JPH0568553A - 細胞からのｒｎａ及びｄｎａの遊離法 - Google Patents

細胞からのｒｎａ及びｄｎａの遊離法

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JPH0568553A JP3252130A JP25213091A JPH0568553A JP H0568553 A JPH0568553 A JP H0568553A JP 3252130 A JP3252130 A JP 3252130A JP 25213091 A JP25213091 A JP 25213091A JP H0568553 A JPH0568553 A JP H0568553A
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Abstract

(57)【要約】 【構成】 一定量の直径が0.05〜1.0 mmのビーズを含む
容器内に細胞の溶液又は懸濁液を入れ、充分な時間、出
力密度が0.2 W/mlを越えない超音波を作用させて細胞を
破砕し、該細胞内のＲＮＡおよびＤＮＡを溶液に放出す
る方法。 【効果】 遺伝プローブを用いるハイブリダイゼーショ
ンによって対象生物を同定、検定できる程に、分子構造
の良く保持された状態でＲＮＡおよびＤＮＡを細胞から
採取できる。また、結核菌のような不応性の微生物から
もＲＮＡおよびＤＮＡを過度に破壊することなく採取で
きる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】本出願はKohne, D.E. により1983年 1月10
日出願された米国特許出願456,729号、名称「非ウィル
ス性微生物の検出、同定及び定量法」、Kohne,D. E. に
より1984年 9月 4日出願された米国特許出願655,365
号、名称「微生物及びウィルスの検出、同定及び定量
法」、Kohne, D.E. により1984年 7月 5日出願された米
国特許出願627,795 号、名称「核酸再結合促進法」及び
Kohne, D.E. らにより1986年 1月 7日出願された米国特
許出願、名称「核酸再結合促進法」に関係するものであ
る。これらの全ての開示は本明細書の記載内容中で参照
される。
【０００２】本発明の技術分野 本発明は細胞破砕（disrupting）とそれにより細胞成分
を溶液中へ遊離させる(release) 方法に関するものであ
る。特に、本発明は様々な組成の小ビーズを含む容器内
に入れた微生物溶液中で微生物からＲＮＡ及びＤＮＡを
遊離させるための方法に関するものである。この容器を
次いで、細胞が破砕し細胞成分が遊離されるまで超音波
浴中に設置する。前記溶液中には、緩衝液、洗剤、遺伝
プローブ、抗体、酵素、キレート化剤、塩、有機化合物
等の様々な添加物を入れることができる。本発明方法の
結果、開放又は閉鎖容器中の臨床的又は生物学的試料中
に存在するMycobacterium tuberculosisのような他の方
法では不応性の完全な微生物も破砕することができ、Ｒ
ＮＡ及びＤＮＡを含む細胞成分を遊離させ、試料中で検
出、同定、定量又は遺伝プローブや抗体検出法を用いた
その他の診断法を行なうことができる。
【０００３】先行技術の説明 バイオテクノロジー革命によって細胞の遺伝的成分に大
きな関心が生じた。その結果、微生物内からのＲＮＡ及
びＤＮＡ遊離を促進させる方法を決定するための大規模
な努力が過去25年間に費やされてきた。例えば、微生物
内に含まれるＲＮＡおよびＤＮＡは、その微生物の臨床
的又は生物学的試料中の存在の有無を同定するために有
用な価値ある情報を与えることができる。遺伝プローブ
を含むハイブリダイゼーション反応は遺伝プローブ上の
相補的な核酸配列とのハイブリダイゼーションを促進さ
せるため細胞内からの遺伝情報の遊離に依存している。
このようなハイブリダイゼーション反応は生物学的試料
中に存在する微生物の分離、検出、同定及び／又は定量
に用いることができる。
【０００４】ある種の細胞は容易に破砕され、細胞成分
を遊離するが、他の種類で細胞を破砕しにくいものもあ
る。その細胞の１例であるMycobacterium tuberculosis
は結核の原因となり、破砕が難しいことでよく知られて
いる。その結果、この種の不応性(refractory)の微生物
内のＲＮＡやＤＮＡを便宜的かつ効率的に得ることはよ
り困難であり、これが遺伝プローブの方法による同定を
不可能にしている原因である。
【０００５】ヒトに疫病をおこす全ての感染症疾患の中
