JP2002051778A - 小型球形ウイルス（ｓｒｓｖ）ｒｎａ検出のためのオリゴヌクレオチドおよび検出法 - Google Patents
小型球形ウイルス（ｓｒｓｖ）ｒｎａ検出のためのオリゴヌクレオチドおよび検出法Info
- Publication number
- JP2002051778A JP2002051778A JP2000182326A JP2000182326A JP2002051778A JP 2002051778 A JP2002051778 A JP 2002051778A JP 2000182326 A JP2000182326 A JP 2000182326A JP 2000182326 A JP2000182326 A JP 2000182326A JP 2002051778 A JP2002051778 A JP 2002051778A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- rna
- srsv
- sequence
- oligonucleotide
- dna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Virology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 小型球形ウイルス（ＳＲＳＶ）ＲＮＡを検出
するためのオリゴヌクレオチドであって、比較的低温
（例えば４１℃）一定温度で、ＳＲＳＶ ＲＮＡに特異
的に結合するオリゴヌクレオチドと、それらを用いた一
定温度核酸増幅法からなるＳＲＳＶ ＲＮＡ検出法の提
供。 【解決手段】ＳＲＳＶのゲノムＲＮＡを検出するために
有用なオリゴヌクレオチドであって、ＳＲＳＶ ＲＮＡ
に特異的に結合可能である、下記配列番号１又は同様の
６種類のいずれかの配列中の少なくとも連続した１０塩
基以上からなるオリゴヌクレオチド。 ｔｃｃｔｔｔｔａｔｇ ｇｔａｔｇｇｇｔｇｔ（配列番
号１）
するためのオリゴヌクレオチドであって、比較的低温
（例えば４１℃）一定温度で、ＳＲＳＶ ＲＮＡに特異
的に結合するオリゴヌクレオチドと、それらを用いた一
定温度核酸増幅法からなるＳＲＳＶ ＲＮＡ検出法の提
供。 【解決手段】ＳＲＳＶのゲノムＲＮＡを検出するために
有用なオリゴヌクレオチドであって、ＳＲＳＶ ＲＮＡ
に特異的に結合可能である、下記配列番号１又は同様の
６種類のいずれかの配列中の少なくとも連続した１０塩
基以上からなるオリゴヌクレオチド。 ｔｃｃｔｔｔｔａｔｇ ｇｔａｔｇｇｇｔｇｔ（配列番
号１）
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、臨床検査、公衆衛
生、食品検査、食中毒検査におけるＳＲＳＶの検出用の
オリゴヌクレオチドに関するものである。小型球形ウイ
ルス（ＳｍａｌｌＲｏｕｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ Ｖ
ｉｒｕｓ、ＳＲＳＶ）は、一般にウイルス性食中毒の原
因ウイルスとして知られている。
生、食品検査、食中毒検査におけるＳＲＳＶの検出用の
オリゴヌクレオチドに関するものである。小型球形ウイ
ルス（ＳｍａｌｌＲｏｕｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ Ｖ
ｉｒｕｓ、ＳＲＳＶ）は、一般にウイルス性食中毒の原
因ウイルスとして知られている。
【０００２】
【従来の技術】ＳＲＳＶはヒトカリシウイルスに属す
る。ヒトカリシウイルスは、ジェノグループＩ（Ｇ
Ｉ）、ジェノグループＩＩ（ＧＩＩ）、ジェノグループ
ＩＩＩ（ＧＩＩＩ）の３種の遺伝子型に区別されてき
た。一般に、ＧＩ、ＧＩＩはＳＲＳＶ、ＧＩＩＩは（狭
義の）ヒトカリシウイルスと呼ばれている。
る。ヒトカリシウイルスは、ジェノグループＩ（Ｇ
Ｉ）、ジェノグループＩＩ（ＧＩＩ）、ジェノグループ
ＩＩＩ（ＧＩＩＩ）の３種の遺伝子型に区別されてき
た。一般に、ＧＩ、ＧＩＩはＳＲＳＶ、ＧＩＩＩは（狭
義の）ヒトカリシウイルスと呼ばれている。
【０００３】我が国で届け出されている食中毒の約２０
％はウイルスが原因と推定されている。これらのウイル
ス性食中毒例の約８０％以上からＳＲＳＶが検出され
る。おもな感染源は食品で、しばしば生カキが問題とな
っている。また、乳幼児の（散発性の）急性胃腸炎から
もＳＲＳＶが検出され、ヒトからヒトへ伝播する可能性
も示唆されている。以上から、ＳＲＳＶの検査は、公衆
衛生上および食品の品質管理上大きな課題となってい
る。
％はウイルスが原因と推定されている。これらのウイル
ス性食中毒例の約８０％以上からＳＲＳＶが検出され
る。おもな感染源は食品で、しばしば生カキが問題とな
っている。また、乳幼児の（散発性の）急性胃腸炎から
もＳＲＳＶが検出され、ヒトからヒトへ伝播する可能性
も示唆されている。以上から、ＳＲＳＶの検査は、公衆
衛生上および食品の品質管理上大きな課題となってい
る。
【０００４】これまでＳＲＳＶの検出は、電子顕微鏡に
よる観察が基本であった。ただし、この方法は、検出す
るには１０6個／ｍｌ以上のウイルス量が必要で、対象
が患者糞便に限られている。また、ウイルスを観察でき
ても同定することはできなかった。
よる観察が基本であった。ただし、この方法は、検出す
るには１０6個／ｍｌ以上のウイルス量が必要で、対象
が患者糞便に限られている。また、ウイルスを観察でき
ても同定することはできなかった。
【０００５】近年、ヒトカリシウイルスのウイルス様中
空粒子が生産できるようになり、これを用いた特異抗体
検出ＥＬＩＳＡの検討も進められている。しかし、検出
感度は電子顕微鏡と同程度で決して高感度な方法とはい
えない。
空粒子が生産できるようになり、これを用いた特異抗体
検出ＥＬＩＳＡの検討も進められている。しかし、検出
感度は電子顕微鏡と同程度で決して高感度な方法とはい
えない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】以上のように、従来法
では複雑な操作と長時間を要し、また短時間で試料中に
存在する極微量のＳＲＳＶを検出することは困難であ
り、食品検査等に必要な迅速かつ高感度な検出法の出現
が望まれている。さらには、検査をより簡便にするため
には、自動化された検査装置の開発が要求されている。
では複雑な操作と長時間を要し、また短時間で試料中に
存在する極微量のＳＲＳＶを検出することは困難であ
り、食品検査等に必要な迅速かつ高感度な検出法の出現
が望まれている。さらには、検査をより簡便にするため
には、自動化された検査装置の開発が要求されている。
【０００７】高感度な検出法としては標的核酸を増幅す
る方法の利用が可能である。ＳＲＳＶのようなゲノムが
ＲＮＡの特定配列の増幅法としては、逆転写―ポリメレ
ースチェインリアクション（ＲＴ−ＰＣＲ）法が知られ
ている。この方法は、逆転写工程で標的ＲＮＡのｃＤＮ
Ａを合成し、引き続いてｃＤＮＡの特定配列の両末端部
に相補的および相同な一組のプライマー（アンチセンス
プライマーは逆転写工程と共用でよい）と熱耐性ＤＮＡ
ポリメレース存在下で、熱変性、プライマー・アニー
ル、伸長反応からなるサイクルを繰り返し行うことによ
って特定ＤＮＡ配列を増幅する方法である。しかし、Ｒ
Ｔ−ＰＣＲ法は、２段階の操作（逆転写工程およびＰＣ
Ｒ工程）、および、急激な昇温・降温を繰り返す操作が
必要であり、そのことが自動化への障害として挙げられ
る。
る方法の利用が可能である。ＳＲＳＶのようなゲノムが
ＲＮＡの特定配列の増幅法としては、逆転写―ポリメレ
ースチェインリアクション（ＲＴ−ＰＣＲ）法が知られ
ている。この方法は、逆転写工程で標的ＲＮＡのｃＤＮ
Ａを合成し、引き続いてｃＤＮＡの特定配列の両末端部
に相補的および相同な一組のプライマー（アンチセンス
プライマーは逆転写工程と共用でよい）と熱耐性ＤＮＡ
ポリメレース存在下で、熱変性、プライマー・アニー
ル、伸長反応からなるサイクルを繰り返し行うことによ
って特定ＤＮＡ配列を増幅する方法である。しかし、Ｒ
Ｔ−ＰＣＲ法は、２段階の操作（逆転写工程およびＰＣ
Ｒ工程）、および、急激な昇温・降温を繰り返す操作が
必要であり、そのことが自動化への障害として挙げられ
る。
【０００８】一方、特定ＲＮＡ配列の増幅法としては、
逆転写酵素およびＲＮＡポリメレースの協奏的作用によ
って特定ＲＮＡ配列を増幅するＮＡＳＢＡ法や３ＳＲ法
等が知られている。この方法は、標的ＲＮＡを鋳型と
し、プロモーター配列を含むプライマー、逆転写酵素、
およびリボヌクレエースＨにより、プロモーター配列を
含む２本鎖ＤＮＡを合成し、該２本鎖ＤＮＡを鋳型とし
てＲＮＡポリメレースにより、標的ＲＮＡの特定塩基配
列を含むＲＮＡを合成し、該ＲＮＡが引き続きプロモー
ター配列を含む２本鎖ＤＮＡ合成の鋳型となる連鎖反応
を行うものである。
逆転写酵素およびＲＮＡポリメレースの協奏的作用によ
って特定ＲＮＡ配列を増幅するＮＡＳＢＡ法や３ＳＲ法
等が知られている。この方法は、標的ＲＮＡを鋳型と
し、プロモーター配列を含むプライマー、逆転写酵素、
およびリボヌクレエースＨにより、プロモーター配列を
含む２本鎖ＤＮＡを合成し、該２本鎖ＤＮＡを鋳型とし
てＲＮＡポリメレースにより、標的ＲＮＡの特定塩基配
列を含むＲＮＡを合成し、該ＲＮＡが引き続きプロモー
ター配列を含む２本鎖ＤＮＡ合成の鋳型となる連鎖反応
を行うものである。
【０００９】このようにＮＡＳＢＡ法や３ＳＲ法は一定
温度での核酸増幅が可能であり、自動化へ適している方
法だと考えられる。しかし、これらの増幅法は比較的低
温（例えば４１℃）で反応を行うために、標的ＲＮＡが
分子内構造を形成し、プライマーの結合を阻害し、反応
効率を低下させる可能性が考えられる。したがって、増
幅反応の前に標的ＲＮＡの熱変性を行うことで、標的Ｒ
ＮＡの分子内構造を壊し、プライマーの結合効率を向上
させるための操作が必要であった。
温度での核酸増幅が可能であり、自動化へ適している方
法だと考えられる。しかし、これらの増幅法は比較的低
温（例えば４１℃）で反応を行うために、標的ＲＮＡが
分子内構造を形成し、プライマーの結合を阻害し、反応
効率を低下させる可能性が考えられる。したがって、増
幅反応の前に標的ＲＮＡの熱変性を行うことで、標的Ｒ
