JP2000014400A - 標的核酸の定量方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】概ね一定の温度で試料中の特定塩基配列を含む
１本鎖ＲＮＡを分析するための簡便で精度の高い方法で
あって、反応液の急激な昇温・降温操作を繰り返す操作
や増幅されたＲＮＡの測定に際して担体を使用する必要
がなく、密閉した容器中で全操作を完了し得る方法を提
供すること。 【解決手段】少なくとも第１の１本鎖オリゴ核酸、第２
の１本鎖オリゴＤＮＡ、各種ポリメレースとその基質、
第３の１本鎖オリゴＤＮＡ及び特定塩基配列に相補的な
配列を有し、該配列を有する核酸と結合した場合に測定
可能な蛍光信号を発するように標識された第４の１本鎖
オリゴＤＮＡを用い、蛍光信号を１度以上測定する操作
を含む、試料中の標的核酸の分析方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、試料中の特定塩基
配列を含む１本鎖ＲＮＡを分析するための方法に関する
ものであり、ウイルスのＲＮＡや細菌のｍＲＮＡの定性
・定量を可能とし、感染症の診断やその治療を目的とし
た薬剤の効果の判定に有効な方法である。また本発明
は、特定の核酸塩基配列からなるＤＮＡやＲＮＡを大量
に製造する方法に関するものであり、有用遺伝子のクロ
ーニングや未知遺伝子の探索等に有効な方法である。更
に本発明は、これら方法に用いる試薬セット等に関する
ものである。

【０００２】

【従来の技術】生体成分の分析には高い特異性と感度が
求められる。特定塩基配列を含む核酸（標的核酸）の分
析では、該核酸が特定塩基配列に相補的な配列を有する
核酸（核酸プローブ）と配列特異的に複合体を形成する
性質が利用される。

【０００３】標的核酸の定量には、形成された複合体の
量に関連した測定可能な信号を得る手段が重要である
が、一般的に臨床診断等の目的においては、試料中に存
在し得る標的核酸量は極微量であることから、該手段は
高感度なものでなければならない。

【０００４】従来より、試料中の標的核酸を定量する方
法として、膜、ビーズ、ゲル等の固相の表面上に測定可
能な信号を発するように標識した核酸プローブと標的核
酸との複合体を形成する工程を含むサンドイッチアッセ
イと呼ばれる方法が用いられてきた。具体的には、それ
ぞれ標的核酸中の異なる特定塩基配列に配列特異的な２
種類の核酸プローブを用い、その第１の核酸プローブ
は、測定可能な信号を発するよう、例えば可視部に色を
持つ色素、蛍光物質又はこれらを生成し得る酵素等で標
識し、第２のプローブは固相表面に固定し、試料にこれ
らの核酸プローブを添加し、試料中の標的核酸を第１及
び第２の核酸プローブと相補結合させて固相表面に複合
体を形成させ、引き続き反応液中の上清と固相とを分離
して上記複合体形成に関与していない未反応の第１プロ
ーブを分離し（Ｂ／Ｆ分離工程）、しかる後に固相表面
上の標識物質を測定して標的核酸量を決定する。ここ
で、標識物として可視部に色を持つ色素や蛍光物質を生
成し得る酵素を用いた場合は、上記Ｂ／Ｆ分離工程後、
それらの前駆体である酵素基質を反応液に添加し、その
反応産物である色素や蛍光物質を測定することになる。

【０００５】特にウイルス感染症の診断では、臨床試料
中の標的核酸（ウイルス核酸）は極微量であることが多
いため、高感度かつ良好な再現性の測定を実現するため
に信号強度を向上し高感度化する目的から、酵素基質と
して化学発光物質を用いたり、ポリメレースチェインリ
アクション（ＰＣＲ）法等によって標的核酸を予め増幅
しておき、これを試料としてサンドイッチアッセイ法に
適用する方策が試みられている。

【０００６】他のＰＣＲを用いた標的核酸の分析法とし
て、競合ＰＣＲ法が知られている。この方法は、既知濃
度の標的核酸に類似した配列を有する核酸（コンペティ
ター）を試料に添加してＰＣＲを実施し、コンペティタ
ーにより競合的に阻害された標的核酸の増幅程度から試
料中の標的核酸濃度を推定するものである。より具体的
には、末端にプライマーと相補的な配列有し、しかも電
気泳動等の分離手段によって標的核酸の増幅産物とは識
別可能な（例えば鎖長が異なる等）核酸を用意し、これ
を各種濃度となるように試料に混合し、それらについて
同時にＰＣＲを実施するのである。

【０００７】ＰＣＲを用いた標的核酸の定量方法とし
て、他に担体を用いない均一系での分析法も提案されて
いる。例えば本出願人は、インターカレーター性蛍光色
素の存在下でＰＣＲを行い、反応液の蛍光を各ＰＣＲサ
イクルごとに測定してその変化から標的核酸の初期量を
決定する分析法が知られている（特開平５−２３７００
０号公報；医学のあゆみ、１７３（１２）、９５９−９
６３（１９９５年）；Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ、２２９、２０７−２１３（１９９５
年）参照）。この分析法では、ＰＣＲによる増幅産物が
二本鎖ＤＮＡであることから、二本鎖核酸にインターカ
レーションして蛍光強度が増大する等、その蛍光特性が
変化する性質を有するインターカレーター性蛍光色素を
用い、これをＰＣＲによる増幅操作前に予め試料溶液に
添加し、反応溶液の蛍光強度を経時的に測定してその立
ち上がりサイクル等から標的核酸の初期量を決定するの
である。更にこの方法には、密閉した反応容器内部の反
応液の蛍光強度の測定から標的核酸の増幅の様子を観察
することが可能で、試料容器内部から反応液を採取して
分析する必要がないため、増幅産物の飛散に由来する擬
陽性の惹起という課題を回避できるという効果もある。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】前記サンドイッチ法で
は、比較的高感度といわれる酵素化学発光法において、
発光物質を大量に生産するよう多数の酵素分子を第１プ
ローブに標識したとしても、現状では１０５コピー程度
の標的核酸が定量及び検出の限界である。これは、反応
液中で第１のプローブがこの不溶性担体に非特異的に吸
着して大きな背景信号（バックグラウンド）を発生し、
その結果、固相表面上に形成された複合体の測定結果に
誤差を与えることとなるからである。

【０００９】第１プローブの不溶性担体への非特異的吸
着を回避する目的で、担体表面を親水化処理、蛋白質等
による担体表面の吸着点ブロッキング、そしてＢ／Ｆ分
離工程に続いて不溶性担体を十分洗浄したり、洗浄効果
を向上するために界面活性剤を含む洗浄液をすること等
が試みられている。

【００１０】しかし、担体表面の化学的な親水化処理等
は全ての担体で可能なわけでなく、担体の材質によって
は処理できないうえ、技術的に必ずしも容易ではない。
また担体表面の吸着点をブロッキングする目的で該表面
を蛋白質で被覆しても、被覆蛋白質が第１プローブの核
酸部分又は標識と相互作用し、担体への新たな非特異的
吸着を招く可能性がある。Ｂ／Ｆ分離工程において担体
の洗浄回数を増やすことには操作上の限界があり、洗浄
液に界面活性剤を添加する等した場合は担体上に形成さ
れた複合体の分解を促す可能性もある。

【００１１】競合ＰＣＲ法では、１検体を分析するた
め、想定核酸濃度を含む各種濃度のコンペティターを調
製し、これを添加した試料についてＰＣＲを実施する必
要がある。しかもＰＣＲの終了後には、試料を反応容器
から取り出して電気泳動等の分離操作を行わなければな
らない。このため自動化が困難であり、多数の検体を迅
速に処理する必要性の高い臨床検査に適用するには不適
当である。また、試料を反応容器から取り出さなければ
ならないことから、ＰＣＲ法の実際的な応用における課
題とされている増幅産物の飛散に由来する擬陽性の惹起
という課題を解決し得ない。

【００１２】インターカレーター性蛍光色素の存在下で
ＰＣＲを実施する方法では、インターカレーター性蛍光
色素が二本鎖核酸にインターカレーションすることを原
理としているため、試料中に特定核酸以外の２本鎖ＤＮ
Ａ、例えば大量のゲノムＤＮＡ等、が混在する場合、イ
ンターカレーター性蛍光色素がこれらにもインターカレ
ーションして大きなバックグラウンドを生じてしまうと
いう課題がある。また、ＰＣＲ法では特定核酸配列に相
補的な一対のオリゴＤＮＡを伸長反応用プラマーとして
用いるが、このプライマーの配列によってはこれらが互
いに相補結合し、この結果、互いに他方のプライマーを
鋳型としてプライマーダイマーが生産されることがあ
る。インターカレーター性蛍光色素は２本鎖核酸に非特
異的にインターカレーションするため、このようなプラ
イマーダイマーの生産に由来してバックグラウンドが増
加するという課題もある。

【００１３】また特に臨床診断の分野では、大量の検体
について迅速かつ再現性の良い分析を実現するため、今
後ますます自動化の要求が高まると考えられる。ところ
がＰＣＲでは、反応液の急激な昇温・降温操作を繰り返
す必要があり、しかも該操作の正確さと再現性が結果に
影響を及ぼすことがあるため、厳重に温度を管理しつ
つ、かかる昇温・降温操作を行わなければならないが、
このような仕様を満足するインキュベーション機能を具
備し、なおかつ十分な処理能力を有する全自動機を提供
することは容易ではない。

【００１４】また、ウイルス核酸はＲＮＡである場合が
多いが、その場合はＲＮＡを鋳型として逆転写酵素の作
用によって一旦ｃＤＮＡを合成してからＰＣＲを行うこ
ととなり、実質的に２段階の工程を行わなければならな
い。

【００１５】一定温度で標的核酸を増幅する方法とし
て、いわゆるＮＡＳＢＡ法が知られている。ＮＡＳＢＡ
法は昇温・降温という操作を必要としない点で自動化が
容易と考えられるものの、増幅されたＲＮＡを分析する
ために上記サンドイッチ法や電気泳動による分離が必要
であるため、これら操作に起因する課題を解決するもの
ではない。

【００１６】そこで本発明の目的は、概ね一定の温度で
試料中の特定塩基配列を含む１本鎖ＲＮＡを分析するた
めの簡便で精度の高い方法であって、ＰＣＲのように反
応液の急激な昇温・降温操作を繰り返す操作や増幅され
たＲＮＡの測定に際して担体を使用する必要がなく、特
に好適な態様においては密閉した容器中で全操作を完了
し得る方法を提供することにある。また本発明の他の目
的は、概ね一定の温度で特定塩基配列の核酸を製造する
ための簡便な方法を提供することにある。

【００１７】

【課題を解決するための手段】本出願人は、標的核酸中
の特定塩基配列特定塩基配列に相補的な配列を有し、標
的核酸と結合した場合に測定可能な蛍光信号を発するよ
うにインターカレーター性蛍光色素で標識した核酸プロ
ーブを開発した（特願平７−１８５５９９号公報／ＥＰ
公開第７１４９８６号公報／Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２４（２４）、４９９２−４９
９７（１９９６））参照）。この核酸プローブは、標的
核酸と相補結合を形成するとで測定可能な蛍光信号を発
するため、相補結合を形成していないものと分離するこ
となしに相補結合の形成の有無及び形成された相補結合
体の定量を可能とするものである。ここで本発明者ら
は、この核酸プローブの共存状態で核酸プライマー及び
核酸ポリメレースの作用により特定塩基配列からなるＲ
ＮＡを一定温度にて合成し得ること、言い換えれば、実
質的な標的ＲＮＡの増幅とその分析を、一定温度条件下
で、担体を使用することなく、しかも好適には密閉条件
で行い得ることを見出し、本発明を完成するに至った。

【００１８】即ち本願請求項１の発明は、概ね一定の温
度で試料中の特定塩基配列を含む１本鎖ＲＮＡを分析す
るための簡便で精度の高い方法であって、少なくとも以
下（Ａ）〜（Ｉ）の試薬を用い、試料にこれらを順次添
加するか、これらの２以上を一度に添加するか又はこれ
らを一度に添加する操作（（Ａ）〜（Ｉ）は、この順に
添加することを要しない）と、少なくとも試薬（Ａ）〜
（Ｈ）を添加後に試薬（Ｉ）共存下で蛍光信号を１度以
上測定する操作を含む方法である。

【００１９】（Ａ）前記１本鎖ＲＮＡ中の特定塩基配列
の５’側隣接配列に相補的な配列を有する第１の１本鎖
オリゴ核酸、（Ｂ）特定塩基配列３’末端配列に相補的
な配列を有する第２の１本鎖オリゴＤＮＡ、（Ｃ）ＲＮ
Ａ依存性ＤＮＡポリメレース、（Ｄ）デオキシリボヌク
レオシド三燐酸、（Ｅ）５’末端側から順に（１）ＤＮ
Ａ依存性ＲＮＡポリメレースのプロモーター配列、
（２）該プロモーターのエンハンサー配列及び（３）特
定塩基配列の５’末端配列と同一の塩基配列を有する第
３の１本鎖オリゴＤＮＡ、（Ｆ）ＤＮＡ依存性ＤＮＡポ
リメレース、（Ｇ）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレース、
（Ｈ）リボヌクレオシド三燐酸、及び、（Ｉ）特定塩基
配列に相補的な配列を有し、該配列を有する核酸と結合
した場合に測定可能な蛍光信号を発するように標識され
た第４の１本鎖オリゴＤＮＡ。そして本願請求項２３の
発明は、概ね一定の温度で特定塩基配列の核酸を製造す
るための簡便な方法であって、少なくとも以下（Ａ）〜
（Ｈ）の試薬を用い、５’末端側から順に（１）ＤＮＡ
依存性ＲＮＡポリメレースのプロモーター配列、（２）
該プロモーターのエンハンサー配列及び（３）特定塩基
配列を有する１本鎖ＤＮＡ、又は、該ＤＮＡと該ＤＮＡ
の相補鎖からなる２本鎖ＤＮＡにこれらを順次添加する
か、これらの２以上を一度に添加するか又はこれらを一
度に添加する操作（（Ａ）〜（Ｈ）は、この順に添加す
ることを要しない）と、少なくとも試薬（Ａ）〜（Ｇ）
の添加後に試薬（Ｈ）共存下で蛍光信号を１度以上測定
する操作を含む方法である。