で、おそらく結核は最高の罹患率及び死亡率の原因とな
っていると考えられる。西欧諸国の結核発症率は著しく
低下したが、今日においても、結核は依然として世界中
で最も流行している感染症の１つである。世界の人口の
半数以上が結核菌に感染していると現在推定されてい
る。（Youmans, G.P.,Tuberculosis,W.B. Saunders Com
pany (1979)）結核治療活動の年間総費用は米国単独で
１年間に約６億ドルにのぼると推定される。（会議報告
“Future Research in Tuberculosis:Prospects and P
riorities for Elimination ”９（1985年 6月 5〜7
日）American Review of Respiratory Diseaseの別冊と
して提出（以下“ Pittsfield Report”））1985年 6月
5〜7 日に、the Center for Disease Control (CDC)、
the National Institutes of Health (NIH) 、the Amer
ican Thoracic Society (ATS) 及びPittsfield Antitub
erculosis Association (PATA)の後援による会議での目
的は結核罹患率低下をうながし、究極的には米国及び世
界から結核を消失させるために、研究領域の優先順位を
決定することであった。この中で本疾患の管理（治療）
及び衰退に重要であると認められた障害は一般に行われ
ている長たらしい診断方法である。
【０００６】世界の人口の約50％が結核菌に感染してお
り、世界保健機構（ＷＨＯ）は現在、１年以内に新たに
4〜500 万の結核感染者が出ると推定している。おそら
く１年後にはさらに 4〜500 万の非感染者が結核に罹患
するであろう。この 800〜1000万の新たな患者に加え
て、おそらく１年当り 3〜400 万人の結核による死亡者
が出ると考えられる（「Pittsfield Report 」の14ペー
ジ）。
【０００７】結核の診断及び同定方法は結核治療技術の
状態を反映する。「Pittsfield Report 」の17ページに
は、「結核とは、今世紀の初めでも最先端の医療と考え
られた19世紀の方法を用いて依然として戦っているが、
この方法は21世紀が近付くにつれもはや時代遅れとなり
つつある。」と記載されている。
【０００８】感染者はRobert Koch により開発された方
法と基本的に同じツベルクリンテストに対する反応によ
り診断される。
【０００９】この方法は依然としてかなり粗製の抗原を
皮膚に注入し、腕の腫脹を測定し、結核感染か、他のマ
イコバクテリア感染あるいは非特異的反応かを診断しよ
うとするものである。
【００１０】症例の多くは結核菌の分離により詳しく診
断される。多くの改善が成されたが、細菌学における方
法はPasteur, Ehrlich及びKochらにより開発されたもの
と基本的に同じ方法が用いられている。結核菌は染色さ
れ、鏡検され、培養される。この培養には依然、数週か
ら数ヵ月を要し、さらに他のマイコバクテリアと結核菌
を鑑別するために生化学及びその他の試験が必要であ
る。
【００１１】検出すべき細菌、この場合はMycobacteriu
m tuberculosisの核酸配列に相補的な核酸配列を提供す
るという遺伝プローブ技術の進歩に伴い、「Pittsfield
Report 」の著者はその76ページで、マイコバクテリア
属の微生物内の核酸とそれに相補的な核酸とがハイブリ
ダイゼーションするためにはこの微生物内核酸の遊離方
法を発見することの重要性を以下の様に指摘した。
【００１２】「マイコバクテリア検出のためのＤＮＡプ
ローブの臨床上での使用に於ける重要な点は試料操作で
ある。この試験に於いて基本的に要求されることは試料
の核酸がプローブとハイブリッドするために利用される
ようにならなければならないことである。このハイブリ
ダイゼーション技術は唾液、糞便、血清、組織ホモジネ
ート、脊髄液及び尿に適用できる。
【００１３】さらに、臨床的方法論に関して、本報告書
は続けて以下のように明言している。
【００１４】「ＤＮＡプローブを用いてマイコバクテリ
アを検出する際の大きな困難はハイブリダイゼーション
のために核酸を遊離させるためのマイコバクテリア細胞
の破砕である。このために記述された方法はなく、これ
を成し遂げるための技術開発が重要である。」（下線は
追加） 臨床的実験室に適した有効で安全、かつ簡単な細胞破砕