ＮＡの分子内構造を壊し、プライマーの結合効率を向上
させるための操作が必要であった。
【００１０】そこで本発明は、標的ＲＮＡの分子内構造
フリーな領域に対して特異的に相補結合可能なオリゴヌ
クレオチドを提供することを目的とする。具体的には、
比較的低温かつ一定温度（３５℃〜５０℃、好ましくは
４１℃）で、ＳＲＳＶ（特に千葉ウイルス）のゲノムＲ
ＮＡの分子内構造フリー領域に対して結合するオリゴヌ
クレオチドを提供し、ＳＲＳＶ（特に千葉ウイルス）Ｒ
ＮＡを検出するためのオリゴヌクレオチド、すなわち核
酸増幅法で使用されるオリゴヌクレオチドプライマーを
提供することで、それを利用した簡便、迅速かつ高感度
な検出方法を食品検査、食中毒検査等に提供することを
目的とする。
フリーな領域に対して特異的に相補結合可能なオリゴヌ
クレオチドを提供することを目的とする。具体的には、
比較的低温かつ一定温度（３５℃〜５０℃、好ましくは
４１℃）で、ＳＲＳＶ（特に千葉ウイルス）のゲノムＲ
ＮＡの分子内構造フリー領域に対して結合するオリゴヌ
クレオチドを提供し、ＳＲＳＶ（特に千葉ウイルス）Ｒ
ＮＡを検出するためのオリゴヌクレオチド、すなわち核
酸増幅法で使用されるオリゴヌクレオチドプライマーを
提供することで、それを利用した簡便、迅速かつ高感度
な検出方法を食品検査、食中毒検査等に提供することを
目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】前記目的を達成するため
に成された本願請求項１の発明は、ＳＲＳＶのゲノムＲ
ＮＡを検出するために有用なオリゴヌクレオチドであっ
て、ＳＲＳＶ ＲＮＡに特異的に結合可能である、配列
番号１から７に示したいずれかの配列中の少なくとも連
続した１０塩基以上からなるオリゴヌクレオチドであ
る。
に成された本願請求項１の発明は、ＳＲＳＶのゲノムＲ
ＮＡを検出するために有用なオリゴヌクレオチドであっ
て、ＳＲＳＶ ＲＮＡに特異的に結合可能である、配列
番号１から７に示したいずれかの配列中の少なくとも連
続した１０塩基以上からなるオリゴヌクレオチドであ
る。
【００１２】また本願請求項２の発明は、ＳＲＳＶ Ｒ
ＮＡの増幅工程であり、試料中に存在するＳＲＳＶ Ｒ
ＮＡの特定配列を鋳型として、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリ
メレースによりｃＤＮＡを合成し、リボヌクレエースＨ
によってＲＮＡ・ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡを分解し
て１本鎖ＤＮＡを生成し、該１本鎖ＤＮＡを鋳型として
ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースにより、前記特定配列
または前記特定配列に相補的な配列からなるＲＮＡを転
写可能なプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡを生成
し、そして該２本鎖ＤＮＡがＲＮＡポリメレース存在下
でＲＮＡ転写産物を生成し、該ＲＮＡ転写産物が引き続
き前記ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースによるｃＤＮＡ
合成の鋳型となるようなＲＮＡ増幅工程において、ＳＲ
ＳＶ ＲＮＡに特異的に結合可能である配列番号１から
７に示したいずれかの配列中の少なくとも連続した１０
塩基以上からなる第一のオリゴヌクレオチドと、配列番
号８から１５に示したいずれかの配列中の少なくとも連
続した１０塩基以上からなる、増幅されるＳＲＳＶ Ｒ
ＮＡ配列の一部と相同な配列を有する第二のオリゴヌク
レオチド（ここで第一又は第二のオリゴヌクレオチドの
いずれか一方は、その５’側にＲＮＡポリメレースのプ
ロモーター配列を含む）を用いることを特徴とする。
ＮＡの増幅工程であり、試料中に存在するＳＲＳＶ Ｒ
ＮＡの特定配列を鋳型として、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリ
メレースによりｃＤＮＡを合成し、リボヌクレエースＨ
によってＲＮＡ・ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡを分解し
て１本鎖ＤＮＡを生成し、該１本鎖ＤＮＡを鋳型として
ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースにより、前記特定配列
または前記特定配列に相補的な配列からなるＲＮＡを転
写可能なプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡを生成
し、そして該２本鎖ＤＮＡがＲＮＡポリメレース存在下
でＲＮＡ転写産物を生成し、該ＲＮＡ転写産物が引き続
き前記ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースによるｃＤＮＡ
合成の鋳型となるようなＲＮＡ増幅工程において、ＳＲ
ＳＶ ＲＮＡに特異的に結合可能である配列番号１から
７に示したいずれかの配列中の少なくとも連続した１０
塩基以上からなる第一のオリゴヌクレオチドと、配列番
号８から１５に示したいずれかの配列中の少なくとも連
続した１０塩基以上からなる、増幅されるＳＲＳＶ Ｒ
ＮＡ配列の一部と相同な配列を有する第二のオリゴヌク
レオチド（ここで第一又は第二のオリゴヌクレオチドの
いずれか一方は、その５’側にＲＮＡポリメレースのプ
ロモーター配列を含む）を用いることを特徴とする。
【００１３】本願請求項３の発明は、前記請求項２の発
明に係り、前記ＲＮＡ増幅工程において、増幅により生
じるＲＮＡ転写産物と特異的に結合可能であり、かつ、
インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌク
レオチドプローブ存在下で実施し、反応液の蛍光特性の
変化を測定することからなる（ただし該標識されたオリ
ゴヌクレオチドは、前記第一のオリゴヌクレオチドおよ
び第二のオリゴヌクレオチドとは異なる配列である）。
本願請求項請求項４の発明は、前記請求項３の発明に係
り、前記プローブが、ＲＮＡ転写産物の少なくとも一部
の配列と相補結合するように設計され、複合体を形成し
ていない場合と比較して蛍光特性が変化するものである
ことを特徴とする。そして本願請求項５の発明は、前記
請求項４の発明に係り、前記プローブが、配列番号１６
から１８に示したいずれかの配列中の少なくとも連続し
た１０塩基以上からなるまたはその相補配列であること
を特徴とする。以下、本発明を詳細に説明する。
明に係り、前記ＲＮＡ増幅工程において、増幅により生
じるＲＮＡ転写産物と特異的に結合可能であり、かつ、
インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌク
レオチドプローブ存在下で実施し、反応液の蛍光特性の
変化を測定することからなる（ただし該標識されたオリ
ゴヌクレオチドは、前記第一のオリゴヌクレオチドおよ
び第二のオリゴヌクレオチドとは異なる配列である）。
本願請求項請求項４の発明は、前記請求項３の発明に係
り、前記プローブが、ＲＮＡ転写産物の少なくとも一部
の配列と相補結合するように設計され、複合体を形成し
ていない場合と比較して蛍光特性が変化するものである
ことを特徴とする。そして本願請求項５の発明は、前記
請求項４の発明に係り、前記プローブが、配列番号１６
から１８に示したいずれかの配列中の少なくとも連続し
た１０塩基以上からなるまたはその相補配列であること
を特徴とする。以下、本発明を詳細に説明する。
【００１４】本発明は、ＳＲＳＶのゲノムＲＮＡを検出
するために有用なオリゴヌクレオチドであって、ＳＲＳ
Ｖ ＲＮＡに特異的に結合可能である、配列番号１から
７に示したいずれかの配列中の少なくとも連続した１０
塩基以上からなるオリゴヌクレオチドである。このオリ
ゴヌクレオチドは、比較的低温かつ一定温度（３５℃〜
５０℃、好ましくは４１℃）でＳＲＳＶ ＲＮＡに特異
的に結合可能である。
するために有用なオリゴヌクレオチドであって、ＳＲＳ
Ｖ ＲＮＡに特異的に結合可能である、配列番号１から
７に示したいずれかの配列中の少なくとも連続した１０
塩基以上からなるオリゴヌクレオチドである。このオリ
ゴヌクレオチドは、比較的低温かつ一定温度（３５℃〜
５０℃、好ましくは４１℃）でＳＲＳＶ ＲＮＡに特異
的に結合可能である。
【００１５】本発明は、試料中のＳＲＳＶ ＲＮＡを増
幅するための核酸増幅工程や、核酸増幅工程によって生
成したＲＮＡ転写産物の検出法を提供する。本発明の増
幅工程は、ＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ法、３ＳＲ法等を含む
が、中でも逆転写酵素およびＲＮＡポリメレースの協奏
的作用によって（逆転写酵素およびＲＮＡポリメレース
が協奏的に作用するような条件下で反応させ）ＳＲＳＶ
の特定ＲＮＡ配列を増幅するＮＡＳＢＡ法、３ＳＲ法等
の一定温度核酸増幅法が好ましい。
幅するための核酸増幅工程や、核酸増幅工程によって生
成したＲＮＡ転写産物の検出法を提供する。本発明の増
幅工程は、ＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ法、３ＳＲ法等を含む
が、中でも逆転写酵素およびＲＮＡポリメレースの協奏
的作用によって（逆転写酵素およびＲＮＡポリメレース
が協奏的に作用するような条件下で反応させ）ＳＲＳＶ
の特定ＲＮＡ配列を増幅するＮＡＳＢＡ法、３ＳＲ法等
の一定温度核酸増幅法が好ましい。
【００１６】例えばＮＡＳＢＡ法は、試料中に存在する
ＳＲＳＶ ＲＮＡの特定配列を鋳型として、ＲＮＡ依存
性ＤＮＡポリメレースによりｃＤＮＡを合成し、リボヌ
クレエースＨによってＲＮＡ・ＤＮＡハイブリッドのＲ
ＮＡを分解して１本鎖ＤＮＡを生成し、該１本鎖ＤＮＡ
を鋳型としてＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースにより、
前記特定配列または前記特定配列に相補的な配列からな
るＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を有する２本鎖
ＤＮＡを生成し、そして該２本鎖ＤＮＡがＲＮＡポリメ
