WO2007094506A1

WO2007094506A1 - 生物材料からの核酸抽出法

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Publication number: WO2007094506A1
Application number: PCT/JP2007/053126
Authority: WO
Inventors: Shigeo Tsuchiya; Toshinori Hayashi
Original assignee: Tosoh Corporation
Priority date: 2006-02-15
Filing date: 2007-02-14
Publication date: 2007-08-23
Also published as: JPWO2007094506A1; KR20080094692A; TW200811291A; JP5212099B2; EP1992689A1; EP1992689A4; US20100035331A1; KR101066179B1; CN101384715A; EP1992689B1

Abstract

生物材料を含む試料から生物材料由来の核酸を抽出する方法であって、前記生物材料と少なくとも界面活性剤を含む水溶液を混合し、加熱処理を行った後に前記水溶液を除去して生物材料を分離し、引き続いて該生物材料に固形粉末懸濁液を添加し、これを撹拌あるいは超音波処理することによって前記生物材料を破砕し、該生物材料の核酸を抽出することを特徴とする核酸抽出方法。

Description

明細書生物材料からの核酸抽出法技術分野

本発明は、核酸増幅反応に供する核酸を、生体試料中の生物材料から簡便かつ迅速に抽出する方法に関するもので、感染症検査などの医療分野、分子生物学などの研究分野、食品安全管理などの産業分野などに適用可能である。特に、本発明により、マイコバクテリゥム属などの.硬い細胞壁を有する生物材料から核酸を簡単かつ効率よく抽出でき、その後の核酸増幅反応を用いた遺伝子診断を行うことができる。背景技術

従来、目的試料から核酸を調製する場合、試料の性質に応じて適切な抽出法と、精製法を選択し、抽出'、精製の 2つの工程を順に行うことが一般的である。

ウィルス、微生物、原虫、植物または動物組織などの生物材料から核酸を抽出する一般的方法として、ホモジェナイザー等による機械的方法、変性剤等による化学的な方法、酵素等による生物学的方法がある。又、凍結した試料に粒子状の固形物を添加し混在させ、試料を攪拌することにより細胞を破砕する方法がある。このうち、塩酸グァニジンや、チォシアン酸グァニジンなどの変性剤を用いて抽出する方法（M o l e c u l a r. C l o n i n g , A l a b o r a t o r y m a n u a l A p p e n d i 7. 2 3〜 7 . 2, 5 (N e w Y o r k L a b o r a t o r y , 1 9 8 9年）参照）は抽出物中に変性剤を含み、それ.自体が核酸の増幅反応を阻害するため、抽出後、轎製過程が必要となる。酵素処理による核酸抽出は時間がかかるため処理効率が悪いという問題があり、特にマィコパクテリゥム属の細菌や真菌類であるカビなどの胞子など細胞壁が堅いものに適用した場合は、菌体が壌れないために、核酸の抽出効率が極端に悪い。

そこで、細胞壁の堅く、菌体破砕が難しいという問題を克服するため、微粒子を添加し、超音波洗浄器を用いて超音波処理を行い、核酸を放出する方法が報告されている。（米国特許 5 , 3 7 4 , 5 2 2号参照）。この核酸放出法は簡便で破砕効率もよいが、喀痰や糞便などの検体から核酸を抽出し、これを遺伝子増幅に使用するためには増幅反応阻害物を除くためにさらに精製工程を加えなければならない。 - そこで.、多数の検体の処理を迅速に行うために、生物材料中の核酸を簡便かつ効率良く分離し、抽出物をそのまま遺伝子増幅反応に適用可能な核酸抽出法が望まれていた。発明の開示

遺伝子検査に用いられる検体としては、血液、尿、喀痰、膿、血液培養液、スヮブ、コロニ一等があげられる。これらの検体から抽出した核酸に対し、直接測定を行う場合もあるが、近年の核酸検査では、微量核酸の定性，定量を可能ならしめるために、種々の増幅反応を用いて検体から抽出した核酸を増幅した後、測定を行うことが一般化してきている。このような核酸増幅反応には、一例を示せば、例えば、特許第 2 6 5 0 1 5 9.号公報に記載されたいわゆる N A S B A (N u c l e i c A c i d S e q u e n c e B a s e d, Am p i i f i c a t i o n ) 法や特表平 4一 5 0 0 7 5 9 号公報に記載されたいわゆる TMA (T r n s c r i p t i o n -M e d i a t e d Am p i i f i c a t i o n ) 法、および本実施例の方法である特開 2 0 0 0一 1 4 4 0 ひ号公報記載の TR C ( T r a n s c r i p t i o n— R e v e r s e t r a n s c r i p t i o n C o n c e r t e d r e a c t i o n )' (特願平 1 0 - 1 8 6 4 3 4 ) 等の R NA増幅法、および P C R (P o l ym e r a s e C h a i n R e a c t i o n ) 等の DNA増幅法が挙げられる。