法の必要性は明らかである。細胞分画法及び破砕技術の
一般的概説として、Schnaitman, C.A., 「CellFraction
ation」Manual of Methods for General Bacteriolog
y， Ch. 5, 52〜61（Gerhardt, P 他編集、1981年），C
oakley W.T.他、「Disruption of Microorganisms」 Ad
v. Microbial. Physiol. 16:279〜341 （1977）及びHug
hes, D.E.他「The Disintegration of Micro-organism
s,」Methods in Microbiology , 5B, ch．1,2-54（Norr
is, J.R.及びRibbons, D.W. 編集、1971）がある。
【００１５】マイコバクテリアのような不応性細菌から
ＲＮＡ又はＤＮＡを抽出するこれまでの方法は、細胞を
苛酷な物理的粉砕や振盪により細胞成分を遊離させるも
のである（H. Venner, Acta Biol. Med. Ger. 11:806
(1963); M Tsukamura他、Am. Rev. Respirat. Diseases
，81:403 (1963); Moore他、米国特許第4,295,613
号、名称「細胞破砕装置」1981年10月20日発行、参
照）。これらの方法には無視できない欠点がある。まず
第１に、粉砕粒子の物理的関与による摩擦で過度の発熱
が生じ、これがＤＮＡ及びＲＮＡ等の遺伝的細胞内成分
に対し有害に作用し、その後の診断方法で使用出来なく
なるようにする。
【００１６】さらに、これまでに細胞成分の抽出のため
にこのような苛酷な条件を必要とする多くの生物は非常
に病原性が強い。開放系において大量の病原菌の粉砕に
伴う衛生上の危険は明らかである。
【００１７】これらの問題を認識することにより、不応
性細胞を破砕するための別の方法を試みる研究者たちが
現われてきた。（例えば、L.G.Wayne及び G. A.Diaz,
J. Bacteriol. 93:1374 (1967); L. G. Wayne 及びW.M.
Gross,“Isolation of Deoxyribonucleid Acid From My
cobacteria”J.Bacteriol.，95:1481 (1968)、この中で
はグリセロールを十分含有した培地中十分な好気的条件
下で増長させた Mycobacterium tuberculosis，M. Ka
nsasii，M. avium ，M. gastri，M. flavescens，M.
smegmatis ，M. phlei 及びII族の暗発色性マイコバ
クテリアの培養物を酸素制限下に急激に暴露した後自己
溶解させる、参照）。この方法は時間及び費用がかか
り、微生物を増殖させる段階等の多くの手順を必要とす
る。
【００１８】おそらくこれまでの方法の中で最も有効な
マイコバクテリア細胞破砕法は圧力室（ pressure cel
l）を用いた方法である。この方法はマイコバクテリア
微生物溶液を非常に高い圧力下で非常に小さな直径の小
孔に通過させる。この小孔を細胞溶液が通過する過程で
機械的な力によりマイコバクテリアは破砕し、細胞内成
分が溶液中に遊離される。この方法を用いた細胞破裂率
の範囲は90から 100％である。しかしながら、このよう
なシステムは巨大で高価であり、過剰な発熱を防止し、
溶解した細胞成分への障害を防止するために冷却システ
ムを必要とする。大量の試料を必要とし、その装置は清
潔で操作中の汚染がないことが必要である。結局、感染
菌を扱う場合、巨大な封鎖系が必要である。
【００１９】また、マイコバクテリア属微生物を含む溶
液に非常に強力な超音波衝撃を作用させ細胞を破壊する
こともできる。細胞を破砕するために、強力な超音波探
査器（sonifierやsonicator として知られる）のような
超音波装置を用いた研究者もいた（Seiter, J.A.及び J
ay, J.M., Application of Ployacrylamide Gel Electr
ophoresis to the Characterization and Identificati
on of ArthrobacterSpecies , ”Int. J. Syst. Bacter
iol.，30:460-465 (April. 1980)参照）。しかし、ある
種のアルトロバクター属の蛋白の特性を明らかにし、さ
らにその同定から成るこの研究は大量の細胞懸濁液を破