【００２０】（Ａ）特定塩基配列３’末端配列に相補的
な配列を有する１本鎖オリゴＤＮＡ、 （Ｂ）ＲＮＡ依
存性ＤＮＡポリメレース、（Ｃ）ＤＮＡ依存性ＤＮＡポ
リメレース、（Ｄ）デオキシリボヌクレオシド三燐酸、
（Ｅ）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレース、（Ｆ）リボヌ
クレオシド三燐酸、（Ｇ）５’末端側から順に（１）Ｄ
ＮＡ依存性ＲＮＡポリメレースのプロモーター配列、
（２）該プロモーターのエンハンサー配列及び（３）特
定塩基配列の５’末端配列と同一の塩基配列を有する１
本鎖オリゴＤＮＡ、及び、（Ｈ）特定塩基配列に相補的
な配列を有し、該配列を有する核酸と結合した場合に測
定可能な蛍光信号を発するように標識された１本鎖オリ
ゴＤＮＡ。

【００２１】そして本願請求項２６〜２９の発明は、以
上の発明を実施するための試薬又は試薬セットであり、
具体的に請求項２６は、少なくとも、第１の１本鎖オリ
ゴ核酸を含む第１試薬、トリス酢酸塩、酢酸マグネシウ
ム、酢酸カリウム、ソルビトール及びジメチルスルホオ
キシドを含む第２試薬、ジチオスレイトール、デオキシ
リボヌクレオシド三燐酸、リボヌクレオシド三燐酸、牛
血清アルブミン、第２の１本鎖オリゴＤＮＡ及び第３の
１本鎖オリゴＤＮＡを含む第３試薬、ＲＮＡ依存性ＤＮ
Ａポリメレース、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース、Ｄ
ＮＡ依存性ＲＮＡポリメレース及びＲＮａｓｅ阻害剤を
含む第４試薬、そして第４の１本鎖オリゴＤＮＡを含む
第５試薬から構成される、請求項１又は２３の方法を実
施するための試薬セットである。

【００２２】また具体的に請求項２７は、少なくとも、
第１の１本鎖オリゴ核酸を含む第１試薬、トリス酢酸
塩、酢酸マグネシウム、酢酸カリウム、ソルビトール及
びジメチルスルホオキシドを含む第２試薬、ジチオスレ
イトール、デオキシリボヌクレオシド三燐酸、リボヌク
レオシド三燐酸、牛血清アルブミン、第２の１本鎖オリ
ゴＤＮＡ、第３の１本鎖オリゴＤＮＡ及び第４の１本鎖
オリゴＤＮＡを含む第３試薬、そして、ＲＮＡ依存性Ｄ
ＮＡポリメレース、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース、
ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレース及びＲＮａｓｅ阻害剤
を含む第４試薬から構成される、請求項１又は２３の方
法を実施するための試薬セットである。

【００２３】更に具体的に請求項２８は、少なくとも、
第１の１本鎖オリゴ核酸を含む第１試薬、トリス酢酸
塩、酢酸マグネシウム、酢酸カリウム、ソルビトール及
びジメチルスルホオキシドを含む第２試薬、ジチオスレ
イトール、デオキシリボヌクレオシド三燐酸、リボヌク
レオシド三燐酸、牛血清アルブミン、第２の１本鎖オリ
ゴＤＮＡ及び第３の１本鎖オリゴＤＮＡを含む第３試
薬、そして、第４の１本鎖オリゴＤＮＡ、ＲＮＡ依存性
ＤＮＡポリメレース、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメレー
ス、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレース及びＲＮａｓｅ阻
害剤を含む第４試薬から構成される、請求項１又は２３
の方法を実施するための試薬セットである。

【００２４】そして具体的に請求項２９は、少なくと
も、第１の１本鎖オリゴ核酸、第２の１本鎖オリゴＤＮ
Ａ、第３の１本鎖オリゴＤＮＡ、第４の１本鎖オリゴＤ
ＮＡ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース、ＤＮＡ依存性
ＤＮＡポリメレース、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレー
ス、デオキシリボヌクレオシド三燐酸、リボヌクレオシ
ド三燐酸、トリス酢酸塩、酢酸マグネシウム、酢酸カリ
ウム、ソルビトール、ジメチルスルホオキシド、ジチオ
スレイトール、牛血清アルブミン及びＲＮａｓｅ阻害剤
を含む、請求項１又は２３の方法を実施するための試
薬、即ちこれらが全て混合された一種類の試薬である。

【００２５】以下、本発明を詳細に説明する。

【００２６】本願請求項１の発明は、試料中の特定塩基
配列を含む１本鎖ＲＮＡ（標的ＲＮＡ）を分析する方法
である。ここで分析とは、試料中に該ＲＮＡが存在する
か否かを分析することと、試料中に存在する該ＲＮＡの
存在量を分析することの両方を含む。

【００２７】特定塩基配列とは、５’末端が後述する第
３の１本鎖オリゴＤＮＡにおける（３）の配列で始ま
り、３’末端が後述する第２の１本鎖オリゴＤＮＡと相
補的な配列で終わる、前記１本鎖ＲＮＡ中に存在する塩
基配列部分である。特定塩基配列は任意に決定すること
ができるが、標的ＲＮＡを他の核酸から区別し得る程度
に特異的な配列部分を含むようにすることが重要であ
る。特に特定塩基配列として、その５’末端部分及び
３’末端部分の配列が標的核酸以外の核酸と十分に区別
可能な配列を選択することにより、本発明による特定塩
基配列からなる１本鎖ＲＮＡ合成の特異性を向上するこ
とができる。更にはこれら部分の間に標的核酸以外の核
酸と十分に区別可能な配列を有する配列を選択すること
により、本発明における測定の特異性を向上することが
できる。

【００２８】本願請求項１の発明では、試料中に標的Ｒ
ＮＡが存在している場合、最終的に特定塩基配列からな
る大量のＲＮＡが合成される。

【００２９】試薬（Ａ）は、標的ＲＮＡ中の特定塩基配
列の５’側隣接配列に相補的な配列を有する第１のオリ
ゴ核酸である。該試薬は標的ＲＮＡを５’側で切断し、
その５’末端を特定塩基配列で始まるようにし、これに
より、後述する試薬（Ｂ）〜（Ｄ）の共存下で第２の１
本鎖オリゴＤＮＡの標的ＲＮＡへの結合とＲＮＡ依存性
ＤＮＡポリメレースによる該ＲＮＡを鋳型とするｃＤＮ
Ａ合成が行われる際に、該ｃＤＮＡの３’側末端に特定
塩基配列に相補的な配列が位置するようにするためのも
のである。具体的には、例えば第１オリゴ核酸としてＤ
ＮＡを用い、これをＲＮａｓｅＨとともに添加する等す
れば、標的ＲＮＡは第１のオリゴ核酸との結合部分で切
断され、特定塩基配列の最初の塩基が５’末端に位置す
るようになる。この他に、例えば１本鎖核酸の特定部位
を切断する、触媒活性を有するＤＮＡザイムやリボザイ
ム（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、
９４、４２６２−４２６６（１９９７年）等参照）を第
１のオリゴ核酸として使用することもできる。

【００３０】ＲＮａｓｅＨは、ＲＮＡ中のＤＮＡとの相
補結合部分を非特異的に切断する。このため、ＲＮａｓ
ｅＨを使用する場合は、後述する試薬（Ｂ）の添加に先
立ち、昇温や又は公知のＲＮａｓｅＨ阻害剤を添加する
等、ＲＮａｓｅＨ活性を実質的に失活し得る操作を行
う。昇温は、例えば６０〜７０℃へ加温すれば十分であ
るが、該温度に昇温している時間は極めて短時間で良
い。このため、ＲＮａｓｅＨを用いる場合には、例えば
試薬（Ａ）とＲＮａｓｅＨを別個に又は同時に添加して
適当時間のインキュベーションを行った後に試薬（Ｂ）
〜（Ｉ）を添加することになる。これに対し、ＤＮＡザ
イムやリボザイムを用いる場合は昇温や阻害剤の添加等
の操作は不要であり、単にこれらを試薬（Ａ）として単
独で又は他の試薬と同時に添加することができる。

【００３１】試薬（Ｂ）は、特定塩基配列３’末端配列
に相補的な配列を有する第２の１本鎖オリゴＤＮＡであ
る。該試薬は標的ＲＮＡに相補結合し、後述する試薬
（Ｃ）及び（Ｄ）の共存下で、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリ
メレースによる該ＲＮＡを鋳型とするｃＤＮＡ合成が行
われる際に、該ｃＤＮＡの５’側末端に特定塩基配列の
３’末端と相補的な配列が位置するようにするためのも
のである。第２のオリゴＤＮＡは、０．０２〜１μＭが
標的核酸と共存するように添加すれば良い。

【００３２】試薬（Ｃ）はＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレ
ースであり、試薬（Ｄ）はその基質となるデオキシリボ
ヌクレオシド三燐酸である。試薬（Ｂ）〜（Ｄ）の共存
下で、標的ＲＮＡ中の特定塩基配列３’末端に相補的な
配列を５’末端にもつｃＤＮＡが合成される。

【００３３】このｃＤＮＡは、鋳型となったＲＮＡとＤ
ＮＡ−ＲＮＡ２本鎖の状態であるが、後述する試薬
（Ｅ）における第３の１本鎖オリゴＤＮＡが相補結合を
形成し得る状態にする。この目的のためには、ジメチル
スルホオキサイド（以下、ＤＭＳＯ）を添加して５〜２
０％のＤＭＳＯをＤＮＡ−ＲＮＡ２本鎖と共存させ、２
本鎖間の相補結合力を弱めることが例示できる。ＤＭＳ
Ｏは本発明における他の試薬の作用を妨害するものでは
なく、少なくとも試薬（Ｄ）〜（Ｆ）によるＤＮＡ合成
前にＤＮＡ−ＲＮＡ２本鎖と共存するように添加されれ
ば良い。また、トリ筋芽細胞腫ウイルスポリメレース
（以下、ＡＭＶ逆転写酵素）に代表されるＲＮＡ依存性
ＤＮＡポリメレースには、前述のＲＮａｓｅＨと比較し
て微弱ではあるものの、ＤＮＡ−ＲＮＡ２本鎖中のＲＮ
Ａを切断する活性を有するものがある。そこで、前記し
た試薬（Ｃ）としてこのようなＲＮＡ分解活性を有する
酵素を用いても良い。いずれか一方の作用を利用するの
みでも十分であるが、ＤＭＳＯの作用とＣＭＶ逆転写酵
素等のＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース作用の両方を利
用することが特に好ましい。ＤＭＳＯ及び／又はＲＮＡ
依存性ＤＮＡポリメレースの作用により前記ＲＮＡ−Ｄ
ＮＡ２本鎖は、ＲＮＡ部分が分解及び／又は乖離され、
１本鎖のＤＮＡが得られることとなる。

【００３４】試薬（Ｅ）は、５’末端側から順に（１）
ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレースのプロモーター配列、
（２）該プロモーターのエンハンサー配列及び（３）特
定塩基配列の５’末端配列と同一の塩基配列を有する第
３の１本鎖オリゴＤＮＡである。第３のオリゴＤＮＡ
は、０．０２〜１μＭが標的核酸と共存するように添加
すれば良い。第３のオリゴＤＮＡにおいて、（３）の部
分は試薬（Ｂ）〜（Ｄ）が共存することで合成されるＤ
ＮＡの３’末端に結合する。従って試薬（Ｄ）と（Ｆ）
の共存により、第３のＤＮＡの３’末端からは該ＤＮＡ
を鋳型として、また同時に該ＤＮＡの３’末端から該第
３のオリゴＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポ
リメレースによりそれぞれの相補鎖が合成され、完全な
２本鎖ＤＮＡが合成される。

【００３５】試薬（Ｆ）は、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメ
レースである。本発明においては試薬（Ｃ）におけるＲ
ＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースと該ＤＮＡ依存性ＤＮＡ
ポリメレースの両ポリメレース活性を有する同一の酵素
を用いることにより、使用する試薬種類を減少すること
が特に好ましい。例えば、ＡＭＶ逆転写酵素は両活性を
有する酵素であるが、前述の通り、両ポリメレース活性
に加え、ＤＮＡ−ＲＮＡ２本鎖中のＲＮＡを分解する活
性を有しおり、しかも商業的に入手可能であることか
ら、本発明で使用するうえで特に好ましい酵素として例
示できる。

【００３６】試薬（Ｇ）は、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメ
レースであり、試薬（Ｈ）はその基質となるリボヌクレ
オシド三燐酸である。試薬（Ｄ）〜（Ｆ）の共存により
合成される２本鎖ＤＮＡはＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレ
ースのプロモーター領域を末端に有する。このため、試
薬（Ｇ）及び（Ｈ）の共存下では該ＤＮＡ合成後、直ち
に特定塩基配列からなる１本鎖ＲＮＡの合成が開始され
る。試薬（Ｇ）におけるＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレー
スとしては、具体的に例えばＴ７ ＲＮＡポリメレース
やＴ３ ポリメレース、ＳＰ６ ＲＮＡポリメレース等
を例示することができる。

【００３７】試薬（Ｇ）〜（Ｈ）の共存により合成され
る１本鎖ＲＮＡは特定塩基配列からなるＲＮＡである。
従って、これらが合成されて試薬（Ｂ）〜（Ｆ）と共存
することにより、上述した一連の反応が繰り返し生じる
ことになる。このように、本発明では、昇温等の自動化
が困難な操作を行うことなく、試料に各試薬を添加する
という操作のみで、試料中に存在する極微量の標的ＲＮ
Ａをもとにして前記の如きプロモーター領域を末端にも
つ２本鎖ＤＮＡが合成され、これが特定塩基配列からな
る１本鎖ＲＮＡの合成源となる。合成された１本鎖ＲＮ
Ａは新たな２本鎖ＤＮＡの合成に寄与し、結果として時
間の経過とともに特定塩基配列からなる１本鎖ＲＮＡ量
は飛躍的に増大していくこととなる。

【００３８】ここで、合成される特定の塩基配列からな
る１本鎖ＲＮＡの合成される速度及び合成される最終的
な量は、試料中に含まれていた標的ＲＮＡ量に依存す
る。そこで本発明では、試薬（Ｉ）を用いて試料中に含
まれていた標的ＲＮＡについて分析するのである。

【００３９】試薬（Ｉ）は、特定塩基配列に相補的な配
列を有し、該配列を有する核酸と結合した場合に測定可
能な蛍光信号を発するように標識された第４の１本鎖オ
リゴＤＮＡである。第４のオリゴＤＮＡは、例えばイン
ターカレーター性蛍光色素が結合されたＤＮＡであれば
良い。該ＤＮＡ部分は、特定塩基配列の特異的分析のた
め、６〜１００ヌクレオチド、更に好ましくは１０〜３
０ヌクレオチドとすることが好ましい。むろん該ＤＮＡ
部分は、特定塩基配列中に存在する配列であって、標的
核酸以外の核酸と十分に区別可能な配列部分と相補的な
配列であることが重要である。

