JP2002253257A - ベロ毒素検出のためのオリゴヌクレオチドおよび検出法 - Google Patents
ベロ毒素検出のためのオリゴヌクレオチドおよび検出法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】分子内構造フリー領域に対して設計されたオリ
ゴヌクレオチドとそれらを用いた一定温度核酸増幅法を
提供する。 【解決手段】ベロ毒素１型遺伝子ＶＴ１ ＲＮＡ及びベ
ロ毒素２型遺伝子ＶＴ２ＲＮＡを検出するためのオリゴ
ヌクレオチドで、比較的低温で、ＶＴ１ ＲＮＡ及びＶ
Ｔ２ ＲＮＡに特異的に結合するオリゴヌクレオチド
と、それらを用いた一定温度核酸増幅法からなるベロ毒
素１型遺伝子ＶＴ１ ＲＮＡ又はベロ毒素２型遺伝子Ｖ
Ｔ２ ＲＮＡの検出方法を提供する。
ゴヌクレオチドとそれらを用いた一定温度核酸増幅法を
提供する。 【解決手段】ベロ毒素１型遺伝子ＶＴ１ ＲＮＡ及びベ
ロ毒素２型遺伝子ＶＴ２ＲＮＡを検出するためのオリゴ
ヌクレオチドで、比較的低温で、ＶＴ１ ＲＮＡ及びＶ
Ｔ２ ＲＮＡに特異的に結合するオリゴヌクレオチド
と、それらを用いた一定温度核酸増幅法からなるベロ毒
素１型遺伝子ＶＴ１ ＲＮＡ又はベロ毒素２型遺伝子Ｖ
Ｔ２ ＲＮＡの検出方法を提供する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本願発明は、臨床検査、公衆
衛生、食品検査、食中毒検査におけるベロ毒素（Ｖｅｒ
ｏｔｏｘｉｎ、以下ＶＴと略称する）の検出用のオリゴ
ヌクレオチドや該オリゴヌクレオチドを使用した検出方
法に関するものである。本願発明で提供されるオリゴヌ
クレオチドは、ＲＮＡやＤＮＡの切断、増幅そして検出
といった操作を行なう遺伝子診断用の試薬として、ＶＴ
の定量や診断用の試薬等に有用である。
衛生、食品検査、食中毒検査におけるベロ毒素（Ｖｅｒ
ｏｔｏｘｉｎ、以下ＶＴと略称する）の検出用のオリゴ
ヌクレオチドや該オリゴヌクレオチドを使用した検出方
法に関するものである。本願発明で提供されるオリゴヌ
クレオチドは、ＲＮＡやＤＮＡの切断、増幅そして検出
といった操作を行なう遺伝子診断用の試薬として、ＶＴ
の定量や診断用の試薬等に有用である。
【０００２】
【従来の技術】ベロ毒素は、病原性大腸菌Ｏ１５７を代
表とするベロ毒素産生性大腸菌（Ｖｅｒｏｔｏｘｉｎ−
ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ、以下ＶＴＥＣと略称する）が産生する強力な毒素で
ある。ＶＴＥＣによる感染症の主な症状は出血性大腸炎
に代表される食中毒であるが、場合により溶血性尿毒症
症候群（Ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ Ｕｒｅｍｉｃ Ｓｙｎｄ
ｒｏｍｅ、ＨＵＳ）へと重症化し、最悪の場合では死に
至るケースも報告されている。
表とするベロ毒素産生性大腸菌（Ｖｅｒｏｔｏｘｉｎ−
ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ、以下ＶＴＥＣと略称する）が産生する強力な毒素で
ある。ＶＴＥＣによる感染症の主な症状は出血性大腸炎
に代表される食中毒であるが、場合により溶血性尿毒症
症候群（Ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ Ｕｒｅｍｉｃ Ｓｙｎｄ
ｒｏｍｅ、ＨＵＳ）へと重症化し、最悪の場合では死に
至るケースも報告されている。
【０００３】ＶＴＥＣの血清型は６０種類以上と非常に
多彩であるが、検出頻度からみると主体を占めるのはＯ
１５７：Ｈ７である。またＶＴには、志賀赤痢菌（Ｓｈ
ｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）の産生する志
賀毒素（Ｓｈｉｇａ ｔｏｘｉｎ）と同一構造のＶＴ１
型と、物理化学的性状及び免疫学的性状を異にするＶＴ
２型が存在する。
多彩であるが、検出頻度からみると主体を占めるのはＯ
１５７：Ｈ７である。またＶＴには、志賀赤痢菌（Ｓｈ
ｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）の産生する志
賀毒素（Ｓｈｉｇａ ｔｏｘｉｎ）と同一構造のＶＴ１
型と、物理化学的性状及び免疫学的性状を異にするＶＴ
２型が存在する。
【０００４】近年我が国でも大規模なＶＴＥＣ集団感染
が多発しており、感染源の早期発見と除去を目的として
迅速な検出法が望まれている。さらに臨床的見地からは
症状の初期、即ち発症から数日以内の抗生物質を含む抗
菌剤の投与が有効であることが明らかにされており、菌
の迅速な同定が重要な課題となっている。
が多発しており、感染源の早期発見と除去を目的として
迅速な検出法が望まれている。さらに臨床的見地からは
症状の初期、即ち発症から数日以内の抗生物質を含む抗
菌剤の投与が有効であることが明らかにされており、菌
の迅速な同定が重要な課題となっている。
【０００５】これまでに用いられてきたＶＴの診断手段
として、Ｏ１５７抗原検査がある。しかし一部のサルモ
ネラ菌やシトロバクター菌はＯ１５７抗原との交差抗原
性を有することが知られており、判定の結果疑似陽性を
示すケースが報告されている。またＯ１５７以外の血清
型による集団感染の事例も報告されており、この場合様
々な血清型に対する抗血清を用いた試験を行なう必要が
ある。
として、Ｏ１５７抗原検査がある。しかし一部のサルモ
ネラ菌やシトロバクター菌はＯ１５７抗原との交差抗原
性を有することが知られており、判定の結果疑似陽性を
示すケースが報告されている。またＯ１５７以外の血清
型による集団感染の事例も報告されており、この場合様
々な血清型に対する抗血清を用いた試験を行なう必要が
ある。
【０００６】また近年では、ＶＴＥＣの遺伝子と選択的
にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを作製し、こ
れをプライマーとして用いる遺伝子増幅法（ＰＣＲ法）
を行なうことにより、ベロ毒素産生菌を選択的に検出す
る方法が提案されているが、増幅後のＤＮＡ断片の確認
をアガロース電気泳動により行なっているため、迅速検
出という点で課題がある。
にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを作製し、こ
れをプライマーとして用いる遺伝子増幅法（ＰＣＲ法）
を行なうことにより、ベロ毒素産生菌を選択的に検出す
る方法が提案されているが、増幅後のＤＮＡ断片の確認
をアガロース電気泳動により行なっているため、迅速検
出という点で課題がある。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】ＶＴの場合は、他の食
中毒と比べ少ない汚染菌量で重大な被害をもたらす事か
ら、食品検査等にさらに迅速かつ高感度な検出法の出現
が望まれているが、前述したとおり、従来法では迅速性
及び簡便性という点で課題がある。また、検査をより簡
便にするために、検出を自動化する検査装置の開発も要
求されている。
中毒と比べ少ない汚染菌量で重大な被害をもたらす事か
ら、食品検査等にさらに迅速かつ高感度な検出法の出現
が望まれているが、前述したとおり、従来法では迅速性
及び簡便性という点で課題がある。また、検査をより簡
便にするために、検出を自動化する検査装置の開発も要
求されている。
【０００８】ＲＮＡの特定配列の増幅法としては、逆転
写−ポリメレースチェインリアクション（ＲＴ−ＰＣ
Ｒ）法が知られている。この方法は、逆転写工程で標的
ＲＮＡのｃＤＮＡを合成し、引き続いてｃＤＮＡの特定
配列の両末端部に相補的及び相同な一組のプライマー
（アンチセンスプライマーは逆転写工程と共用でよい）
と熱耐性ＤＮＡポリメレース存在下で、熱変性、プライ
マー・アニール、伸長反応からなるサイクルを繰り返し
行うことによって特定ＤＮＡ配列を増幅する方法であ
る。しかし、ＲＴ−ＰＣＲ法は、２段階の操作（逆転写
工程及びＰＣＲ工程）、及び、急激な昇温・降温を繰り
返す操作が必要であり、そのことが自動化への障害とな
る。
写−ポリメレースチェインリアクション（ＲＴ−ＰＣ
Ｒ）法が知られている。この方法は、逆転写工程で標的
ＲＮＡのｃＤＮＡを合成し、引き続いてｃＤＮＡの特定
配列の両末端部に相補的及び相同な一組のプライマー
（アンチセンスプライマーは逆転写工程と共用でよい）
と熱耐性ＤＮＡポリメレース存在下で、熱変性、プライ
マー・アニール、伸長反応からなるサイクルを繰り返し
行うことによって特定ＤＮＡ配列を増幅する方法であ
る。しかし、ＲＴ−ＰＣＲ法は、２段階の操作（逆転写
工程及びＰＣＲ工程）、及び、急激な昇温・降温を繰り
返す操作が必要であり、そのことが自動化への障害とな
る。
【０００９】特定ＲＮＡ配列の増幅法としては、上記以
外に、逆転写酵素及びＲＮＡポリメレースの協奏的作用
によって特定ＲＮＡ配列を増幅するＮＡＳＢＡ法や３Ｓ
Ｒ法等が知られている。この方法は、標的ＲＮＡを鋳型
とし、プロモーター配列を含むプライマー、逆転写酵
素、及びリボヌクレエースＨにより、プロモーター配列
を含む２本鎖ＤＮＡを合成し、該２本鎖ＤＮＡを鋳型と
してＲＮＡポリメレースにより、標的ＲＮＡの特定塩基
配列を含むＲＮＡを合成し、該ＲＮＡが引き続きプロモ
ーター配列を含む２本鎖ＤＮＡ合成の鋳型となる連鎖反
応を行うものである。
外に、逆転写酵素及びＲＮＡポリメレースの協奏的作用
によって特定ＲＮＡ配列を増幅するＮＡＳＢＡ法や３Ｓ
Ｒ法等が知られている。この方法は、標的ＲＮＡを鋳型
とし、プロモーター配列を含むプライマー、逆転写酵
素、及びリボヌクレエースＨにより、プロモーター配列
を含む２本鎖ＤＮＡを合成し、該２本鎖ＤＮＡを鋳型と
してＲＮＡポリメレースにより、標的ＲＮＡの特定塩基
配列を含むＲＮＡを合成し、該ＲＮＡが引き続きプロモ
ーター配列を含む２本鎖ＤＮＡ合成の鋳型となる連鎖反
応を行うものである。
【００１０】このようにＮＡＳＢＡ法や３ＳＲ法は一定
温度での核酸増幅が可能であり、自動化へ適している方
法だと考えられる。
温度での核酸増幅が可能であり、自動化へ適している方
法だと考えられる。
【００１１】しかしながら、ＮＡＳＢＡ法や３ＳＲ法等
の増幅法では、操作を比較的低温（例えば４１℃）で反
応を行うために、標的ＲＮＡが分子内構造を形成し、プ
ライマーの結合を阻害し、反応効率を低下させる可能性
が考えられる。したがって、従来は、増幅反応の前に標
的ＲＮＡの熱変性を行うことで、標的ＲＮＡの分子内構
造を壊し、プライマーの結合効率を向上させるための操
作が必要であり、操作の迅速性及び簡便性という点で課
題が残されていた。
の増幅法では、操作を比較的低温（例えば４１℃）で反
応を行うために、標的ＲＮＡが分子内構造を形成し、プ
ライマーの結合を阻害し、反応効率を低下させる可能性
が考えられる。したがって、従来は、増幅反応の前に標
的ＲＮＡの熱変性を行うことで、標的ＲＮＡの分子内構
造を壊し、プライマーの結合効率を向上させるための操
作が必要であり、操作の迅速性及び簡便性という点で課
題が残されていた。
【００１２】そこで本願発明は、標的ＲＮＡの分子内構
造フリーな領域に対して特異的に相補結合可能で、操作
を比較的低温（３５℃から５０℃、好ましくは４１℃）
で行った場合でも標的ＲＮＡへの結合が阻害されず、し
たがって反応効率を低下させることのないオリゴヌクレ
オチドの提供を目的とする。より具体的には、比較的低
温かつ一定温度で、ＶＴ１ ＲＮＡ又はＶＴ２ ＲＮＡ
の分子内構造フリー領域に対して結合するオリゴヌクレ
オチドや、ＶＴ１ ＲＮＡ又はＶＴ２ ＲＮＡを検出す
るためのオリゴヌクレオチド等の、核酸増幅法で使用さ
れるオリゴヌクレオチドプライマーの提供と、それを利
用した簡便、迅速かつ高感度な検出方法の提供を目的と
するものである。
造フリーな領域に対して特異的に相補結合可能で、操作
を比較的低温（３５℃から５０℃、好ましくは４１℃）
で行った場合でも標的ＲＮＡへの結合が阻害されず、し
たがって反応効率を低下させることのないオリゴヌクレ
オチドの提供を目的とする。より具体的には、比較的低
温かつ一定温度で、ＶＴ１ ＲＮＡ又はＶＴ２ ＲＮＡ
の分子内構造フリー領域に対して結合するオリゴヌクレ
オチドや、ＶＴ１ ＲＮＡ又はＶＴ２ ＲＮＡを検出す
るためのオリゴヌクレオチド等の、核酸増幅法で使用さ
れるオリゴヌクレオチドプライマーの提供と、それを利
用した簡便、迅速かつ高感度な検出方法の提供を目的と
するものである。
【００１３】
【課題を解決するための手段】前記目的を達成するため
に成された本願請求項１の発明は、ＶＴ１ ＲＮＡを検
出又は増幅するためのオリゴヌクレオチドであって、Ｖ
Ｔ１ ＲＮＡに特異的に結合可能である、配列番号１か
ら５に示したいずれかの配列中の少なくとも連続した１
０塩基以上を含む配列を特徴とするオリゴヌクレオチド
である。また前記目的を達成するために成された本願請
求項２の発明は、ＶＴ２ ＲＮＡを検出又は増幅するた
めのオリゴヌクレオチドであって、ＶＴ２ ＲＮＡに特
異的に結合可能である、配列番号６から１４に示したい
ずれかの配列中の少なくとも連続した１０塩基以上を含
む配列を特徴とするオリゴヌクレオチドである。
に成された本願請求項１の発明は、ＶＴ１ ＲＮＡを検
出又は増幅するためのオリゴヌクレオチドであって、Ｖ
Ｔ１ ＲＮＡに特異的に結合可能である、配列番号１か
ら５に示したいずれかの配列中の少なくとも連続した１
０塩基以上を含む配列を特徴とするオリゴヌクレオチド
である。また前記目的を達成するために成された本願請
求項２の発明は、ＶＴ２ ＲＮＡを検出又は増幅するた
めのオリゴヌクレオチドであって、ＶＴ２ ＲＮＡに特
異的に結合可能である、配列番号６から１４に示したい
ずれかの配列中の少なくとも連続した１０塩基以上を含
む配列を特徴とするオリゴヌクレオチドである。