レース存在下でＲＮＡ転写産物を生成し、該ＲＮＡ転写
産物が引き続き前記ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースに
よるｃＤＮＡ合成の鋳型となるようなＲＮＡ増幅工程で
あるが、本発明ではＳＲＳＶ ＲＮＡに特異的に結合可
能である配列番号１から７に示したいずれかの配列中の
少なくとも連続した１０塩基以上からなる第一のオリゴ
ヌクレオチドと、配列番号８から１５に示したいずれか
の配列中の少なくとも連続した１０塩基以上からなる、
増幅されるＳＲＳＶ ＲＮＡ配列の一部と相同な配列を
有する第二のオリゴヌクレオチド（ここで第一又は第二
のオリゴヌクレオチドのいずれか一方は、その５’側に
ＲＮＡポリメレースのプロモーター配列を含む）を用い
ることを特徴とする。
ＳＲＳＶ ＲＮＡの特定配列を鋳型として、ＲＮＡ依存
性ＤＮＡポリメレースによりｃＤＮＡを合成し、リボヌ
クレエースＨによってＲＮＡ・ＤＮＡハイブリッドのＲ
ＮＡを分解して１本鎖ＤＮＡを生成し、該１本鎖ＤＮＡ
を鋳型としてＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースにより、
前記特定配列または前記特定配列に相補的な配列からな
るＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を有する２本鎖
ＤＮＡを生成し、そして該２本鎖ＤＮＡがＲＮＡポリメ
レース存在下でＲＮＡ転写産物を生成し、該ＲＮＡ転写
産物が引き続き前記ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースに
よるｃＤＮＡ合成の鋳型となるようなＲＮＡ増幅工程で
あるが、本発明ではＳＲＳＶ ＲＮＡに特異的に結合可
能である配列番号１から７に示したいずれかの配列中の
少なくとも連続した１０塩基以上からなる第一のオリゴ
ヌクレオチドと、配列番号８から１５に示したいずれか
の配列中の少なくとも連続した１０塩基以上からなる、
増幅されるＳＲＳＶ ＲＮＡ配列の一部と相同な配列を
有する第二のオリゴヌクレオチド（ここで第一又は第二
のオリゴヌクレオチドのいずれか一方は、その５’側に
ＲＮＡポリメレースのプロモーター配列を含む）を用い
ることを特徴とする。
【００１７】ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース、ＤＮＡ
依存性ＤＮＡポリメレース、リボヌクレエースＨは特に
限定されないが、これらの活性のすべてを有しているＡ
ＭＶ逆転写酵素が好ましい。また、ＲＮＡポリメレース
についても特に限定されないが、Ｔ７ファージＲＮＡポ
リメレース、ＳＰ６ファージＲＮＡポリメレースが好ま
しい。
依存性ＤＮＡポリメレース、リボヌクレエースＨは特に
限定されないが、これらの活性のすべてを有しているＡ
ＭＶ逆転写酵素が好ましい。また、ＲＮＡポリメレース
についても特に限定されないが、Ｔ７ファージＲＮＡポ
リメレース、ＳＰ６ファージＲＮＡポリメレースが好ま
しい。
【００１８】上記増幅工程では、ＳＲＳＶ ＲＮＡ配列
の中で特定配列とする領域の５’末領域と重複（１から
１０塩基）して隣接する領域に対し相補的なオリゴヌク
レオチドを添加し、前記ＳＲＳＶ ＲＮＡを特定配列の
５’末領域で切断（リボヌクレエースＨによる）して核
酸増幅初期の鋳型とすることにより、特定配列が５’端
に位置していないＳＲＳＶ ＲＮＡをも増幅することが
できる。この切断のためには、例えば配列番号１から７
のオリゴヌクレオチド（ただし、前記増幅工程において
第一のオリゴヌクレオチドとして使用したもの以外のオ
リゴヌクレオチド）を使用することができる。なお、こ
の切断用オリゴヌクレオチドは、３’末端からの伸長反
応をおさえるために３’水酸基が化学的に修飾（たとえ
ばアミノ化）されたものであることが好ましい。
の中で特定配列とする領域の５’末領域と重複（１から
１０塩基）して隣接する領域に対し相補的なオリゴヌク
レオチドを添加し、前記ＳＲＳＶ ＲＮＡを特定配列の
５’末領域で切断（リボヌクレエースＨによる）して核
酸増幅初期の鋳型とすることにより、特定配列が５’端
に位置していないＳＲＳＶ ＲＮＡをも増幅することが
できる。この切断のためには、例えば配列番号１から７
のオリゴヌクレオチド（ただし、前記増幅工程において
第一のオリゴヌクレオチドとして使用したもの以外のオ
リゴヌクレオチド）を使用することができる。なお、こ
の切断用オリゴヌクレオチドは、３’末端からの伸長反
応をおさえるために３’水酸基が化学的に修飾（たとえ
ばアミノ化）されたものであることが好ましい。
【００１９】以上の核酸増幅工程で得られるＲＮＡ転写
産物は既知の検出方法で検出することができるが、前記
増幅工程をインターカレーター性蛍光色素で標識された
オリゴヌクレオチドプローブ存在下で実施し、反応液の
蛍光特性の変化を測定することが好ましい。このオリゴ
ヌクレオチドプローブとしては、オリゴヌクレオチド中
のリンにリンカーを介してインターカレーター性蛍光色
素を結合させたものが例示できる。この好適なプローブ
では、標的核酸（相補的核酸）と２本鎖を形成するとイ
ンターカレーター部分が２本鎖部分にインターカレート
して蛍光特性が変化するため、分離分析を必要としない
(Ｉｓｈｉｇｕｒｏ，Ｔ．ら（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４（２４）４９９２−４９９
７)。
産物は既知の検出方法で検出することができるが、前記
増幅工程をインターカレーター性蛍光色素で標識された
オリゴヌクレオチドプローブ存在下で実施し、反応液の
蛍光特性の変化を測定することが好ましい。このオリゴ
ヌクレオチドプローブとしては、オリゴヌクレオチド中
のリンにリンカーを介してインターカレーター性蛍光色
素を結合させたものが例示できる。この好適なプローブ
では、標的核酸（相補的核酸）と２本鎖を形成するとイ
ンターカレーター部分が２本鎖部分にインターカレート
して蛍光特性が変化するため、分離分析を必要としない
(Ｉｓｈｉｇｕｒｏ，Ｔ．ら（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４（２４）４９９２−４９９
７)。
【００２０】前記プローブの配列は、ＲＮＡ転写産物の
少なくとも一部に対して相補的な配列を有すれば特に限
定されないが、配列番号１６から１８に示した配列の少
なくとも連続した１０塩基からなる配列が好ましい。ま
たプローブをプライマーとした伸長反応を抑えるため
に、プローブの３’末端の水酸基は化学的に修飾（たと
えばグリコール酸付加）することが望ましい。
少なくとも一部に対して相補的な配列を有すれば特に限
定されないが、配列番号１６から１８に示した配列の少
なくとも連続した１０塩基からなる配列が好ましい。ま
たプローブをプライマーとした伸長反応を抑えるため
に、プローブの３’末端の水酸基は化学的に修飾（たと
えばグリコール酸付加）することが望ましい。
【００２１】上記のようなプローブ共存下で増幅工程を
行うことにより、ＳＲＳＶ ＲＮＡの中の特定配列と同
じ配列からなるＲＮＡを、一チューブ内、一定温度、一
段階で増幅し検出することが可能となり、自動化への適
用も容易となる。
行うことにより、ＳＲＳＶ ＲＮＡの中の特定配列と同
じ配列からなるＲＮＡを、一チューブ内、一定温度、一
段階で増幅し検出することが可能となり、自動化への適
用も容易となる。
【００２２】
【発明の実施形態】以下、本発明を実施例により更に詳
細に説明するが、本発明はこれら実施例により限定され
るものではない。
細に説明するが、本発明はこれら実施例により限定され
るものではない。
【００２３】実施例１ ＳＲＳＶ（千葉ウイルス）に対して４１℃で特異的に結
合するオリゴヌクレオチドを選択した。ＳＲＳＶ（千葉
ウイルス）ＲＮＡの塩基配列のうちＲＮＡ依存性ＲＮＡ
ポリメレースの構造遺伝子の第１番目の塩基から３８６
１番目までの塩基を含む標準ＲＮＡを、２６０ｎｍの紫
外部吸収により定量後、ＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ８．０）、０．１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、１ｍＭＤＴＴ、０．５Ｕ／μｌ ＲＮａｓｅ Ｉｎ
ｈｉｂｉｔｏｒ）を用い０．４５ｐｍｏｌ／μｌとなる
よう希釈した。
合するオリゴヌクレオチドを選択した。ＳＲＳＶ（千葉
ウイルス）ＲＮＡの塩基配列のうちＲＮＡ依存性ＲＮＡ
ポリメレースの構造遺伝子の第１番目の塩基から３８６
１番目までの塩基を含む標準ＲＮＡを、２６０ｎｍの紫
外部吸収により定量後、ＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ８．０）、０．１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、１ｍＭＤＴＴ、０．５Ｕ／μｌ ＲＮａｓｅ Ｉｎ
ｈｉｂｉｔｏｒ）を用い０．４５ｐｍｏｌ／μｌとなる
よう希釈した。
【００２４】以下の組成の反応液９．０μｌを０．５ｍ
ｌ容のＰＣＲ用チューブ（商品名；Ｇｅｎｅ Ａｍｐ
Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅ
ｓ、パーキンエルマー製）に分注した。
ｌ容のＰＣＲ用チューブ（商品名；Ｇｅｎｅ Ａｍｐ
Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅ
ｓ、パーキンエルマー製）に分注した。
【００２５】（反応液の組成） ２０．０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐH７．５） ２０．０ ｍＭ 塩化カリウム １０．０ ｍＭ 塩化マグネシウム ０．１ ｍＭ ＤＴＴ ０．１ ｍＭ ＥＤＴＡ ０．９μＭ 標準ＲＮＡ ２．０μＭ オリゴヌクレオチド（以下に示した配列の