【００４０】ＤＮＡ部分は、合成された特定塩基配列か
らなる１本鎖ＲＮＡと相補結合を形成した場合に、既に
添加されている試薬（Ｃ）におけるＲＮＡ依存性ＤＮＡ
ポリメレースが作用してその３’末端からの伸長が生じ
ないように、該３’末端が特定塩基配列と非相補的な配
列が付加されているか、又は、その３’末端が化学的に
修飾されていることが好ましい。

【００４１】インターカレーター性蛍光色素は、ＤＮＡ
部分が他の核酸と相補結合を形成すると２本鎖部分にイ
ンターカレーションして蛍光特性が変化するものであ
る。この目的のためには、インターカレーター性蛍光色
素を、２本鎖部分へのインターカレーションを妨げない
程度の適当な分子長リンカーを介してＤＮＡと結合する
ことが例示できる。かかるリンカーとしては、インター
カレーター性蛍光色素が２本鎖部分にインターカレーシ
ョンすることを妨げない分子であれば特に制限はない。
特に、両末端に官能基を有する二官能性炭化水素から選
択されるリンカー分子は、オリゴヌクレオチドへの修飾
を行う上で簡便で好ましい。また例えば、市販の試薬セ
ット（Ｃ６−Ｔｈｉｏｌｍｏｄｉｆｉｅｒ、商品名、Ｃ
ｌｏｎｔｅｃｈ製）等を使用することもできる。

【００４２】インターカレーター性蛍光色素としては、
２本鎖にインターカレーションすることで例えば発する
蛍光のピーク波長が変動したりする等、その蛍光特性が
変化するものであれば特に制限はないが、測定の容易さ
等の観点からインターカレーションにより蛍光強度が増
加する性質を有するものが特に好ましい。より具体的に
は、特に蛍光強度の変化が著しいチアゾールオレンジ、
オキサゾールイエロー又はそれらの誘導体を特に好まし
いインターカレーター性蛍光色素として例示できる。

【００４３】インターカレーター性蛍光色素をリンカー
を介して結合させるＤＮＡの位置は、ＤＮＡの５’末
端、３’末端又は中央部分等、インターカレーター性蛍
光色素の２本鎖へのインターカレーションが妨げられ
ず、かつ、ＤＮＡ部分のＲＮＡとの相補結合を阻害しな
い限り特に制限はない。

【００４４】前記２本鎖ＤＮＡ、試薬（Ｇ）及び（Ｈ）
共存下で合成される、特定塩基配列を有する１本鎖ＲＮ
Ａは、試薬（Ｉ）共存下で測定可能な蛍光信号を発す
る。ここで驚くべきことに、合成された１本鎖ＲＮＡと
第４のオリゴＤＮＡが相補結合を形成し、蛍光信号を発
した場合であっても、このＲＮＡは試薬（Ｂ）〜（Ｄ）
共存下でＤＮＡ合成の際の鋳型として機能することが明
らかとなった。即ち本発明では、各試薬の共存状態にお
いてＲＮＡからのＤＮＡ合成、ＤＮＡ２本鎖の合成、Ｄ
ＮＡ２本鎖からのＲＮＡ合成という一連の現象が、第４
のオリゴＤＮＡ共存下で生じるのである。

【００４５】従って、少なくとも試薬（Ａ）〜（Ｈ）の
添加完了後に試薬（Ｉ）を添加して蛍光信号を１度以上
測定する操作を行えば、該測定結果から試料中の標的核
酸を分析することが可能となるのである。ここで、前述
したように第４のオリゴ核酸の共存は最終的には特定塩
基配列からなる１本鎖ＲＮＡの合成に何ら障害を与えな
いため、試薬（Ｉ）を他の試薬と同時に添加することも
可能である。

【００４６】蛍光信号を１度だけ測定する場合は、少な
くとも試薬（Ａ）〜（Ｈ）の添加後、特定塩基配列から
なる１本鎖ＲＮＡが合成されるのに十分な時間インキュ
ベーションを行った後に測定を行えば良い。試薬（Ｉ）
は他の試薬と同時に添加する等、測定前に添加する。こ
のような測定はいわゆるエンドポイント法とよばれる方
式であり、例えば既知量の標的核酸を含む溶液について
同様の操作を行って得られる結果との比較を行うこと
で、試料中の標的核酸を分析することが可能となる。本
願発明における蛍光信号の測定は、好ましくは試薬
（Ａ）〜（Ｈ）の添加後直後から、又は、試薬（Ａ）〜
（Ｈ）の添加後所定時間経過後から経時的に行う。第４
のＤＮＡは、１本鎖ＲＮＡの合成過程において、合成さ
れたＲＮＡと結合・解離を繰り返すが、結合時に測定さ
れる蛍光信号は各測定時における該ＲＮＡの存在量を反
映するため、１本鎖ＲＮＡの増加する様子を経時的に追
跡することが可能となるのである。なお測定自体は連続
的なものであっても一定時間毎の間欠的なものであって
も良い。このように経時的測定を行うと、蛍光信号の経
時変化が得られるが、例えば試薬（Ａ）〜（Ｈ）添加
後、一定強度の蛍光信号が得られるまでに要した時間
や、例えば試薬（Ａ）〜（Ｈ）添加後の蛍光信号強度が
劇的に増大した時間等を手がかりに、試料中の標的ＲＮ
Ａ量（初期量）を分析することが可能となる。

【００４７】後述の実施例で示されるように、本発明に
おいては、前記した試薬（Ａ）〜（Ｉ）はいずれも塩化
物を含まないことが好ましい。また試薬（Ａ）〜（Ｉ）
の他に、酢酸塩を用いることが好ましい。酢酸塩として
は、例えば酢酸マグネシウム又は酢酸カリウムを例示す
ることができる。酢酸塩は、少なくとも試薬（Ｂ）〜
（Ｄ）の共存による１本鎖ＤＮＡの合成時に共存させれ
ば良いが、その濃度は酢酸マグネシウムでは５〜２０ｍ
Ｍ、酢酸カリウムでは５０〜２００ｍＭが好ましい。本
発明においては、更にソルビトールを用いることが好ま
しい。ソルビトールは、少なくとも試薬（Ｂ）〜（Ｄ）
の共存による１本鎖ＤＮＡの合成時に共存させれば良
い。また、牛血清アルブミン等の蛋白質やジチオスレイ
トール等の還元剤を用いることや、ＲＮａｓｅによる合
成された１本鎖ＲＮＡ等の分解を阻害する目的でＲＮａ
ｓｅ阻害剤を用いることが好ましい。更には、用いる各
オリゴ核酸が相補配列と結合可能で、かつ、用いる各種
酵素が活性を発揮し得るｐＨ範囲に反応溶液を維持する
目的で緩衝剤を用いることが好ましい。緩衝剤としては
特にトリス酢酸塩が好適な緩衝剤として例示できる。こ
れらの試薬も、少なくとも試薬（Ｂ）〜（Ｄ）の共存に
よる１本鎖ＤＮＡの合成時に共存させれば良い。これら
好ましい試薬を用いることで、合成産物である１本鎖Ｒ
ＮＡの合成量を向上させることができる。

【００４８】本発明の分析方法では、試料中の標的ＲＮ
Ａの分析を、昇温等操作を行うことなく一定温度で行い
得る。該一定温度は、本発明で使用する試薬（Ａ）、
（Ｂ）、（Ｅ）及び（Ｉ）における各オリゴ核酸が相補
配列と結合可能な温度で、かつ、試薬（Ｃ）、（Ｆ）及
び（Ｇ）が酵素活性を発揮し得る温度であれば制限はな
い。より具体的には、３５〜６０℃の範囲から選ばれる
温度を例示できる。なお温度は厳密に一定である必要は
なく、概ね一定であれば良い。

【００４９】以上の説明から明らかなように、本願請求
項１の分析方法では、用いる試薬を順次添加しても、そ
の２以上を一度に添加しても、又は、その全てを一度に
添加しても得るものである。特に、用いる全試薬を一度
に試料に添加する形態によれば、密閉した容器中で標的
ＲＮＡの分析を可能とするものであり、これにより容器
の開閉に伴う合成された１本鎖ＲＮＡの飛散という課題
を解決し得る。

【００５０】本願請求項２３の発明は、概ね一定の温度
で特定塩基配列の核酸を製造するための簡便な方法であ
る。この方法では、少なくとも以下（Ａ）〜（Ｇ）の試
薬を用い、５’末端側から順に（１）ＤＮＡ依存性ＲＮ
Ａポリメレースのプロモーター配列、（２）該プロモー
ターのエンハンサー配列及び（３）特定塩基配列を有す
る１本鎖ＤＮＡ、又は、該ＤＮＡと該ＤＮＡの相補鎖か
らなる２本鎖ＤＮＡにこれらを順次添加するか、これら
の２以上を一度に添加するか又はこれらを一度に添加す
る操作（（Ａ）〜（Ｈ）は、この順に添加することを要
しない）と、少なくとも試薬（Ａ）〜（Ｇ）の添加後に
試薬（Ｈ）共存下で蛍光信号を１度以上測定する操作を
含む方法である。

【００５１】（Ａ）特定塩基配列３’末端配列に相補的
な配列を有する１本鎖オリゴＤＮＡ、 （Ｂ）ＲＮＡ依
存性ＤＮＡポリメレース （Ｃ）ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース、（Ｄ）デオキ
シリボヌクレオシド三燐酸、（Ｅ）ＤＮＡ依存性ＲＮＡ
ポリメレース、（Ｆ）リボヌクレオシド三燐酸、（Ｇ）
５’末端側から順に（１）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレ
ースのプロモーター配列、（２）該プロモーターのエン
ハンサー配列及び（３）特定塩基配列の５’末端配列と
同一の塩基配列を有する１本鎖オリゴＤＮＡ、及び、
（Ｈ）特定塩基配列に相補的な配列を有し、該配列を有
する核酸と結合した場合に測定可能な蛍光信号を発する
ように標識された１本鎖オリゴＤＮＡ。

【００５２】これまでの説明からも理解されるように、
本願請求項２３の発明は、請求項１の発明における１本
鎖ＲＮＡ合成の合成源である２本鎖ＤＮＡを出発材料と
して特定塩基配列からなる核酸を製造するものである。
ここで、特定塩基配列とは、請求項１における特定塩基
配列とは異なり、標的ＲＮＡに由来する配列であること
を要しない。

【００５３】出発材料である２本鎖ＤＮＡは、ＰＣＲや
ＤＮＡ合成装置等を用いる公知の方法により調製するこ
とができる。なお、試薬（Ａ）、（Ｃ）及び（Ｄ）共存
下では、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレースのプロモータ
ー配列、（２）該プロモーターのエンハンサー配列及び
（３）特定塩基配列を有する１本鎖ＤＮＡに試薬（Ａ）
における第１のオリゴＤＮＡが相補結合後該ＤＮＡを鋳
型とする伸長反応が生じて前記２本鎖ＤＮＡが合成さ
れ、出発材料として機能することになる。また更には、
特定塩基配列を含む１本鎖ＲＮＡに対して請求項１の発
明で説明した各種操作を実施することにより、出発材料
である２本鎖ＤＮＡを調製することもできる。 試薬
（Ａ）における１本鎖オリゴＤＮＡは請求項１の発明に
おける第２のオリゴＤＮＡに該当し、試薬（Ｇ）におけ
る１本鎖オリゴＤＮＡは第３のオリゴＤＮＡに該当し、
試薬（Ｈ）における１本鎖オリゴＤＮＡは第４のオリゴ
ＤＮＡに該当する。従って、これらの添加の形態や作用
等、各種ポリメレースの好適な例示、（Ａ）〜（Ｈ）以
外の好ましく用いられる試薬や操作については、前述の
説明を参照することで容易に理解される。即ち、出発材
料である２本鎖ＤＮＡ、試薬 （Ｅ）及び（Ｆ）の共存
により特定塩基配列からなる１本鎖ＲＮＡを合成させ、
合成された１本鎖ＲＮＡ、試薬（Ａ）、（Ｂ）及び
（Ｄ）の共存により特定塩基配列と相補的な配列からな
る１本鎖ＤＮＡを合成させ、このＤＮＡ、試薬（Ｃ）及
び（Ｄ）の共存により出発材料である２本鎖ＤＮＡを合
成させるのである。なお、請求項１の発明における試薬
（Ａ）と昇温操作等の試薬（Ａ）に関連して実施される
操作は、特定塩基配列を含む１本鎖ＲＮＡであって、そ
の５’末端が特定塩基配列から開始していないＲＮＡか
ら出発材料となる２本鎖ＤＮＡを調製する場合以外、こ
の方法では必要でない。

【００５４】蛍光信号を１度だけ測定する場合は、少な
くとも試薬（Ａ）〜（Ｇ）の添加後、十分な時間インキ
ュベーションを行った後、試薬（Ｉ）の共存下で行う。
また経時的に測定を行う場合は、試薬（Ａ）〜（Ｇ）の
添加後直後から、又は、試薬（Ａ）〜（Ｇ）の添加後所
定時間経過後から経時的に行う。そして測定された蛍光
信号又は測定された蛍光信号の経時的変化が所定量の特
定塩基配列核酸が製造されたことを示した場合には、製
造された核酸の抽出操作を行う。

【００５５】最終的に特定塩基配列からなる１本鎖ＲＮ
Ａを得る場合には、例えばＤＮａｓｅ等のＤＮＡ分解酵
素を添加した後にＲＮＡ抽出操作を行えば良い。最終的
に特定塩基配列を含む１本鎖ＤＮＡ又は該ＤＮＡと該Ｄ
ＮＡの相補鎖からなる２本鎖ＤＮＡを得る場合には、例
えばＲＮａｓｅ等のＲＮＡ分解酵素を添加した後にＤＮ
Ａ抽出操作を行えば良い。むろん、このようなＲＮＡと
ＤＮＡの混合物を得る場合には、核酸分解酵素を添加す
ることなしに核酸抽出操作を行えば良い。ＤＮＡ及び／
又はＲＮＡの抽出は、例えばエタノールを添加してこれ
らを沈殿させる等、公知の手法に従うことにより容易に
実施できる。