【００１４】また本願請求項３の発明は、ＶＴ１ ＲＮ
Ａの検出方法であり、試料中に存在するＶＴ１ ＲＮＡ
の特定配列を鋳型として、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレ
ースによりｃＤＮＡを合成し、リボヌクレエースＨによ
ってＲＮＡ・ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡを分解して１
本鎖ＤＮＡを生成し、該１本鎖ＤＮＡを鋳型としてＤＮ
Ａ依存性ＤＮＡポリメレースにより、前記特定配列又は
前記特定配列に相補的な配列からなるＲＮＡを転写可能
なプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡを生成し、そ
して該２本鎖ＤＮＡがＲＮＡポリメレース存在下でＲＮ
Ａ転写産物を生成し、該ＲＮＡ転写産物が引き続き前記
ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースによるｃＤＮＡ合成の
鋳型となるようなＲＮＡ増幅工程において、ＶＴ１ Ｒ
ＮＡ配列に特異的に結合可能である配列番号１から５に
示したいずれかの配列中の少なくとも連続した１０塩基
以上からなる第一のオリゴヌクレオチドと、配列番号１
５から１８に示したいずれかの配列中の少なくとも連続
した１０塩基以上からなる第二のオリゴヌクレオチド
（ここで第一又は第二のオリゴヌクレオチドのいずれか
一方は、その５’側にＲＮＡポリメレースのプロモータ
ー配列を含む）を用いることを特徴とする。また本願請
求項４の発明は、ＶＴ２ ＲＮＡの検出方法であり、試
料中に存在するＶＴ２ ＲＮＡの特定配列を鋳型とし
て、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースによりｃＤＮＡを
合成し、リボヌクレエースＨによってＲＮＡ・ＤＮＡハ
イブリッドのＲＮＡを分解して１本鎖ＤＮＡを生成し、
該１本鎖ＤＮＡを鋳型としてＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメ
レースにより、前記特定配列又は前記特定配列に相補的
な配列からなるＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を
有する２本鎖ＤＮＡを生成し、そして該２本鎖ＤＮＡが
ＲＮＡポリメレース存在下でＲＮＡ転写産物を生成し、
該ＲＮＡ転写産物が引き続き前記ＲＮＡ依存性ＤＮＡポ
リメレースによるｃＤＮＡ合成の鋳型となるようなＲＮ
Ａ増幅工程において、ＶＴ２ ＲＮＡ配列に特異的に結
合可能である配列番号６から１４に示したいずれかの配
列中の少なくとも連続した１０塩基以上からなる第一の
オリゴヌクレオチドと、配列番号１９から２３に示した
いずれかの配列中の少なくとも連続した１０塩基以上か
らなる第二のオリゴヌクレオチド（ここで第一又は第二
のオリゴヌクレオチドのいずれか一方は、その５’側に
ＲＮＡポリメレースのプロモーター配列を含む）を用い
ることを特徴とする。
Ａの検出方法であり、試料中に存在するＶＴ１ ＲＮＡ
の特定配列を鋳型として、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレ
ースによりｃＤＮＡを合成し、リボヌクレエースＨによ
ってＲＮＡ・ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡを分解して１
本鎖ＤＮＡを生成し、該１本鎖ＤＮＡを鋳型としてＤＮ
Ａ依存性ＤＮＡポリメレースにより、前記特定配列又は
前記特定配列に相補的な配列からなるＲＮＡを転写可能
なプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡを生成し、そ
して該２本鎖ＤＮＡがＲＮＡポリメレース存在下でＲＮ
Ａ転写産物を生成し、該ＲＮＡ転写産物が引き続き前記
ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースによるｃＤＮＡ合成の
鋳型となるようなＲＮＡ増幅工程において、ＶＴ１ Ｒ
ＮＡ配列に特異的に結合可能である配列番号１から５に
示したいずれかの配列中の少なくとも連続した１０塩基
以上からなる第一のオリゴヌクレオチドと、配列番号１
５から１８に示したいずれかの配列中の少なくとも連続
した１０塩基以上からなる第二のオリゴヌクレオチド
（ここで第一又は第二のオリゴヌクレオチドのいずれか
一方は、その５’側にＲＮＡポリメレースのプロモータ
ー配列を含む）を用いることを特徴とする。また本願請
求項４の発明は、ＶＴ２ ＲＮＡの検出方法であり、試
料中に存在するＶＴ２ ＲＮＡの特定配列を鋳型とし
て、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースによりｃＤＮＡを
合成し、リボヌクレエースＨによってＲＮＡ・ＤＮＡハ
イブリッドのＲＮＡを分解して１本鎖ＤＮＡを生成し、
該１本鎖ＤＮＡを鋳型としてＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメ
レースにより、前記特定配列又は前記特定配列に相補的
な配列からなるＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を
有する２本鎖ＤＮＡを生成し、そして該２本鎖ＤＮＡが
ＲＮＡポリメレース存在下でＲＮＡ転写産物を生成し、
該ＲＮＡ転写産物が引き続き前記ＲＮＡ依存性ＤＮＡポ
リメレースによるｃＤＮＡ合成の鋳型となるようなＲＮ
Ａ増幅工程において、ＶＴ２ ＲＮＡ配列に特異的に結
合可能である配列番号６から１４に示したいずれかの配
列中の少なくとも連続した１０塩基以上からなる第一の
オリゴヌクレオチドと、配列番号１９から２３に示した
いずれかの配列中の少なくとも連続した１０塩基以上か
らなる第二のオリゴヌクレオチド（ここで第一又は第二
のオリゴヌクレオチドのいずれか一方は、その５’側に
ＲＮＡポリメレースのプロモーター配列を含む）を用い
ることを特徴とする。
【００１５】本願請求項５の発明は、前記請求項３又は
４の発明に係り、前記増幅を、増幅により生じるＲＮＡ
転写産物と特異的に結合可能であり、かつ、インターカ
レーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプ
ローブ存在下で実施し、反応液の蛍光特性の変化を測定
する操作を実施することからなる。本願請求項６の発明
は、前記請求項５の発明に係り、前記オリゴヌクレオチ
ドプローブが、ＲＮＡ転写産物の少なくとも一部の配列
と相補結合するように設計され、複合体を形成していな
い場合と比較して蛍光特性が変化するものであることを
特徴とする。本願請求項７の発明は、前記請求項５の発
明に係り、前記オリゴヌクレオチドプローブが配列番号
２４に示した配列中の少なくとも連続した１０塩基以上
からなる配列又はその相補配列である、ＶＴ１ ＲＮＡ
の検出方法である。本願請求項８の発明は、前記請求項
５の発明に係り、前記オリゴヌクレオチドプローブが配
列番号２５に示した配列中の少なくとも連続した１０塩
基以上からなる配列又はその相補配列である、ＶＴ２
ＲＮＡの検出方法である。以下、本願発明を詳細に説明
する。
４の発明に係り、前記増幅を、増幅により生じるＲＮＡ
転写産物と特異的に結合可能であり、かつ、インターカ
レーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプ
ローブ存在下で実施し、反応液の蛍光特性の変化を測定
する操作を実施することからなる。本願請求項６の発明
は、前記請求項５の発明に係り、前記オリゴヌクレオチ
ドプローブが、ＲＮＡ転写産物の少なくとも一部の配列
と相補結合するように設計され、複合体を形成していな
い場合と比較して蛍光特性が変化するものであることを
特徴とする。本願請求項７の発明は、前記請求項５の発
明に係り、前記オリゴヌクレオチドプローブが配列番号
２４に示した配列中の少なくとも連続した１０塩基以上
からなる配列又はその相補配列である、ＶＴ１ ＲＮＡ
の検出方法である。本願請求項８の発明は、前記請求項
５の発明に係り、前記オリゴヌクレオチドプローブが配
列番号２５に示した配列中の少なくとも連続した１０塩
基以上からなる配列又はその相補配列である、ＶＴ２
ＲＮＡの検出方法である。以下、本願発明を詳細に説明
する。
【００１６】まず本願発明は、ＶＴ１ ＲＮＡを検出す
るために有用なオリゴヌクレオチドであって、ＶＴ１
ＲＮＡに特異的に結合可能である、配列番号１から５に
示したいずれかの配列中の少なくとも連続した１０塩基
以上から成るオリゴヌクレオチドである。このオリゴヌ
クレオチドは比較的低温かつ一定温度（３５℃から５０
℃、好ましくは４１℃）で、ＶＴ１ ＲＮＡに特異的に
結合可能である。
るために有用なオリゴヌクレオチドであって、ＶＴ１
ＲＮＡに特異的に結合可能である、配列番号１から５に
示したいずれかの配列中の少なくとも連続した１０塩基
以上から成るオリゴヌクレオチドである。このオリゴヌ
クレオチドは比較的低温かつ一定温度（３５℃から５０
℃、好ましくは４１℃）で、ＶＴ１ ＲＮＡに特異的に
結合可能である。
【００１７】そして本願発明が提供する、試料中のＶＴ
１ ＲＮＡを増幅する工程を含むＲＮＡの検出方法は、
核酸増幅工程としてＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ法、３ＳＲ法
等のいずれかを含むが、中でも逆転写酵素及びＲＮＡポ
リメレースの協奏的作用によって（逆転写酵素及びＲＮ
Ａポリメレースが協奏的に作用するような条件下で反応
させ）ＶＴ１ ＲＮＡ中の特定配列を増幅するＮＡＳＢ
Ａ法又は３ＳＲ法等の、一定温度条件下で実施できる核
酸増幅法が好ましい。
１ ＲＮＡを増幅する工程を含むＲＮＡの検出方法は、
核酸増幅工程としてＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ法、３ＳＲ法
等のいずれかを含むが、中でも逆転写酵素及びＲＮＡポ
リメレースの協奏的作用によって（逆転写酵素及びＲＮ
Ａポリメレースが協奏的に作用するような条件下で反応
させ）ＶＴ１ ＲＮＡ中の特定配列を増幅するＮＡＳＢ
Ａ法又は３ＳＲ法等の、一定温度条件下で実施できる核
酸増幅法が好ましい。
【００１８】例えばＮＡＳＢＡ法は、試料中に存在する
ＶＴ１ ＲＮＡの特定配列を鋳型として、ＲＮＡ依存性
ＤＮＡポリメレースによりｃＤＮＡを合成し、リボヌク
レエースＨによってＲＮＡ・ＤＮＡハイブリッドのＲＮ
Ａを分解して１本鎖ＤＮＡを生成し、該１本鎖ＤＮＡを
鋳型としてＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースにより、前
記特定配列又は前記特定配列に相補的な配列からなるＲ
ＮＡを転写可能なプロモーター配列を有する二本鎖ＤＮ
Ａを生成し、そして該二本鎖ＤＮＡがＲＮＡポリメレー
ス存在下でＲＮＡ転写産物を生成し、該ＲＮＡ転写産物
が引き続き前記ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースによる
ｃＤＮＡ合成の鋳型となるようなＲＮＡ増幅工程である
が、本願発明ではＶＴ１ ＲＮＡに特異的に結合可能で
ある配列番号１から５に示したいずれかの配列中の少な
くとも連続した１０塩基以上から成る第一のオリゴヌク
レオチドと、配列番号１５から１８に示したいずれかの
配列中の少なくとも連続した１０塩基以上から成る、増
幅されるＶＴ１ ＲＮＡ配列の一部と相同な配列を有す
る第二のオリゴヌクレオチド（ここで第一又は第二のオ
リゴヌクレオチドのいずれか一方は、その５’側にＲＮ
Ａポリメレースのプロモーター配列を含む）を用いるこ
とを特徴とする。
ＶＴ１ ＲＮＡの特定配列を鋳型として、ＲＮＡ依存性
ＤＮＡポリメレースによりｃＤＮＡを合成し、リボヌク
レエースＨによってＲＮＡ・ＤＮＡハイブリッドのＲＮ
Ａを分解して１本鎖ＤＮＡを生成し、該１本鎖ＤＮＡを
鋳型としてＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースにより、前
記特定配列又は前記特定配列に相補的な配列からなるＲ
ＮＡを転写可能なプロモーター配列を有する二本鎖ＤＮ
Ａを生成し、そして該二本鎖ＤＮＡがＲＮＡポリメレー
ス存在下でＲＮＡ転写産物を生成し、該ＲＮＡ転写産物
が引き続き前記ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースによる
ｃＤＮＡ合成の鋳型となるようなＲＮＡ増幅工程である
が、本願発明ではＶＴ１ ＲＮＡに特異的に結合可能で
ある配列番号１から５に示したいずれかの配列中の少な
くとも連続した１０塩基以上から成る第一のオリゴヌク
レオチドと、配列番号１５から１８に示したいずれかの
配列中の少なくとも連続した１０塩基以上から成る、増
幅されるＶＴ１ ＲＮＡ配列の一部と相同な配列を有す
る第二のオリゴヌクレオチド（ここで第一又は第二のオ
リゴヌクレオチドのいずれか一方は、その５’側にＲＮ
Ａポリメレースのプロモーター配列を含む）を用いるこ
とを特徴とする。
【００１９】ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース、ＤＮＡ
依存性ＤＮＡポリメレース、リボヌクレエースＨは特に
限定されないが、これらの活性のすべてを有しているＡ
ＭＶ逆転写酵素が好ましい。また、ＲＮＡポリメレース
についても特に限定されないが、Ｔ７ファージＲＮＡポ
リメレース、ＳＰ６ファージＲＮＡポリメレースが好ま
しい。
依存性ＤＮＡポリメレース、リボヌクレエースＨは特に
限定されないが、これらの活性のすべてを有しているＡ
ＭＶ逆転写酵素が好ましい。また、ＲＮＡポリメレース