砕するためにビーズとＷ350 型ソニケーター（Heat Sys
tems-Ultrasonics, Inc.）を用いた。Seiterらはこの懸
濁液の微片物質を除去するために遠心分離し、上澄を採
取し、次にポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、蛋
白特性を示した。この型の強力な探査装置ではかなりの
量の熱が発生し、温度上昇を抑制するために、冷却外被
又は氷浴を必要とするが、この温度上昇により、もはや
プローブ法での検出が不可能なほど細胞内のＤＮＡ又は
ＲＮＡが破壊されることが多い。この事実は多数の参考
文献により示されている。例えば、Salter,D.N. 及びSm
ith, R.H.,“Protein Utilization in theYoung Steer:
Digestion and Nitrogen Retention of 15N-Labelled
Rumen Bacterial Protein”，British Journal of Nutr
ition, 51:531-539 (1984),こぶ胃の細菌の懸濁液を超
音波ジスインテグレイダー（Soniprobe: Dawe Instrume
ntsLtd., London）を用いてガラスビーズを加えた該懸
濁液の氷冷却部分の超音波処理により破砕した。この処
理では温度が25〜30℃に徐々に上昇し、全細菌の約95％
が破砕された。しかしこの方法では破砕前と最終的に破
砕した細菌片の最後の透析後の分析によってＲＮＡ及び
ＤＮＡが完全に破壊されていることが判明した。
【００２０】この種の探査型超音波処理器の出力は80〜
100 W と測定された。（Closs, O.,他“The Antigens o
f Mycobacterium bovis, Strain BCG, Studied by Cros
sedImmunoelectrophoresis:A Reference System”，Sca
nd. J, Immunol. 12: 249〜263 （1980）。この研究で
は Mycobacterium bovis 菌液を氷水中のロゼット冷却
室中でＢ−12型のBranson sonifier（Branson Sonic Po
wer Co., Danbury, Conn. ）を用いて測定時の出力80〜
100wで超音波処理し、 Mycobacterium bovisの抗原成
分を明らかにした。さらに、Alliger, H.,米国特許第3,
558,066 号、名称「グラム陽性細菌から得られる抗原の
超音波処理による抽出、1971年 1月26日発行，を参照す
べし。対照的に、本発明による方法で用いられる超音波
浴は低出力で作動し、使いやすく、経済的で小さく機能
的である。この装置では超音波処理する溶液に障害を与
えるほど該溶液の温度を上昇させないので、冷却外被あ
るいは氷浴を必要としない。さらに、本法では感染物質
も安全な方法で取り扱うことができる。この超音波浴は
生物学的に安全なキャビネット内に入れることができ噴
霧状の危険物質の発生を確実に防ぐために試験管を密閉
することもできる。また、多くの試料を同時に処理する
ことができる。
【００２１】結局、既存の方法である、細胞の圧力室及
び強力な超音波探査器は時間がかかりすぎ、非経済的
で、安全かつ有効なやり方で使用することは困難であ
る。
【００２２】故に、細胞成分を遊離させるための簡単で
経済的な細胞粉砕法を提供することが本発明の第一の目
的である。さらに、細胞内の核酸を大きく損傷すること
なく微生物からＲＮＡ及びＤＮＡを遊離させる方法を提
供することが本発明の次の目的である。未精製の生物学
的、環境的、食物又は臨床的試料中に含有される微生物
からＲＮＡ及びＤＮＡを遊離させる方法を提供すること
も本発明の目的である。開放又は閉鎖容器内の試料か
ら、微生物を容易に検出、同定又は定量するために、該
微生物を含有すると思われる未精製生物学的又は臨床試
料、即ち、唾液、糞便、血清、組織、血液、尿、脊髄
液、滑液や他の体液等の試料からＲＮＡ及びＤＮＡをそ
の試料中へ遊離させるための迅速、効率的かつ経済的な
方法の提供が本発明の次の目的である。さらに、不応性
微生物から、細胞物質を遊離させる方法を提供すること
が本発明の目的である。
【００２３】一般的に述べれば、溶液中の細胞又は微生
物を、例えばガラス、プラスチック、砂又はケイ酸塩、
ラテックス、水晶、金属、金属酸化物等の種々の組成の
小型ビーズと共に容器内で、超音波浴（例えば宝石の洗
浄や実験装置として使用される型）内で超音波処理する