【００５６】上記した本願請求項１又は２３の発明を実
施する場合、少なくとも、第１の１本鎖オリゴ核酸を含
む第１試薬、トリス酢酸塩、酢酸マグネシウム、酢酸カ
リウム、ソルビトール及びジメチルスルホオキシドを含
む第２試薬、ジチオスレイトール、デオキシリボヌクレ
オシド三燐酸、リボヌクレオシド三燐酸、牛血清アルブ
ミン、第２の１本鎖オリゴＤＮＡ及び第３の１本鎖オリ
ゴＤＮＡを含む第３試薬、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレ
ース、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース、ＤＮＡ依存性
ＲＮＡポリメレース及びＲＮａｓｅ阻害剤を含む第４試
薬、そして第４の１本鎖オリゴＤＮＡを含む第５試薬か
ら構成される試薬セットを用い、これらを試薬番号の順
に順次試料等に添加することが例示できる。なお請求項
２３の発明では、前述した通り第１の１本鎖オリゴ核酸
を用いる必要のない場合がある。この場合には第１試薬
を除けば良い。

【００５７】また上記した本願請求項１又は２３の発明
を実施する場合、少なくとも、第１の１本鎖オリゴ核酸
を含む第１試薬、トリス酢酸塩、酢酸マグネシウム、酢
酸カリウム、ソルビトール及びジメチルスルホオキシド
を含む第２試薬、ジチオスレイトール、デオキシリボヌ
クレオシド三燐酸、リボヌクレオシド三燐酸、牛血清ア
ルブミン、第２の１本鎖オリゴＤＮＡ、第３の１本鎖オ
リゴＤＮＡ及び第４の１本鎖オリゴＤＮＡを含む第３試
薬、そして、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース、ＤＮＡ
依存性ＤＮＡポリメレース、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメ
レース及びＲＮａｓｅ阻害剤を含む第４試薬から構成さ
れる試薬セットを用い、これらを試薬番号の順に順次試
料等に添加することが例示できる。なお請求項２３の発
明では、前述した通り第１の１本鎖オリゴ核酸を用いる
必要のない場合がある。この場合には第１試薬を除けば
良い。

【００５８】更に上記した本願請求項１又は２３の発明
を実施する場合、少なくとも、第１の１本鎖オリゴ核酸
を含む第１試薬、トリス酢酸塩、酢酸マグネシウム、酢
酸カリウム、ソルビトール及びジメチルスルホオキシド
を含む第２試薬、ジチオスレイトール、デオキシリボヌ
クレオシド三燐酸、リボヌクレオシド三燐酸、牛血清ア
ルブミン、第２の１本鎖オリゴＤＮＡ及び第３の１本鎖
オリゴＤＮＡを含む第３試薬、そして、第４の１本鎖オ
リゴＤＮＡ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース、ＤＮＡ
依存性ＤＮＡポリメレース、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメ
レース及びＲＮａｓｅ阻害剤を含む第４試薬から構成さ
れる試薬セットを用い、これらを試薬番号の順に順次試
料等に添加することが例示できる。なお請求項２３の発
明では、前述した通り第１の１本鎖オリゴ核酸を用いる
必要のない場合がある。この場合には第１試薬を除けば
良い。

【００５９】そして上記した本願請求項１又は２３の発
明を実施する場合、最も好ましくは、少なくとも、第１
の１本鎖オリゴ核酸、第２の１本鎖オリゴＤＮＡ、第３
の１本鎖オリゴＤＮＡ、第４の１本鎖オリゴＤＮＡ、Ｒ
ＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポ
リメレース、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレース、デオキ
シリボヌクレオシド三燐酸、リボヌクレオシド三燐酸、
トリス酢酸塩、酢酸マグネシウム、酢酸カリウム、ソル
ビトール、ジメチルスルホオキシド、ジチオスレイトー
ル、牛血清アルブミン及びＲＮａｓｅ阻害剤を含む試薬
を用い、これを試料に添加することが例示できる。なお
請求項２３の発明では、前述した通り第１の１本鎖オリ
ゴ核酸を用いる必要のない場合がある。この場合には第
１の１本鎖オリゴＤＮＡを除けば良い。特にこの試薬
は、他の試薬セットとは異なり、必要な試薬全てが混合
された一種類の試薬である。従って試料に対して１回の
み、該試薬の添加を行えば良い。

【００６０】上記した試薬セット又は試薬中の各試薬
は、試料等に添加した状態で必要量が試料等と共存し得
るように試薬セット又は試薬中の濃度を調製する。な
お、前述の通りＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース及びＤ
ＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースとして両ポリメレース活
性を有する同一の酵素を用いることも可能である。

【００６１】

【発明の実施の形態】以下、本発明を実施例により更に
詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により限定さ
れるものではない。

【００６２】実施例１ ２本鎖ＤＮＡの調製５’末端に
ＳＰ６プロモーター配列を持つＤＮＡと該ＤＮＡに相補
的なＤＮＡからなる２本鎖DNA を調製した。

【００６３】まず、以下の組成の反応液７０μｌをＰＣ
Ｒ用チューブに分注した。

【００６４】１０．７ｍＭトリス・塩酸バッファー（ｐ
Ｈ８．３） ５３．６ｍＭ塩化カリウム ２．３６ｍＭ塩化マグネシウム 各０．２６８ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄ
ＴＴＰ ０．２５７μＭの、第３の１本鎖オリゴＤＮＡ （配列）５’ ATT TAG GTG ACA CTA TAG AAT ACA ACA
CTC CAC CAT AGA TCA CTC CCC TG ３’ ０．２５７μＭの、第２の１本鎖オリゴＤＮＡ （配列）５’ ACT CGC AAG CAC CCT ATC A ３’ ０．０３２Ｕ／μｌの、市販のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリ
メレース（ＡｍｐｌｉＴａｑ、商品名、パーキンエルマ
ー社製） 次に、１０⁶コピー／５μｌのＤＮＡ標準を５μｌ添加
した。なおＤＮＡ標準は、ヒトＣ型肝炎ウイルス（ＨＣ
Ｖ）ｃＤＮＡの塩基番号１〜１８６３を含む、１８６５
塩基対の２本鎖ＤＮＡである。また塩基番号について
は、文献（加藤ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ．、Ｕ
ＳＡ、１９９０年、８７、９５２４〜９５２８）に従っ
て記載する。

【００６５】次に、反応液を９５℃に昇温して９分間放
置し、引き続いて以下（１）〜（３）の操作を１サイク
ルとして、４０サイクル繰り返した。

【００６６】（１）９５℃で３０秒間維持する操作、
（２）６５℃で３０秒間維持する操作、そして、（３）
７２℃で１分間維持する操作。

【００６７】４０サイクル終了後、反応液をとり、２％
アガロース電気泳動を行った後、エチジウムブロマイド
染色して確認した。

【００６８】エチジウムブロマイド染色の結果を図１に
示す。図１から明らかなように、約３２０塩基対のＤＮ
Ａに由来する単一バンドが認められる。このことは、以
上の操作によって５’末端にSP6 プロモーター配列（下
線）を持った、以下ような塩基配列のＤＮＡとその相補
鎖が調製されたことを示すものである。

【００６９】（配列）５’ ATT TAG GTG ACA CTA TAG
AAT ACA A- （ＨＣＶのｃＤＮＡ塩基番号１１〜３０
０） ３’ 実施例２ 酢酸マグネシウム濃度の影響 本発明における酢酸マグネシウムの最適濃度を検討し
た。まず、以下のような組成の反応液を調製し、各１４
μｌずつＰＣＲ用チューブに分注した。

【００７０】８５．７ｍＭトリス酢酸（ｐＨ８．１） １６．１、３２．１又は４８．２ｍＭ酢酸マグネシウム ２１４．３ｍＭ酢酸カリウム ２１．４％ ＤＭＳＯ ３２．１％ソルビトール 各２．１ｍＭの、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ 各２．１ｍＭの、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴ
ＴＰ ２１４μｇ／ｍｌ ＢＳＡ ０．１２μＭの、第２の１本鎖オリゴＤＮＡ （配列）５’ ACT CGC AAG CAC CCT ATC A ３’ 次に、１０⁴コピー、１０⁵コピー、１０⁶コピー又は１
０⁷コピー／１０μｌのＤＮＡ標準１０μｌ、又は、陰
性標準としてＤＮＡを含まないＴＥ緩衝液 （１０ｍＭ
トリス塩酸（ｐＨ８．０）及び０．１ｍＭ ＥＤＴＡを
含む緩衝液）１０μｌを添加した。なおＤＮＡ標準は以
下の配列からなるＤＮＡとそれに相補的なＤＮＡからな
る２本鎖ＤＮＡである。

【００７１】（配列）５’ ATT TAG GTG ACA CTA TAG
AAT ACA A-（HCV ｃＤＮＡの塩基番号１１〜３００）
３’ 反応液表面にミネラルオイル１００μｌを重層した後、
４５℃で５分間加温し、続いて以下の酵素混合液を５μ
ｌ添加し、４５℃で１時間反応させた。

【００７２】３０Ｕ／μｌの、市販のＳＰ６ＲＮＡポリ
メレース（宝酒造（株）製） １２Ｕ／μｌの、市販のＲＮａｓｅ阻害剤（宝酒造
（株）製） 次に、２．７５μＭの、第３の１本鎖オリゴＤＮＡを
０．６μｌ添加した。

【００７３】（配列）５’ ATT TAG GTG ACA CTA TAG
AAT ACA ACA CTC CAC CAT AGA TCA CTC CCC TG ３’ 引き続き３７Ｕ／μｌのＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラー
ゼ・ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼであるＡＭＶ逆転
写酵素（宝酒造（株）製）を０．４μｌ添加し、４５℃
で２時間放置した後、反応液の５μｌをとり、２％アガ
ロース電気泳動を行った。泳動後、アガロースゲルを１
００００倍希釈したＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＩＩ（宝酒
造（株）製）で３０分染色した。

【００７４】染色されたゲルの様子を図２に示す。最終
濃度１５ｍＭの酢酸マグネシウム共存により、最大量の
産物が得られることが分かる。

【００７５】実施例３ 酢酸カリウムの影響 本発明における酢酸カリウムの最適濃度を検討した。ま
ず、以下のような組成の反応液を調製し、各１４μｌず
つＰＣＲ用チューブに分注した。

【００７６】８５．７ｍＭトリス酢酸（ｐＨ８．１） ２８．９ｍＭ酢酸マグネシウム ２１４．３、２３５．７、２５７．１又は２７８．６ｍ
Ｍ酢酸カリウム ２１．４％ ＤＭＳＯ ３２．１％ソルビトール 各２．１ｍＭの、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ 各２．１ｍＭの、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴ
ＴＰ ２１４μｇ／ｍｌ ＢＳＡ ０．１２μＭの、第２の１本鎖オリゴＤＮＡ （配列）５’ ACT CGC AAG CAC CCT ATC A ３’ 次に、１０³コピー、１０⁴コピー、１０⁵コピー又は１
０⁶コピー／１０μｌのＤＮＡ標準１０μｌ、又は、陰
性標準としてＤＮＡを含まないＴＥ緩衝液１０μｌを添
加した。なおＤＮＡ標準は以下の配列からなるＤＮＡと
それに相補的なＤＮＡからなる２本鎖ＤＮＡである。 （配列）５’ ATT TAG GTG ACA CTA TAG AAT ACA A-
（ＨＣＶ ｃＤＮＡの塩基番号１１〜３００） ３’ 反応液表面にミネラルオイル１００μｌを重層した後、
４５℃で５分間加温し、続いて以下の酵素混合液を５μ
ｌ添加し、４５℃で１時間反応させた。

【００７７】３０Ｕ／μｌの、市販のＳＰ６ＲＮＡポリ
メレース（宝酒造（株）製） １２Ｕ／μｌの、市販のＲＮａｓｅ阻害剤（宝酒造
（株）製） 次に、２．７５μＭの、第３の１本鎖オリゴＤＮＡを
０．６μｌ添加した。

【００７８】（配列）５’ ATT TAG GTG ACA CTA TAG
AAT ACA ACA CTC CAC CAT AGA TCA CTC CCC TG ３’ 引き続き３７Ｕ／μｌのＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラー
ゼ・ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼであるＡＭＶ逆転
写酵素（宝酒造（株）製）を０．４μｌ添加し、４５℃
で２時間放置した後、反応液の５μｌをとり、２％アガ
ロース電気泳動を行った。泳動後、アガロースゲルを１
００００倍希釈したＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＩＩ（宝酒
造（株）製）で３０分染色した。

【００７９】染色されたゲルの様子を図３に示す。酢酸
カリウムが最終濃度で１２０ｍＭ共存することにより、
初期の標的核酸量が１０³コピーであっても産物が得ら
れることが分かる。このように、最終濃度１１０〜１３
０ｍＭの酢酸カリウム共存により、反応効率が最大にな
ることが分かる。

【００８０】実施例４ ソルビトールの影響 本発明におけるソルビトールの最適濃度を検討した。ま
ず、以下のような組成の反応液を調製し、各２０μｌず
つＰＣＲ用チューブに分注した。

【００８１】６０ｍＭトリス酢酸（ｐＨ８．１） ２０．３ｍＭ酢酸マグネシウム １８７．５ｍＭ酢酸カリウム １５％ ＤＭＳＯ ２２．５、１６．８、１３．５、１１．３％ソルビトー
ル （最終濃度はそれぞれ１５、１１．３、９又は７．５
％） 各１．５ｍＭの、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ 各１．５ｍＭの、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴ
ＴＰ １５０μｇ／ｍｌ ＢＳＡ ０．３μＭの、第２の１本鎖オリゴＤＮＡ （配列）５’ ACT CGC AAG CAC CCT ATC A ３’ ０．３μＭの、第３の１本鎖オリゴＤＮＡ （配列）５’ ATT TAG GTG ACA CTA TAG AAT ACA ACA
CTC CAC CAT AGA TCA CTC CCC TG ３’ 次に、１０³コピー、１０⁴コピー、１０⁵コピー又は１
０⁶コピー／５μｌのＲＮＡ標準５μｌ、又は、陰性標
準としてＲＮＡを含まないＴＥ緩衝液５μｌを添加し
た。なおＲＮＡ標準は以下の配列からなる。 （配列）５’ GAA UAC AA- （HCV RNAの塩基番号１１
〜３００) ３’ 反応液表面にミネラルオイル１００μｌを重層した後、
６５℃で１０分間加温した後、チューブを氷水中に移し
て５分間静置した。続いて以下の酵素混合液を５μｌ添
加し、４５℃で４時間反応させた。