についても特に限定されないが、Ｔ７ファージＲＮＡポ
リメレース、ＳＰ６ファージＲＮＡポリメレースが好ま
しい。
【００２０】上記増幅工程では、ＶＴ１ ＲＮＡ配列の
中で特定配列とする領域の５’末領域と重複（１から１
０塩基）して隣接する領域に対して相補的なオリゴヌク
レオチドを添加し、前記ＶＴ１ ＲＮＡを特定配列の
５’末領域で切断（リボヌクレエースＨによる）して核
酸増幅初期の鋳型とすることにより、特定配列が５’端
に位置していないＶＴ１ ＲＮＡをも増幅することが出
来る。この切断のためには、例えば配列番号１から５の
オリゴヌクレオチド（ただし、前記増幅工程において第
一のオリゴヌクレオチドとして使用したもの以外のオリ
ゴヌクレオチド）を使用する事が出来る。なお、この切
断用オリゴヌクレオチドは、３’末端からの伸長反応を
抑えるために、３’水酸基が化学的に修飾（たとえばア
ミノ化）されたものであることが望ましい。
中で特定配列とする領域の５’末領域と重複（１から１
０塩基）して隣接する領域に対して相補的なオリゴヌク
レオチドを添加し、前記ＶＴ１ ＲＮＡを特定配列の
５’末領域で切断（リボヌクレエースＨによる）して核
酸増幅初期の鋳型とすることにより、特定配列が５’端
に位置していないＶＴ１ ＲＮＡをも増幅することが出
来る。この切断のためには、例えば配列番号１から５の
オリゴヌクレオチド（ただし、前記増幅工程において第
一のオリゴヌクレオチドとして使用したもの以外のオリ
ゴヌクレオチド）を使用する事が出来る。なお、この切
断用オリゴヌクレオチドは、３’末端からの伸長反応を
抑えるために、３’水酸基が化学的に修飾（たとえばア
ミノ化）されたものであることが望ましい。
【００２１】以上の核酸増幅工程で得られるＲＮＡ転写
産物は既知の検出方法で検出する事が出来るが、前記増
幅工程をインターカレーター性蛍光色素で標識されたオ
リゴヌクレオチドプローブ存在下で実施し、反応液の蛍
光特性の変化を測定する事が好ましい。このオリゴヌク
レオチドプローブとしては、オリゴヌクレオチド中のリ
ンにリンカーを介してインターカレーター性蛍光色素を
結合させたものが例示出来る。この好適なプローブで
は、標的核酸（相補的核酸）と二本鎖を形成するとイン
ターカレーター部分が二本鎖部分にインターカレートし
て蛍光特性が変化するため、分離分析を必要としない
（Ｉｓｈｉｇｕｒｏ，Ｔら（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４（２４）４９９２−４９９
７）。
産物は既知の検出方法で検出する事が出来るが、前記増
幅工程をインターカレーター性蛍光色素で標識されたオ
リゴヌクレオチドプローブ存在下で実施し、反応液の蛍
光特性の変化を測定する事が好ましい。このオリゴヌク
レオチドプローブとしては、オリゴヌクレオチド中のリ
ンにリンカーを介してインターカレーター性蛍光色素を
結合させたものが例示出来る。この好適なプローブで
は、標的核酸（相補的核酸）と二本鎖を形成するとイン
ターカレーター部分が二本鎖部分にインターカレートし
て蛍光特性が変化するため、分離分析を必要としない
（Ｉｓｈｉｇｕｒｏ，Ｔら（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４（２４）４９９２−４９９
７）。
【００２２】前記プローブの配列は、ＲＮＡ転写産物の
少なくとも一部に対して相補的な配列を有すれば特に限
定されないが、配列番号２４に示した配列の少なくとも
連続した１０塩基以上から成る配列が好ましい。またプ
ローブをプライマーとした伸長反応を抑えるために、プ
ローブの３’末端の水酸基は化学的に修飾（たとえばグ
リコール酸付加）することが望ましい。
少なくとも一部に対して相補的な配列を有すれば特に限
定されないが、配列番号２４に示した配列の少なくとも
連続した１０塩基以上から成る配列が好ましい。またプ
ローブをプライマーとした伸長反応を抑えるために、プ
ローブの３’末端の水酸基は化学的に修飾（たとえばグ
リコール酸付加）することが望ましい。
【００２３】上記のようなプローブ共存下で増幅工程を
行なう事により、ＶＴ１ ＲＮＡの中の特定配列と同じ
配列から成るＲＮＡを、一チューブ内、一定温度、一段
階で増幅し検出する事が可能となり、自動化への適用も
容易となる。
行なう事により、ＶＴ１ ＲＮＡの中の特定配列と同じ
配列から成るＲＮＡを、一チューブ内、一定温度、一段
階で増幅し検出する事が可能となり、自動化への適用も
容易となる。
【００２４】次に本願発明は、ＶＴ２ ＲＮＡを検出す
るために有用なオリゴヌクレオチドであって、ＶＴ２
ＲＮＡに特異的に結合可能である、配列番号６から１４
に示したいずれかの配列中の少なくとも連続した１０塩
基以上から成るオリゴヌクレオチドである。このオリゴ
ヌクレオチドは比較的低温かつ一定温度（３５℃から５
０℃、好ましくは４１℃）で、ＶＴ２ ＲＮＡに特異的
に結合可能である。
るために有用なオリゴヌクレオチドであって、ＶＴ２
ＲＮＡに特異的に結合可能である、配列番号６から１４
に示したいずれかの配列中の少なくとも連続した１０塩
基以上から成るオリゴヌクレオチドである。このオリゴ
ヌクレオチドは比較的低温かつ一定温度（３５℃から５
０℃、好ましくは４１℃）で、ＶＴ２ ＲＮＡに特異的
に結合可能である。
【００２５】そして本願発明が提供する、試料中のＶＴ
２ ＲＮＡを増幅する工程を含むＲＮＡの検出方法は、
核酸増幅工程としてＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ法、３ＳＲ法
等のいずれかを含むが、中でも逆転写酵素及びＲＮＡポ
リメレースの協奏的作用によって（逆転写酵素及びＲＮ
Ａポリメレースが協奏的に作用するような条件下で反応
させ）ＶＴ２ ＲＮＡ中の特定配列を増幅するＮＡＳＢ
Ａ法又は３ＳＲ法等の、一定温度条件下で実施できる核
酸増幅法が好ましい。
２ ＲＮＡを増幅する工程を含むＲＮＡの検出方法は、
核酸増幅工程としてＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ法、３ＳＲ法
等のいずれかを含むが、中でも逆転写酵素及びＲＮＡポ
リメレースの協奏的作用によって（逆転写酵素及びＲＮ
Ａポリメレースが協奏的に作用するような条件下で反応
させ）ＶＴ２ ＲＮＡ中の特定配列を増幅するＮＡＳＢ
Ａ法又は３ＳＲ法等の、一定温度条件下で実施できる核
酸増幅法が好ましい。
【００２６】例えばＮＡＳＢＡ法は、試料中に存在する
ＶＴ２ ＲＮＡの特定配列を鋳型として、ＲＮＡ依存性
ＤＮＡポリメレースによりｃＤＮＡを合成し、リボヌク
レエースＨによってＲＮＡ・ＤＮＡハイブリッドのＲＮ
Ａを分解して１本鎖ＤＮＡを生成し、該１本鎖ＤＮＡを
鋳型としてＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースにより、前
記特定配列又は前記特定配列に相補的な配列からなるＲ
ＮＡを転写可能なプロモーター配列を有する二本鎖ＤＮ
Ａを生成し、そして該二本鎖ＤＮＡがＲＮＡポリメレー
ス存在下でＲＮＡ転写産物を生成し、該ＲＮＡ転写産物
が引き続き前記ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースによる
ｃＤＮＡ合成の鋳型となるようなＲＮＡ増幅工程である
が、本願発明ではＶＴ２ ＲＮＡに特異的に結合可能で
ある配列番号６から１４に示したいずれかの配列中の少
なくとも連続した１０塩基以上から成る第一のオリゴヌ
クレオチドと、配列番号１９から２３に示したいずれか
の配列中の少なくとも連続した１０塩基以上から成る、
増幅されるＶＴ２ ＲＮＡ配列の一部と相同な配列を有
する第二のオリゴヌクレオチド（ここで第一又は第二の
オリゴヌクレオチドのいずれか一方は、その５’側にＲ
ＮＡポリメレースのプロモーター配列を含む）を用いる
ことを特徴とする。
ＶＴ２ ＲＮＡの特定配列を鋳型として、ＲＮＡ依存性
ＤＮＡポリメレースによりｃＤＮＡを合成し、リボヌク
レエースＨによってＲＮＡ・ＤＮＡハイブリッドのＲＮ
Ａを分解して１本鎖ＤＮＡを生成し、該１本鎖ＤＮＡを
鋳型としてＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースにより、前
記特定配列又は前記特定配列に相補的な配列からなるＲ
ＮＡを転写可能なプロモーター配列を有する二本鎖ＤＮ
Ａを生成し、そして該二本鎖ＤＮＡがＲＮＡポリメレー
ス存在下でＲＮＡ転写産物を生成し、該ＲＮＡ転写産物
が引き続き前記ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースによる
ｃＤＮＡ合成の鋳型となるようなＲＮＡ増幅工程である
が、本願発明ではＶＴ２ ＲＮＡに特異的に結合可能で
ある配列番号６から１４に示したいずれかの配列中の少
なくとも連続した１０塩基以上から成る第一のオリゴヌ
クレオチドと、配列番号１９から２３に示したいずれか
の配列中の少なくとも連続した１０塩基以上から成る、
増幅されるＶＴ２ ＲＮＡ配列の一部と相同な配列を有
する第二のオリゴヌクレオチド（ここで第一又は第二の
オリゴヌクレオチドのいずれか一方は、その５’側にＲ
ＮＡポリメレースのプロモーター配列を含む）を用いる
ことを特徴とする。
【００２７】ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース、ＤＮＡ
依存性ＤＮＡポリメレース、リボヌクレエースＨは特に
限定されないが、これらの活性のすべてを有しているＡ
ＭＶ逆転写酵素が好ましい。また、ＲＮＡポリメレース
についても特に限定されないが、Ｔ７ファージＲＮＡポ
リメレース、ＳＰ６ファージＲＮＡポリメレースが好ま
しい。
依存性ＤＮＡポリメレース、リボヌクレエースＨは特に
限定されないが、これらの活性のすべてを有しているＡ
ＭＶ逆転写酵素が好ましい。また、ＲＮＡポリメレース
についても特に限定されないが、Ｔ７ファージＲＮＡポ
リメレース、ＳＰ６ファージＲＮＡポリメレースが好ま
しい。
【００２８】上記増幅工程では、ＶＴ２ ＲＮＡ配列の
中で特定配列とする領域の５’末領域と重複（１から１
０塩基）して隣接する領域に対して相補的なオリゴヌク
レオチドを添加し、前記ＶＴ２ ＲＮＡを特定配列の
５’末領域で切断（リボヌクレエースＨによる）して核
酸増幅初期の鋳型とすることにより、特定配列が５’端
に位置していないＶＴ２ ＲＮＡをも増幅することが出
来る。この切断のためには、例えば配列番号６から１４
のオリゴヌクレオチド（ただし、前記増幅工程において
第一のオリゴヌクレオチドとして使用したもの以外のオ
リゴヌクレオチド）を使用する事が出来る。なお、この
切断用オリゴヌクレオチドは、３’末端からの伸長反応
を抑えるために、３’末端の水酸基が化学的に修飾（た
とえばアミノ化）されたものであることが望ましい。
中で特定配列とする領域の５’末領域と重複（１から１
０塩基）して隣接する領域に対して相補的なオリゴヌク
レオチドを添加し、前記ＶＴ２ ＲＮＡを特定配列の
５’末領域で切断（リボヌクレエースＨによる）して核
酸増幅初期の鋳型とすることにより、特定配列が５’端
に位置していないＶＴ２ ＲＮＡをも増幅することが出
来る。この切断のためには、例えば配列番号６から１４
のオリゴヌクレオチド（ただし、前記増幅工程において
第一のオリゴヌクレオチドとして使用したもの以外のオ
リゴヌクレオチド）を使用する事が出来る。なお、この
切断用オリゴヌクレオチドは、３’末端からの伸長反応
を抑えるために、３’末端の水酸基が化学的に修飾（た
とえばアミノ化）されたものであることが望ましい。
【００２９】以上の核酸増幅工程で得られるＲＮＡ転写
産物は既知の検出方法で検出する事が出来るが、前記増
幅工程をインターカレーター性蛍光色素で標識されたオ
リゴヌクレオチドプローブ存在下で実施し、反応液の蛍
光特性の変化を測定する事が好ましい。このオリゴヌク
レオチドプローブとしては、オリゴヌクレオチド中のリ
ンにリンカーを介してインターカレーター性蛍光色素を
結合させたものが例示出来る。この好適なプローブで
は、標的核酸（相補的核酸）と二本鎖を形成するとイン
ターカレーター部分が二本鎖部分にインターカレートし
て蛍光特性が変化するため、分離分析を必要としない
（Ｉｓｈｉｇｕｒｏ，Ｔら（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４（２４）４９９２−４９９
７）。
産物は既知の検出方法で検出する事が出来るが、前記増
幅工程をインターカレーター性蛍光色素で標識されたオ
リゴヌクレオチドプローブ存在下で実施し、反応液の蛍
光特性の変化を測定する事が好ましい。このオリゴヌク
レオチドプローブとしては、オリゴヌクレオチド中のリ
ンにリンカーを介してインターカレーター性蛍光色素を
結合させたものが例示出来る。この好適なプローブで
は、標的核酸（相補的核酸）と二本鎖を形成するとイン
ターカレーター部分が二本鎖部分にインターカレートし
て蛍光特性が変化するため、分離分析を必要としない
（Ｉｓｈｉｇｕｒｏ，Ｔら（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４（２４）４９９２−４９９
７）。
【００３０】前記プローブの配列は、ＲＮＡ転写産物の
少なくとも一部に対して相補的な配列を有すれば特に限
定されないが、配列番号２５に示した配列の少なくとも
連続した１０塩基以上から成る配列が好ましい。またプ
ローブをプライマーとした伸長反応を抑えるために、プ
ローブの３’末端の水酸基は化学的に修飾（たとえばグ
リコール酸付加）することが望ましい。
少なくとも一部に対して相補的な配列を有すれば特に限
定されないが、配列番号２５に示した配列の少なくとも
連続した１０塩基以上から成る配列が好ましい。またプ
ローブをプライマーとした伸長反応を抑えるために、プ