と、ＲＮＡ及びＤＮＡを含む細胞成分を数分のうちに該
溶液中に遊離するという驚異的な発見により上述の目的
は成し遂げられる。この結果から、前記核酸は核酸ハイ
ブリダイゼーション法により容易に検出でき、他の種類
の超音波装置により時々生じる該核酸の損傷もないこと
が示された。通常不応性のマイコバクテリアを含む検討
したすべての微生物で容易に細胞破砕が生じた。容器内
の溶液中に遊離されたＲＮＡ及びＤＮＡは例えば、遺伝
プローブ中に存在する相補的核酸配列とハイブリダイゼ
ーションが可能である。この方法は抗体反応のための蛋
白及び細胞成分の遊離にも使用される。細胞及びビーズ
を含有した溶液を入れた容器には、例えばプラスチック
製試験管又は適当に密閉し得る他の適当な容器が使用で
きる。あるいはまた、超音波エネルギーは例えば変換器
を通して細胞及びビーズの溶液や懸濁液に直接伝達でき
るので、細胞及びビーズを保持する別の容器を必要とし
ない。本発明の方法による超音波処理で細胞が破砕した
後、遊離したＲＮＡ又はＤＮＡと遺伝プローブとを適切
な条件下で反応させるために、緩衝液、洗剤、遺伝プロ
ーブ、抗体、酵素、キレート化剤、塩、有機化合物等、
様々な物質を添加することができる。従って、本発明の
１具体例は、未精製の臨床的又は生物学的試料中の細胞
を該試料中で溶解又は破砕することにより、検出すべき
微生物のＲＮＡ又はＤＮＡの核酸配列と相補的な核酸配
列を持つ遺伝プローブとハイブリダイゼーションさせる
ために遺伝物質を溶液中に容易に遊離させる一過程を開
示している。特定な操作で必要とする最適条件を得るた
めに当業者であれば溶液中に添加するその他の物質を変
化させることができる。
【００２４】広い見地から、本発明の方法は、小型ビー
ズと共に容器内に入れた細胞溶液を例えば超音波浴内で
超音波処理すると、細胞は破砕し、細胞成分を必要なら
ば閉鎖できる容器内の溶液に遊離するという驚異的発見
に基づいている。本発明の方法により容易に遊離される
細胞成分にはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸
（ＲＮＡ）がある。
【００２５】ある種の細胞は破砕が非常に困難であっ
た。その一種である Mycobacterium tuberculosisは複
合脂質から成る密度の高い細胞壁を持つ桿状形細菌（桿
菌）である。これらの細胞は破砕しにくいことで有名で
ある。その結果、これらの細胞を破砕するために苛酷な
条件が提案され用いられ、その有害作用のため、核酸が
損傷し、以降の実験や処理に使用不可能となる場合もあ
った。しかし、このような種類の細胞を溶解するための
便宜的で、安全、効率的及び経済的な方法は引き続き至
急に必要とされていた。
【００２６】マイコバクテリア属の細胞中に含有する核
酸をハイブリダイゼーションに用いるために該細胞を破
砕することが非常に困難なのでマイコバクテリア属の検
出用のＤＮＡやＲＮＡプローブの臨床上の使用が妨げら
れている。この基本的要求、すなわち、効率的、安全、
かつ経済的な細胞内ＲＮＡ及びＤＮＡの溶液への遊離が
なければ、ハイブリダイゼーションは不可能で、マイコ
バクテリア属のような不応性細胞の診断手段としての遺
伝プローブの価値は明らかに減少する。本出願人の発明
以前にはこれらの細胞のＲＮＡ及び／又はＤＮＡをハイ
ブリダイゼーション不可能とすることなく適切に破砕す
る簡単な方法は示されていなかった。
【００２７】本発明の方法を実施するために、様々な市
販の超音波浴を用いることができる。例えばConnecticu
t Shelton の Branson Cleaning Equipment Company は
タンク容積 10 オンスから 8ガロンの12個のモデルを B
ransonic（登録商標）という名称で販売している。Cali
fornia、Anaheim の Mettler Electronics（登録商標）
も又タンク容積 2.1クォートから18ガロンの数種のモデ
ルを販売している。これらの超音波浴はペン、宝石、機
械類、エンジン部品、ノズル、実験器具、スイッチ、
鍵、自動車部品、ガラス、セラミック、金属、硬質プラ
スチック等の洗浄に用いられる。これらの超音波浴は入
力した電気的エネルギーを高周波数の超音波エネルギー
に変換するために、例えばジルコニウムチタン酸鉛又は
チタン酸バリウム等の圧電気変換器や磁気拘束変換器を
利用している。この機械的エネルギーすなわち振動は洗
浄タンク中を占める液体中につながりそれを通して伝達
される。 Bransonic（登録商標）超音波洗浄器は周波数