【００８２】３６Ｕ／μｌの、市販のＳＰ６ＲＮＡポリ
メレース（宝酒造（株）製） １２Ｕ／μｌの、市販のＲＮａｓｅ阻害剤（宝酒造
（株）製） ９Ｕ／μｌのＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ・ＤＮＡ
依存性ＤＮＡポリメラーゼであるＡＭＶ逆転写酵素（宝
酒造（株）製） 反応液の５μｌをとり、アガロース電気泳動を行った。
泳動後、アガロースゲルを１００００倍希釈したＳＹＢ
Ｒ Ｇｒｅｅｎ ＩＩ（宝酒造（株）製）で３０分染色
した。

【００８３】染色されたゲルの様子を図３に示す。その
結果、ソルビトールが最終濃度で７．５〜１１．３％共
存することにより、初期の標的核酸量が１０³コピーで
あっても３００塩基対の位置にはっきりとバンドが認め
られることが分かる。産物が得られることが分かる。こ
のように、最終濃度７．５〜１１．３％のソルビトール
共存により、反応効率が最大になることが分かる。

【００８４】実施例５ ２本鎖ＤＮＡを標的核酸とした
核酸増幅 各種濃度の２本鎖ＤＮＡを標的核酸として増幅産物量を
検討した。まず、以下のような組成の反応液を調製し、
各１９μｌずつＰＣＲ用チューブに分注した。 ６３．２ｍＭトリス酢酸（ｐＨ８．１） ２１．３ｍＭ酢酸マグネシウム １９７．４ｍＭ酢酸カリウム ２２．５％ ＤＭＳＯ ２２．５％ソルビトール 各１．６ｍＭの、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ 各１．６ｍＭの、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴ
ＴＰ １５７．９μｇ／ｍｌ ＢＳＡ ０．０５５μＭの、第２の１本鎖オリゴＤＮＡ （配列）５’ ACT CGC AAG CAC CCT ATC A ３’ 次に、１０³コピー、１０⁴コピー、１０⁵コピー又は１
０⁶コピー／５μｌのＤＮＡ標準５μｌ、又は、陰性標
準としてＲＮＡを含まないＴＥ緩衝液５μｌを添加し
た。なおＤＮＡ標準は以下の配列からなるＤＮＡとそれ
に相補的なＤＮＡからなる２本鎖ＤＮＡである。 （配列）５’ ATT TAG GTG ACA CTA TAG AAT ACA A-
（ＨＣＶ ｃＤＮＡの塩基番号１１〜３００） ３’ 反応液表面にミネラルオイル１００μｌを重層した後、
４５℃で５分間加温し、続いて以下の酵素混合液を５μ
ｌ添加し、４５℃で１時間反応させた。

【００８５】３０Ｕ／μｌの、市販のＳＰ６ＲＮＡポリ
メレース（宝酒造（株）製） １２Ｕ／μｌの、市販のＲＮａｓｅ阻害剤（宝酒造
（株）製） 次に、２．７５μＭの、第３の１本鎖オリゴＤＮＡを
０．６μｌ添加した。

【００８６】（配列）５’ ATT TAG GTG ACA CTA TAG
AAT ACA ACA CTC CAC CAT AGA TCA CTC CCC TG ３’ 引き続き３７Ｕ／μｌのＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラー
ゼ・ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼであるＡＭＶ逆転
写酵素（宝酒造（株）製）を０．４μｌ添加し、４５℃
で２時間放置した後、反応液の５μｌをとり、２％アガ
ロース電気泳動を行った。泳動後、アガロースゲルを１
００００倍希釈したＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＩＩ（宝酒
造（株）製）で３０分染色した。

【００８７】染色されたゲルの様子を図５に示す。初期
の標的核酸量が１０³コピー／５μｌ以上の場合、全て
の場合で約３００塩基対の位置にバンドが認められ、し
かも認められたバンドは、初期核酸量に依存して黒化度
を示した。この結果から、２本鎖ＤＮＡを標的核酸とし
た場合には、高感度の分析が可能であることが分かる。
実施例６ 第１の１本鎖オリゴ核酸とＲＮａｓｅＨ用
いたＲＮＡの特異的切断 第１の１本鎖オリゴ核酸とＲ
ＮａｓｅＨを用いてＲＮＡを特定塩基配列の５’側隣接
部分で切断した。

【００８８】まず、以下のような組成の反応液を調製
し、各７．２μｌずつＰＣＲ用チューブに分注した。

【００８９】４０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０） ４ｍＭ塩化マグネシウム １ｍＭジチオスレイトール １μＭの、第１の１本鎖オリゴＤＮＡ（１１ｍｅｒ） （配列）５’ GTC CGG GGG AA ３’ 次に、５．７μＭのＲＮＡ（１３３ｍｅｒ）を１．８μ
ｌ添加し、６５℃で１０分間加熱した後、氷水中に移し
て急冷した。１３３ｍｅｒ ＲＮＡの配列は以下の通り
である。 （配列）５’ ( ベクター配列）GGG AAA GCU UGC AUG
CCU GCA GGU CGA CUC UAG AGG AUC CCC GGG UAC CGA G
CU CGA AUU CC （ＨＣＶ由来の配列）U UGG GGGCGA CA
C UCC ACC AUA GAU CAC UCC CCU GUG AGG AAC UAC UGU
CUU CAC GCA GAAAGC GUC UAG C ３’（下線部は１１ｍ
ｅｒのＤＮＡと相補的な配列部分である） ３７℃で５分間加温した後、各０．０１、０．００１、
０．０００１又は０．００００１Ｕ／μｌのＲＮａｓｅ
Ｈ（宝酒造（株）製）を１μｌずつ添加し、３７℃で１
時間反応させた。反応液にゲル・ローディング緩衝液
（０．１Ｍトリス塩酸（ｐＨ８．０）、６０ｍＭ ＥＤ
ＴＡ、０．２５％ブロモフェノールブルー及び４０％シ
ョ糖を含む緩衝液）を２μｌを加えた後、ホルムアミド
１２μｌを添加し、６５℃で５分間加温した後、反応液
の１２μｌをとり、１２％尿素変性ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動を行った。

【００９０】アクリルアミドゲルを5 分間水洗する操作
を３回繰り返した後、ゲルを１００００倍希釈ＳＹＢＲ
Ｇｒｅｅｎ ＩＩ（宝酒造（株）製）で３０分染色し
た。一方、以下のような組成の反応液を調製し、各１
０．８μｌずつＰＣＲ用チューブに分注した。

【００９１】４０ｍＭトリス酢酸緩衝液（ｐＨ８．１） ３７ｍＭ酢酸マグネシウム ３４７ｍＭ酢酸カリウム ２２％ソルビトール １ｍＭジチオスレイトール ０．９μＭの、第１の１本鎖オリゴ核酸（１１ｍｅｒ） （配列）５’ GTC CGG GGG AA ３’ 次に、５．７μＭのＲＮＡ（１３３ｍｅｒ）を１．８μ
ｌ添加し、６５℃で１０分間加熱した後、氷水中に移し
て急冷した。

【００９２】３７℃で５分間加温した後、各０．０１、
０．００１、０．０００１又は０．００００１Ｕ／μｌ
のＲＮａｓｅＨ（宝酒造（株）製）を１μｌずつ添加
し、３７℃で１時間反応させた。反応液にゲル・ローデ
ィング緩衝液を２μｌを加えた後、ホルムアミド１２μ
ｌを添加し、６５℃で５分間加温した後、反応液の１２
μｌをとり、１２％尿素変性ポリアクリルアミドゲル電
気泳動を行った。

【００９３】アクリルアミドゲルを5 分間水洗する操作
を3 回繰り返した後、ゲルを１００００倍希釈ＳＹＢＲ
Ｇｒｅｅｎ ＩＩ（宝酒造（株）製）で３０分染色し
た。各組成の反応液を用いた結果を図６に示す。トリス
塩酸緩衝液では最終濃度が０．０００００１及び０．０
０００１Ｕ／μｌのＲＮａｓｅＨ共存により１３３ｍｅ
ｒのバンドは消え、６０〜７０ｍｅｒのバンドが認めら
れた。ＲＮａｓｅＨの最終濃度を上げると１３３ｍｅｒ
の更なる分解が認められた。一方トリス酢酸緩衝液で
は、最終濃度が０．０００７Ｕ／μｌのＲＮａｓｅＨ共
存により１３３ｍｅｒのバンドは消え、６０〜７０ｍｅ
ｒのバンドが認められた。このバンドの位置は、１３３
ｍｅｒのＲＮＡが第１の１本鎖オリゴ核酸の結合部位で
切断された場合に出現するＲＮＡの位置と一致する。

【００９４】このことから、第１の１本鎖オリゴ核酸と
ＲＮａｓｅＨを用いることにより、標的ＲＮＡを特定塩
基配列の５’側で特異的に切断可能であることが分か
る。

【００９５】実施例７ ＲＮＡを標的とした核酸増幅 各種濃度の標的ＲＮＡを用いて本発明を実施し、増幅産
物を確認した。まず、以下のような組成の反応液を調製
し、各２０μｌずつＰＣＲ用チューブに分注した。

【００９６】６０ｍＭトリス酢酸（ｐＨ８．１） ２０．３ｍＭ酢酸マグネシウム １８７．５ｍＭ酢酸カリウム ２２．５％ ＤＭＳＯ ２２．５％ソルビトール 各１．５ｍＭの、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ 各１．５ｍＭの、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴ
ＴＰ １５０μｇ／ｍｌ ＢＳＡ ０．３μＭの、第３の１本鎖オリゴＤＮＡ （配列）５’ ATT TAG GTG ACA CTA TAG AAT ACA ACA
CTC CAC CAT AGA TCA CTC CCC TG ３’ ０．３μＭの、第２の１本鎖オリゴＤＮＡ （配列）５’ ACT CGC AAG CAC CCT ATC A ３’ 次に、１０²コピー、１０³コピー、１０⁴コピー、１０⁵
コピー又は１０⁶コピー／５μｌのＲＮＡ標準５μｌ、
又は、陰性標準としてＲＮＡを含まないＴＥ緩衝液５μ
ｌを添加した。なおＲＮＡ標準は以下の配列からなる。 （配列）５’ GAA UAC AA- （HCV RNAの塩基番号１１
〜３００) ３’ 反応液表面にミネラルオイル１００μｌを重層し、６５
℃で１０分間加温した後、チューブを氷水中に移して５
分間静置した。続いて以下の酵素混合液を５μｌ添加
し、４５℃で４時間反応させた。

【００９７】３６Ｕ／μｌの、市販のＳＰ６ＲＮＡポリ
メレース（宝酒造（株）製） １２Ｕ／μｌの、市販のＲＮａｓｅ阻害剤（宝酒造
（株）製） ９Ｕ／μｌのＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ・ＤＮＡ
依存性ＤＮＡポリメラーゼであるＡＭＶ逆転写酵素（宝
酒造（株）製） 反応液の５μｌをとり、アガロース電気泳動を行った。
泳動後、アガロースゲルを１００００倍希釈したＳＹＢ
Ｒ Ｇｒｅｅｎ ＩＩ（宝酒造（株）製）で３０分染色
した。

【００９８】染色されたゲルの様子を図７に示す。図７
から、初期濃度が１０³コピー／５μｌ以上の標的RNA
を用いた場合は、約３００塩基対の位置にバンドが認め
られることが分かる。しかも認められたバンドは、初期
RNA 量に対応した黒化度を示した。この結果から、本発
明によって高感度に標的ＲＮＡを検出できることが分か
る。ここで増幅産物は、標的ＲＮＡの初期量に応じて経
時的に増幅されていることも分かる。

【００９９】実施例８ 増幅産物の同定 増幅産物をＤＮａｓｅ又はＲＮａｓｅで処理した後、増
幅産物を同定した。陰性対象としてのＴＥ緩衝液及び、
１０⁵コピー又は１０⁶コピー／５μｌの標準ＲＮＡを５
μｌ用い、酵素を用いる反応までを実施例７と同様の反
応を行った。ＲＮＡ標準は以下のＲＮＡである。 （配列）５’ GAA UAC AA- （ＨＣＶ ＲＮＡの塩基番
号１１〜３００） ３’ ＤＮＡ標準は以下の配列のＤＮＡ及びその相補鎖からな
る２本鎖ＤＮＡである。（配列）５’ ATT TAG GTG AC
A CTA TAG AAT ACA A-（ＨＣＶ ｃＤＮＡの塩基番号１
１〜３００）- ３’ 反応後、それぞれの反応液を６５℃で３０分間加温し
た。上記３種類の反応液、標準ＲＮＡ（６９ｎｇ／μ
ｌ）及び標準ＤＮＡ（６ｎｇ／μｌ）を各６μｌずつ各
３本のチューブに分注し、うち１本には０．６μｌの
０．５ｍｇ／ｍｌのＲＮａｓｅＡを、他の１本には０．
６μｌの１ｍｇ／ｍｌ ＤＮａｓｅ Ｉを添加し、残り
の１本には何も添加しなかった。これらを３本とも３７
℃で１時間反応させた後、反応液を５μｌとり、２％ア
ガロースゲルで電気泳動を行った。泳動後、アガロース
ゲルを１００００倍希釈したＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ
Ｉ（宝酒造 （株）製）で３０分染色した。なお、標準
ＲＮＡ（６９ｎｇ／μｌ）及び標準ＤＮＡ（６ｎｇ／μ
ｌ）についての反応液組成は、酵素を含まない以外は実
施例７における組成と同一である。

【０１００】電気泳動の結果を図８に示す。図８から、
１０⁶コピーのＲＮＡ標準を標的として反応後、ＤＮａ
ｓｅ Ｉ処理によってＤＮＡ産物を消化した場合、ＲＮ
Ａ産物の黒化度は３４５ｎｇngのＲＮＡ標準に匹敵する
ものだった。また、ＤＮａｓｅ Ｉ処理したＲＮＡ産物
のバンドの位置はＲＮＡ標準と一致した。

【０１０１】一方、１０⁶コピーのＲＮＡ標準を標的と
して反応後、ＲＮａｓｅＡ処理によってＲＮＡ産物を消
化した場合、ＤＮＡ標準と同位置にバンドがみられた。

【０１０２】この結果から、標的ＲＮＡからＲＮＡ産物
とＤＮＡ産物が同時に合成されていることが分かる。

【０１０３】実施例９ ＲＮＡ産物及びＤＮＡ産物の経
時的変化 ＤＮＡ産物量及びＲＮＡ産物量の経時変化を調べた。ま
ず、以下のような組成の反応液を調製し、各３３μｌず
つ１０本のＰＣＲ用チューブに分注した。