ローブの３’末端の水酸基は化学的に修飾（たとえばグ
リコール酸付加）することが望ましい。
【００３１】上記のようなプローブ共存下で増幅工程を
行なう事により、ＶＴ２ ＲＮＡの中の特定配列と同じ
配列から成るＲＮＡを、一チューブ内、一定温度、一段
階で増幅し検出する事が可能となり、自動化への適用も
容易となる。
行なう事により、ＶＴ２ ＲＮＡの中の特定配列と同じ
配列から成るＲＮＡを、一チューブ内、一定温度、一段
階で増幅し検出する事が可能となり、自動化への適用も
容易となる。
【００３２】
【発明の実施形態】以下、本願発明を実施例により更に
詳細に説明するが、本願発明はこれら実施例により限定
されるものではない。
詳細に説明するが、本願発明はこれら実施例により限定
されるものではない。
【００３３】実施例１ ＶＴ１ ＲＮＡに対し、４１℃という比較的低温で特異
的に結合するオリゴヌクレオチドを選択した。ＶＴ１
ＲＮＡ塩基配列（Ｃａｌｄｅｒｗｏｏｄ，Ｓ．Ｂ．他、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．
Ａ．、８４、４３６４−４３６８（１９８７）、米国Ｇ
ｅｎ Ｂａｎｋ登録番号Ｍ１６６２５）の塩基番号２２
８から１５５８の領域を含む標準ＲＮＡを、２６０ｎｍ
の紫外部吸収により定量後、ＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．５Ｕ／μｌ ＲＮａｓｅ Ｉ
ｎｈｉｂｉｔｏｒ）を用い１．３３ｐｍｏｌ／μｌとな
るよう希釈した。
的に結合するオリゴヌクレオチドを選択した。ＶＴ１
ＲＮＡ塩基配列（Ｃａｌｄｅｒｗｏｏｄ，Ｓ．Ｂ．他、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．
Ａ．、８４、４３６４−４３６８（１９８７）、米国Ｇ
ｅｎ Ｂａｎｋ登録番号Ｍ１６６２５）の塩基番号２２
８から１５５８の領域を含む標準ＲＮＡを、２６０ｎｍ
の紫外部吸収により定量後、ＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．５Ｕ／μｌ ＲＮａｓｅ Ｉ
ｎｈｉｂｉｔｏｒ）を用い１．３３ｐｍｏｌ／μｌとな
るよう希釈した。
【００３４】以下の組成の反応液１４．０μｌを０．５
ｍｌ容のＰＣＲ用チューブ（商品名；Ｇｅｎｅ Ａｍｐ
Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂ
ｅｓ、パーキンエルマー製）に分注した。
ｍｌ容のＰＣＲ用チューブ（商品名；Ｇｅｎｅ Ａｍｐ
Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂ
ｅｓ、パーキンエルマー製）に分注した。
【００３５】（反応液の組成） ６０．０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６） ９０．０ｍＭ 塩化カリウム １３．０ｍＭ 塩化マグネシウム １．０ｍＭ ＤＴＴ ８０．０ｎＭ 標準ＲＮＡ ０．８μＭ オリゴヌクレオチド（以下に示した配列の
オリゴヌクレオチド） （オリゴ−１）：配列番号１ （オリゴ−２）：配列番号２ （オリゴ−３）：配列番号２６ （オリゴ−４）：配列番号３ （オリゴ−５）：配列番号４ （オリゴ−６）：配列番号５ 容量調整用蒸留水 上記の反応液を４１℃で５分間保温後、８．０Ｕ／μｌ
のＡＭＶ逆転写酵素（宝酒造（株）製）を１μｌ添加し
た（ＡＭＶ逆転写酵素は、ＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖のＲＮ
Ａを切断する活性を有する酵素である）。
オリゴヌクレオチド） （オリゴ−１）：配列番号１ （オリゴ−２）：配列番号２ （オリゴ−３）：配列番号２６ （オリゴ−４）：配列番号３ （オリゴ−５）：配列番号４ （オリゴ−６）：配列番号５ 容量調整用蒸留水 上記の反応液を４１℃で５分間保温後、８．０Ｕ／μｌ
のＡＭＶ逆転写酵素（宝酒造（株）製）を１μｌ添加し
た（ＡＭＶ逆転写酵素は、ＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖のＲＮ
Ａを切断する活性を有する酵素である）。
【００３６】引き続きＰＣＲチューブを４１℃に１０分
間保温した。反応後の切断断片を確認するため、尿素変
性ポリアクリルアミドゲル（アクリルアミド濃度は６
％、尿素７Ｍ）電気泳動を実施した。電気泳動後の染色
は市販の染色液（商品名；ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ
Ｉ、宝酒造（株）製）により行った。標的ＲＮＡの特定
部位にオリゴヌクレオチドが結合すると、ＡＭＶ逆転写
酵素が有するＲＮａｓｅＨ活性により、ＤＮＡ／ＲＮＡ
二本鎖のＲＮＡが切断され、特定バンドが観察される。
間保温した。反応後の切断断片を確認するため、尿素変
性ポリアクリルアミドゲル（アクリルアミド濃度は６
％、尿素７Ｍ）電気泳動を実施した。電気泳動後の染色
は市販の染色液（商品名；ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ
Ｉ、宝酒造（株）製）により行った。標的ＲＮＡの特定
部位にオリゴヌクレオチドが結合すると、ＡＭＶ逆転写
酵素が有するＲＮａｓｅＨ活性により、ＤＮＡ／ＲＮＡ
二本鎖のＲＮＡが切断され、特定バンドが観察される。
【００３７】電気泳動の結果（白黒反転図）を図１に示
した。オリゴヌクレオチドが標準ＲＮＡに特異的に結合
した場合、標準ＲＮＡはその領域で分解され、特定の鎖
長の分解産物を生ずる。表１には、オリゴヌクレオチド
が標準ＲＮＡに特異的に結合した場合の位置と期待され
るバンドの鎖長を示した。オリゴ−１からオリゴ６は、
期待される位置での切断が確認された。以上から、これ
らのオリゴヌクレオチドは、４１℃一定の状態でＶＴ１
ＲＮＡに強く結合している事が示された。
した。オリゴヌクレオチドが標準ＲＮＡに特異的に結合
した場合、標準ＲＮＡはその領域で分解され、特定の鎖
長の分解産物を生ずる。表１には、オリゴヌクレオチド
が標準ＲＮＡに特異的に結合した場合の位置と期待され
るバンドの鎖長を示した。オリゴ−１からオリゴ６は、
期待される位置での切断が確認された。以上から、これ
らのオリゴヌクレオチドは、４１℃一定の状態でＶＴ１
ＲＮＡに強く結合している事が示された。
【００３８】
【表１】 実施例２ ＶＴ２ ＲＮＡに対して、４１℃で特異的に結合するオ
リゴヌクレオチドを選択した。ＶＴ２ ＲＮＡ塩基配列
（Ｓｃｈｍｉｔｔ，Ｃ．Ｋ．他、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍ
ｕｎ、５９、１０６５−１０７３（１９９１）、米国Ｇ
ｅｎ Ｂａｎｋ登録番号Ｘ０７８６５）の塩基番号８１
から１４３７の領域を含む標準ＲＮＡを、２６０ｎｍの
紫外部吸収により定量後、ＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．５Ｕ／μｌ ＲＮａｓｅ Ｉ
ｎｈｉｂｉｔｏｒ）を用い１．７５ｐｍｏｌ／μｌとな
るよう希釈した。
リゴヌクレオチドを選択した。ＶＴ２ ＲＮＡ塩基配列
（Ｓｃｈｍｉｔｔ，Ｃ．Ｋ．他、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍ
ｕｎ、５９、１０６５−１０７３（１９９１）、米国Ｇ
ｅｎ Ｂａｎｋ登録番号Ｘ０７８６５）の塩基番号８１
から１４３７の領域を含む標準ＲＮＡを、２６０ｎｍの
紫外部吸収により定量後、ＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．５Ｕ／μｌ ＲＮａｓｅ Ｉ
ｎｈｉｂｉｔｏｒ）を用い１．７５ｐｍｏｌ／μｌとな
るよう希釈した。
【００３９】以下の組成の反応液１４．０μｌを０．５
ｍｌ容のＰＣＲ用チューブ（商品名；Ｇｅｎｅ Ａｍｐ
Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂ
ｅｓ、パーキンエルマー製）に分注した。
ｍｌ容のＰＣＲ用チューブ（商品名；Ｇｅｎｅ Ａｍｐ
Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂ
ｅｓ、パーキンエルマー製）に分注した。
【００４０】（反応液の組成） ６０．０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６） ９０．０ｍＭ 塩化カリウム １３．０ｍＭ 塩化マグネシウム １．０ｍＭ ＤＴＴ ８０．０ｎＭ 標準ＲＮＡ ０．８μＭ オリゴヌクレオチド（以下に示した配列の
オリゴヌクレオチド） （オリゴ−７）：配列番号６ （オリゴ−８）：配列番号７ （オリゴー９）：配列番号８ （オリゴ−１０）：配列番号９ （オリゴ−１１）：配列番号１０ （オリゴ−１２）：配列番号１１ （オリゴ−１３）：配列番号１２ （オリゴ−１４）：配列番号１３ （オリゴ−１５）：配列番号１４ 容量調整用蒸留水 上記の反応液を、４１℃で５分間保温後、８．０Ｕ／μ
ｌのＡＭＶ逆転写酵素（宝酒造（株）製）を１μｌ添加
した（ＡＭＶ逆転写酵素は、ＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖のＲ
ＮＡを切断する活性を有する酵素である）。
オリゴヌクレオチド） （オリゴ−７）：配列番号６ （オリゴ−８）：配列番号７ （オリゴー９）：配列番号８ （オリゴ−１０）：配列番号９ （オリゴ−１１）：配列番号１０ （オリゴ−１２）：配列番号１１ （オリゴ−１３）：配列番号１２ （オリゴ−１４）：配列番号１３ （オリゴ−１５）：配列番号１４ 容量調整用蒸留水 上記の反応液を、４１℃で５分間保温後、８．０Ｕ／μ
ｌのＡＭＶ逆転写酵素（宝酒造（株）製）を１μｌ添加
した（ＡＭＶ逆転写酵素は、ＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖のＲ
ＮＡを切断する活性を有する酵素である）。
【００４１】引き続きＰＣＲチューブを４１℃に１０分
間保温した。反応後の切断断片を確認するため、尿素変
性ポリアクリルアミドゲル（アクリルアミド濃度は６
％、尿素７Ｍ）電気泳動を実施した。電気泳動後の染色
は市販の染色液（商品名；ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ
Ｉ、宝酒造（株）製）により行った。標的ＲＮＡの特定
部位にオリゴヌクレオチドが結合すると、ＡＭＶ逆転写
酵素が有するＲＮａｓｅＨ活性により、ＤＮＡ／ＲＮＡ
二本鎖のＲＮＡが切断され、特定バンドが観察される。
間保温した。反応後の切断断片を確認するため、尿素変
性ポリアクリルアミドゲル（アクリルアミド濃度は６
％、尿素７Ｍ）電気泳動を実施した。電気泳動後の染色
は市販の染色液（商品名；ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ
Ｉ、宝酒造（株）製）により行った。標的ＲＮＡの特定
部位にオリゴヌクレオチドが結合すると、ＡＭＶ逆転写
酵素が有するＲＮａｓｅＨ活性により、ＤＮＡ／ＲＮＡ
二本鎖のＲＮＡが切断され、特定バンドが観察される。
【００４２】電気泳動の結果（白黒反転図）を図２に示
した。オリゴヌクレオチドが標準ＲＮＡに特異的に結合
した場合、標準ＲＮＡはその領域で分解され、特定の鎖
長の分解産物を生ずる。表２には、オリゴヌクレオチド
が標準ＲＮＡに特異的に結合した場合の位置と期待され
るバンドの鎖長を示した。オリゴ−７からオリゴ１５
は、期待される位置での切断が確認された。以上から、
これらのオリゴヌクレオチドは、４１℃一定の状態でＶ
Ｔ２ ＲＮＡに強く結合している事が示された。
した。オリゴヌクレオチドが標準ＲＮＡに特異的に結合
した場合、標準ＲＮＡはその領域で分解され、特定の鎖
長の分解産物を生ずる。表２には、オリゴヌクレオチド
が標準ＲＮＡに特異的に結合した場合の位置と期待され
るバンドの鎖長を示した。オリゴ−７からオリゴ１５
は、期待される位置での切断が確認された。以上から、
これらのオリゴヌクレオチドは、４１℃一定の状態でＶ
Ｔ２ ＲＮＡに強く結合している事が示された。
【００４３】
【表２】 実施例３ ＶＴ１ ＲＮＡに特異的に結合するオリゴヌクレオチド
プローブを用いてＲＮＡ増幅反応を行なった。 （１）実施例１と同様のＶＴ１標準ＲＮＡをＲＮＡ希釈
液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ、０．５Ｕ／μｌ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉ
ｂｉｔｏｒ（宝酒造（株）製）、５ｍＭ ＤＴＴ）を用
い、それぞれ１０ 4コピー／２．５μｌ、１０3コピー／
２．５μｌとなるよう希釈した。コントロール試験区
（Ｎｅｇａ）には希釈液のみを用いた。 （２）以下の組成の反応液２３．３μｌを０．５ｍｌ容
のＰＣＲチューブ（商品名；Ｇｅｎｅ Ａｍｐ Ｔｈｉ
ｎ−Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｓ、パ
ーキンエルマー製）に分注し、これに上記ＲＮＡ試料
２．５μｌを添加した。
プローブを用いてＲＮＡ増幅反応を行なった。 （１）実施例１と同様のＶＴ１標準ＲＮＡをＲＮＡ希釈
液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ、０．５Ｕ／μｌ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉ
ｂｉｔｏｒ（宝酒造（株）製）、５ｍＭ ＤＴＴ）を用
い、それぞれ１０ 4コピー／２．５μｌ、１０3コピー／
２．５μｌとなるよう希釈した。コントロール試験区