約55 KHZで作動し、一方 Mettler（登録商標）装置の公
称周波数は22〜67KHZ の範囲である。超音波という用語
は人の聴取域、即ち約20 KHZよりすぐ上の周波数を意味
する。また一方、超音波エネルギーは例えば変換器を通
して細胞溶液又は懸濁液及びビーズに直接伝達されるの
で、細胞及びビーズを入れるための容器を必要としな
い。精製済み又は未精製の細胞あるいは微生物の溶液や
懸濁液は超音波エネルギーを伝達することができるステ
ンレス鋼のような物質から成る容器又は筒（well）ある
いは一連の容器又は筒の中に入れることができる。その
筒は入力エネルギーを超音波エネルギーに変換できる適
切な変換器又は他の装置に接続しているかあるいは近接
している。細胞及びビーズを直接試料容器として機能す
る１つの筒や一連の筒に入れるか又は細胞及びビーズを
容器内に入れ筒内にある液体中に容器を沈めることもで
きる。その筒は液体漏れや噴霧形成を防ぐために適切な
ふたで閉鎖することができる。上述の例は単なる具体例
であり、本発明上の特質や不可欠な性質を持つ他の特定
な形態でも具体化できることを理解しなければならな
い。
【００２８】超音波による細胞破砕方法は十分説明され
ているわけではないが、液体中を伝播する超音波は圧縮
及び圧力最小部分の交互から成り立っているものと仮定
されている。波の振幅が十分大きい場合は、キャビテー
ションという現象が生じる。キャビテーションは微細小
泡を発生させ、破壊する。これらの小泡又は空洞が共振
大まで成長すると、１圧縮サイクルで直ちにかつ激しく
崩壊し、おそらく20,000気圧もの大きな局所的圧力変化
が生じる。高出力密度装置の場合、数ミクロンの距離で
感じられるこの機械的衝撃は細胞破砕作用を示す。（Al
liger, H. Ultrasonic Disruption ，American Laborat
ory ，1975年10月よりの再出版） しかしながら、本発明の方法に於いては、細胞がキャビ
テーションにより破壊されるとは考えられない。なぜな
らば実際に、細胞は小型ビーズがなくては破壊されない
からである。むしろ、超音波が細菌溶液又は懸濁液中の
ビーズを振動させ、その結果、剪断力により細胞が破砕
されると考えられる。微小ビーズと超音波との間の正確
な相互作用は明らかでなく、出願人もある理論に拘束又
は制限されることを好まないが、超音波がビーズに振動
性運動を伝えると考えられている。そして、細胞はビー
ズの前記運動による強い剪断作用を受け、その結果細胞
壁が破裂し、細胞成分が遊離する。しかしながら、一度
溶液中に遊離された細胞成分の損傷を防ぐことが大切で
ある。本発明の低出力密度超音波浴は細胞を十分破砕す
るが、一度遊離されたＲＮＡ又はＤＮＡを破壊する程強
力ではない。その上、本発明の方法は室温（18℃）及び
それ以上で有効に細胞を破砕する。しかしこのパラメー
ターは本発明の有効な温度範囲を制限しているとは考え
られない。
【００２９】本発明による超音波法ではマイコバクテリ
ア属のような不応性微生物も、迅速、安全、効率的及び
経済的な方法で有効に破砕し、容易にＲＮＡ及びＤＮＡ
等の細胞成分を遊離させることが認められている。
【００３０】出願人は本発明方法を細胞加圧を用いた細
胞破砕法と比較した。細胞加圧法はこの方法を用いてほ
ぼ全ての細菌が破砕されるため、比較のための参考方法
として選択した。マイコバクテリア属の菌液を用いた。
上記比較のための一般的プロトロールを以下に示した。
【００３１】Ａ．マイコバクテリア属を含む溶液を４つ
の試料に分けた。
【００３２】1) 第１試料は細胞を18,000 psiで 2回加
圧した。
【００３３】2) 第２試料には閉鎖容器内でガラスビー
ズを添加し、超音波浴内に入れ、本発明方法に従い超音
波処理を行った。
【００３４】3) 第３試料は閉鎖容器内でガラスビーズ
を添加せず、槇の通りに超音波処理を行った。
【００３５】4) 第４試料は処理をせずに対照として用
いた。
【００３６】Ｂ．A.の各試料の破砕された細胞分画を測
定した。特定の処理をした各試料中に遊離されたＲＮＡ
量は核酸ハイブリダイゼーション動力学法により測定し
た。各試料の一部を0.48Ｍリン酸緩衝液（ＰＢ）、 0.2
％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）で調整した。 Myc
obacterium tuberculosis ＲＮＡに相補的な放射性標
識ＤＮＡを各試料に加え、72℃でインキュベートした。
特定の時間後に各試料の一部を採取し、0.14M ＰＢ、0.