オリゴヌクレオチド） （オリゴ−１）；配列番号１ （オリゴ−２）；配列番号２ （オリゴ−３）；配列番号３ （オリゴ−４）；配列番号１９ （オリゴ−５）：配列番号２０ （オリゴ−６）；配列番号２１ （オリゴ−７）；配列番号２２ （オリゴ−８）；配列番号６ （オリゴー９）；配列番号７ （オリゴ−１０）；配列番号２３ （オリゴ−１１）；配列番号４ （オリゴ−１２）；配列番号２４ （オリゴ−１３）；配列番号２５ （オリゴ−１４）；配列番号２６ （オリゴ−１５）；配列番号５ 容量調整用蒸留水 上記の反応液を、４１℃で５分間保温後、０．１Ｕ／μ
ｌのＲＮａｓｅ Ｈ（宝酒造（株）製）を１μｌ添加し
た（ＲＮａｓｅ Ｈは、ＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖のＲＮＡ
を切断する酵素である）。
オリゴヌクレオチド） （オリゴ−１）；配列番号１ （オリゴ−２）；配列番号２ （オリゴ−３）；配列番号３ （オリゴ−４）；配列番号１９ （オリゴ−５）：配列番号２０ （オリゴ−６）；配列番号２１ （オリゴ−７）；配列番号２２ （オリゴ−８）；配列番号６ （オリゴー９）；配列番号７ （オリゴ−１０）；配列番号２３ （オリゴ−１１）；配列番号４ （オリゴ−１２）；配列番号２４ （オリゴ−１３）；配列番号２５ （オリゴ−１４）；配列番号２６ （オリゴ−１５）；配列番号５ 容量調整用蒸留水 上記の反応液を、４１℃で５分間保温後、０．１Ｕ／μ
ｌのＲＮａｓｅ Ｈ（宝酒造（株）製）を１μｌ添加し
た（ＲＮａｓｅ Ｈは、ＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖のＲＮＡ
を切断する酵素である）。
【００２６】引き続きＰＣＲチューブを４１℃に１５分
間保温した。反応後の切断断片を確認するため、尿素変
性ポリアクリルアミドゲル（アクリルアミド濃度は６
％、尿素７Ｍ）電気泳動を実施した。電気泳動後の染色
は市販の染色液（商品名ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＩＩ、
宝酒造（株）製)により行った。標的ＲＮＡの特定部位
にオリゴヌクレオチドが結合すると、ＲＮａｓｅ Ｈに
より、ＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖のＲＮＡが切断され、特定
バンドが観察される。
間保温した。反応後の切断断片を確認するため、尿素変
性ポリアクリルアミドゲル（アクリルアミド濃度は６
％、尿素７Ｍ）電気泳動を実施した。電気泳動後の染色
は市販の染色液（商品名ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＩＩ、
宝酒造（株）製)により行った。標的ＲＮＡの特定部位
にオリゴヌクレオチドが結合すると、ＲＮａｓｅ Ｈに
より、ＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖のＲＮＡが切断され、特定
バンドが観察される。
【００２７】電気泳動の結果(白黒反転図)を図１に示し
た。オリゴヌクレオチドが標準ＲＮＡに特異的に結合し
た場合、標準ＲＮＡはその領域で分解され、特定の鎖長
の分解産物を生ずる。表１には、オリゴヌクレオチドが
標準ＲＮＡに特異的に結合した場合の位置と期待される
バンドの鎖長を示した。オリゴ−１、オリゴ−２、オリ
ゴ−３、オリゴ−８、オリゴ−９、オリゴ−１０、オリ
ゴ−１１、オリゴ−１５の場合に、特定のバンドが確認
された。以上から、これらのオリゴヌクレオチドは、４
１℃一定の状態でＳＲＳＶ ＲＮＡに強く結合している
事が示された。なお、表１中の番号は、ｐｏｌ構造遺伝
子開始塩基を＋２としたときの番号であり、位置は各オ
リゴが結合する（標的側）領域の５’末端の塩基であ
る。また表中の丸は特異バンドが認められること、三角
は特異バンドは見られるが、非特異バンドも見られるこ
と、そしてバツは特異バンドが認められないことをそれ
ぞれ示す。
た。オリゴヌクレオチドが標準ＲＮＡに特異的に結合し
た場合、標準ＲＮＡはその領域で分解され、特定の鎖長
の分解産物を生ずる。表１には、オリゴヌクレオチドが
標準ＲＮＡに特異的に結合した場合の位置と期待される
バンドの鎖長を示した。オリゴ−１、オリゴ−２、オリ
ゴ−３、オリゴ−８、オリゴ−９、オリゴ−１０、オリ
ゴ−１１、オリゴ−１５の場合に、特定のバンドが確認
された。以上から、これらのオリゴヌクレオチドは、４
１℃一定の状態でＳＲＳＶ ＲＮＡに強く結合している
事が示された。なお、表１中の番号は、ｐｏｌ構造遺伝
子開始塩基を＋２としたときの番号であり、位置は各オ
リゴが結合する（標的側）領域の５’末端の塩基であ
る。また表中の丸は特異バンドが認められること、三角
は特異バンドは見られるが、非特異バンドも見られるこ
と、そしてバツは特異バンドが認められないことをそれ
ぞれ示す。
【００２８】
【表１】
【００２９】実施例２ ＳＲＳＶ ＲＮＡに特異的に結合するオリゴヌクレオチ
ドプローブを用いてＲＮＡ増幅反応を行なった。
ドプローブを用いてＲＮＡ増幅反応を行なった。
【００３０】（１）実施例１と同様のＳＲＳＶ（千葉ウ
イルス）標準ＲＮＡをＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．
５Ｕ／μｌ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（宝酒造
（株）製）、５ｍＭ ＤＴＴ）を用い、１０4コピー／
５μｌとなるよう希釈した。コントロール試験区（Ｎｅ
ｇａ）には希釈液のみを用いた。
イルス）標準ＲＮＡをＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．
５Ｕ／μｌ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（宝酒造
（株）製）、５ｍＭ ＤＴＴ）を用い、１０4コピー／
５μｌとなるよう希釈した。コントロール試験区（Ｎｅ
ｇａ）には希釈液のみを用いた。
【００３１】（２）以下の組成の反応液２０．８μｌを
０．５ｍｌ容のＰＣＲ用チューブ（商品名；Ｇｅｎｅ
Ａｍｐ Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ
Ｔｕｂｅｓ、パーキンエルマー製）に分注し、これに上
記ＲＮＡ試料５μｌを添加した。
０．５ｍｌ容のＰＣＲ用チューブ（商品名；Ｇｅｎｅ
Ａｍｐ Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ
Ｔｕｂｅｓ、パーキンエルマー製）に分注し、これに上
記ＲＮＡ試料５μｌを添加した。
【００３２】反応液の組成（各濃度は最終反応液量３０
μｌにおける濃度） ６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ ８．６） １３ｍＭ 塩化マグネシウム ９０ｍＭ 塩化カリウム ３９Ｕ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ １ｍＭ ＤＴＴ 各０．２５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴ
ＴＰ ３．６ｍＭ ＩＴＰ 各３．０ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ ０．１６μＭの第１オリゴヌクレオチド １．０μＭの第２オリゴヌクレオチド １．０μＭの第３オリゴヌクレオチド １３％ ＤＭＳＯ 容量調整用蒸留水 （３）第１、第２、第３オリゴヌクレオチドとして、表
２の説明に示す配列のオリゴヌクレオチドを用いてＲＮ
Ａ増幅反応を行なった。なお、第１、第２、第３オリゴ
ヌクレオチドの組み合わせが表２に示す組み合わせとな
るよう溶液を調製した。
μｌにおける濃度） ６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ ８．６） １３ｍＭ 塩化マグネシウム ９０ｍＭ 塩化カリウム ３９Ｕ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ １ｍＭ ＤＴＴ 各０．２５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴ
ＴＰ ３．６ｍＭ ＩＴＰ 各３．０ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ ０．１６μＭの第１オリゴヌクレオチド １．０μＭの第２オリゴヌクレオチド １．０μＭの第３オリゴヌクレオチド １３％ ＤＭＳＯ 容量調整用蒸留水 （３）第１、第２、第３オリゴヌクレオチドとして、表
２の説明に示す配列のオリゴヌクレオチドを用いてＲＮ
Ａ増幅反応を行なった。なお、第１、第２、第３オリゴ
ヌクレオチドの組み合わせが表２に示す組み合わせとな
るよう溶液を調製した。
【００３３】（４）この反応液を４１℃で５分間保温
後、以下の組成の酵素液４．２μｌを添加した。
後、以下の組成の酵素液４．２μｌを添加した。
【００３４】酵素液の組成（各濃度は最終反応液量３０
μｌにおける濃度） １．７％ ソルビトール ３μｇ 牛血清アルブミン １４２Ｕ Ｔ７ＲＮＡポリメレース（ギブコ社製） ８Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素（宝酒造（株）製） 容量調整用蒸留水 （５）引き続きＰＣＲチューブを４１℃で３０分間保温
した。反応後のＲＮＡ増幅部分を確認するため、アガロ
ースゲル（アガロース濃度４％）電気泳動を実施した。
電気泳動後の染色は市販の染色液（商品名；ＳＹＢＲ
Ｇｒｅｅｎ ＩＩ（宝酒造（株）製）により行なった。
標的ＲＮＡの特定部位にオリゴヌクレオチドが結合する
と第２と第３オリゴヌクレオチドに挟まれた部分のＲＮ
Ａが増幅され、特定バンドが観察される。
μｌにおける濃度） １．７％ ソルビトール ３μｇ 牛血清アルブミン １４２Ｕ Ｔ７ＲＮＡポリメレース（ギブコ社製） ８Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素（宝酒造（株）製） 容量調整用蒸留水 （５）引き続きＰＣＲチューブを４１℃で３０分間保温
した。反応後のＲＮＡ増幅部分を確認するため、アガロ
ースゲル（アガロース濃度４％）電気泳動を実施した。
電気泳動後の染色は市販の染色液（商品名；ＳＹＢＲ
Ｇｒｅｅｎ ＩＩ（宝酒造（株）製）により行なった。
標的ＲＮＡの特定部位にオリゴヌクレオチドが結合する