前記した従来の核酸抽出法によっても前記した種々の検体から核酸を抽出することが可能である。しかしながら、核酸抽出物を前記のような増幅反応に供する頻度が高まるにつれ、従来の核酸抽出法によって得られた核酸抽出物の中には、前記のような核酸増幅反応で使用される逆転写酵素や DNA.ポリメレース等の酵素類の活性または反応を阻害する核酸増幅反応阻害物質が存在する可能性が指摘されている。前記された検体のなかでも喀痰は、特に気道粘液や各種核酸、細胞などの生体成分に由来する核酸増幅反応を阻害する物質が存在する可能性が高いことが指摘されているが、それらが核酸抽出物に混入すると核酸増幅反応が阻害され、結果的に正確な検査が行えなくなってしまう。

遺伝子検査では、通常、内部標準が用いられ、偽陰性を防止するとはできる。しかしながら、核酸増幅反応を阻害する物質を核酸抽出工程において除去することが最も望ましい解決法であることは明らかである。

そこで本願発明の目的は、核酸を抽出すべき生物材料から核酸増幅反応を阻害する物質を除去した上で、とくにマイコバクテリゥム属などの硬い細胞壁を有する細菌から核酸を簡単かつ効率よく抽出する,方法及び該方法を実施するためのキットを提供することである前記目的を達成するためになされた本願第 1の発明は、生物材料を含む試料から生物材料由来の核酸を抽出する方法であって、前記生物材料と少なくとも界面活性剤を含む水溶液を混合し、加熱処理を行つた後に前記水溶液を除去して生物材料を分離し、. 引き続いて該生物材料に固形粉末懸濁液を添加し、これを撹拌あるいは超音波処理することによって前記生物材料を破砕し、該生物材料の核酸を抽出することを特徴とする。また、本願第 2の発明は前記第 1の発明に係り、前記界面活性剤がステロイド骨格を持つァニオン性界面活性剤あるいは両性界面活性剤であることを特徴とする。本願第 3 の発明は、前記第 2の発明に係り、前記ァニオン性界面活性剤あるいは両性界面活性剤が胆汁酸、コール酸、デォキシコール酸、 3 - [ (3 -コールアミドプロピル) ジメチルアンモニォ] プロパンスルホン酸（C HA P S ) 及びそれらの塩から選ばれることを特徴とする。本願第 4の発明は、前記界面活性剤の濃度が 0 , l mM〜 5 0 Ι Μの範囲であることを特徴とする。本願第 5の発明は、前記加熱処理の温度が 6 0 °C〜 9 0 °Cであることを特徴とする。本願第 6の発明は、前記固形粉末が無定形であり、その長径が 3 2 以下であり、その比重が 3. 5以上であり、その硬度（Hv l O ) 力 6 0 0 以上であることを特徴とする。本願第 7の発明は、前記無定形固形粉末がジルコニァであることを特徴とする。本願第 8の発明は、生物材料を含む試料から生物材料由来の核酸を抽出する方法であって、（ 1 ) 前記試料から生物材料を分離する、（ 2 ) 該生物材料と少なくともコール酸を 0. 1〜 5 0 m Mの濃度で含む水溶液を混合する、（ 3 ) 6 0〜 9 0 °Cで加熱処理をした後、前記水溶液を除去して前記生物材料を分離する、（ 4 ) 引き続いて該生物材料に、無定形で長径が 2 0 ^ m以下であり、その比重が 4. 5〜 6. 5であり、その硬度（Hv 1 0 ) が 8 0 0以上であ.るジルコニァ粉末を含む懸濁液を添加する、（ 5 ) 超音波処理により前記生物材料を破砕する、（ 6 ) 該破砕物の上清中に目的の核酸を得る、工程からなることを特徴とする。本願第 9の発明は、前記超音波処理が、少なくとも二つの波長の超音波で同時あるいは交互に処理することによってなされることを特徴とする。本願第 1 0の発明は、前記生物材料がゥィルス、微生物、原虫、植物又は動物組織であることを特徴とする。本願第 1 1の発明は、前記微生物がマイコバクテリゥム属に属するものであることを特徴とする。本願第 1 2の発明は、前記生物材料を含む試料が、喀痰、胃液、尿、膿、腹水、胸水、心嚢水、血液、組織などの生物由来試料、気管支洗浄液、肺胞洗浄液などの組織洗浄液、培地、又は土、水、空気、などの環境材料であることを特徴とする。本願第 1 3の発明は、 .前記第 1〜 1 2の発明に係る核酸抽出方法を実施するための試薬キットであって、少なくとも、前記界面活性剤を含む試薬、および前記固形粉末を構成成分として含む試薬からなることを特徴とする。以下、本発明を詳細に説明する。図面の簡単な説明