02％ＳＤＳで希釈した。この希釈試料は72℃、0.14M Ｐ
Ｂ、0.02％ＳＤＳで平衡状態としたハイドロキシアパタ
イト（ＨＡ）カラム上で分析した。基本的なＨＡ分画法
は Kohne及びBritten, Procedures in Nucleic Acid Re
search （1971），Cantoni 及びDavies編集、Harper &
Row． 2巻500 ページ（1971）中に記載されている。各
試料中の遊離ＲＮＡ濃度を測定するために試料の動力学
プロフィルを比較した。
【００３７】Ｃ．結果を表Ｉに示した。
【００３８】 表 Ｉ 細胞処理法 破壊された細胞分画 1. 細胞加圧法 100 ％ 18,000 psiの圧力を 2回細胞に加圧 2. ガラスビーズを添加し、10分間超音波処理 100 ％ 3. ガラスビーズを添加せずに10分間超音波処理 15 ％ 4. 対 照 12 ％ 種々の異なる細菌を用いて、超音波洗浄浴中での破砕と
French pressure cellを用いた破砕とを比較した。試料
を２つに分けた。その一方の 100μｌ（mg）を同容量の
ガラスビーズを添加した試験管に加え、脱気した水（脱
気法は超音波浴を沸騰水で満たし、温度が90℃に低下し
た時に15分超音波処理して行なった）を用いた超音波浴
中で75℃で10分間超音波処理を行った。この試料を10倍
希釈し、Ｈ6000A ローターを用いてSorvall RC-3B で34
00rpm 30分間遠心分離し、粒子物質を沈渣とした。各
試料のもう一方をFrench pressure cellを通した後水で
10倍希釈し、同様に遠心分離した。細胞物質の遊離を25
5 nmの紫外線吸収で調べた。255nm の吸収は細胞破砕の
指数となる。核酸及び蛋白はこの波長で吸収を示す主な
物質である。この結果は、同様な懸濁液から上澄に遊離
されたＡ255 の単位で以下の表IIに示した。
【００３９】 表 II Ａ255 Ａ255 微 生 物 超音波法 French Pressure cell Legionella pneumophila 0.961 0.170 Baker ′s yeast 1.229 1.299 Mycobacterium nonchromogenicum 0.201 0.018 Escherichia coli 1.607 0.973 Staphylococcus aureus 0.337 0.028 Bacillus subtilis 0.960 0.039 Legionella pneumophila 及び Escherichia Coliはグ
ラム陰性桿菌の例である。Bacillus subtilis はグラム
陽性桿菌である。Staphylococcus aureus はグラム陽性
球菌、一方Mycobacterium nonchromogenicumは抗酸菌で
ある。最後に、パン酵母は細菌以外の生物を代表してい
る。異なる種類の細胞壁を持つこれらの生物は全て本発
明を用いて容易に破壊される。
【００４０】本発明方法によれば、不応性細胞であって
も、ビーズが溶液中に存在する限りは低出力密度でも細
胞破砕が生じることが判明している。超音波探査器を細
胞懸濁液の容器内に直接設置し、 0.2〜0.3 W/mlの超音
波出力密度にした場合、表層への作用及び衝撃波が主に
細胞崩壊の原因となると考えられる(Coakley他、上記文
献 303ページ参照)。しかし、出願人は本発明の相対的
出力密度を典型的な高出力密度プローブ超音波発信器と
比較し、本発明の方法においては溶液中にビーズが存在
する限り0.2W/mlより顕著に低密度でも細胞を破砕でき
ることを発見した。高出力密度プローブ超音波発信器は
200mlの水中で 5分間作動させた。8.95℃の温度変化が
あった。この変化を8.95×200 又は1790 cal/5分の出力
又は25Wの出力に換算した。典型的な実験で、この出力
の大部分が 3ml以内のプローブ先端に集中し、その結果
出力密度は約 8.3W/mlとなる。これと比べて、 250mlの
水を入れた典型的な超音波浴を10分間作動させた結果温
度は10.4℃上昇する。この上昇は18w/浴の出力に換算さ
れる。本発明によれば、典型的細胞破砕実験では浴に 7
50mlの水を入れる。この出力密度は0.024 W/mlである。
この比較によれば、このプローブ超音波発信器の出力密
度は洗浄浴の 300倍以上になる。しかし、出願者は、上
述したように、細胞溶液に粒子状ビーズを加えた場合、
このように低出力密度でも細胞破砕が生じることを発見
した。
【００４１】他の実験において、 1％ドデシル硫酸ナト
リウム（ＳＤＳ）中でmycobacteria懸濁液を調製し、Pe
troff-Hausser 計数チャンバを用いて細胞数を数えた。
1％ＳＤＳで希釈して 7×108 個／mlに調製し、1000 p
siの圧力のFrench pressurecellを用いて破砕した。同
様の懸濁液の試料 1mlを 0.1mlのガラスビーズ(0.1〜0.