（Ｎｅｇａ）には希釈液のみを用いた。 （２）以下の組成の反応液２３．３μｌを０．５ｍｌ容
のＰＣＲチューブ（商品名；Ｇｅｎｅ Ａｍｐ Ｔｈｉ
ｎ−Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｓ、パ
ーキンエルマー製）に分注し、これに上記ＲＮＡ試料
２．５μｌを添加した。
【００４４】反応液の組成（各濃度は最終反応液量３０
μｌにおける濃度） ６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６） １７ｍＭ 塩化マグネシウム ９０ｍＭ 塩化カリウム ３９Ｕ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ １ｍＭ ＤＴＴ 各０．２５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴ
ＴＰ ３．６ｍＭ ＩＴＰ 各３．０ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ ０．１６μＭの第１オリゴヌクレオチド １．０μＭの第２オリゴヌクレオチド １．０μＭの第３オリゴヌクレオチド １３％ ＤＭＳＯ 容量調整用蒸留水 （３）第１、第２、第３オリゴヌクレオチドとして、表
３の説明に示す配列のオリゴヌクレオチドを用いてＲＮ
Ａ増幅反応を行なった。なお、第１、第２、第３オリゴ
ヌクレオチドの組み合わせが表３に示す組み合わせとな
るよう溶液を調製した。 （４）この反応液を４１℃で５分間保温後、以下の組成
の酵素液４．２μｌを添加した。
μｌにおける濃度） ６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６） １７ｍＭ 塩化マグネシウム ９０ｍＭ 塩化カリウム ３９Ｕ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ １ｍＭ ＤＴＴ 各０．２５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴ
ＴＰ ３．６ｍＭ ＩＴＰ 各３．０ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ ０．１６μＭの第１オリゴヌクレオチド １．０μＭの第２オリゴヌクレオチド １．０μＭの第３オリゴヌクレオチド １３％ ＤＭＳＯ 容量調整用蒸留水 （３）第１、第２、第３オリゴヌクレオチドとして、表
３の説明に示す配列のオリゴヌクレオチドを用いてＲＮ
Ａ増幅反応を行なった。なお、第１、第２、第３オリゴ
ヌクレオチドの組み合わせが表３に示す組み合わせとな
るよう溶液を調製した。 （４）この反応液を４１℃で５分間保温後、以下の組成
の酵素液４．２μｌを添加した。
【００４５】酵素液の組成（各濃度は最終反応液量３０
μｌにおける濃度） １．７％ ソルビトール ３μｇ 牛血清アルブミン １４２Ｕ Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（ギブコ製） ８Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素（宝酒造（株）製） 容量調整用蒸留水 （５）引き続きＰＣＲチューブを４１℃で３０分間保温
した。反応後のＲＮＡ増幅部分を確認するため、アガロ
ースゲル（アガロース濃度４％）電気泳動を実施した。
電気泳動後の染色は市販の染色液（商品名；ＳＹＢＲ
Ｇｒｅｅｎ ＩＩ、宝酒造（株）製）により行なった。
標的ＲＮＡの特定部位にオリゴヌクレオチドが結合する
と第２と第３オリゴヌクレオチドに挟まれた部分のＲＮ
Ａが増幅され、特定バンドが観察される。
μｌにおける濃度） １．７％ ソルビトール ３μｇ 牛血清アルブミン １４２Ｕ Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（ギブコ製） ８Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素（宝酒造（株）製） 容量調整用蒸留水 （５）引き続きＰＣＲチューブを４１℃で３０分間保温
した。反応後のＲＮＡ増幅部分を確認するため、アガロ
ースゲル（アガロース濃度４％）電気泳動を実施した。
電気泳動後の染色は市販の染色液（商品名；ＳＹＢＲ
Ｇｒｅｅｎ ＩＩ、宝酒造（株）製）により行なった。
標的ＲＮＡの特定部位にオリゴヌクレオチドが結合する
と第２と第３オリゴヌクレオチドに挟まれた部分のＲＮ
Ａが増幅され、特定バンドが観察される。
【００４６】電気泳動結果の写真（白黒反転）を図３と
図４に示した。この反応で増幅される特定バンドの鎖長
は表３に示した通りである。これより表３に示したオリ
ゴヌクレオチドの組み合わせを用いたＲＮＡ増幅反応に
おいて、いずれの組み合わせにおいても特定バンドが確
認できたため、これらのオリゴヌクレオチドはＶＴ１の
検出に有効であることが示された。
図４に示した。この反応で増幅される特定バンドの鎖長
は表３に示した通りである。これより表３に示したオリ
ゴヌクレオチドの組み合わせを用いたＲＮＡ増幅反応に
おいて、いずれの組み合わせにおいても特定バンドが確
認できたため、これらのオリゴヌクレオチドはＶＴ１の
検出に有効であることが示された。
【００４７】
【表３】 表３は、本実施例で用いた第１、第２、第３のオリゴヌ
クレオチドの組み合わせ、及びその組み合わせを用いて
ＲＮＡ増幅反応させた時に増幅される特定バンドの鎖長
を示す。第１オリゴヌクレオチドの塩基配列のうち、
３’末端の水酸基はアミノ化されている。第２オリゴヌ
クレオチドの塩基配列のうち５’端１番目の「Ａ」から
２２番目の「Ａ」までの部分はＴ７プロモーター配列で
あり、それに続く２３番目の「Ｇ」から２８番目の
「Ａ」までの部分はエンハンサー配列である。
クレオチドの組み合わせ、及びその組み合わせを用いて
ＲＮＡ増幅反応させた時に増幅される特定バンドの鎖長
を示す。第１オリゴヌクレオチドの塩基配列のうち、
３’末端の水酸基はアミノ化されている。第２オリゴヌ
クレオチドの塩基配列のうち５’端１番目の「Ａ」から
２２番目の「Ａ」までの部分はＴ７プロモーター配列で
あり、それに続く２３番目の「Ｇ」から２８番目の
「Ａ」までの部分はエンハンサー配列である。
【００４８】第１オリゴヌクレオチド ５Ｓ（配列番号２７） ６Ｓ（配列番号２８） ７Ｓ（配列番号２９） ８Ｓ（配列番号３０） 第２オリゴヌクレオチド ５Ｆ（配列番号３６） ６Ｆ（配列番号３７） ７Ｆ（配列番号３８） ８Ｆ（配列番号３９） 第３オリゴヌクレオチド ６Ｒ（配列番号２） ７Ｒ（配列番号２６） ８Ｒ（配列番号３） ９Ｒ（配列番号４） 実施例４ ＶＴ２ ＲＮＡに特異的に結合するオリゴヌクレオチド
プローブを用いてＲＮＡ増幅反応を行なった。 （１）実施例２と同様のＶＴ２標準ＲＮＡをＲＮＡ希釈
液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ、０．５Ｕ／μｌ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉ
ｂｉｔｏｒ（宝酒造（株）製）、５ｍＭ ＤＴＴ）を用
い、それぞれ１０ 4コピー／２．５μｌ、１０3コピー／
２．５μｌとなるよう希釈した。コントロール試験区
（Ｎｅｇａ）には希釈液のみを用いた。 （２）以下の組成の反応液２３．３μｌを０．５ｍｌ容
のＰＣＲチューブ（商品名；Ｇｅｎｅ Ａｍｐ Ｔｈｉ
ｎ−Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｓ、パ
ーキンエルマー製）に分注し、これに上記ＲＮＡ試料
２．５μｌを添加した。
プローブを用いてＲＮＡ増幅反応を行なった。 （１）実施例２と同様のＶＴ２標準ＲＮＡをＲＮＡ希釈
液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ、０．５Ｕ／μｌ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉ
ｂｉｔｏｒ（宝酒造（株）製）、５ｍＭ ＤＴＴ）を用
い、それぞれ１０ 4コピー／２．５μｌ、１０3コピー／
２．５μｌとなるよう希釈した。コントロール試験区
（Ｎｅｇａ）には希釈液のみを用いた。 （２）以下の組成の反応液２３．３μｌを０．５ｍｌ容
のＰＣＲチューブ（商品名；Ｇｅｎｅ Ａｍｐ Ｔｈｉ
ｎ−Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｓ、パ
ーキンエルマー製）に分注し、これに上記ＲＮＡ試料
２．５μｌを添加した。
【００４９】反応液の組成（各濃度は最終反応液量３０
μｌにおける濃度） ６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６） １７ｍＭ 塩化マグネシウム ９０ｍＭ 塩化カリウム ３９Ｕ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ １ｍＭ ＤＴＴ 各０．２５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴ
ＴＰ ３．６ｍＭ ＩＴＰ 各３．０ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ ０．１６μＭの第１オリゴヌクレオチド １．０μＭの第２オリゴヌクレオチド １．０μＭの第３オリゴヌクレオチド １３％ ＤＭＳＯ 容量調整用蒸留水 （３）第１、第２、第３オリゴヌクレオチドとして、表
４の説明に示す配列のオリゴヌクレオチドを用いてＲＮ
Ａ増幅反応を行なった。なお、第１、第２、第３オリゴ
ヌクレオチドの組み合わせが表４に示す組み合わせとな
るよう溶液を調製した。 （４）この反応液を４１℃で５分間保温後、以下の組成
の酵素液４．２μｌを添加した。
μｌにおける濃度） ６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６） １７ｍＭ 塩化マグネシウム ９０ｍＭ 塩化カリウム ３９Ｕ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ １ｍＭ ＤＴＴ 各０．２５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴ
ＴＰ ３．６ｍＭ ＩＴＰ 各３．０ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ ０．１６μＭの第１オリゴヌクレオチド １．０μＭの第２オリゴヌクレオチド １．０μＭの第３オリゴヌクレオチド １３％ ＤＭＳＯ 容量調整用蒸留水 （３）第１、第２、第３オリゴヌクレオチドとして、表
４の説明に示す配列のオリゴヌクレオチドを用いてＲＮ
Ａ増幅反応を行なった。なお、第１、第２、第３オリゴ
ヌクレオチドの組み合わせが表４に示す組み合わせとな
るよう溶液を調製した。 （４）この反応液を４１℃で５分間保温後、以下の組成
の酵素液４．２μｌを添加した。
【００５０】酵素液の組成（各濃度は最終反応液量３０
μｌにおける濃度） １．７％ ソルビトール ３μｇ 牛血清アルブミン １４２Ｕ Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（ギブコ製） ８Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素（宝酒造（株）製） 容量調整用蒸留水 （５）引き続きＰＣＲチューブを４１℃で３０分間保温
した。反応後のＲＮＡ増幅部分を確認するため、アガロ
ースゲル（アガロース濃度４％）電気泳動を実施した。
電気泳動後の染色は市販の染色液（商品名；ＳＹＢＲ
Ｇｒｅｅｎ ＩＩ、宝酒造（株）製）により行なった。
標的ＲＮＡの特定部位にオリゴヌクレオチドが結合する
と第２と第３オリゴヌクレオチドに挟まれた部分のＲＮ
Ａが増幅され、特定バンドが観察される。
μｌにおける濃度） １．７％ ソルビトール ３μｇ 牛血清アルブミン １４２Ｕ Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（ギブコ製） ８Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素（宝酒造（株）製） 容量調整用蒸留水 （５）引き続きＰＣＲチューブを４１℃で３０分間保温
した。反応後のＲＮＡ増幅部分を確認するため、アガロ
ースゲル（アガロース濃度４％）電気泳動を実施した。
電気泳動後の染色は市販の染色液（商品名；ＳＹＢＲ
Ｇｒｅｅｎ ＩＩ、宝酒造（株）製）により行なった。
標的ＲＮＡの特定部位にオリゴヌクレオチドが結合する
と第２と第３オリゴヌクレオチドに挟まれた部分のＲＮ
Ａが増幅され、特定バンドが観察される。
【００５１】電気泳動結果の写真（白黒反転）を図５か
ら図７に示した。この反応で増幅される特定バンドの鎖
長は表４に示した通りである。これより表４に示したオ
リゴヌクレオチドの組み合わせを用いたＲＮＡ増幅反応
において、いずれの組み合わせにおいても特定バンドが
確認できたため、これらのオリゴヌクレオチドはＶＴ２
の検出に有効であることが示された。
ら図７に示した。この反応で増幅される特定バンドの鎖
長は表４に示した通りである。これより表４に示したオ
リゴヌクレオチドの組み合わせを用いたＲＮＡ増幅反応
において、いずれの組み合わせにおいても特定バンドが
確認できたため、これらのオリゴヌクレオチドはＶＴ２
の検出に有効であることが示された。
【００５２】
【表４】 表４は、本実施例で用いた第１、第２、第３のオリゴヌ
クレオチドの組み合わせ、及びその組み合わせを用いて
ＲＮＡ増幅反応させた時に増幅される特定バンドの鎖長
を示す。第１オリゴヌクレオチドの塩基配列のうち、
３’末端の水酸基はアミノ化されている。第２オリゴヌ
クレオチドの塩基配列のうち５’端１番目の「Ａ」から