図 1 は実施例 1で行った方法で、喀痰 N A L C処理物からの核酸抽出物に各種濃度の結核菌 1 6 S r R NAの標準 R NAを加えて T 反応を行った際の結果を示す。

図 2は実施例 2で行つた B C G 1 0菌から 1 6 0菌を 2 0 0 xL の結核陰性喀痰 N A L C処理物に分散させた検体から核酸抽出を行い、得られた抽出物を用いて R N A増幅反応を行った際の反応時間と蛍光強度比のグラフを示す。 1 Q菌 / 2 0 0 までの検体が検出できた。

図, 3は実施例 3で行つたマイコバクテリゥム ' アビゥム（My c o b a c t e r i um a v i u m) 1.0菌から 1 6 0菌を 2 0 0 の結核陰性喀痰 NAL C処理物に分散させた検体から核酸抽出を行い、得られた抽出物を用いて R N A増幅反応を行った際の反応時間と蛍光強度比のグラフを示す。 1 0菌 / 2 0 0 ； Lまでの検体が検出できた。

図 4は実施例 4で行ったマイコバクテリゥム · イントラセルラー (My c o b a c t e r i u m i n t r a c e 1 1 u 1 a r e ) 1 0菌から 1 6 0菌を 2 0 0 Lの結核陰性喀痰 N A L C処理物に分散させた検体から核酸抽出を行い、得られた抽出物を用いて R N A増幅反応を行った際の反応時間と蛍光強度比のグラフである。 1 0菌 Z 2 0 O Lまでの検体が検出できた。

図 5は実施例 5で行ったマイコバクテリゥム · カンサシ（ M y c o b a c t e r i um k a n s- a s i i ) 1 0菌カ、ら 1 6 0菌を 2 0 0 M Lの模擬喀痰（ムチン 2. 1 m g Zm L，ペプトン 4 , 2 %溶液）に分散させた検体から核酸抽出を行い、得られた抽出物を用いて R Ν Α増幅反応を行った際の反応時間と蛍光強度比のグラフを示す。 1 0菌 / 2 0 0 iLまでの検体が検出できた。発明を実施するための最良の形態

本発明における検体には、喀痰、胃液、尿、気管支洗浄液、膿/ 肺胞洗浄液、腹水、胸水、心嚢水、糞便、組織、血液、血清、コロニー、スヮブ若しくは他の体液等の生体試料の試料懸濁液、食物試料のホモジェナイズ等の試料懸濁液があげられる。試料が喀痰の場合は、 NA L C処理等の試料の粘性を落す前処理を行うとより好ましい結果が得られる。また、環境分析等における環境水や排水、土壌の懸濁液等があげられる。

本発明における生物材料には、ウィルス、細菌、真菌、原虫植物又は動物などが挙げられるが、これらに限定されない。本発明は W

、特に細胞の破砕が難しい真菌、マイコバクテリゥム属などの生物材料に有用である。 .

本発明の核酸抽出法は、検体から核酸を抽出するにあたり、核酸増幅反応阻害物質を界面活性剤で溶出して除去するものであるが、本願発明者らは、核酸増幅反応阻害物質の一つに糖タンパクがあり、界面活性剤によって糖タンパクが可溶化されることによって核酸増幅反応阻害物質を除去する効果を発揮すると考えられる。ここで、このような糖タンパク質の例として、喀痰に含まれる気道粘液糖タンパク質（ムチンと呼ばれる）がある。