【０１０４】６１ｍＭトリス酢酸（ｐＨ８．１） ２０．５ｍＭ酢酸マグネシウム １８９．２ｍＭ酢酸カリウム ２１．７％ ＤＭＳＯ １２％ソルビトール １５ｍＭジチオスレイトール 各１．５ｍＭの、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ 各１．５ｍＭの、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴ
ＴＰ １５１μｇ／ｍｌ ＢＳＡ ０．３μＭの、第３の１本鎖オリゴＤＮＡ （配列）５’ ATT TAG GTG ACA CTA TAG AAT ACA ACA
CTC CAC CAT AGA TCA CTC CCC TG ３’ ０．３μＭの、第２の１本鎖オリゴＤＮＡ （配列）５’ ACT CGC AAG CAC CCT ATC A ３’ 次に、１０⁶コピー／５μｌのＲＮＡ標準と、陰性標準
としてＴＥ緩衝液をそれぞれ８．３μｌずつ、各５本の
チューブに添加した。なおＲＮＡ標準は以下の配列から
なる。 （配列）５’ GAA UAC AA- （HCV RNAの塩基番号１１
〜３００) ３’ 反応液表面にミネラルオイル１００μｌを重層し、６５
℃で１０分間加温した後、チューブを氷水中に移して５
分間静置した。続いて４４℃で１０分間加温後、以下の
酵素混合液を８．６μｌ添加し、４４℃で０、１、２、
３、４時間反応させた後にＲＮＡ標準及び陰性標準をそ
れぞれ１本ずつとり、氷中に移した。。

【０１０５】３２．８Ｕ／μｌの、市販のＳＰ６ＲＮＡ
ポリメレース（宝酒造（株）製） １１．８Ｕ／μｌの、市販のＲＮａｓｅ阻害剤（宝酒造
（株）製） ８．２Ｕ／μｌのＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ・Ｄ
ＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼであるＡＭＶ逆転写酵素
（宝酒造（株）製） 全チューブから反応液の５μｌをとり、２％アガロース
電気泳動を行った。泳動後、アガロースゲルを１０００
０倍希釈したＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＩＩ（宝酒造
（株）製）で３０分染色し写真を撮影した。そしてデン
シトメーターを用いて電気泳動写真からバンドの黒化度
（ＯＤ値）を測定した。

【０１０６】残ったそれぞれの反応液を６５℃で２０分
間加温後、各反応液を１０μｌずつ３本のチューブに分
注し、１本には１μｌの０．５ｍｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅ
Ａを、他の１本には１μｌの１ｍｇ／ｍｌ ＤＮａｓｅ
Ｉを、残りの１本には１μｌのＴＥ緩衝液を添加した。
これらを３本とも３７℃で１時間反応させ、反応液の５
μｌをとり、２％アガロースゲルで電気泳動を行った。
泳動後、ゲルを１００００倍希釈したＳＹＢＲ Ｇｒｅ
ｅｎ ＩＩ（宝酒造（株）製）で３０分染色し写真を撮
影した。そしてデンシトメーターを用いて電気泳動写真
からバンドの黒化度（ＯＤ値）を測定した。

【０１０７】電気泳動写真からのバンド黒化度から定量
したＤＮＡ産物及びＲＮＡ産物量の経時的変化を図９に
示す。ＲＮＡ産物量はＤＮＡ産物量の約４０倍であっ
た。また、ＲＮＡ産物量もＤＮＡ産物量も、ともに反応
開始２時間以降で急激に増加する（立ち上がる）ことが
分かる。この結果は、本発明の方法によるＲＮＡ産物及
びＤＮＡ産物の増加はとも類似した増幅曲線を描くこと
が分かる。

【０１０８】実施例１０ 第４の１本鎖オリゴＤＮＡを
用いた増幅産物量の測定 第４の１本鎖オリゴＤＮＡを用いて、反応液について蛍
光信号測定を行い、合成されたＲＮＡ量を分析した。ま
ず、以下の組成の反応液２０μｌを３０本のＰＣＲ用チ
ューブに分注した。

【０１０９】６０ｍＭトリス酢酸（ｐＨ８．１） ２０．３ｍＭ酢酸マグネシウム １８７．５ｍＭ酢酸カリウム ２２．５％ ＤＭＳＯ １２％ソルビトール 各１．５ｍＭの、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ 各１．５ｍＭの、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴ
ＴＰ １５０μｇ／ｍｌ ＢＳＡ ０．３μＭの、第３の１本鎖オリゴＤＮＡ （配列）５’ ATT TAG GTG ACA CTA TAG AAT ACA ACA
CTC CAC CAT AGA TCA CTC CCC TG ３’ ０．３μＭの、第２の１本鎖オリゴＤＮＡ （配列）５’ ACT CGC AAG CAC CCT ATC A ３’ 次に、１０⁶コピー／５μｌのＲＮＡ標準と、陰性標準
としてＴＥ緩衝液をそれぞれ５μｌずつ、各１５本のチ
ューブに添加した。なおＲＮＡ標準は以下の配列からな
る。 （配列）５’ GAA UAC AA- （ＨＣＶ ＲＮＡの塩基番
号１１〜３００) ３’ 反応液表面にミネラルオイル１００μｌを重層し、６５
℃で１０分間加温した後、チューブを氷水中に移して５
分間静置した。続いて４４℃で１０分間加温後、以下の
酵素混合液を５μｌ添加し、４４℃で０、１、２、３、
４時間反応させた後にＲＮＡ標準及び陰性標準をそれぞ
れ３本ずつとり、氷中に移した。

【０１１０】３６Ｕ／μｌの、市販のＳＰ６ＲＮＡポリ
メレース（宝酒造（株）製） １２Ｕ／μｌの、市販のＲＮａｓｅ阻害剤（宝酒造
（株）製） ９Ｕ／μｌのＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ・ＤＮＡ
依存性ＤＮＡポリメラーゼであるＡＭＶ逆転写酵素（宝
酒造（株）製） 全チューブから反応液の５μｌをとり、２％アガロース
電気泳動を行った。泳動後、各時間で取り出した３本の
チューブ中の反応液を混合し、その中から５μｌとり２
％アガロース電気泳動を行った。泳動後、アガロースゲ
ルを１００００倍希釈したＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＩＩ
（宝酒造（株）製）で３０分染色し写真を撮影した。

【０１１１】混合後の反応液５０μｌに以下の組成の測
定用緩衝液１００μｌを添加した。 ４０ｍＭトリス酢酸（ｐＨ８．１） １３ｍＭ酢酸マグネシウム １２５ｍＭ酢酸カリウム １０ｍＭジチオスレイトール ２Ｕ／μｌ ＲＮａｓｅ阻害剤 ３７．５ｎＭの、第４の１本鎖オリゴＤＮＡ（以下、Ｙ
Ｏ−２７１） （配列）５’ CTC GC*G GGG GCT G ３’ （＊はインターカレーター性蛍光色素であるオキサゾー
ルイエローの結合位置を示す。ＤＮＡ部分の第１〜１１
番目の塩基がＨＣＶ ｃＤＮＡの塩基番号２２３〜２３
３に相補的である。なお蛍光色素のＤＮＡ部分への結合
等については、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ、２４（２４）、４９９２−４９９７（１９９
６年）におけるＹＯ−ＹＰＦ−２７１と同一である。参
考のため、ＹＯ−２７１の構造を図１９に示す） ６５℃で１５分間加温後、氷水中で急冷し、５分間静置
した。引き続き３７℃で１０分間加温した後、予め３７
℃に加温した蛍光測定用セルに移し、励起波長４９０ｎ
ｍ、蛍光波長５１０ｎｍで蛍光強度を測定した。

【０１１２】電気泳動の結果を図１０に、第４の１本鎖
オリゴＤＮＡ（ＹＯ−２７１）からの蛍光信号の測定結
果を図１１に示す。図１１から明らかなように、ＹＯ−
２７１からの蛍光信号はＲＮＡ標準では２時間以降に急
激な立ち上がりを見せたが、陰性対象では蛍光強度の増
加はみられなかった。この結果は、第４の１本鎖オリゴ
ＤＮＡを用いることで増幅産物量を特異的に測定できる
ことを示す。

【０１１３】実施例１１ 第４の１本鎖オリゴＤＮＡの
３’末端修飾 第４の１本鎖オリゴＤＮＡ共存下で１本鎖ＲＮＡを合成
させる場合に、共存するＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレー
スの作用によって該ＤＮＡの３’末端から伸長反応が起
こり、結果的に非特異的な蛍光信号が増加する恐れがあ
る。そこで、ターミナルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）
で処理してオリゴＤＮＡの３’末端を修飾（ｄｄＴＴｐ
の付加）し、その効果を確認した。

【０１１４】以下の組成の反応液（総量５０μｌ）で、
３７℃、１時間のＴｄＴ処理を行った。

【０１１５】１００ｍＭカコジル酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ７．２） １ｍＭ塩化コバルト ０．１ｍＭジチオスレイトール ０．５ｍＭ ｄｄＴＴＰ ０．６Ｕ/ μｌ ＴｄＴ（宝酒造（株）製） ３７．３μＭの、第４の１本鎖オリゴＤＮＡ（ＹＯ−２
７１） 引き続き、フェノール：クロロホルム抽出を行い、水層
を回収し、市販のカラム（クロマ・スピン−１０、商品
名、東洋紡（株）製）で精製後、ＯＤ２６０で定量し
た。

【０１１６】得られたＴｄＴ処理ＹＯ−２７１と未処理
ＹＯ−２７１を用いて、本発明における蛍光信号の測定
を行った。

【０１１７】まず、以下の組成の反応液５０μｌ（未処
理ＹＯ−２７１を添加又はＴｄＴ処理ＹＯ−２７１を添
加）をそれぞれ１０本のチューブに分注した。

【０１１８】６９ｍＭトリス酢酸（ｐＨ８．１） ２０．３ｍＭ酢酸マグネシウム １８７．５ｍＭ酢酸カリウム ２１．５％ ＤＭＳＯ １２％ソルビトール １５ｍＭジチオスレイトール 各１．５ｍＭの、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ 各１．５ｍＭの、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴ
ＴＰ １５０μｇ／ｍｌ ＢＳＡ ０．３μＭの、第３の１本鎖オリゴＤＮＡ （配列）５’ ATT TAG GTG ACA CTA TAG AAT ACA ACA
CTC CAC CAT AGA TCA CTC CCC TG ３’ ０．３μＭの、第２の１本鎖オリゴＤＮＡ （配列）５’ ACT CGC AAG CAC CCT ATC A ３’ １１２．５ｎＭのＴｄＴ処理ＹＯ−２７１又は未処理Ｙ
Ｏ−２７１ 次に、１０⁶コピー／５μｌのＲＮＡ標準と、陰性標準
としてＴＥ緩衝液をそれぞれ１２．５μｌずつ、各５本
のチューブに添加した。なおＲＮＡ標準は以下の配列か
らなる。 （配列）５’ GAA UAC AA- （ＨＣＶ ＲＮＡの塩基番
号１１〜３００) ３’ 反応液表面にミネラルオイル１００μｌを重層し、６５
℃で１０分間加温した後、チューブを氷水中に移して５
分間静置した。続いて４４℃で１０分間加温後、以下の
酵素混合液を１２．５μｌ添加し、４４℃で０、１、
２、３、４時間反応させた後にＲＮＡ標準及び陰性標準
のチューブをとり、氷中に移した。

【０１１９】３４．２Ｕ／μｌの、市販のＳＰ６ＲＮＡ
ポリメレース（宝酒造（株）製） １２Ｕ／μｌの、市販のＲＮａｓｅ阻害剤（宝酒造
（株）製） ８．４Ｕ／μｌのＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ・Ｄ
ＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼであるＡＭＶ逆転写酵素
（宝酒造（株）製） それぞれの反応液５０μｌに下記組成の希釈緩衝液１０
０μｌを添加し、４４℃で５分間加温した後、予め４４
℃に加温した蛍光測定用セルに移し、励起波長４９０ｎ
ｍ、蛍光波長５１０ｎｍで蛍光強度を測定した。

【０１２０】４０ｍＭトリス酢酸（ｐＨ８．１） １３ｍＭ酢酸マグネシウム １２５ｍＭ酢酸カリウム １０ｍＭジチオスレイトール ２Ｕ／μｌ ＲＮａｓｅ阻害剤 未処理及びＴｄＴ処理ＹＯ−２７１を用いた結果を図１
２及び図１３に示す。未処理ＹＯ−２７１を用いた場合
は陰性標準で蛍光信号の増加が見られ、ＲＮＡ標準との
有為な差は認められなかった。これに対してｄｄＴＴｐ
処理したＹＯ−２７１では、両者に有意な差が見られ
た。この結果から、本発明における第４の１本鎖オリゴ
ＤＮＡ共存下でＲＮＡを合成させる場合には、ＲＮＡ依
存性ＤＮＡポリメレースの作用によってＤＮＡの３’末
端から伸長反応が起こらないよう、当該３’末端を修飾
等することが好ましいことが分かる。

【０１２１】実施例１２ 第４の１本鎖オリゴＤＮＡ共
存下でのＲＮＡ又はＤＮＡの合成 実施例１１で調製したｄｄＴＴｐ処理ＹＯ−２７１を用
いて、第４の１本鎖オリゴＤＮＡ共存下でＲＮＡ又はＤ
ＮＡの合成が影響を受けるか否かを調査した。まず、以
下の組成の反応液５０μｌを１０本のチューブに分注し
た。

【０１２２】６０ｍＭトリス酢酸（ｐＨ８．１） ２０．３ｍＭ酢酸マグネシウム １８７．５ｍＭ酢酸カリウム ２１．５％ ＤＭＳＯ １２％ソルビトール １５ｍＭジチオスレイトール 各１．５ｍＭの、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ 各１．５ｍＭの、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴ
ＴＰ １５０μｇ／ｍｌ ＢＳＡ ０．３μＭの、第３の１本鎖オリゴＤＮＡ （配列）５’ ATT TAG GTG ACA CTA TAG AAT ACA ACA
CTC CAC CAT AGA TCA CTC CCC TG ３’ ０．３μＭの、第２の１本鎖オリゴＤＮＡ （配列）５’ ACT CGC AAG CAC CCT ATC A ３’ １１２．５ｎＭのＴｄＴ処理ＹＯ−２７１ 次に、１０⁶コピー／５μｌのＲＮＡ標準と、陰性標準
としてＴＥ緩衝液をそれぞれ１２．５μｌずつ、各５本
のチューブに添加した。なおＲＮＡ標準は以下の配列か
らなる。 （配列）５’ GAA UAC AA- （HCV RNAの塩基番号１１
〜３００) ３’ 反応液表面にミネラルオイル１００μｌを重層し、６５
℃で１０分間加温した後、チューブを氷水中に移して５
分間静置した。続いて４４℃で１０分間加温後、以下の
酵素混合液を１２．５μｌ添加し、４４℃で０、１、
２、３、４時間反応させた後にＲＮＡ標準及び陰性標準
のチューブをとり、氷中に移した。。