２２番目の「Ａ」までの部分はＴ７プロモーター配列で
あり、それに続く２３番目の「Ｇ」から２８番目の
「Ａ」までの部分はエンハンサー配列である。
クレオチドの組み合わせ、及びその組み合わせを用いて
ＲＮＡ増幅反応させた時に増幅される特定バンドの鎖長
を示す。第１オリゴヌクレオチドの塩基配列のうち、
３’末端の水酸基はアミノ化されている。第２オリゴヌ
クレオチドの塩基配列のうち５’端１番目の「Ａ」から
２２番目の「Ａ」までの部分はＴ７プロモーター配列で
あり、それに続く２３番目の「Ｇ」から２８番目の
「Ａ」までの部分はエンハンサー配列である。
【００５３】第１オリゴヌクレオチド Ｂ２Ｓ（配列番号３１） Ｂ３Ｓ（配列番号３２） Ｂ４Ｓ（配列番号３３） Ｂ５Ｓ（配列番号３４） Ｂ７Ｓ（配列番号３５） 第２オリゴヌクレオチド Ｂ２Ｆ（配列番号４０） Ｂ３Ｆ（配列番号４１） Ｂ４Ｆ（配列番号４２） Ｂ５Ｆ（配列番号４３） Ｂ７Ｆ（配列番号４４） 第３オリゴヌクレオチド Ｂ４Ｒ（配列番号８） Ｂ５Ｒ（配列番号９） Ｂ７Ｒ（配列番号１０） Ｂ８Ｒ（配列番号１１） Ｂ９Ｒ（配列番号１２） 実施例５ 本願発明によるオリゴヌクレオチドの組み合わせを用い
て、標的ＶＴ２ ＲＮＡの様々な初期コピー数における
検出を行なった。 （１）実施例２と同様のＶＴ２標準ＲＮＡをＲＮＡ希釈
液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ、０．５Ｕ／μｌ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉ
ｂｉｔｏｒ（宝酒造（株）製）、５ｍＭ ＤＴＴ）を用
い、１０5コピー／２．５μｌから１０1コピー／２．５
μｌまでとなるよう希釈した。コントロール試験区（陰
性）には希釈液のみを用いた。 （２）以下の組成の反応液２３．３μｌを０．５ｍｌ容
のＰＣＲ用チューブ（商品名；Ｇｅｎｅ Ａｍｐ Ｔｈ
ｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｓ、
パーキンエルマー製）に分注し、これに上記ＲＮＡ試料
２．５μｌを添加した。
て、標的ＶＴ２ ＲＮＡの様々な初期コピー数における
検出を行なった。 （１）実施例２と同様のＶＴ２標準ＲＮＡをＲＮＡ希釈
液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ、０．５Ｕ／μｌ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉ
ｂｉｔｏｒ（宝酒造（株）製）、５ｍＭ ＤＴＴ）を用
い、１０5コピー／２．５μｌから１０1コピー／２．５
μｌまでとなるよう希釈した。コントロール試験区（陰
性）には希釈液のみを用いた。 （２）以下の組成の反応液２３．３μｌを０．５ｍｌ容
のＰＣＲ用チューブ（商品名；Ｇｅｎｅ Ａｍｐ Ｔｈ
ｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｓ、
パーキンエルマー製）に分注し、これに上記ＲＮＡ試料
２．５μｌを添加した。
【００５４】反応液の組成（各濃度は最終反応液量３０
μｌにおける濃度） ６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６） １７ｍＭ 塩化マグネシウム １５０ｍＭ 塩化カリウム ３９Ｕ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ １ｍＭ ＤＴＴ 各０．２５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴ
ＴＰ ３．６ｍＭ ＩＴＰ 各３．０ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ ０．１６μＭの第１オリゴヌクレオチド（表４の５Ｓ、
３'末端の水酸基はアミノ化されている。） １．０μＭの第２オリゴヌクレオチド（表４の５Ｆ） １．０μＭの第３オリゴヌクレオチド（表４の７Ｒ） ２５ｎＭのインターカレーター性蛍光色素で標識された
オリゴヌクレオチド（配列番号２５、５’末端から１２
番目の「Ｔ」と１３番目の「Ａ」の間のリンにインター
カレーター性蛍光色素が標識されている、また３’末端
の水酸基はグリコール基で修飾されている） １３％ ＤＭＳＯ 容量調整用蒸留水 （３）上記の反応液を４１℃で５分間保温後、以下の組
成で、かつ、あらかじめ４１℃で２分間保温した酵素液
４．２μｌを添加した。
μｌにおける濃度） ６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６） １７ｍＭ 塩化マグネシウム １５０ｍＭ 塩化カリウム ３９Ｕ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ １ｍＭ ＤＴＴ 各０．２５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴ
ＴＰ ３．６ｍＭ ＩＴＰ 各３．０ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ ０．１６μＭの第１オリゴヌクレオチド（表４の５Ｓ、
３'末端の水酸基はアミノ化されている。） １．０μＭの第２オリゴヌクレオチド（表４の５Ｆ） １．０μＭの第３オリゴヌクレオチド（表４の７Ｒ） ２５ｎＭのインターカレーター性蛍光色素で標識された
オリゴヌクレオチド（配列番号２５、５’末端から１２
番目の「Ｔ」と１３番目の「Ａ」の間のリンにインター
カレーター性蛍光色素が標識されている、また３’末端
の水酸基はグリコール基で修飾されている） １３％ ＤＭＳＯ 容量調整用蒸留水 （３）上記の反応液を４１℃で５分間保温後、以下の組
成で、かつ、あらかじめ４１℃で２分間保温した酵素液
４．２μｌを添加した。
【００５５】酵素液の組成（各濃度は最終反応液量３０
μｌにおける濃度） １．７％ ソルビトール ３μｇ 牛血清アルブミン １４２Ｕ Ｔ７ＲＮＡポリメレース（ギブコ社製） ８Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素（宝酒造（株）製） 容量調整用蒸留水 （４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温度調
節機能付き蛍光分光光度計を用い、４１℃で保温して、
励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍで、反応溶液
を経時的に測定した。
μｌにおける濃度） １．７％ ソルビトール ３μｇ 牛血清アルブミン １４２Ｕ Ｔ７ＲＮＡポリメレース（ギブコ社製） ８Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素（宝酒造（株）製） 容量調整用蒸留水 （４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温度調
節機能付き蛍光分光光度計を用い、４１℃で保温して、
励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍで、反応溶液
を経時的に測定した。
【００５６】酵素添加時の時刻を０分として、試料の蛍
光増加比（所定時刻の蛍光強度値÷バックグラウンドの
蛍光強度値）の経時変化を図８（Ａ）に示した。また、
初期ＲＮＡ量の対数値と立ち上がり時間（蛍光増加比が
陰性の平均値に標準偏差の３倍を加えた値：１．２にな
るまでの時間）との関係の結果を図８（Ｂ）に示した。
なお、初期ＲＮＡ量は１０1コピー／３０μｌから１０5
コピー／３０μｌである。
光増加比（所定時刻の蛍光強度値÷バックグラウンドの
蛍光強度値）の経時変化を図８（Ａ）に示した。また、
初期ＲＮＡ量の対数値と立ち上がり時間（蛍光増加比が
陰性の平均値に標準偏差の３倍を加えた値：１．２にな
るまでの時間）との関係の結果を図８（Ｂ）に示した。
なお、初期ＲＮＡ量は１０1コピー／３０μｌから１０5
コピー／３０μｌである。
【００５７】図８より、１０1コピーが約２０分で検出
された。標的ＲＮＡの初期濃度に依存した蛍光プロファ
イルと検量線が得られ、未知試料中に存在するＶＴ２
ＲＮＡの定量が可能であることが示された。以上より、
本法により、ＶＴ２ ＲＮＡの迅速・高感度な検出が可
能であることが示された。
された。標的ＲＮＡの初期濃度に依存した蛍光プロファ
イルと検量線が得られ、未知試料中に存在するＶＴ２
ＲＮＡの定量が可能であることが示された。以上より、
本法により、ＶＴ２ ＲＮＡの迅速・高感度な検出が可
能であることが示された。
【００５８】
【発明の効果】以上に説明したように、本願発明が提供
するオリゴヌクレオチドは、ＶＴ１ＲＮＡ又はＶＴ２
ＲＮＡの分子内構造フリー領域に相補的に結合するオリ
ゴヌクレオチドである。この結果、増幅工程を実施する
前にこれらＲＮＡの熱変性を行い、その分子内構造を壊
し、プライマーの結合効率を向上させるための操作を行
わなくとも、比較的低温かつ一定温度で該工程を行うＲ
ＮＡの検出を実施することが可能となる。したがって本
願発明のオリゴヌクレオチドを使用することにより、迅
速性及び簡便性はもとより、自動化に適したＲＮＡ検出
方法を提供することが可能となる。
するオリゴヌクレオチドは、ＶＴ１ＲＮＡ又はＶＴ２
ＲＮＡの分子内構造フリー領域に相補的に結合するオリ
ゴヌクレオチドである。この結果、増幅工程を実施する
前にこれらＲＮＡの熱変性を行い、その分子内構造を壊
し、プライマーの結合効率を向上させるための操作を行
わなくとも、比較的低温かつ一定温度で該工程を行うＲ
ＮＡの検出を実施することが可能となる。したがって本
願発明のオリゴヌクレオチドを使用することにより、迅
速性及び簡便性はもとより、自動化に適したＲＮＡ検出
方法を提供することが可能となる。
【００５９】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110>Tosoh Corporation <120>ベロ毒素検出のためのオリゴヌクレオチド及び検出法 <130>PA211-0407 <160>44 <210>1 <211>20 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>ＶＴ１ ＲＮＡに特異的に結合可能なオリゴヌクレオチド <400>1 aaaaaacatt atttgtcctg 20 <210>2 <211>20 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>ＶＴ１ ＲＮＡに特異的に結合可能なオリゴヌクレオチド <400>2 tggcgattta tctgcatccc 20 <210>3 <211>20 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>ＶＴ１ ＲＮＡに特異的に結合可能なオリゴヌクレオチド <400>3 gatgatgaca attcagtatt 20 <210>4 <211>20 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>ＶＴ１ ＲＮＡに特異的に結合可能なオリゴヌクレオチド <400>4 ttttattgtg cgtaatccca 20 <210>5 <211>20 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>ＶＴ１ ＲＮＡに特異的に結合可能なオリゴヌクレオチド <400>5 taatagttct gcgcatcaga 20 <210>6 <211>20 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>ＶＴ２ ＲＮＡに特異的に結合可能なオリゴヌクレオチド <400>6 tatacaggtg ttccttttgg 20 <210>7 <211>20 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>ＶＴ２ ＲＮＡに特異的に結合可能なオリゴヌクレオチド <400>7 tatatgttca agaggggtcg 20 <210>8 <211>20 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>ＶＴ２ ＲＮＡに特異的に結合可能なオリゴヌクレオチド <400>8 atggtcaaaa cgcgcctgat 20 <210>9 <211>20 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>ＶＴ２ ＲＮＡに特異的に結合可能なオリゴヌクレオチド <400>9 tagaaagtat ttgttgccgt 20 <210>10 <211>20 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>ＶＴ２ ＲＮＡに特異的に結合可能なオリゴヌクレオチド <400>10 gtaaggcttc tgctgtgaca 20 <210>11 <211>20 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>ＶＴ２ ＲＮＡに特異的に結合可能なオリゴヌクレオチド <400>11 cagtttcaga cagtgcctga 20 <210>12 <211>20 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>ＶＴ２ ＲＮＡに特異的に結合可能なオリゴヌクレオチド <400>12 ttgctgattc gcccccagtt 20 <210>13 <211>20 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>ＶＴ２ ＲＮＡに特異的に結合可能なオリゴヌクレオチド <400>13 attattaaag gatattctcc 20 <210>14 <211>20 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>ＶＴ２ ＲＮＡに特異的に結合可能なオリゴヌクレオチド <400>14 attgtttatt tttataacag 20 <210>15 <211>25 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>ＶＴ１ ＲＮＡ増幅用オリゴヌクレオチド <400>15 tttttatcgc tttgctgatt tttca 25 <210>16 <211>25 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>ＶＴ１ ＲＮＡ増幅用オリゴヌクレオチド <400>16 cgccattcgt tgactacttc ttatc 25 <210>17 <211>25 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>ＶＴ１ ＲＮＡ増幅用オリゴヌクレオチド <400>17 tgatctcagt gggcgttctt atgta 25 <210>118 <211>25 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>ＶＴ１ ＲＮＡ増幅用オリゴヌクレオチド <400>18 tcatcatgca tcgcgagttg ccaga 25 <210>19 <211>25 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>ＶＴ２ ＲＮＡ増幅用オリゴヌクレオチド <400>19 gtatatgaag tgtatattat ttaaa 25 <210>20 <211>25 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>ＶＴ２ ＲＮＡ増幅用オリゴヌクレオチド <400>20 atatatctca ggggaccaca tcggt 25 <210>21 <211>25 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>ＶＴ２ ＲＮＡ増幅用オリゴヌクレオチド <400>21 accatcttcg tctgattatt gagca 25 <210>22 <211>25 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>ＶＴ２ ＲＮＡ増幅用オリゴヌクレオチド <400>22 ttctaccgtt tttcagattt tacac 25 <210>23 <211>25 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>ＶＴ２ ＲＮＡ増幅用オリゴヌクレオチド <400>23 cttacgcttc aggcagatac agaga 25 <210>24 <211>20 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>ＶＴ１ ＲＮＡ検出用オリゴヌクレオチド <400>24 tgtaacgtgg tatagctact 20 <210>25 <211>20 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>ＶＴ２ ＲＮＡ検出用オリゴヌクレオチド <400>25 ttaacgccag atatgatgaa 20 <210>26 <211>20 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>第３オリゴヌクレオチド <400>26 gatcatccag tgttgtacga 20 <210>27 <211>39 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>第１オリゴヌクレオチド <400>27 aaaaaacatt atttgtcctg ttaacaaatc ctgtcacat 39 <210>28 <211>39 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>第１オリゴヌクレオチド <400>28 tggcgattta tctgcatccc cgtacgactg atccctgca 39 <210>29 <211>39 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>第１オリゴヌクレオチド <400>29 gatcatccag tgttgtacga aatcccctct gtatttgcc 39 <210>30 <211>39 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>第１オリゴヌクレオチド <400>30 gatgatgaca attcagtatt aatgccacgc ttcccagaa 39 <210>31 <211>39 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>第１オリゴヌクレオチド <400>31 tatacaggtg ttccttttgg ctgaagtaat cagcaccag 39 <210>32 <211>39 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>第１オリゴヌクレオチド <400>32 tatatgttca agaggggtcg atatctctgt ccgtatact 39 <210>33 <211>39 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>第１オリゴヌクレオチド <400>33 atggtcaaaa cgcgcctgat agacatcaag ccctcgtat 39 <210>34 <211>39 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>第１オリゴヌクレオチド <400>34 tagaaagtat ttgttgccgt attaacgaac ccggccaca 39 <210>35 <211>39 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>第１オリゴヌクレオチド <400>35 gtaaggcttc tgctgtgaca gtgacaaaac gcagaactg 39 <210>36 <211>53 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>第１オリゴヌクレオチド <400>36 aattctaata cgactcacta tagggagatt tttatcgctt tgctgatttt tca 53 <210>37 <211>53 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>第１オリゴヌクレオチド <400>37 aattctaata cgactcacta tagggagacg ccattcgttg actacttctt atc 53 <210>38 <211>53 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>第１オリゴヌクレオチド <400>38 aattctaata cgactcacta tagggagatg atctcagtgg gcgttcttat gta 53 <210>39 <211>53 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>第１オリゴヌクレオチド <400>39 aattctaata cgactcacta tagggagatc atcatgcatc gcgagttgcc aga 53 <210>40 <211>53 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>第２オリゴヌクレオチド <400>40 aattctaata cgactcacta tagggagagt atatgaagtg tatattattt aaa 53 <210>41 <211>53 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>第２オリゴヌクレオチド <400>41 aattctaata cgactcacta tagggagaat atatctcagg ggaccacatc ggt 53 <210>42 <211>53 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>第２オリゴヌクレオチド <400>42 aattctaata cgactcacta tagggagaac catcttcgtc tgattattga gca 53 <210>43 <211>53 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>第２オリゴヌクレオチド <400>43 aattctaata cgactcacta tagggagatt ctaccgtttt tcagatttta cac 53 <210>44 <211>53 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>第２オリゴヌクレオチド <400>44 aattctaata cgactcacta tagggagact tacgcttcag gcagatacag aga 53
【図１】実施例１で行なったオリゴ−１からオリゴ−６
とＡＭＶ逆転写酵素を用いて、４１℃でのＶＴ１ ＲＮ
Ａ標準品の切断実験を行った後のサンプルの尿素変性６
％ＰＡＧＥの電気泳動写真である（白黒反転）。なお、
図中名称表示の無い他のレーンについては、本実施例と
無関係である。
とＡＭＶ逆転写酵素を用いて、４１℃でのＶＴ１ ＲＮ
Ａ標準品の切断実験を行った後のサンプルの尿素変性６
％ＰＡＧＥの電気泳動写真である（白黒反転）。なお、
図中名称表示の無い他のレーンについては、本実施例と
無関係である。
【図２】実施例２で行なったオリゴ−７からオリゴ−１
５とＡＭＶ逆転写酵素を用いて、４１℃でのＶＴ２ Ｒ
ＮＡ標準品の切断実験を行った後のサンプルの尿素変性
６％ＰＡＧＥの電気泳動写真である（白黒反転）。な
お、図中名称表示の無い他のレーンについては、本実施
例と無関係である。
５とＡＭＶ逆転写酵素を用いて、４１℃でのＶＴ２ Ｒ
ＮＡ標準品の切断実験を行った後のサンプルの尿素変性
６％ＰＡＧＥの電気泳動写真である（白黒反転）。な
お、図中名称表示の無い他のレーンについては、本実施
例と無関係である。
【図３】実施例１で行なったＶＴ１ ＲＮＡ標準品の初
期ＲＮＡ量１０4コピー／３０μｌ及び１０3コピー／３
０μｌにおいて、表３の組み合わせ（ａ）から（ｃ）の
オリゴヌクレオチドプローブを用いてＲＮＡ増幅反応さ
せた時の４％アガロースゲル電気泳動写真。レーン１が
組み合わせ（ａ）、初期ＲＮＡ量１０4コピー／３０μ
ｌ、レーン２・３が組み合わせ（ａ）、初期ＲＮＡ量１
０3コピー／３０μｌ、レーン４が組み合わせ（ａ）、
コントロール（ＲＮＡ試料の代わりに希釈液のみを用い
たもの）、レーン５が組み合わせ（ｂ）、初期ＲＮＡ量
１０4コピー／３０μｌ、レーン６・７が組み合わせ
（ｂ）、初期ＲＮＡ量１０3コピー／３０μｌ、レーン
８が組み合わせ（ｂ）、コントロール（ＲＮＡ試料の代
わりに希釈液のみを用いたもの）、レーン９が組み合わ
せ（ｃ）、初期ＲＮＡ量１０ 4コピー／３０μｌ、レー
ン１０・１１が組み合わせ（ｃ）、初期ＲＮＡ量１０3
コピー／３０μｌ、レーン１２が組み合わせ（ｃ）、コ
ントロール（ＲＮＡ試料の代わりに希釈液のみを用いた
もの）のそれぞれの結果である。いずれの組み合わせを
用いても特定バンドが確認できた。
期ＲＮＡ量１０4コピー／３０μｌ及び１０3コピー／３
０μｌにおいて、表３の組み合わせ（ａ）から（ｃ）の
オリゴヌクレオチドプローブを用いてＲＮＡ増幅反応さ
せた時の４％アガロースゲル電気泳動写真。レーン１が
組み合わせ（ａ）、初期ＲＮＡ量１０4コピー／３０μ
ｌ、レーン２・３が組み合わせ（ａ）、初期ＲＮＡ量１
０3コピー／３０μｌ、レーン４が組み合わせ（ａ）、
コントロール（ＲＮＡ試料の代わりに希釈液のみを用い
たもの）、レーン５が組み合わせ（ｂ）、初期ＲＮＡ量
１０4コピー／３０μｌ、レーン６・７が組み合わせ
（ｂ）、初期ＲＮＡ量１０3コピー／３０μｌ、レーン
８が組み合わせ（ｂ）、コントロール（ＲＮＡ試料の代
わりに希釈液のみを用いたもの）、レーン９が組み合わ
せ（ｃ）、初期ＲＮＡ量１０ 4コピー／３０μｌ、レー
ン１０・１１が組み合わせ（ｃ）、初期ＲＮＡ量１０3
コピー／３０μｌ、レーン１２が組み合わせ（ｃ）、コ
ントロール（ＲＮＡ試料の代わりに希釈液のみを用いた
もの）のそれぞれの結果である。いずれの組み合わせを
用いても特定バンドが確認できた。
【図４】実施例１で行なったＶＴ１ ＲＮＡ標準品の初
期ＲＮＡ量１０4コピー／３０μｌ及び１０3コピー／３
０μｌにおいて、表３の組み合わせ（ｄ）から（ｆ）の
オリゴヌクレオチドプローブを用いてＲＮＡ増幅反応さ
せた時の４％アガロースゲル電気泳動写真。レーン１が
組み合わせ（ｄ）、初期ＲＮＡ量１０4コピー／３０μ
ｌ、レーン２・３が組み合わせ（ｄ）、初期ＲＮＡ量１
０3コピー／３０μｌ、レーン４が組み合わせ（ｄ）、
コントロール（ＲＮＡ試料の代わりに希釈液のみを用い
たもの）、レーン５が組み合わせ（ｅ）、初期ＲＮＡ量
１０4コピー／３０μｌ、レーン６・７が組み合わせ