本発明に用いる界面活性剤としてステロイド骨格を有するァニォン性界面活性剤及び両性界面活性剤であれば特に限定されないが、胆汁酸、コール酸、デォキシコール酸、 C H A P S及びそれらの塩等から選ばれた少なくとも 1種の界面活性剤が好ましい。コ一ル酸を用いる場合にその濃度は 0 . I m Mから 5 0 m M、好ましくは 1 m Mから 2 0 m Mを用いる。また、加熱処理の温度は、特に制限されるわけではないが、好ましくは 6 0 °C〜 9 0 °C、より好ましくは 6 0 °C〜 8 0 °Cであり、加熱時間も特に制限されるものではないが、好ましくは 2分から 2 0分、より好ましくは 2分から 5分である。 'ここで、加熱処理は静置して行うのが好ましい。さらに界面活性剤処理の回数は、特に制限されるものではないが、 1 回から 5回程度行うことが好ましい。なお、核酸を含有する検体と界面活性剤を混合して溶出物を選択的に除去するには、例えば遠心操作によつて実施すれば良い。遠心操作は、特に制限されるものではないが、 1 6， 0 0 0 X gで 5分間行うことで核酸を含有する検体と核酸増幅反応阻害物質含有の界面活性剤溶出物とを分離することができる。本願発明における、界面活性剤を混合して溶出物を選択的に除去する工程は、実際に抽出しようとする核酸や抽出を行う検体を勘案し、予備的な実験を行ったうえで具体的な条件を設定することが重要である。 .

本発明における固形粉末の材質は特に限定されないが、例えば、ジルコニァ、ダイァモンド、アルミナ (酸化アルミ二ゥム）、鉄、合金等が挙げられるが、抽出効率、コストの面から、ジルコニァが好適である。

前記固形粉末は、物理的に生物材料が破砕できればその形状は特に限定されないが、無定形であることが好ましい。該無定形の固形粉末とは、粒子が球形、楕円形等の滑らかな表面を持った形状ではなく、表面に鋭利な凹凸を有する粒子よりなる固形粉末を意味する

。前記粒子の大きさはその粒子径の最も長い部分（長径）が平均 3 2 m以下であればよいが、好ましくは平均 2 0 m以下である（測定機器 C OUL TE R L S I 3 0 ) 。その比重は、超音波ゃ攪拌による粉末の運動エネルギーを利用して組織を破砕することから、大きい方が好ましく、 3. 0以上あればよい。抽出された核酸を含む上清と前記固形粉末は、遠心あるいは静置により分離することが可能である。また、固形粉末にあらかじめ磁性体を含有させておくことにより、磁力による分離も可能である。固形粉末の硬さは、 ^いほど好ましく、ビッカース硬度（Hv 1 0 ) にして 6 0 0以上あ .ることが好ましい。本発明の最適な態様では、長径 2 0 m以下、比重 5. 7〜 6. 2、硬度（Hvl O) 9 0 0以上のジルコ二ァの無定形固形粉末を使用する。ジルコニァの無定形粉末の例としては、電融ジルコニァ Z CO— E 6 (AS T RON社製、平均長径 6 m 、比重 5. 8、ピッカース硬度（Hv 1 0 ) 1 2 0 0 ) 、電融ジルコニァ N S T 8 H、 F 3 50 (S A I NT— GO BA I N ¾製、平均長径 2 4 ΠΙ、比重 6. 0、ピツカ一ス硬度（Hvl O) 1 2 0 0 ) 、電融ジルコニァ # 4 0 0 (大平洋ラ.ンダム社製、平均長径 1 8 II m ) 等があるが、これに限定されない。試料への固形粉末の添加量は、試料の種類、攪拌方法、攪拌時間によって適宜決められる。固形粉末.を添加後、続いて、撹拌及びノ又は超音波処理により物理的に菌体を破砕する。

攪拌方法は、試料を入れた容器を手で往復振動させれば良く、振幅の方向は縦でも横でもよいが、好ましくは縦方向に往復振動させるのがよい。あるいは、ポルテックスミキサーで攪拌してもよい。菌体の破砕は、超音波処理による破砕がより好ましく、定常波の影響を除くため、交互または同時に 2周波数以上の超音波処理が最も好ましい。超音波処理は試料および粉末固形物を入れた容器を超音波洗浄機の洗浄槽中の液体に浸すか浮かべればよい。攪拌時間または超音波処理時間は、微生物および組織の細胞膜が破壊されるまででよく、具体的には 2分間以上でよい。組織が植物の組織の様に、丈夫な細胞壁を持ち硬い場合には、それ以上長くても良い。

