia de promotor para una RNA-polimerasa.

6. 6.

   El kit de cualquiera de las reivindicaciones 1 - 5, que comprende además al menos una sonda marcada detectablemente complementaria de un amplicón de VHB producido en una reacción de amplificación in vitro usando dichos cebadores.

7. 7.

   El kit de la reivindicación 6, en donde la sonda marcada detectablemente comprende un marcador fluorescente.

8. 8. El kit de las reivindicaciones 6 o 7, en donde dicha sonda marcada detectablemente es una baliza molecular.

9. 9.

   El kit de cualquiera de las reivindicaciones 1 - 8, que comprende además cebadores para amplificar un ácido nucleico diana del VIH-1.

10. 10.

    El kit de cualquiera de las reivindicaciones 1 - 9, que comprende además cebadores para amplificar un ácido nucleico diana del VHC.

11. 11.

    El kit de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, que comprende además un oligonucleótido de captura de diana.

12. 12.

    El kit de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde dicho kit es para una amplificación mediada por transcripción de un ácido nucleico diana del VHB de una muestra biológica.