（ｅ）、初期ＲＮＡ量１０3コピー／３０μｌ、レーン
８が組み合わせ（ｅ）、コントロール（ＲＮＡ試料の代
わりに希釈液のみを用いたもの）、レーン９が組み合わ
せ（ｆ）、初期ＲＮＡ量１０ 4コピー／３０μｌ、レー
ン１０・１１が組み合わせ（ｆ）、初期ＲＮＡ量１０3
コピー／３０μｌ、レーン１２が組み合わせ（ｆ）、コ
ントロール（ＲＮＡ試料の代わりに希釈液のみを用いた
もの）のそれぞれの結果である。いずれの組み合わせを
用いても特定バンドが確認できた。
期ＲＮＡ量１０4コピー／３０μｌ及び１０3コピー／３
０μｌにおいて、表３の組み合わせ（ｄ）から（ｆ）の
オリゴヌクレオチドプローブを用いてＲＮＡ増幅反応さ
せた時の４％アガロースゲル電気泳動写真。レーン１が
組み合わせ（ｄ）、初期ＲＮＡ量１０4コピー／３０μ
ｌ、レーン２・３が組み合わせ（ｄ）、初期ＲＮＡ量１
０3コピー／３０μｌ、レーン４が組み合わせ（ｄ）、
コントロール（ＲＮＡ試料の代わりに希釈液のみを用い
たもの）、レーン５が組み合わせ（ｅ）、初期ＲＮＡ量
１０4コピー／３０μｌ、レーン６・７が組み合わせ
（ｅ）、初期ＲＮＡ量１０3コピー／３０μｌ、レーン
８が組み合わせ（ｅ）、コントロール（ＲＮＡ試料の代
わりに希釈液のみを用いたもの）、レーン９が組み合わ
せ（ｆ）、初期ＲＮＡ量１０ 4コピー／３０μｌ、レー
ン１０・１１が組み合わせ（ｆ）、初期ＲＮＡ量１０3
コピー／３０μｌ、レーン１２が組み合わせ（ｆ）、コ
ントロール（ＲＮＡ試料の代わりに希釈液のみを用いた
もの）のそれぞれの結果である。いずれの組み合わせを
用いても特定バンドが確認できた。
【図５】実施例２で行なったＶＴ２ ＲＮＡ標準品の初
期ＲＮＡ量１０4コピー／３０μｌ及び１０3コピー／３
０μｌにおいて、表４の組み合わせ（ｇ）から（ｉ）の
オリゴヌクレオチドプローブを用いてＲＮＡ増幅反応さ
せた時の４％アガロースゲル電気泳動写真。レーン１が
組み合わせ（ｇ）、初期ＲＮＡ量１０4コピー／３０μ
ｌ、レーン２・３が組み合わせ（ｇ）、初期ＲＮＡ量１
０3コピー／３０μｌ、レーン４が組み合わせ（ｇ）、
コントロール（ＲＮＡ試料の代わりに希釈液のみを用い
たもの）、レーン５が組み合わせ（ｈ）、初期ＲＮＡ量
１０4コピー／３０μｌ、レーン６・７が組み合わせ
（ｈ）、初期ＲＮＡ量１０3コピー／３０μｌ、レーン
８が組み合わせ（ｈ）、コントロール（ＲＮＡ試料の代
わりに希釈液のみを用いたもの）、レーン９が組み合わ
せ（ｉ）、初期ＲＮＡ量１０ 4コピー／３０μｌ、レー
ン１０・１１が組み合わせ（ｉ）、初期ＲＮＡ量１０3
コピー／３０μｌ、レーン１２が組み合わせ（ｉ）、コ
ントロール（ＲＮＡ試料の代わりに希釈液のみを用いた
もの）のそれぞれの結果である。いずれの組み合わせを
用いても特定バンドが確認できた。
期ＲＮＡ量１０4コピー／３０μｌ及び１０3コピー／３
０μｌにおいて、表４の組み合わせ（ｇ）から（ｉ）の
オリゴヌクレオチドプローブを用いてＲＮＡ増幅反応さ
せた時の４％アガロースゲル電気泳動写真。レーン１が
組み合わせ（ｇ）、初期ＲＮＡ量１０4コピー／３０μ
ｌ、レーン２・３が組み合わせ（ｇ）、初期ＲＮＡ量１
０3コピー／３０μｌ、レーン４が組み合わせ（ｇ）、
コントロール（ＲＮＡ試料の代わりに希釈液のみを用い
たもの）、レーン５が組み合わせ（ｈ）、初期ＲＮＡ量
１０4コピー／３０μｌ、レーン６・７が組み合わせ
（ｈ）、初期ＲＮＡ量１０3コピー／３０μｌ、レーン
８が組み合わせ（ｈ）、コントロール（ＲＮＡ試料の代
わりに希釈液のみを用いたもの）、レーン９が組み合わ
せ（ｉ）、初期ＲＮＡ量１０ 4コピー／３０μｌ、レー
ン１０・１１が組み合わせ（ｉ）、初期ＲＮＡ量１０3
コピー／３０μｌ、レーン１２が組み合わせ（ｉ）、コ
ントロール（ＲＮＡ試料の代わりに希釈液のみを用いた
もの）のそれぞれの結果である。いずれの組み合わせを
用いても特定バンドが確認できた。
【図６】実施例２で行なったＶＴ２ ＲＮＡ標準品の初
期ＲＮＡ量１０4コピー／３０μｌ及び１０3コピー／３
０μｌにおいて、表４の組み合わせ（ｊ）から（ｌ）の
オリゴヌクレオチドプローブを用いてＲＮＡ増幅反応さ
せた時の４％アガロースゲル電気泳動写真。レーン１が
組み合わせ（ｊ）、初期ＲＮＡ量１０4コピー／３０μ
ｌ、レーン２・３が組み合わせ（ｊ）、初期ＲＮＡ量１
０3コピー／３０μｌ、レーン４が組み合わせ（ｊ）、
コントロール（ＲＮＡ試料の代わりに希釈液のみを用い
たもの）、レーン５が組み合わせ（ｋ）、初期ＲＮＡ量
１０4コピー／３０μｌ、レーン６・７が組み合わせ
（ｋ）、初期ＲＮＡ量１０3コピー／３０μｌ、レーン
８が組み合わせ（ｋ）、コントロール（ＲＮＡ試料の代
わりに希釈液のみを用いたもの）、レーン９が組み合わ
せ（ｌ）、初期ＲＮＡ量１０ 4コピー／３０μｌ、レー
ン１０・１１が組み合わせ（ｌ）、初期ＲＮＡ量１０3
コピー／３０μｌ、レーン１２が組み合わせ（ｌ）、コ
ントロール（ＲＮＡ試料の代わりに希釈液のみを用いた
もの）のそれぞれの結果である。いずれの組み合わせを
用いても特定バンドが確認できた。
期ＲＮＡ量１０4コピー／３０μｌ及び１０3コピー／３
０μｌにおいて、表４の組み合わせ（ｊ）から（ｌ）の
オリゴヌクレオチドプローブを用いてＲＮＡ増幅反応さ
せた時の４％アガロースゲル電気泳動写真。レーン１が
組み合わせ（ｊ）、初期ＲＮＡ量１０4コピー／３０μ
ｌ、レーン２・３が組み合わせ（ｊ）、初期ＲＮＡ量１
０3コピー／３０μｌ、レーン４が組み合わせ（ｊ）、
コントロール（ＲＮＡ試料の代わりに希釈液のみを用い
たもの）、レーン５が組み合わせ（ｋ）、初期ＲＮＡ量
１０4コピー／３０μｌ、レーン６・７が組み合わせ
（ｋ）、初期ＲＮＡ量１０3コピー／３０μｌ、レーン
８が組み合わせ（ｋ）、コントロール（ＲＮＡ試料の代
わりに希釈液のみを用いたもの）、レーン９が組み合わ
せ（ｌ）、初期ＲＮＡ量１０ 4コピー／３０μｌ、レー
ン１０・１１が組み合わせ（ｌ）、初期ＲＮＡ量１０3
コピー／３０μｌ、レーン１２が組み合わせ（ｌ）、コ
ントロール（ＲＮＡ試料の代わりに希釈液のみを用いた
もの）のそれぞれの結果である。いずれの組み合わせを
用いても特定バンドが確認できた。
【図７】実施例２で行なったＶＴ２ ＲＮＡ標準品の初
期ＲＮＡ量１０4コピー／３０μｌ及び１０3コピー／３
０μｌにおいて、表４の組み合わせ（ｍ）のオリゴヌク
レオチドプローブを用いてＲＮＡ増幅反応させた時の４
％アガロースゲル電気泳動写真。レーン１が初期ＲＮＡ
量１０4コピー／３０μｌ、レーン２・３が初期ＲＮＡ
量１０3コピー／３０μｌ、レーン４がコントロール
（ＲＮＡ試料の代わりに希釈液のみを用いたもの）のそ
れぞれの結果である。いずれの組み合わせを用いても特
定バンドが確認できた。
期ＲＮＡ量１０4コピー／３０μｌ及び１０3コピー／３
０μｌにおいて、表４の組み合わせ（ｍ）のオリゴヌク
レオチドプローブを用いてＲＮＡ増幅反応させた時の４
％アガロースゲル電気泳動写真。レーン１が初期ＲＮＡ
量１０4コピー／３０μｌ、レーン２・３が初期ＲＮＡ
量１０3コピー／３０μｌ、レーン４がコントロール
（ＲＮＡ試料の代わりに希釈液のみを用いたもの）のそ
れぞれの結果である。いずれの組み合わせを用いても特
定バンドが確認できた。
【図８】図８は実施例４で行なったＶＴ２ ＲＮＡ標準
品の初期ＲＮＡ量１０1コピー／３０μｌから１０5コピ
ー／３０μｌにおいて、反応時間とＲＮＡの生成ととも
に増大する蛍光強度比のグラフ（左）及び初期ＲＮＡ量
の対数値と検出時間（蛍光強度比が１．２となる時刻）
との間で得られた検量線（右）である。図中、四角は１
０5コピー、丸は１０4コピー、三角は１０3コピー、ひ
し形は１０2コピー、プラスは１０コピー、そしてバツ
はコントロールについての結果である。初期コピー数１
０1コピー／３０μｌのＲＮＡが反応約２０分で検出で
き、初期ＲＮＡ量と検出時間との間に相関関係のあるこ
とが示された。
品の初期ＲＮＡ量１０1コピー／３０μｌから１０5コピ
ー／３０μｌにおいて、反応時間とＲＮＡの生成ととも
に増大する蛍光強度比のグラフ（左）及び初期ＲＮＡ量
の対数値と検出時間（蛍光強度比が１．２となる時刻）
との間で得られた検量線（右）である。図中、四角は１
０5コピー、丸は１０4コピー、三角は１０3コピー、ひ
し形は１０2コピー、プラスは１０コピー、そしてバツ
はコントロールについての結果である。初期コピー数１
０1コピー／３０μｌのＲＮＡが反応約２０分で検出で
き、初期ＲＮＡ量と検出時間との間に相関関係のあるこ
とが示された。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA80 CA04 CA09 CA11 HA12 4B063 QA01 QA19 QQ01 QQ52 QR08 QR32 QR42 QR56 QR62 QR66 QS16 QS25 QS36 QX02
Claims (8)
- 【請求項１】ベロ毒素１型（Ｖｅｒｏ ｔｏｘｉｎ
１、以下ＶＴ１と略称する）の遺伝子要素であるＶＴ１
遺伝子又は該遺伝子に由来するＲＮＡ（以下ＶＴ１ Ｒ
ＮＡと略称する）を、検出又は増幅するためのオリゴヌ
クレオチドであって、ＶＴ１ ＲＮＡに特異的に結合可
能である、配列番号１から５に示したいずれかの配列中
の少なくとも連続した１０塩基以上を含む配列を特徴と
するオリゴヌクレオチド。 - 【請求項２】ベロ毒素２型（Ｖｅｒｏ ｔｏｘｉｎ
２、以下ＶＴ２と略称する）の遺伝子要素であるＶＴ２
遺伝子又は該遺伝子に由来するＲＮＡ（以下ＶＴ２ Ｒ
ＮＡと略称する）を、検出又は増幅するためのオリゴヌ
クレオチドであって、ＶＴ２ ＲＮＡに特異的に結合可
能である、配列番号６から１４に示したいずれかの配列
中の少なくとも連続した１０塩基以上を含む配列を特徴
とするオリゴヌクレオチド。 - 【請求項３】試料中に存在するＶＴ１ ＲＮＡの特定配
列を鋳型として、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースによ
りｃＤＮＡを合成し、リボヌクレエースＨによってＲＮ
Ａ・ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡを分解して１本鎖ＤＮ
Ａを生成し、該１本鎖ＤＮＡを鋳型としてＤＮＡ依存性
ＤＮＡポリメレースにより、前記特定配列又は前記特定
配列に相補的な配列からなるＲＮＡを転写可能なプロモ
ーター配列を有する２本鎖ＤＮＡを生成し、そして該２
本鎖ＤＮＡがＲＮＡポリメレース存在下でＲＮＡ転写産
物を生成し、該ＲＮＡ転写産物が引き続き前記ＲＮＡ依
存性ＤＮＡポリメレースによるｃＤＮＡ合成の鋳型とな
るようなＲＮＡ増幅工程において、ＶＴ１ ＲＮＡ配列
に特異的に結合可能である配列番号１から５に示したい
ずれかの配列中の少なくとも連続した１０塩基以上から
なる第一のオリゴヌクレオチドと、配列番号１５から１
８に示したいずれかの配列中の少なくとも連続した１０
塩基以上からなる第二のオリゴヌクレオチド（ここで第
一又は第二のオリゴヌクレオチドのいずれか一方は、そ
の５’側にＲＮＡポリメレースのプロモーター配列を含
む）を用いることを特徴とするＶＴ１ ＲＮＡの検出方
法。 - 【請求項４】試料中に存在するＶＴ２ ＲＮＡの特定配
列を鋳型として、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースによ
りｃＤＮＡを合成し、リボヌクレエースＨによってＲＮ
Ａ・ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡを分解して１本鎖ＤＮ
Ａを生成し、該１本鎖ＤＮＡを鋳型としてＤＮＡ依存性
ＤＮＡポリメレースにより、前記特定配列又は前記特定
配列に相補的な配列からなるＲＮＡを転写可能なプロモ
ーター配列を有する２本鎖ＤＮＡを生成し、そして該２
本鎖ＤＮＡがＲＮＡポリメレース存在下でＲＮＡ転写産
物を生成し、該ＲＮＡ転写産物が引き続き前記ＲＮＡ依
存性ＤＮＡポリメレースによるｃＤＮＡ合成の鋳型とな
るようなＲＮＡ増幅工程において、ＶＴ２ ＲＮＡ配列
に特異的に結合可能である配列番号６から１４に示した
いずれかの配列中の少なくとも連続した１０塩基以上か
らなる第一のオリゴヌクレオチドと、配列番号１９から
２３に示したいずれかの配列中の少なくとも連続した１
０塩基以上からなる第二のオリゴヌクレオチド（ここで
第一又は第二のオリゴヌクレオチドのいずれか一方は、
その５’側にＲＮＡポリメレースのプロモーター配列を
含む）を用いることを特徴とするＶＴ２ ＲＮＡの検出
方法。 - 【請求項５】前記増幅を、増幅により生じるＲＮＡ転写
産物と特異的に結合可能であり、かつ、インターカレー
ター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプロー
ブ存在下で実施し、反応液の蛍光特性の変化を測定する
操作を実施することからなる、請求項３又は請求項４に
記載の検出方法（ただし該標識されたオリゴヌクレオチ
ドは、前記第一のオリゴヌクレオチド及び第二のオリゴ
ヌクレオチドとは異なる配列である）。 - 【請求項６】前記オリゴヌクレオチドプローブは、ＲＮ
Ａ転写産物の少なくとも一部の配列と相補結合するよう
に設計され、複合体を形成していない場合と比較して蛍
光特性が変化するものであることを特徴とする請求項５
に記載の検出方法。 - 【請求項７】前記オリゴヌクレオチドプローブは、配列
番号２４に示した配列中の少なくとも連続した１０塩基
以上からなる配列又はその相補配列である、請求項５に
記載のＶＴ１ ＲＮＡの検出方法。 - 【請求項８】前記オリゴヌクレオチドプローブは、配列
番号２５に示した配列中の少なくとも連続した１０塩基
以上からなる配列又はその相補配列である、請求項５に
記載のＶＴ２ ＲＮＡの検出方法。
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