本願発明に従えば、核酸増幅反応によって対象生物を同定、検出できる程度に、精製された状態で核酸が細胞から採取できる。また、本願発明は、対象生物として、細胞壁の堅い微生物を含み、さらに核酸阻害物質を多く含む種々の検体に対して有効である。例えば、 '喀痰に含まれるマイコバクテリゥム属の細菌からも効率よく核酸を抽出し、遺伝子の高感度 · 迅速検査を行うことが可能である。実施例

以下に、発明を更に詳細に説明するために実施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

実施例 1 喀痰からの核酸抽出試料に存在する阻害物質

非,結核性抗酸菌感染患者から同意を得て取得した喀痰（以降「結核陰性喀痰」と記述する）を N A L C— .N a O H処理（商品名； B W

B Lマイコプレップ、日本べクトンディッキンソン（株）を使用）して調製した検体 2 0 O ^ Lを用いて次の 2つの処理を行った。即ち、条件 1.； lm Lの P B Sに添加し、撹拌した後に 1 6 , 0 0 0 X gで 5分間遠心し、上清を取り除いた。条件 2 ； 1 m Lの p H 9に調製した 1 0 mM コ一ル酸ナトリウム、 I mM E D TAを含む 5 0 mM グリシン- N a OH緩衝液（以降「洗浄液」と記述する）に添加し、 8 0 °Cのドライヒートブロック上に 2分間静置した後、 . 1 6， 0 0 0 X gで 5分間遠心し、上清を取り除いた。上記 1、 2 の条件で得られたそれぞれの沈査に 0. 0 0 5 % y e a s t R N A ( S I GM A社製）を含み、 0. 5 gZmLの電融ジルコニァ Z C O - E 6 (A S T R ON社製、平均粒径 6 m) を懸濁させた T E溶液（WAKO社製、 1 0 mM T r i s - H C 1 , 1 mM E D T A, p H 8 ) 5 0 L (以降「溶菌試薬」と記述する）を添加し、そのチューブを超音波洗浄器 WT— 7 0 S T (本多電子製、周波数 4 0 k H z、出力 7 0 W) の洗浄浴中に浮かべ、 5分間超音波処理を行った。その後、 1 6， 0 0 0 ' X gで 3分間遠心し、上清を

3 0 ^ L別のチューブに移し、核酸抽出物を得た。

( 1 ) 複数の結核陰性喀痰から上記のように得られた核酸抽出物を混合し、陰性喀痰抽出試料とした。この陰性喀痰抽出試料 4. 5 Lと結核菌 1 6 S r R NAの領域を含む標準 R NA (塩基番号 2

4 3〜 1 8 4 3 (R NAの塩基番号は G e n B a n kに登録されている Z 8 3 8 6 2 に従った）を含む標準 RNAで、結核菌の 1 6 S r R NAの塩基配列を含む二本鎖 D NAを錶型としたインビトロ転写により合成、精製された R NA、. 1 6 0 1塩基）の各種濃度溶液

( I mM E D TAと R N a s eインヒピ夕一を含む 1 O mMトリス塩酸緩衝液に標準 Aを溶解。以降同緩衝液を「R NA希釈緩衝液」と記述する） 0. 5 Lを混合し、特開 2 0 0 4— 1 9 4 5 8 3号公報に記載した方法に従い、核酸増幅反応に供した。なお、コントロール（N e g a) では、陰性喀痰抽出試料に代えて RN A 希釈緩衝液 4. 5 ^ Lを混合した。

( 2 ) 以下の組成の反応液 2 0 を P C R用チューブ（容量

0. 5 m L ； G e n e Am T h i n -W a l l e d R e a c t i o n T u b e > パーキンエルマ一製）に分注し、これに上記混合試料を添加した。

反応液の組成（各濃度は最終反応液量 3 0 Lにおける濃度）

6 0 m T r i s 一塩酸緩衝液（ p H 8. 6 ) 1 7 m 塩化マグネシウム

1 0 0 m M 塩化カリウム

6 U RN a s. e インヒビ夕一'（宝酒造（株）

1 mM D T T

各 0. 2 5 mMの d AT P、 d C T P d G T P、 d T

T P

3. 6 mM I T P

各 3. O mMの AT P、 C T P、 G T P、 U T P

0 · 1 6 ； Μの第 1 オリゴヌクレオチド (MY R— I S 一 1 0、配列番号 1。 3 ' 末端側の水酸基はァミノ化されている。

)