と第２と第３オリゴヌクレオチドに挟まれた部分のＲＮ
Ａが増幅され、特定バンドが観察される。
【００３５】電気泳動結果の写真（白黒反転）を図２〜
図５に示した。この反応で増幅される特定バンドの鎖長
は表２に示した通りである。これより表２に示したオリ
ゴヌクレオチドの組み合わせを用いたＲＮＡ増幅反応に
おいて、いずれの組み合わせにおいても特定バンドが確
認できたため、これらのオリゴヌクレオチドはＳＲＳＶ
の検出に有効であることが示された。
図５に示した。この反応で増幅される特定バンドの鎖長
は表２に示した通りである。これより表２に示したオリ
ゴヌクレオチドの組み合わせを用いたＲＮＡ増幅反応に
おいて、いずれの組み合わせにおいても特定バンドが確
認できたため、これらのオリゴヌクレオチドはＳＲＳＶ
の検出に有効であることが示された。
【００３６】
【表２】
【００３７】表２は、本実施例で用いた第１、第２、第
３オリゴヌクレオチドの組み合わせ、およびその組み合
わせを用いてＲＮＡ増幅反応させた時に増幅される特定
バンドの鎖長を示す。第１オリゴヌクレオチドの塩基配
列のうち、３’末端の水酸基はアミノ化されている。第
２オリゴヌクレオチドの塩基配列のうち５’端１番目の
「Ａ」から２２番目の「Ａ」までの部分はＴ７プロモー
ター配列であり、それに続く２３番目の「Ｇ」から２８
番目の「Ａ」までの部分はエンハンサー配列である。
３オリゴヌクレオチドの組み合わせ、およびその組み合
わせを用いてＲＮＡ増幅反応させた時に増幅される特定
バンドの鎖長を示す。第１オリゴヌクレオチドの塩基配
列のうち、３’末端の水酸基はアミノ化されている。第
２オリゴヌクレオチドの塩基配列のうち５’端１番目の
「Ａ」から２２番目の「Ａ」までの部分はＴ７プロモー
ター配列であり、それに続く２３番目の「Ｇ」から２８
番目の「Ａ」までの部分はエンハンサー配列である。
【００３８】 第１オリゴヌクレオチド １Ｓ（配列番号２７、塩基番号 ３５４〜３７７）' ２Ｓ（配列番号２８，塩基番号 ４６８〜４９１） １５Ｓ（配列番号２９、塩基番号 ２２９７〜２３２０） ８Ｓ（配列番号３０、塩基番号 ２５５６〜２５７９） 第２オリゴヌクレオチド １Ｆ１（配列番号３１、塩基番号 ３７２〜３９４） １Ｆ２（配列番号３２、塩基番号 ３６９〜３９１） ２Ｆ１（配列番号３３、塩基番号 ４８６〜５０８） ２Ｆ２（配列番号３４、塩基番号 ４８３〜５０５） １５Ｆ１（配列番号３５、塩基番号 ２３１５〜２３３７） １５Ｆ２（配列番号３６、塩基番号 ２３１２〜２３３４）' ８Ｆ１（配列番号３７、塩基番号 ２５７４〜２５９６）' ８Ｆ２（配列番号３８、塩基番号 ２５７１〜２５９３）' 第３オリゴヌクレオチド ３Ｒ（配列番号３、塩基番号 ６４９〜６６８） １１Ｒ（配列番号４、塩基番号 ７１３〜７３２） ８Ｒ（配列番号６、塩基番号 ２５６０〜２５７９） ９Ｒ（配列番号７、塩基番号 ２７９７〜２８１６） 実施例３ 本願発明によるオリゴヌクレオチドの組み合わせを用い
て、標的ＳＲＳＶ ＲＮＡの様々な初期コピー数におけ
る検出を行なった。
て、標的ＳＲＳＶ ＲＮＡの様々な初期コピー数におけ
る検出を行なった。
【００３９】（１）実施例１と同様のＳＲＳＶ（千葉ウ
イルス）標準ＲＮＡをＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ(ｐＨ８．０)、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５Ｕ
／μｌＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（宝酒造（株）
製）、５ｍＭ ＤＴＴ）を用い、１０5コピー／５μｌ
から１０1コピー／５μｌまでとなるよう希釈した。コ
ントロール試験区（陰性）には希釈液のみを用いた。
イルス）標準ＲＮＡをＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ(ｐＨ８．０)、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５Ｕ
／μｌＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（宝酒造（株）
製）、５ｍＭ ＤＴＴ）を用い、１０5コピー／５μｌ
から１０1コピー／５μｌまでとなるよう希釈した。コ
ントロール試験区（陰性）には希釈液のみを用いた。
【００４０】（２）以下の組成の反応液２０．８μｌを
０．５ｍｌ容のＰＣＲ用チューブ（商品名；Ｇｅｎｅ
Ａｍｐ Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ
Ｔｕｂｅｓ、パーキンエルマー製）に分注し、これに上
記ＲＮＡ試料５μｌを添加した。
０．５ｍｌ容のＰＣＲ用チューブ（商品名；Ｇｅｎｅ
Ａｍｐ Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ
Ｔｕｂｅｓ、パーキンエルマー製）に分注し、これに上
記ＲＮＡ試料５μｌを添加した。
【００４１】反応液の組成（各濃度は最終反応液量３０
μｌにおける濃度） ６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ ８．６） １７ｍＭ 塩化マグネシウム ９０ｍＭ 塩化カリウム ３９Ｕ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ １ｍＭ ＤＴＴ 各０．２５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴ
ＴＰ ３．６ｍＭ ＩＴＰ 各３．０ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ ０．１６μＭの第１オリゴヌクレオチド（１Ｓ、配列番
号２７、３’末端の水酸基はアミノ化されている） １．０μＭの第２オリゴヌクレオチド（１Ｆ２、配列番
号３２） １．０μＭの第３オリゴヌクレオチド（１１Ｒ、配列番
号４） ２５ｎＭのインターカレーター性蛍光色素で標識された
オリゴヌクレオチド（ＹＯ−ＳＲＳＶ−Ｓ−Ｇ、配列番
号３９、５’末端から１１番目の「Ａ」と１２番目の
「Ｔ」の間のリンにインターカレーター性蛍光色素が標
識されている、また３’末端の水酸基はグリコール基で
修飾されている） １３％ ＤＭＳＯ 容量調整用蒸留水 （３）上記の反応液を４１℃で５分間保温後、以下の組
成で、かつ、あらかじめ４１℃で２分間保温した酵素液
４．２μｌを添加した。
μｌにおける濃度） ６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ ８．６） １７ｍＭ 塩化マグネシウム ９０ｍＭ 塩化カリウム ３９Ｕ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ １ｍＭ ＤＴＴ 各０．２５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴ
ＴＰ ３．６ｍＭ ＩＴＰ 各３．０ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ ０．１６μＭの第１オリゴヌクレオチド（１Ｓ、配列番
号２７、３’末端の水酸基はアミノ化されている） １．０μＭの第２オリゴヌクレオチド（１Ｆ２、配列番
号３２） １．０μＭの第３オリゴヌクレオチド（１１Ｒ、配列番
号４） ２５ｎＭのインターカレーター性蛍光色素で標識された
オリゴヌクレオチド（ＹＯ−ＳＲＳＶ−Ｓ−Ｇ、配列番
号３９、５’末端から１１番目の「Ａ」と１２番目の
「Ｔ」の間のリンにインターカレーター性蛍光色素が標
識されている、また３’末端の水酸基はグリコール基で
修飾されている） １３％ ＤＭＳＯ 容量調整用蒸留水 （３）上記の反応液を４１℃で５分間保温後、以下の組
成で、かつ、あらかじめ４１℃で２分間保温した酵素液
４．２μｌを添加した。
【００４２】酵素液の組成（各濃度は最終反応液量３０
μｌにおける濃度） １．７％ ソルビトール ３μｇ 牛血清アルブミン １４２Ｕ Ｔ７ＲＮＡポリメレース（ギブコ社製） ８Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素（宝酒造（株）製） 容量調整用蒸留水 （４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温度調
節機能付き蛍光分光光度計を用い、４１℃で保温して、
励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍで、反応溶液
を経時的に測定した。
μｌにおける濃度） １．７％ ソルビトール ３μｇ 牛血清アルブミン １４２Ｕ Ｔ７ＲＮＡポリメレース（ギブコ社製） ８Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素（宝酒造（株）製） 容量調整用蒸留水 （４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温度調
節機能付き蛍光分光光度計を用い、４１℃で保温して、
励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍで、反応溶液
を経時的に測定した。
【００４３】酵素添加時の時刻を０分として、試料の蛍
光増加比（所定時刻の蛍光強度値÷バックグラウンドの
蛍光強度値）の経時変化を図６（Ａ）に示した。また、
初期ＲＮＡ量の対数値と立ち上がり時間（蛍光増加比が
陰性の平均値に標準偏差の３倍を加えた値：１．２にな
るまでの時間）との関係の結果を図６（Ｂ）に示した。
なお、初期ＲＮＡ量は１０1コピー／３０μｌから１０5
コピー／３０μｌである。
光増加比（所定時刻の蛍光強度値÷バックグラウンドの
蛍光強度値）の経時変化を図６（Ａ）に示した。また、
初期ＲＮＡ量の対数値と立ち上がり時間（蛍光増加比が
陰性の平均値に標準偏差の３倍を加えた値：１．２にな
るまでの時間）との関係の結果を図６（Ｂ）に示した。
なお、初期ＲＮＡ量は１０1コピー／３０μｌから１０5
コピー／３０μｌである。
【００４４】図６より、１０1コピーが約２５分で検出
された。標識ＲＮＡの初期濃度に依存した蛍光プロファ
イルと検量線が得られ、未知試料中に存在するＳＲＳＶ