【０１２３】３４．２Ｕ／μｌの、市販のＳＰ６ＲＮＡ
ポリメレース（宝酒造（株）製） １２Ｕ／μｌの、市販のＲＮａｓｅ阻害剤（宝酒造
（株）製） ８．４Ｕ／μｌのＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ・Ｄ
ＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼであるＡＭＶ逆転写酵素
（宝酒造（株）製） 全チューブの反応液５μｌをとり、２％アガロースで電
気泳動を行った。泳動後、アガロースゲルを１００００
倍希釈したＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＩＩ（宝酒造（株）
製）で３０分染色し写真を撮影した。そしてデンシトメ
ーターを用いて電気泳動写真からバンドの黒化度（ＯＤ
値）を測定した。

【０１２４】電気泳動の結果を図１４に、電気泳動写真
から黒化度を測定した結果を図１５に示す。ＲＮＡ標準
では経時的な増幅産物量の増加がみられたが、陰性標準
では特異産物の増加はみられなかった。この結果から、
本発明の第４の１本鎖オリゴＤＮＡが共存しても、ＲＮ
Ａの合成等は阻害されないことが分かる。

【０１２５】実施例１３ 第４の１本鎖オリゴＤＮＡ用
いる増幅産物量の経時的変化の分析 実施例１１で調製したｄｄＴＴｐ処理ＹＯ−２７１を用
いて、第４の１本鎖オリゴＤＮＡ共存下で合成されたＲ
ＮＡ量を経時的に測定し、モニターした。まず、以下の
組成の反応液５０μｌを１０本のチューブに分注した。

【０１２６】６０ｍＭトリス酢酸（ｐＨ８．１） ２０．３ｍＭ酢酸マグネシウム １８７．５ｍＭ酢酸カリウム ２１．５％ ＤＭＳＯ １２％ソルビトール １５ｍＭジチオスレイトール 各１．５ｍＭの、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ 各１．５ｍＭの、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴ
ＴＰ １５０μｇ／ｍｌ ＢＳＡ ０．３μＭの、第３の１本鎖オリゴＤＮＡ （配列）５’ ATT TAG GTG ACA CTA TAG AAT ACA ACA
CTC CAC CAT AGA TCA CTC CCC TG ３’ ０．３μＭの、第２の１本鎖オリゴＤＮＡ （配列）５’ ACT CGC AAG CAC CCT ATC A ３’ １１２．５ｎＭのＴｄＴ処理ＹＯ−２７１ 次に、１０⁶コピー／５μｌのＲＮＡ標準と、陰性標準
としてＴＥ緩衝液をそれぞれ１２．５μｌずつ、各５本
のチューブに添加した。なおＲＮＡ標準は以下の配列か
らなる。 （配列）５’ GAA UAC AA- （HCV RNAの塩基番号１１
〜３００) ３’ 反応液表面にミネラルオイル１００μｌを重層し、６５
℃で１０分間加温した後、チューブを氷水中に移して５
分間静置した。続いて４４℃で１０分間加温後、以下の
酵素混合液を１２．５μｌ添加し、４４℃で０、１、
２、３、４時間反応させた後にＲＮＡ標準及び陰性標準
のチューブをとり、氷中に移した。。

【０１２７】３４．２Ｕ／μｌの、市販のＳＰ６ＲＮＡ
ポリメレース（宝酒造（株）製） １２Ｕ／μｌの、市販のＲＮａｓｅ阻害剤（宝酒造
（株）製） ８．４Ｕ／μｌのＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ・Ｄ
ＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼであるＡＭＶ逆転写酵素
（宝酒造（株）製） それぞれの反応液５０μｌに下記組成の希釈緩衝液１０
０μｌを添加し、４４℃で５分間加温した後、予め４４
℃に加温した蛍光測定用セルに移し、励起波長４９０ｎ
ｍ、蛍光波長５１０ｎｍで蛍光強度を測定した。

【０１２８】４０ｍＭトリス酢酸（ｐＨ８．１） １３ｍＭ酢酸マグネシウム １２５ｍＭ酢酸カリウム １０ｍＭジチオスレイトール ２Ｕ／μｌ ＲＮａｓｅ阻害剤 蛍光測定の結果を図１６に示す。ＲＮＡ標準では蛍光強
度の経時的な増加がみられたが、陰性対象では蛍光増加
は認められなかった。蛍光増加の様子（プロファイル）
は実施例１２の電気泳動による定量結果とほぼ一致し
た。この結果から、第４の１本鎖オリゴＤＮＡを使用す
ることにより、特異的な増幅産物量（合成されたＲＮＡ
量）の経時変化を測定できることが分かる。

【０１２９】実施例１４ 第４の１本鎖オリゴＤＮＡを
用いた蛍光信号の経時的変化測定による分析 既知濃度の標的ＲＮＡについて、実施例１１で調製した
ｄｄＴＴｐ処理ＹＯ−２７１を用いて蛍光強度の経時的
変化を調べた。まず、以下の組成の反応液５０μｌを１
７本のＰＣＲ用チューブに分注した。

【０１３０】６０ｍＭトリス酢酸（ｐＨ８．１） ２０．３ｍＭ酢酸マグネシウム １８７．５ｍＭ酢酸カリウム ２１．５％ ＤＭＳＯ １２％ソルビトール １５ｍＭジチオスレイトール 各１．５ｍＭの、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ 各１．５ｍＭの、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴ
ＴＰ １５０μｇ／ｍｌ ＢＳＡ ０．３μＭの、第３の１本鎖オリゴＤＮＡ （配列）５’ ATT TAG GTG ACA CTA TAG AAT ACA ACA
CTC CAC CAT AGA TCA CTC CCC TG ３’ ０．３μＭの、第２の１本鎖オリゴＤＮＡ （配列）５’ ACT CGC AAG CAC CCT ATC A ３’ １１２．５ｎＭのＴｄＴ処理ＹＯ−２７１ 次に、１０⁴コピー又は１０⁵コピー／５μｌのＲＮＡ標
準と、陰性標準としてＴＥ緩衝液をそれぞれ１２．５μ
ｌずつ、各４本のチューブに添加した。更に１０⁶コピ
ー／５μのＲＮＡ標準１２．５μｌをそれぞれ５本のチ
ューブに添加した。なおＲＮＡ標準は以下の配列からな
る。 （配列）５’ GAA UAC AA- （HCV RNAの塩基番号１１
〜３００) ３’ 反応液表面にミネラルオイル１００μｌを重層し、６５
℃で１０分間加温した後、チューブを氷水中に移して５
分間静置した。続いて４４℃で１０分間加温後、以下の
酵素混合液を１２．５μｌ添加し、４４℃で０、１時間
（１０⁶コピー／５μｌのＲＮＡ標準の場合のみ）、
２、３、４時間反応させた後にＲＮＡ標準及び陰性標準
のチューブを１本とり、氷中に移した。。

【０１３１】３４．２Ｕ／μｌの、市販のＳＰ６ＲＮＡ
ポリメレース（宝酒造（株）製） １２Ｕ／μｌの、市販のＲＮａｓｅ阻害剤（宝酒造
（株）製） ８．４Ｕ／μｌのＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ・Ｄ
ＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼであるＡＭＶ逆転写酵素
（宝酒造（株）製） それぞれの反応液５０μｌに下記組成の希釈緩衝液１０
０μｌを添加し、４４℃で５分間加温した後、予め４４
℃に加温した蛍光測定用セルに移し、励起波長４９０ｎ
ｍ、蛍光波長５１０ｎｍで蛍光強度を測定した。

【０１３２】４０ｍＭトリス酢酸（ｐＨ８．１） １３ｍＭ酢酸マグネシウム １２５ｍＭ酢酸カリウム １０ｍＭジチオスレイトール １Ｕ／μｌ ＲＮａｓｅ阻害剤 各時点で測定された蛍光強度からバックグラウンドの蛍
光強度を差し引いた結果を図１７に示す。得られた蛍光
増加の増幅曲線について、反応時間３時間目の蛍光増加
を標的ＲＮＡの初期濃度に対してプロットしたところ
（図１８）、初期濃度に依存した蛍光増加が認められ
た。この結果から、蛍光強度の経時変化を測定すること
によって得られた増幅曲線をもとに、標的ＲＮＡの初期
濃度と蛍光増加から検量線を作成できることが分かる。
同様に未知濃度試料についても蛍光増加を測定すること
によって、標的ＲＮＡの初期量を算出可能であることが
分かる

【０１３３】。

【発明の効果】以上の説明から明らかなように、本発明
によれば、試料中の特定塩基配列を含む１本鎖ＲＮＡに
ついて、反応液を急激に昇温・降温するという操作を繰
り返すことなく、概ね一定温度で分析することが可能と
なる。しかも本発明の分析方法では、担体を使用せずに
均一系で高感度かつ特異的に標的核酸を分析することが
できる。

【０１３４】本発明では、試料中の微量の１本鎖ＲＮＡ
をもとにして、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレースのプロ
モーター領域を末端にもつ２本鎖ＤＮＡが合成され、こ
れが多量の１本鎖ＲＮＡの合成源となり、さらに合成さ
れた１本鎖ＲＮＡは新たな２本鎖ＤＮＡの合成に寄与す
る。この結果、時間の経過とともに中間体として反応に
介在する１本鎖ＲＮＡ量は飛躍的に増大することになる
が、該ＲＮＡの合成速度及び最終的な合成量は、試料中
にそもそも含まれていた標的ＲＮＡ量に依存することか
ら、該ＲＮＡ量を測定することにより標的ＲＮＡの分析
が可能となるのである。

【０１３５】本発明における第４の１本鎖オリゴＤＮＡ
は、反応液中の１本鎖ＲＮＡと結合し蛍光強度を増大等
することから、反応液について蛍光強度を測定すること
により、試料中の標的ＲＮＡの初期量を分析することが
可能となる。

【０１３６】このように本発明の分析方法では、１本鎖
のＲＮＡ及びＤＮＡが反応中間体として合成され、これ
らにプライマーが結合して反応が進行することから一定
温度での実施が可能で、ＰＣＲのようにプライミングを
目的とした反応液の急激な昇温・降温を多数回にわたっ
て繰り返す必要がないため、自動化することも容易であ
る。また本発明では第４の１本鎖オリゴＤＮＡの使用に
より、１本鎖ＲＮＡ合成過程での蛍光強度を測定すれ
ば、合成されたＲＮＡ量等をモニターすることが可能で
あり、反応生成物について電気泳動を行ったりサンドイ
ッチ法等を行う必要が無く、標的ＲＮＡの有無及び量を
高精度かつ迅速に均一系で分析することが可能な臨床診
断等で用いるのに極めて簡便な一段階の分析方法が提供
される。

【０１３７】一方、本発明は、一定温度での反応で特定
塩基配列からなるＲＮＡを大量に製造できることから、
従来の化学合成法によるものやＲＴ−ＰＣＲ法による場
合に比較して、穏和な条件下で実施可能でしかも簡便な
ＲＮＡの製造方法も提供する。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１の結果を示す図である。第２及び第３
の１本鎖オリゴＤＮＡを用いてＰＣＲを行った後、合成
産物を２％アガロースゲル電気泳動した結果であり、レ
ーン番号２〜４は既知濃度の対象ＤＮＡを、レーン番号
５〜７はＰＣＲ産物０．２〜５μｌである。

【図２】実施例２の結果を示す図である。酢酸マグネシ
ウムの濃度を変えて反応を行った後、２％アガロースゲ
ル電気泳動を行った結果であり、図中矢印の位置（約３
００塩基対）に特異的産物のバンドが出現した。なお酢
酸マグネシウム濃度は最終濃度を示した。

【図３】実施例３の結果を示す図である。酢酸カリウム
の濃度を変えて反応を行った後、２％アガロースゲル電
気泳動を行った結果であり、図中矢印の位置（約３００
塩基対）に特異的産物のバンドが出現した。なお酢酸カ
リウム濃度は最終濃度を示した。

【図４】実施例４の結果を示す図である。ソルビトール
の濃度を変えて反応を行った後、２％アガロースゲル電
気泳動を行った結果であり、図中矢印の位置（約３００
塩基対）に特異的産物のバンドが出現した。

【図５】実施例５の結果を示す図である。各種濃度のDN
A 標準を用いて反応を行った後、２％アガロースゲル電
気泳動を行った結果であり、図中矢印の位置（約３００
塩基対）に特異的産物のバンドが出現した。

【図６】実施例６の結果を示す図である。１３３ｍｅｒ
ＲＮＡ、該ＲＮＡの特定塩基配列の５’側隣接配列に
相補的な配列を有する第１の１本鎖オリゴＤＮＡ及び各
種濃度のＲＮａｓｅＨを反応させた後、１２％尿素変性
ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った結果であり、
図中矢印は１３３ｍｅｒ及び７２ｍｅｒの位置を示す。

【図７】実施例７の結果を示す図である。各種濃度のＲ
ＮＡ標準を用いて反応を行った後、２％アガロースゲル
電気泳動を行った結果であり、図中矢印の位置（約３０
０塩基対）に特異的産物のバンドが出現した。

【図８】実施例８の結果を示す図である。１０⁶コピー
／５μｌのＲＮＡ標準を用いて反応を行った後、産物を
ＲＮａｓｅＡ又はＤＮａｓｅＩで処理し、２％アガロー
スゲル電気泳動を行った結果であり、図中にはＤＮＡ産
物とＲＮＡ産物のバンドの位置を示した。

【図９】実施例９の結果を示す図である。１０⁶コピー
／５μｌのＲＮＡ標準を用い、時間を変化させて反応を
行った後、ＲＮａｓｅＡ又はＤＮａｓｅＩで処理し、２
％アガロースゲル電気泳動を行い、デンシトメーターで
定量した結果を示す。

【図１０】実施例１０の結果を示す図である。１０⁶コ
ピー／５μｌのＲＮＡ標準を用い、時間を変化させて反
応を行った後、２％アガロースゲル電気泳動を行った結
果である。