1. 0 の第 2オリゴヌクレオチド ( M Y R - 1 F 一 1 0、配列番号 2。 5 ，末端側第 1番目の「 A」から 2 2番目の「A」までの領域は T 7プロモーターの領域であり、それに続く 2 3番目の「G」から 2 8番目の「A」までの領域はェンハンサー配列で,ある。 )

1. 0 Mの第 3オリゴヌクレオチド（MY R— 3 R T 1 8、配列番号 3 )

2 5 n Mのインターカレー夕一性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチド（Y〇一 MY R— P 2— 2— S— G、配列番号 4。 5 ' 末端から 7番目の「A」と 8番目の「G」との間のリンにインタ一カレーター性色素が標識されている。また、 3 ' 末端側の水酸基はグリコ一ル基で修飾されている。）

1 3 % D M S〇

容量調整用蒸留水

( 3 ) 上記の反応液を 4 3 °Cで 5分間保温後、以下の組成で、かつ、あらかじめ 4 3 °Cで 2分間保温した酵素液 5 Lを添加した。

酵素液の組成（各濃度は最終反応液量 3 0 Lにおける濃度）

2. 0 % ソルビトール

3. ら g 牛血清アルブミン

1 4 2 U T 7 R NAポリメラ一ゼ (タカラバイオ製

)

6. 4 U AM V逆転写酵素（夕カラバイオ製）容量調整用蒸留水

( 4 ) 引き続き P C Rチューブを直接測定可能な温度調節機能付き蛍光分光光度計を用い、 4 3 °Cで保温して、励起波長 4 7 0 n m、蛍光波長 5 2 0 n mで、反応溶液を経時的に測定した。

( 5 ) 各核酸抽出物での立ち上がり時間（蛍光増加比が陰性の平均値に標準偏差の 3倍を加えた値の 1. 2倍になるまでの時間）の結果を図 1に示した。これらの結果、上記の条件 1では結核陰性喀痰由来の阻害物により抽出物無添加の立ち上がり時間よりも 1 0 ³コピーの標準 RNAで 4分以上、 1 0⁴コピーで 3分、 1 0⁵コピ一で 2分以上遅れた。一方、上記の条件 2では 1 0³コピーで 3分、 1 0⁴コピーで 1分、 1 0⁵コピーで 1分と改善された。実施例 2 結核陰性喀痰の前処理と核酸抽出—その 1

結核陰性喀痰を N A L C— N a O H処理（商品名； B B Lマイコプレップ、日本べクトンディッキンソン（株）を使用）レて調製した検体 2 0 0 Lにそれぞれ 1 0 、 2 0 、 4 0 、 8 0 、 1 6 0菌の B C G溶液を加え、これを検体とした。

1 m Lの洗浄液を添加し、 7 0 °Cのドライヒートブロック上に 3 分間静置した後、 1 6 , 0 0 0 X gで 5分間遠心し、上清を取り除いた。得られた沈査に溶菌試薬を 5 0 L添加し、そのチューブを超音波洗浄器 V S— D 1 0 0 (本多電子製、周波数 2 4、 3 1 k H z、出力 1 1 0 W) の洗浄浴中に浮かべ、 5分間超音波処理を行つた。その後、 1 6， 0 0 0 X gで ·3分間遠心し、上清を 3 0 μ L別のチューブに移し、核酸抽出物を得た。そのうち 5 を実施例 1 と同様の核酸増幅反応に供して B C Gの 1 6 S r R NAの測定を実施した。

各核酸抽出物での立ち上がり時間（'蛍光増加比が陰性の平均値に標準偏差の 3倍を加えた値の 1. 2倍になるまでの時間）の結果を図 2に示した。これらの結果本願発明の抽出方法によって喀痰中の B C G菌を検出することが示された。

実施例 3

本発明の抽出法が非結核性抗酸菌のマイコバクテリゥム · アビゥム（My c o b a c t e r i um a v i u m) に適用できるか確認した。

結核陰性喀痰を N A L C— N a〇. H処理（商品名； B B Lマイコブレップ、日本べクトンディッキンソン（株）を使用）して調製した検体, 2 0 0 Lにそれぞれ 1 0、 2 0、 4 0、 8 0、 1 6 0菌のマィコバクテリゥム ' アビゥム（M. a v i um) を加え、これを検体とした。