ＲＮＡの定量が可能であることが示された。以上よ
り、本法により、ＳＲＳＶ ＲＮＡの迅速・高感度な検
出が可能であることが示された。
された。標識ＲＮＡの初期濃度に依存した蛍光プロファ
イルと検量線が得られ、未知試料中に存在するＳＲＳＶ
ＲＮＡの定量が可能であることが示された。以上よ
り、本法により、ＳＲＳＶ ＲＮＡの迅速・高感度な検
出が可能であることが示された。
【００４５】
【発明の効果】以上の説明のように、本発明は、小型球
形ウイルス（ＳＲＳＶ）ＲＮＡの分子内構造フリー領域
に相補的に結合するオリゴヌクレオチドおよびそれを用
いた検出法を提供する。また本発明は、小型球形ウイル
ス（ＳＲＳＶ）ＲＮＡを検出するためのオリゴヌクレオ
チド、すなわち核酸増幅法で使用されるオリゴヌクレオ
チドプライマーやオリゴヌクレオチドプローブを提供す
る。
形ウイルス（ＳＲＳＶ）ＲＮＡの分子内構造フリー領域
に相補的に結合するオリゴヌクレオチドおよびそれを用
いた検出法を提供する。また本発明は、小型球形ウイル
ス（ＳＲＳＶ）ＲＮＡを検出するためのオリゴヌクレオ
チド、すなわち核酸増幅法で使用されるオリゴヌクレオ
チドプライマーやオリゴヌクレオチドプローブを提供す
る。
【００４６】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Tosoh Corporation <120> 小型球形ウイルス（ＳＲＳＶ）ＲＮＡ検出のためのオリゴヌクレオチドお よび検出法 <130> PA211-0189 <160> 38 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SRSV RNAに特異的に結合可能なオリゴヌクレオチド <400> 1 tccttttatg gtatgggtgt 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SRSV RNAに特異的に結合可能なオリゴヌクレオチド <400> 2 gggccgcggt gtaaagtggc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SRSV RNAに特異的に結合可能なオリゴヌクレオチド <400> 3 cttctatgga gttcatacca 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SRSV RNAに特異的に結合可能なオリゴヌクレオチド <400> 4 gctgagtaat ctgcatcaaa 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SRSV RNAに特異的に結合可能なオリゴヌクレオチド <400> 5 ctaccattct ggaattgaac 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SRSV RNAに特異的に結合可能なオリゴヌクレオチド <400> 6 attgggtttg acagaattgg 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SRSV RNAに特異的に結合可能なオリゴヌクレオチド <400> 7 tatagatgcc ataaaataca 20 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SRSV RNAに特異的に結合可能なオリゴヌクレオチド <400> 8 aaaggaaaaa tgatgattgg aat 23 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SRSV RNAに特異的に結合可能なオリゴヌクレオチド <400> 9 ataaaaggaa aaatgatgat tgg 23 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SRSV RNAに特異的に結合可能なオリゴヌクレオチド <400> 10 cggccctaaa ggatgaatta gtc 23 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SRSV RNAに特異的に結合可能なオリゴヌクレオチド <400> 11 ccgcggccct aaaggatgaa tta 23 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SRSV RNAに特異的に結合可能なオリゴヌクレオチド <400> 12 tggtaggtgt acaattgacg gtc 23 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SRSV RNAに特異的に結合可能なオリゴヌクレオチド <400> 13 gaatggtagg tgtacaattg acg 23 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SRSV RNAに特異的に結合可能なオリゴヌクレオチド <400> 14 cccaatagtc aacagtttgt ccc 23 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SRSV RNAに特異的に結合可能なオリゴヌクレオチド <400> 15 aaacccaata gtcaacagtt tgt 23 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SRSV RNAに特異的に結合可能なオリゴヌクレオチド <400> 16 tcttcttaat cttttgataa 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SRSV RNAに特異的に結合可能なオリゴヌクレオチド <400> 17 taactgttga gagatcagca 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SRSV RNAに特異的に結合可能なオリゴヌクレオチド <400> 18 taaatcattg gaccatcttc 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> オリゴ−４ <400> 19 tgaggcgggc ggggtcaaaa 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> オリゴ−５ <400> 20 tcaccggggg tattatttgg 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> オリゴ−６ <400> 21 cttcaagggg cacttctaca 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> オリゴ−７ <400> 22 cgactgtggg agggactagg 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> オリゴ−１０ <400> 23 aggatataat ttgaactcac 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> オリゴ−１２ <400> 24 cagcggaaca tagcctgcca 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> オリゴ−１３ <400> 25 agattgcgat ctcctgtcca 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> オリゴ−１４ <400> 26 agggtcctaa catcagcaat 20 <210> 27 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> １Ｓ <400> 27 tccttttatg gtatgggtgt cccg 24 <210> 28 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ２Ｓ <400> 28 gggccgcggt gtaaagtggc ttca 24 <210> 29 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> １５Ｓ <400> 29 ctaccattct ggaattgaac attt 24 <210> 30 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ８Ｓ <400> 30 attgggtttg acagaattgg tcac 24 <210> 31 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> １Ｆ１ <400> 31 aattctaata cgactcacta tagggagaaa aggaaaaatg atgattggaa t 51 <210> 32 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> １Ｆ２ <400> 32 aattctaata cgactcacta tagggagaat aaaaggaaaa atgatgattg g 51 <210> 33 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ２Ｆ１ <400> 33 aattctaata cgactcacta tagggagacg gccctaaagg atgaattagt c 51 <210> 34 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ２Ｆ２ <400> 34 aattctaata cgactcacta tagggagacc gcggccctaa aggatgaatt a 51 <210> 35 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> １５Ｆ１ <400> 35 aattctaata cgactcacta tagggagatg gtaggtgtac aattgacggt c 51 <210> 36 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> １５Ｆ２ <400> 36 aattctaata cgactcacta tagggagaga atggtaggtg tacaattgac g 51 <210> 37 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ８Ｆ１ <400> 37 aattctaata cgactcacta tagggagacc caatagtcaa cagtttgtcc c 51 <210> 38 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ８Ｆ２ <400> 38 aattctaata cgactcacta tagggagaaa acccaatagt caacagtttg t 51 <210> 39 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ＹＯ−ＳＲＳＶ−Ｓ−Ｇ <400> 39 tgcataaatc attggaccat cttc ２４