【図１１】実施例１０の結果を示す図である。図１０で
得られた産物に第４の１本鎖オリゴＤＮＡを添加し、蛍
光強度を測定した結果を示す。

【図１２】実施例１１の結果を示す図である。第４の１
本鎖オリゴＤＮＡの存在下で１０⁶コピー／５μｌのＲ
ＮＡ標準を用い、時間を変化させて反応を行った後、蛍
光強度を測定した結果を示す。

【図１３】実施例１１の結果を示す図である。３’末端
を処理（ｄｄＴＴＰを付加）した第４の１本鎖オリゴＤ
ＮＡ共存下、１０⁶コピー／５μｌのＲＮＡ標準を用
い、時間を変化させて反応を行った後、蛍光強度を測定
した結果を示す。

【図１４】実施例１２の結果を示す図である。３’末端
を処理（ｄｄＴＴＰを付加）した第４の１本鎖オリゴＤ
ＮＡ共存下、１０⁶コピー／５μｌのＲＮＡ標準を用
い、時間を変化させて反応を行った後、２％アガロース
ゲル電気泳動を行った結果を示す。

【図１５】実施例１２の結果を示す図である。図１４の
電気泳動を行った結果をデンシトメーターで定量した結
果を示す。

【図１６】実施例１３の結果を示す図である。３’末端
を処理（ｄｄＴＴＰを付加）した第４の１本鎖オリゴＤ
ＮＡ共存下、１０⁶コピー／５μｌのＲＮＡ標準を用
い、時間を変化させて反応を行った後、蛍光強度を測定
した結果を示す。

【図１７】実施例１４の結果を示す図である。３’末端
を処理（ｄｄＴＴＰを付加）した第４の１本鎖オリゴＤ
ＮＡ共存下、１０⁴コピー、１０⁵コピー又は１０⁶コピ
ー／５μｌのＲＮＡ標準を用い、時間を変化させて反応
を行った後、蛍光強度を測定した結果を示す。

【図１８】実施例１４の結果を示す図である。図１７で
得られた増幅曲線から、ＲＮＡ標準の初期濃度に対する
3 時間目蛍光増加をプロットした結果を示す。

【図１９】実施例で使用した第４の１本鎖オリゴＤＮＡ
であるＹＯ−２７１の構造を示す。図中左の分子はＤＮ
Ａ部分であり、右の分子はインターカレーター性蛍光色
素であるオキサゾールイエローであり、両者は図にしめ
したようなリンカーを介して結合され、ＤＮＡ部分が２
本鎖を形成した場合、蛍光色素が該２本鎖部分にインタ
ーカレーション可能にされている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 2G045 AA35 BB50 DA12 DA13 DA14 FB01 FB07 FB12 4B063 QA01 QA19 QQ06 QQ10 QQ52 QR08 QR31 QR32 QR41 QR42 QR43 QR56 QR66 QS02 QS16 QS25 QX02

Claims (28)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】概ね一定の温度で試料中の特定塩基配列を
   含む１本鎖ＲＮＡを分析するための簡便で精度の高い方
   法であって、少なくとも以下（Ａ）〜（Ｉ）の試薬を用
   い、試料にこれらを順次添加するか、これらの２以上を
   一度に添加するか又はこれらを一度に添加する操作
   （（Ａ）〜（Ｉ）は、この順に添加することを要しな
   い）と、少なくとも試薬（Ａ）〜（Ｈ）を添加後に試薬
   （Ｉ）共存下で蛍光信号を１度以上測定する操作を含む
   方法； （Ａ）前記１本鎖ＲＮＡ中の特定塩基配列の５’側隣接
   配列に相補的な配列を有する第１の１本鎖オリゴ核酸、
   （Ｂ）特定塩基配列３’末端配列に相補的な配列を有す
   る第２の１本鎖オリゴＤＮＡ、（Ｃ）ＲＮＡ依存性ＤＮ
   Ａポリメレース、（Ｄ）デオキシリボヌクレオシド三燐
   酸、（Ｅ）５’末端側から順に（１）ＤＮＡ依存性ＲＮ
   Ａポリメレースのプロモーター配列、（２）該プロモー
   ターのエンハンサー配列及び（３）特定塩基配列の５’
   末端配列と同一の塩基配列を有する第３の１本鎖オリゴ
   ＤＮＡ、（Ｆ）ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース、
   （Ｇ）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレース、（Ｈ）リボヌ
   クレオシド三燐酸、及び、（Ｉ）特定塩基配列に相補的
   な配列を有し、該配列を有する核酸と結合した場合に測
   定可能な蛍光信号を発するように標識された第４の１本
   鎖オリゴＤＮＡ。
2. 【請求項２】前記温度が３５〜６０℃の範囲から選択さ
   れた温度であることを特徴とする請求項１の方法。
3. 【請求項３】試薬（Ａ）における第１のオリゴ核酸とし
   てＤＮＡが用いること、及び、ＲＮａｓｅＨを添加する
   操作と該操作の後でかつ試薬（Ｂ）の添加に先立ち、昇
   温によりＲＮａｓｅＨを失活させる操作又はＲＮａｓｅ
   Ｈを失活させる阻害剤を添加する操作を行うことを特徴
   とする請求項１の方法。
4. 【請求項４】試薬（Ａ）の添加後、試薬（Ｂ）〜（Ｈ）
   を一度に添加し、更に試薬（Ｉ）を添加することを特徴
   とする請求項３の方法。
5. 【請求項５】試薬（Ａ）の添加後、試薬（Ｂ）〜（Ｉ）
   を一度に添加することを特徴とする請求項３の方法。
6. 【請求項６】試薬（Ａ）における第１のオリゴ核酸とし
   てボザイム又はＤＮＡザイムを用いることを特徴とする
   請求項１の方法。
7. 【請求項７】更にジメチルスルホオキサイド及び／又は
   ＤＮＡ−ＲＮＡ２本鎖中のＲＮＡを分解する酵素を用い
   ることを特徴とする請求項１の方法。
8. 【請求項８】ジメチルスルホオキサイドが５〜２０％の
   濃度範囲であることを特徴とする請求項７の方法。
9. 【請求項９】ＤＮＡ−ＲＮＡ中のＲＮＡを分解する酵素
   として、試薬（Ｃ）におけるＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメ
   レースを用いることを特徴とする請求項７の方法。
10. 【請求項１０】試薬（Ｃ）及び（Ｆ）におけるＲＮＡ依
    存性ＤＮＡポリメレースとＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメレ
    ースとして両ポリメレース活性を有する同一の酵素を用
    い、これにより実質的に試薬（Ｃ）又は（Ｆ）の添加操
    作を省略することを特徴とする請求項１の方法。
11. 【請求項１１】前記酵素がトリ筋芽細胞腫ウイルスポリ
    メレースであることを特徴とする請求項１０の方法。
12. 【請求項１２】試薬（Ｂ）及び（Ｅ）における第２のオ
    リゴＤＮＡ及び第３のオリゴＤＮＡとして、それぞれ
    ０．０２〜１μＭのＤＮＡを用いることを特徴とする請
    求項１の方法。
13. 【請求項１３】試薬（Ｇ）におけるＤＮＡ依存性ＲＮＡ
    ポリメレースとしてファージｓｐ６ポリメレース、ファ
    ージＴ３ポリメレース又はファージＴ７ポリメレースか
    ら選ばれる１種以上の酵素を用いることを特徴とする請
    求項１の方法。
14. 【請求項１４】試薬（Ｉ）における第４のオリゴＤＮＡ
    として、インターカレーター性蛍光色素が結合されたＤ
    ＮＡが用い、ここで該インターカレーター性蛍光色素
    は、該ＤＮＡが核酸と相補結合を形成すると２本鎖部分
    にインターカレーションして蛍光特性が変化するもので
    あることを特徴とする請求項１の方法。
15. 【請求項１５】試薬（Ｉ）における第４のオリゴＤＮＡ
    が、その３’末端部分に特定塩基配列に非相補的な配列
    を含み、又は、その３’末端部分が修飾されたＤＮＡで
    あることを特徴とする請求項１又は１４の方法。
16. 【請求項１６】測定された蛍光信号又は測定された蛍光
    信号の経時的変化から試料に存在した１本鎖ＲＮＡの存
    在を検出し又はその存在量を推定する操作を含む請求項
    １の方法。
17. 【請求項１７】添加される試薬がいずれも塩化物を含ま
    ない試薬であることを特徴とする請求項１の方法。
18. 【請求項１８】更に酢酸塩を用いることを特徴とする請
    求項１の方法。
19. 【請求項１９】酢酸塩が５〜２０ｍＭの濃度範囲の酢酸
    マグネシウム又は５０〜２００ｍＭの濃度範囲の酢酸カ
    リウムであることを特徴とする請求項１８の方法。
20. 【請求項２０】更にソルビトールを用いることを特徴と
    する請求項１の方法。
21. 【請求項２１】概ね一定の温度で特定塩基配列の核酸を
    製造するための簡便な方法であって、少なくとも以下
    （Ａ）〜（Ｇ）の試薬を用い、５’末端側から順に
    （１）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレースのプロモーター
    配列、（２）該プロモーターのエンハンサー配列及び
    （３）特定塩基配列を有する１本鎖ＤＮＡ、又は、該Ｄ
    ＮＡと該ＤＮＡの相補鎖からなる２本鎖ＤＮＡにこれら
    を順次添加するか、これらの２以上を一度に添加するか
    又はこれらを一度に添加する操作（（Ａ）〜（Ｈ）は、
    この順に添加することを要しない）と、少なくとも試薬
    （Ａ）〜（Ｇ）の添加後に試薬（Ｈ）の共存下で蛍光信
    号を１度以上測定する操作を含む方法；（Ａ）特定塩基
    配列３’末端配列に相補的な配列を有する１本鎖オリゴ
    ＤＮＡ、（Ｂ）ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース （Ｃ）ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース、（Ｄ）デオキ
    シリボヌクレオシド三燐酸、（Ｅ）ＤＮＡ依存性ＲＮＡ
    ポリメレース、（Ｆ）リボヌクレオシド三燐酸、（Ｇ）
    ５’末端側から順に（１）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレ
    ースのプロモーター配列、（２）該プロモーターのエン
    ハンサー配列及び（３）特定塩基配列の５’末端配列と
    同一の塩基配列を有する１本鎖オリゴＤＮＡ、及び、
    （Ｈ）特定塩基配列に相補的な配列を有し、該配列を有
    する核酸と結合した場合に測定可能な蛍光信号を発する
    ように標識された１本鎖オリゴＤＮＡ。
22. 【請求項２２】測定された蛍光信号又は測定された蛍光
    信号の経時的変化が所定量の特定塩基配列核酸が製造さ
    れたことを示した場合に、ＤＮａｓｅを添加して特定塩
    基配列の１本鎖ＲＮＡを得ることを特徴とする請求項２
    １の方法。
23. 【請求項２３】測定された蛍光信号又は測定された蛍光
    信号の経時的変化が所定量の特定塩基配列核酸が製造さ
    れたことを示した場合に、ＲＮａｓｅを添加して特定塩
    基配列のＤＮＡとその相補鎖からなる２本鎖ＤＮＡを得
    ることを特徴とする請求項２１の方法。
24. 【請求項２４】少なくとも、第１の１本鎖オリゴ核酸を
    含む第１試薬、トリス酢酸塩、酢酸マグネシウム、酢酸
    カリウム、ソルビトール及びジメチルスルホオキシドを
    含む第２試薬、ジチオスレイトール、デオキシリボヌク
    レオシド三燐酸、リボヌクレオシド三燐酸、牛血清アル
    ブミン、第２の１本鎖オリゴＤＮＡ及び第３の１本鎖オ
    リゴＤＮＡを含む第３試薬、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメ
    レース、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース、ＤＮＡ依存
    性ＲＮＡポリメレース及びＲＮａｓｅ阻害剤を含む第４
    試薬、そして第４の１本鎖オリゴＤＮＡを含む第５試薬
    から構成される、請求項１又は２１の方法を実施するた
    めの試薬セット。
25. 【請求項２５】少なくとも、第１の１本鎖オリゴ核酸を
    含む第１試薬、トリス酢酸塩、酢酸マグネシウム、酢酸
    カリウム、ソルビトール及びジメチルスルホオキシドを
    含む第２試薬、ジチオスレイトール、デオキシリボヌク
    レオシド三燐酸、リボヌクレオシド三燐酸、牛血清アル
    ブミン、第２の１本鎖オリゴＤＮＡ、第３の１本鎖オリ
    ゴＤＮＡ及び第４の１本鎖オリゴＤＮＡを含む第３試
    薬、そして、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース、ＤＮＡ
    依存性ＤＮＡポリメレース、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメ
    レース及びＲＮａｓｅ阻害剤を含む第４試薬から構成さ
    れる、請求項１又は２１の方法を実施するための試薬セ
    ット。
26. 【請求項２６】少なくとも、第１の１本鎖オリゴ核酸を
    含む第１試薬、トリス酢酸塩、酢酸マグネシウム、酢酸
    カリウム、ソルビトール及びジメチルスルホオキシドを
    含む第２試薬、ジチオスレイトール、デオキシリボヌク
    レオシド三燐酸、リボヌクレオシド三燐酸、牛血清アル
    ブミン、第２の１本鎖オリゴＤＮＡ及び第３の１本鎖オ
    リゴＤＮＡを含む第３試薬、そして、第４の１本鎖オリ
    ゴＤＮＡ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース、ＤＮＡ依
    存性ＤＮＡポリメレース、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメレ
    ース及びＲＮａｓｅ阻害剤を含む第４試薬から構成され
    る、請求項１又は２１の方法を実施するための試薬セッ
    ト。
27. 【請求項２７】少なくとも、第１の１本鎖オリゴ核酸、
    第２の１本鎖オリゴＤＮＡ、第３の１本鎖オリゴＤＮ
    Ａ、第４の１本鎖オリゴＤＮＡ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポ
    リメレース、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメレース、ＤＮＡ
    依存性ＲＮＡポリメレース、デオキシリボヌクレオシド
    三燐酸、リボヌクレオシド三燐酸、トリス酢酸塩、酢酸
    マグネシウム、酢酸カリウム、ソルビトール、ジメチル
    スルホオキシド、ジチオスレイトール、牛血清アルブミ
    ン及びＲＮａｓｅ阻害剤を含む、請求項１又は２１の方
    法を実施するための試薬。
28. 【請求項２８】少なくとも、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメ
    レース及びＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースとして両ポ
    リメレース活性を有する同一の酵素を含むことを特徴と
    する請求項２４〜２７いずれかの試薬セット又は試薬。