この検体に 1 m Lの洗浄液を添加し、混合した後、 7 0 °Cのドラィヒードブロック上に 3分間静置し、 1 6， O O O X gで 5分間遠心して、上清を取り除いた。得られた沈査に溶菌試薬を 5 0 添加し、そのチューブを超音波洗浄器 V S— D 1 0 0 (本多電子製、周波数 2 4、 3 1 k H z、出力 1 1 0 W ) の洗浄槽中に浮かべ、 5 分間超音波処理を行った。その後、 1 6， 0 0 0 X gで 3分間遠心し、上清を 3 0 L別のチューブに移し、核酸抽出物を得た。そのうち 5 しを実施例 1 と同様の核酸増幅反応に供してマイコバクテリウム · アビゥム（ M . a V i u m) の 1 6 S r R N Aの測定を実施した。ただし、使用したプライマー、プローブの組み合わせは以下のとおりである。

第 1 オリゴヌクレオチド（MYR— 1 S— 4 0、配列番号 5 )

第 2オリゴヌクレオチド (MY R— 1 F— 4 0、配列番号 6 )

第 3オリゴヌクレオチド（MY R— 3 R A 1 6 — 4、配列番号 7 )

インターカレー夕一性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチド（Y〇—MY R— P 5— S— G、配列番号 8 )

各核酸抽出物での立ち上がり時間（蛍光増加比が陰性の平均値に標準偏差の 3倍を加えた値の 1. 2倍になるまでの時間）の結果を図 3 に示した。これらの結果、本願発明の抽出方法によって喀痰中の各菌数のマイコバクテリゥム · アビゥム（M， a v i u m) を検出することが示された。

実施例 4

本発明の抽出法が非結核性抗酸菌のマイコバクテリゥム · イン卜ラセレラ一 (M y c o b a c t e r i u m i n t r a c e 1 1 u 1 a r e ) に適用できるか確認した。 '

結核陰性喀痰を N A L C— N a〇 H処理（商品名； B B Lマイコプレップ、日本べクトンディッキンソン（株）を使用）レて調製した検体 2 0 0 Lにそれぞれ 1 0、 2 0、 4 0、 8 0、 1 6 0菌のマィコパクテリゥム ' イントラセルラー（M. i n t r a c e 1 1 u 1 a r e ) を加え、これを検体とした。

この検体に 1 mLの洗浄液を添加し、実施例 3 と同様に核酸抽出物を得た。そのうち 5 Lを実施例 3 と同様の核酸増幅反応に供してマイコパクテリゥム · イントラセルラー（M. i n t r a c e 1 1 u 1 a r e ) の 1 6 Sr R NAの測定を実施した。ただし、使用したプライマー、プローブの組み合わせは以下のとおりである。

第 1 オリゴヌクレオチド（MY R— 1 S— 4 0、配列番号 5 )

第 2オリゴヌクレオチド（MY R F— 4 0、配列番号 6 )

第 3オリゴヌクレオチド（MY R— 3 R I 1 8、配列番号 9 )

インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチド（YO— MY R— P 5 — S— G、配列番号 8 )

各核酸抽出物での立ち上がり時間（蛍光増加比が陰性の平均値に標準偏差の 3倍を加えた値の 1. 2倍になるまでの時間）の結果を図 4に示した。これらの結果、本願発明の抽出方法によって喀痰中の各菌数のマイコバクテリゥム · イントラセルラー（M. i n t r a c e 1 1 u 1 a r e ) を検出することが示された。

実施,例 5

本発明の抽出法が非結核性抗酸菌のマイコパクテリゥム · カンサシ ( M y c o b a c t e r i u m k a n s a s i i ) に適用できるか確認した。

結核陰性喀痰の NAL C— N a〇H処理物の代用物としてムチン溶液（ムチン 2. l m g/mL、ペプトン 4. 2 % , 1- 0 mM T r i s — H C 1 、 1 mM E D T A、 p H 8 ) 2 0 0 Lにそれぞれ 1 0、 2 0、 4 0、 8 0、 1 6 0菌のマイコバクテリゥム ' カンサシ（ M . k a n s a s i i ) を加え、これを検体とした。

この検体に 1 mLの洗浄液を添加し、実施例 3 と同様に核酸抽出物を得た。そのうち 5 Lを実施例 3 と同様の核酸増幅反応に供してマイコバクテリゥム · 力ンサシ（M. k a n s a s i i ) の 1 6 S r R N Aの測定を実施した。ただし、使用したプライマー、プローブの組み合わせは以下のとおり.である。