【図１】図１は、オリゴ−１からオリゴ−１５を用い
て、４１℃でＳＲＳＶ ＲＮＡ標準への結合実験を行っ
た後のサンプルの尿素変性６％ＰＡＧＥの電気泳動写真
である（白黒反転）。
て、４１℃でＳＲＳＶ ＲＮＡ標準への結合実験を行っ
た後のサンプルの尿素変性６％ＰＡＧＥの電気泳動写真
である（白黒反転）。
【図２】図２は、実施例２で行なった初期ＲＮＡ量１０
４コピー／３０μｌにおいて、表２の組み合わせ（ａ）
〜（ｄ）のオリゴヌクレオチドを用いてＲＮＡ増幅反応
させた時の電気泳動写真である。レーン１・２が組み合
わせ（ａ）、レーン４・５が組み合わせ（ｂ）、レーン
７・８が組み合わせ（ｃ）、レーン１０・１１が組み合
わせ（ｄ）のそれぞれの結果であり、レーン３・６・９
・１２がＮｅｇａ（ＲＮＡ試料の代わりに希釈液のみを
用いたもの）である。また分子量マーカーはφＸ１７４
／ＨａｅＩＩＩ ｄｉｇｅｓｔ（Ｍａｒｋｅｒ ４）を
使用した（レーンＭ）。いずれの組み合わせを用いても
特定バンドが確認できた。
４コピー／３０μｌにおいて、表２の組み合わせ（ａ）
〜（ｄ）のオリゴヌクレオチドを用いてＲＮＡ増幅反応
させた時の電気泳動写真である。レーン１・２が組み合
わせ（ａ）、レーン４・５が組み合わせ（ｂ）、レーン
７・８が組み合わせ（ｃ）、レーン１０・１１が組み合
わせ（ｄ）のそれぞれの結果であり、レーン３・６・９
・１２がＮｅｇａ（ＲＮＡ試料の代わりに希釈液のみを
用いたもの）である。また分子量マーカーはφＸ１７４
／ＨａｅＩＩＩ ｄｉｇｅｓｔ（Ｍａｒｋｅｒ ４）を
使用した（レーンＭ）。いずれの組み合わせを用いても
特定バンドが確認できた。
【図３】図３は、実施例２で行なった初期ＲＮＡ量１０
4コピー／３０μｌにおいて、表２の組み合わせ（ｅ）
〜（ｈ）のオリゴヌクレオチドを用いてＲＮＡ増幅反応
させた時の電気泳動写真である。レーン１・２が組み合
わせ（ｅ）、レーン４・５が組み合わせ（ｆ）、レーン
７・８が組み合わせ（ｇ）、レーン１０・１１が組み合
わせ（ｈ）のそれぞれの結果であり、レーン３・６・９
・１２がＮｅｇａ（ＲＮＡ試料の代わりに希釈液のみを
用いたもの）である。また分子量マーカーはφＸ１７４
／ＨａｅＩＩＩ ｄｉｇｅｓｔ（Ｍａｒｋｅｒ ４）を
使用した（レーンＭ）。いずれの組み合わせを用いても
特定バンドが確認できた。
4コピー／３０μｌにおいて、表２の組み合わせ（ｅ）
〜（ｈ）のオリゴヌクレオチドを用いてＲＮＡ増幅反応
させた時の電気泳動写真である。レーン１・２が組み合
わせ（ｅ）、レーン４・５が組み合わせ（ｆ）、レーン
７・８が組み合わせ（ｇ）、レーン１０・１１が組み合
わせ（ｈ）のそれぞれの結果であり、レーン３・６・９
・１２がＮｅｇａ（ＲＮＡ試料の代わりに希釈液のみを
用いたもの）である。また分子量マーカーはφＸ１７４
／ＨａｅＩＩＩ ｄｉｇｅｓｔ（Ｍａｒｋｅｒ ４）を
使用した（レーンＭ）。いずれの組み合わせを用いても
特定バンドが確認できた。
【図４】図４は、実施例２で行なった初期ＲＮＡ量１０
4コピー／３０μｌにおいて、表２の組み合わせ（ｉ）
〜（ｌ）のオリゴヌクレオチドを用いてＲＮＡ増幅反応
させた時の電気泳動写真である。レーン１・２が組み合
わせ（ｉ）、レーン４・５が組み合わせ（ｊ）、レーン
７・８が組み合わせ（ｋ）、レーン１０・１１が組み合
わせ（ｌ）のそれぞれの結果であり、レーン３・６・９
・１２がＮｅｇａ（ＲＮＡ試料の代わりに希釈液のみを
用いたもの）である。また分子量マーカーはφＸ１７４
／ＨａｅＩＩＩ ｄｉｇｅｓｔ（Ｍａｒｋｅｒ ４）を
使用した（レーンＭ）。いずれの組み合わせを用いても
特定バンドが確認できた。
4コピー／３０μｌにおいて、表２の組み合わせ（ｉ）
〜（ｌ）のオリゴヌクレオチドを用いてＲＮＡ増幅反応
させた時の電気泳動写真である。レーン１・２が組み合
わせ（ｉ）、レーン４・５が組み合わせ（ｊ）、レーン
７・８が組み合わせ（ｋ）、レーン１０・１１が組み合
わせ（ｌ）のそれぞれの結果であり、レーン３・６・９
・１２がＮｅｇａ（ＲＮＡ試料の代わりに希釈液のみを
用いたもの）である。また分子量マーカーはφＸ１７４
／ＨａｅＩＩＩ ｄｉｇｅｓｔ（Ｍａｒｋｅｒ ４）を
使用した（レーンＭ）。いずれの組み合わせを用いても
特定バンドが確認できた。
【図５】図５は、実施例２で行なった初期ＲＮＡ量１０
4コピー／３０μｌにおいて、表２の組み合わせ
（ｍ）、（ｎ）のオリゴヌクレオチドを用いてＲＮＡ増
幅反応させた時の電気泳動写真である。レーン１・２が
組み合わせ（ｍ）、レーン４・５が組み合わせ（ｎ）の
それぞれの結果であり、レーン３・６がＮｅｇａ（ＲＮ
Ａ試料の代わりに希釈液のみを用いたもの）である。ま
た分子量マーカーはφＸ１７４／ＨａｅＩＩＩ ｄｉｇ
ｅｓｔ（Ｍａｒｋｅｒ ４）を使用した（レーンＭ）。
いずれの組み合わせを用いても特定バンドが確認でき
た。
4コピー／３０μｌにおいて、表２の組み合わせ
（ｍ）、（ｎ）のオリゴヌクレオチドを用いてＲＮＡ増
幅反応させた時の電気泳動写真である。レーン１・２が
組み合わせ（ｍ）、レーン４・５が組み合わせ（ｎ）の
それぞれの結果であり、レーン３・６がＮｅｇａ（ＲＮ
Ａ試料の代わりに希釈液のみを用いたもの）である。ま
た分子量マーカーはφＸ１７４／ＨａｅＩＩＩ ｄｉｇ
ｅｓｔ（Ｍａｒｋｅｒ ４）を使用した（レーンＭ）。
いずれの組み合わせを用いても特定バンドが確認でき
た。
【図６】図６は実施例３で行なった初期ＲＮＡ量１０1
コピー／３０μｌから１０5コピー／３０μｌにおい
て、反応時間とＲＮＡの生成とともに増大する蛍光増加
比のグラフ（Ａ）および初期ＲＮＡ量の対数値と立ち上
がり時間との間で得られた検量線（Ｂ）である。初期コ
ピー数１０1コピー／３０μｌのＲＮＡが反応約２５分
で検出でき、初期ＲＮＡ量と立ち上り時間との間に相関
関係のあることが示された。
コピー／３０μｌから１０5コピー／３０μｌにおい
て、反応時間とＲＮＡの生成とともに増大する蛍光増加
比のグラフ（Ａ）および初期ＲＮＡ量の対数値と立ち上
がり時間との間で得られた検量線（Ｂ）である。初期コ
ピー数１０1コピー／３０μｌのＲＮＡが反応約２５分
で検出でき、初期ＲＮＡ量と立ち上り時間との間に相関
関係のあることが示された。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ (Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:93） Ｃ１２Ｒ 1:93） (Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:93） Ｃ１２Ｒ 1:93）
Claims (5)
- 【請求項１】小型球形ウイルス（ＳＲＳＶ）のゲノムＲ
ＮＡを検出するために有用なオリゴヌクレオチドであっ
て、ＳＲＳＶ ＲＮＡに特異的に結合可能である、配列
番号１から７に示したいずれかの配列中の少なくとも連
続した１０塩基以上からなるオリゴヌクレオチド。 - 【請求項２】試料中に存在するＳＲＳＶ ＲＮＡの特定
配列を鋳型として、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースに
よりｃＤＮＡを合成し、リボヌクレエースＨによってＲ
ＮＡ・ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡを分解して１本鎖Ｄ
ＮＡを生成し、該１本鎖ＤＮＡを鋳型としてＤＮＡ依存
性ＤＮＡポリメレースにより、前記特定配列または前記
特定配列に相補的な配列からなるＲＮＡを転写可能なプ
ロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡを生成し、そして
該２本鎖ＤＮＡがＲＮＡポリメレース存在下でＲＮＡ転
写産物を生成し、該ＲＮＡ転写産物が引き続き前記ＲＮ
Ａ依存性ＤＮＡポリメレースによるｃＤＮＡ合成の鋳型
となるようなＲＮＡ増幅工程において、ＳＲＳＶ ＲＮ
Ａに特異的に結合可能である配列番号１から７に示した
いずれかの配列中の少なくとも連続した１０塩基以上か
らなる第一のオリゴヌクレオチドと、配列番号８から１
５に示したいずれかの配列中の少なくとも連続した１０
塩基以上からなる、増幅されるＳＲＳＶ ＲＮＡ配列の
一部と相同な配列を有する第二のオリゴヌクレオチド
（ここで第一又は第二のオリゴヌクレオチドのいずれか
一方は、その５’側にＲＮＡポリメレースのプロモータ
ー配列を含む）を用いることを特徴とする、ＳＲＳＶ
ＲＮＡの増幅工程。 - 【請求項３】前記ＲＮＡ増幅工程において、増幅により
生じるＲＮＡ転写産物と特異的に結合可能であり、か
つ、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴ
ヌクレオチドプローブ存在下で実施し、反応液の蛍光特
性の変化を測定することからなる請求項第２項に記載の
工程（ただし該標識されたオリゴヌクレオチドは、前記
第一のオリゴヌクレオチドおよび第二のオリゴヌクレオ
チドとは異なる配列である）。 - 【請求項４】前記プローブは、ＲＮＡ転写産物の少なく
とも一部の配列と相補結合するように設計され、複合体
を形成していない場合と比較して蛍光特性が変化するも
のであることを特徴とする請求項第３項に記載の検出方
法。 - 【請求項５】前記プローブは、配列番号１６から１８に
示したいずれかの配列中の少なくとも連続した１０塩基
以上からなるまたはその相補配列であることを特徴とす
る請求項第４項に記載の検出方法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000182326A JP2002051778A (ja) | 2000-05-31 | 2000-06-13 | 小型球形ウイルス（ｓｒｓｖ）ｒｎａ検出のためのオリゴヌクレオチドおよび検出法 |
| EP01113194A EP1170383A3 (en) | 2000-05-31 | 2001-05-30 | Oligonucleotides and method for detection of small round structured virus (SRSV) RNA |
| US09/866,778 US20020031760A1 (en) | 2000-05-31 | 2001-05-30 | Oligonucleotides and method for detection of small round structured virus (SRSV) RNA |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000-166502 | 2000-05-31 | ||
| JP2000166502 | 2000-05-31 | ||
| JP2000182326A JP2002051778A (ja) | 2000-05-31 | 2000-06-13 | 小型球形ウイルス（ｓｒｓｖ）ｒｎａ検出のためのオリゴヌクレオチドおよび検出法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002051778A true JP2002051778A (ja) | 2002-02-19 |
Family
ID=26593252
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000182326A Pending JP2002051778A (ja) | 2000-05-31 | 2000-06-13 | 小型球形ウイルス（ｓｒｓｖ）ｒｎａ検出のためのオリゴヌクレオチドおよび検出法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20020031760A1 (ja) |
| EP (1) | EP1170383A3 (ja) |
| JP (1) | JP2002051778A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005245434A (ja) * | 2004-02-04 | 2005-09-15 | Tosoh Corp | ノロウイルスの検出試薬 |
| JP2009000063A (ja) * | 2007-06-22 | 2009-01-08 | Tosoh Corp | 改良されたノロウイルスｒｎａ検出方法 |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6630300B2 (en) * | 2000-11-21 | 2003-10-07 | Tosoh Corporation | Oligonucleotides and method for characterizing and detecting Genogroup II type small round structured virus |
| JP2003274957A (ja) * | 2002-03-20 | 2003-09-30 | Tosoh Corp | 小型球形ウイルスを特徴づける塩基配列 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100316498B1 (ko) * | 1992-08-04 | 2002-06-20 | 다니엘 엘. 캐시앙, 헨리 엘. 노르호프, 피터 알. 쉬어리 | 핵산서열증폭방법 |
| JP3968810B2 (ja) * | 1997-01-24 | 2007-08-29 | 東ソー株式会社 | 核酸配列分析方法 |
| JP4438110B2 (ja) * | 1998-07-01 | 2010-03-24 | 東ソー株式会社 | 標的核酸の定量方法 |
-
2000
- 2000-06-13 JP JP2000182326A patent/JP2002051778A/ja active Pending
-
2001
- 2001-05-30 US US09/866,778 patent/US20020031760A1/en not_active Abandoned
- 2001-05-30 EP EP01113194A patent/EP1170383A3/en not_active Withdrawn
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005245434A (ja) * | 2004-02-04 | 2005-09-15 | Tosoh Corp | ノロウイルスの検出試薬 |
| JP2009000063A (ja) * | 2007-06-22 | 2009-01-08 | Tosoh Corp | 改良されたノロウイルスｒｎａ検出方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1170383A2 (en) | 2002-01-09 |
| US20020031760A1 (en) | 2002-03-14 |
| EP1170383A3 (en) | 2003-05-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPWO2018042598A1 (ja) | ジカウイルス検出用プライマーセット | |
| JP4603979B2 (ja) | Ｓａｒｓコロナウイルスの検出法 | |
| EP1134292B1 (en) | Oligonucleotides for detection of 'Vibrio parahaemolyticus' and detection method for 'Vibrio parahaemolyticus' using the same oligonucleotides | |
| JP2002051778A (ja) | 小型球形ウイルス（ｓｒｓｖ）ｒｎａ検出のためのオリゴヌクレオチドおよび検出法 | |
| US20060228698A1 (en) | Oligonucleotide for detection of HIV-1 and detection method | |
| WO2000075371A1 (fr) | Procede d'amplification d'acide nucleique potentialise | |
| JP2005080531A (ja) | 腸炎ビブリオ菌の耐熱性溶血毒類似溶血毒素遺伝子の検出試薬 | |
| EP1411117B1 (en) | NASBA based method for detecting mycobacterium tuberculosis | |
| US6630300B2 (en) | Oligonucleotides and method for characterizing and detecting Genogroup II type small round structured virus | |
| JP2011078389A (ja) | サポウイルスｒｎａの検出方法および検出試薬 | |
| JP4406968B2 (ja) | 簡便で増強された核酸増幅法 | |
| JP2002218999A (ja) | ジェノグループｉｉ型小型球形ウイルスｒｎａの検出法 | |
| JP2005218317A (ja) | 腸管出血性大腸菌の志賀毒素群遺伝子の検出試薬 | |
| JP4701532B2 (ja) | Ｈｉｖ−１ｒｎａの増幅および検出法 | |
| JP2003284565A (ja) | 非定型抗酸菌Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ検出のためのオリゴヌクレオチドおよび検出法 | |
| EP1352974A1 (en) | Oligonucleotide for detection of atypical mycobacteria mycobacterium avium and detection method | |
| JP2005245434A (ja) | ノロウイルスの検出試薬 | |
| JP2005080530A (ja) | 腸炎ビブリオ菌の耐熱性溶血毒素遺伝子の検出試薬 | |
| JP2001258569A (ja) | 腸炎ビブリオ菌検出のためのオリゴヌクレオチド | |
| EP1201770A2 (en) | Oligonucleotide for highly sensitive detection of hepatitis c virus and method for detection thereof | |
| JP2001340086A (ja) | 腸炎ビブリオ菌の耐熱性溶血毒遺伝子の検出法 | |
| KR20220101575A (ko) | 루프구조매개 등온증폭 산물의 전사를 위한 변형 프라이머 구조 및 이의 용도 | |
| JP2002253257A (ja) | ベロ毒素検出のためのオリゴヌクレオチドおよび検出法 | |
| JP2002153289A (ja) | ジェノグループｉｉ型小型球形ウイルスを特徴づける塩基配列および検出のためのオリゴヌクレオチド | |
| JP2002281972A (ja) | サルモネラ検出のためのオリゴヌクレオチド及び検出法 |