第 1オリゴヌクレオチド（MY R— 1 S— 4 0、配列番号 5 )

第 2オリゴヌクレオチド（MY R— 1 F— 4 0、配列番号 6 ) ^

第 3オリゴヌクレオチド（MY R— 3 R K 1 6 — 4、配列番号 1 0 )

イン夕一カレ一夕一性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチド（Y〇一 MYR— P 4 — S— G、配列番号 1 1 )

各核酸抽出物での立ち上がり時間（蛍光増加比が陰性の平均値に標準偏差の 3倍を加えた値の 1 . 2倍になるまでの時間）の結果を図 5に示した。これらの結果、本願発明の抽出方法によって喀痰中の各菌数のマイコバクテリゥム · 力ンサシ（M. k a n s a s i i ) を検出することが示された。

Claims

請求の範囲

1. 生物材料を含む試料から生物材料由来の核酸を抽出する方法であって、前記生物材料と少なくとも界面活性剤を含む水溶液を混合し、加熱処理を行った後に前記水溶液を除去して生物材料を分離し、引き続いて該生物材料に固形粉末懸濁液を添加し、これを撹拌あるいは超音波処理することによって前記生物材料を破砕し、該生物材料の核酸を抽出することを特徴とする核酸抽出方法。

2. 前記界面活性剤がステロイド骨格を持つァニオン性界面活性剤あるいは両性界面活性剤であることを特徴とする請求項 1に記載の核酸抽出方法。

3. 前記ァニオン性界面活性剤あるいは両性界面活性剤が胆汁酸、コール酸、デォキシコ一ル酸、 3 -[ (3 -コールアミドプロピル）ジメチルアンモニォ] プロパンスルホン酸（CHAP S) 及びそれらの塩から選ばれることを特徴とする請求項 2に記載の核酸抽出方法。

4. 前記界面活性剤の濃度が 0. 1 m M〜 5 0 m Mの範囲であることを特徴とする請求項 1〜 3のいずれかに記載の核酸抽出方法。

5. 加熱処理の温度が 6 0 °C〜 9 0 °Cである、請求項 1〜4いずれかに記載の核酸抽出方法。

6. 前記固形粉末が無定形であり、その長径が 3 2 以下であり、その比重が 3. 0以上であり、その硬度（Hvl O ) が 6 0 0以上であることを特徴とする請求項 1〜 5のいずれかに記載の核酸抽出方法。

7. 前記無定形固形粉末がジルコニァであることを特徴とする請求項, 6に記載の核酸抽出方法。

8. 生物材料を含む試料から生物材料由来の核酸を抽出する方法であって、（ 1 ) 前記試料から生物材料を分離する、（ 2 ) 該生物材料と少なくともコール酸を 0. 1〜 5 0 mMの濃度で含む水溶液を混合する、（ 3 ) 6 0〜 9 0 °Cで加熱処理をした後、前記水溶液を除去して前記生物材料を分離する、（4) 引き続いて該生物材料に、無定形で長径が 2 0 m以下であり、その比重が 4. 5 ~ 6. 5であり、その硬度（Hvl O ) が 8 0 0以上であるジルコニァ粉末を含む懸濁液を添加する、（ 5 ) 超音波処理により前記生物材料を破砕する、（6 ) 該破砕物の上清中に目的の核酸を得る、工程からなることを特徴とする核酸抽出方法。

9. 前記超音波処理が、少なくとも二つの波長の超音波で同時あるいは交互に処理することによってなされることを特徴とする請求項 8に記載の核酸抽出方法。

1 0. 前記生物材料がウィルス、微生物、原虫、植物又は動物組織であることを特徴とする請求項 1〜 9のいずれかに記載の核酸抽出方法。

1 1. 前記微生物がマイコバクテリ'ゥム属に属するものであることを特徴とする請求項 1 0に記載の核酸抽出方法。

1 2. 前記生物材料を含む試料が、喀痰、胃液、尿、膿、腹水、胸水、心嚢水、血液、組織などの生物由来試料、気管支洗浄液、肺胞洗浄液などの組織洗浄液、培地、又は土、水、空気、などの環境材料であることを特徴とする請求項 1〜 1 1のいずれかに記載の核酸抽出方法。

1 3. 請求項 1〜 1 2のいずれかに記載の核酸抽出方法を実施するための試薬キットであって、少なくとも、前記界面活性剤を含む試薬、および前記固形粉末を構成成分として含む試薬からなることを特徴とする核酸抽出キット。