3 mm）を入れたフタ付きEppendorf 管中に加え、洗浄浴
（Mettler Electronics Cavitator ME4.6）を用い室温
で10分間、超音波処理を行った。プローブ測定法により
遊離されたＲＮＡ量を測定することにより破砕の程度を
測定した。
【００４２】試 薬： 試 薬 １：0.96Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、pH 6.8 2.0%ＳＤＳ 1 mM EDTA 1 mM EGTA プローブ溶液：3.5 ml試薬 1 0.14Ｍリン酸緩衝液及び0.02％ＳＤＳ中の 125Ｉ標識Ｔ
Ｂプローブ 30 μｌでその活性は8,000 cpm/μｌ 試 薬 ２：0.14 Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 6.8 0.02％ＳＤＳ 1 ｇハイドロキシアパタイト(HA)／50ml 試 薬 ３：0.14Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、pH 6.8 0.02％ＳＤＳ方 法 ：試料は 100μｌの破砕された細胞懸濁液及び10
0 μｌのプローブ溶液から成る。正の対照は 100μｌの
プローブ溶液及び10μｌのＴＢ ＲＮＡ(0.5μｇ／10μ
ｌ）及び90μｌの水から成る。負の対照は 100μｌのプ
ローブ溶液と 100μｌの水から成る。 100μｌのプロー
ブを用いて総カウント数を測定した。
【００４３】各時間ごとに個々の試料を調製した。破砕
された各生物試料は各々15，30及び120分にて測定し
た。試料及び対照は72℃でインキュベートした。インキ
ュベーション後、総カウント及びＨＡ対照を除く対照及
び試料全てに 5mlの試薬２を添加し試料を攪拌した。
【００４４】72℃で 5分間インキュベーションした後、
試験管を攪拌し、ＩＥＣ36筒型遠心器を用い1500 rpmで
遠心分離した。上澄を静かに除去し、総カウント試料以
外の対照及び試料全てに 5mlの試薬３を添加した。この
試料を攪拌し、前述のように遠心分離した。上澄を静か
に除去し 5.5mlのcytoscint を添加し、攪拌し、シンチ
レーションカウンターでこの試験管をカウントした。Ｈ
Ａ試料のカウントはバックグラウンドと考えられるので
各試料及び総カウントから減じる。試料当りのこの結果
のカウントを総カウント数で割り、 100倍して％ハイブ
リダイゼーション（% hyb)を得た。
【００４５】１組の中で% hyb の値が最も高いものを％
max とした。１本鎖の％（% SS）は100（%max-%hyb ）
％max とした。時間ごとの log（％SS）をプロットし、
％SS＝0.5 の時点からｔ1/2 を測定した。ＲＮＡ濃度は
次式で示される： ［ＲＮＡ］＝2(0.0023)/0.011/ｔ1/2 式中の0.0023はＴＢプローブのCot の半分に相当する。
0.011の値はマイクロモルへの光学密度の変換係数で、
係数2 は濃度を最初の破砕した溶液の濃度にするために
必要である。
【００４６】細胞等価物のＲＮＡ数は 5.5×10-9μｇ／
細胞と測定された。
【００４７】結 果：それぞれガラスビーズと超音波洗
浄浴(Son.)及びFrench Pressure Cell（F.P.）を用いて
与えられた細胞懸濁液から遊離されたＲＮＡの割合を以
下の表III で示した。
【００４８】 表 III ｔ1/2 （時間） Son.／F.P.で遊離 細 菌 F.P. Son. されたＲＮＡの割合 M.flavescens 0.08 0.18 0.44 M.gordonae 0.25 0.44 0.56 M.phlei 0.075 0.15 0.48 M.simiae 0.58 0.64 0.90 M.fortuitum 0.14 0.31 0.47 M.terrae 0.095 0.098 0.98 M.nonchromogenicum 0.325 0.35 0.92 M.malmoense 0.55 0.67 0.82 Ｍ．ａｓｉａｔｉｃｕｍ 0.42 0.30 1.39 M.vaccae 0.17 0.055 3.17 M.smegmatis 0.10 0.17 0.57 M.gastri 0.18 0.29 0.58 M.szulgai 0.89 0.41 2.13 M.triviale 0.22 0.20 1.11 M.haemophilum 0.15 0.18 0.85 M.kansasii 0.25 0.67 0.36 M.marinum 0.13 0.17 0.78 M.bovis 0.10 0.21 0.49 M.bovis (BCG) 0.11 0.17 0.68 M.africanum 0.065 0.22 0.30 M.thermoresistibile 0.28 0.54 0.51 M.tuberculosis 0.19 0.41 0.45 M.chelonae 0.29 0.18 1.60 M.scrofulaceum 0.81 0.52 1.57 M.avium 0.16 0.25 0.65 M.intracellulare 0.35 0.37 0.92 この例では、これら26株のマイコバクテリアは全て上述
した超音波破砕法を用いて破砕されることが示されてい
る。
【００４９】本発明の方法はM. tuberculosisより不応
性でない多数の他の生物において細胞を破砕するために
も利用される。遺伝プローブによる標準的ハイブリダイ
ゼーション法により細胞の破砕が証明された。高いハイ
ブリダイゼーション値の結果を得たことは完全な細胞破
砕及び完全なＲＮＡの利用の可能性を示している。
【００５０】細胞破砕のための至適条件を決定するため
に実験を行った。細胞破砕の程度を規定する比較的重要
な３つの変数を決定するために８組の実験を行った。こ
れら３つの変数は： (1) 浴内の水に存在する気体の量； (2) 浴内の水の温度；及び (3) 試験管中に加えるビーズの量 である。
【００５１】以下のコーディングを用いて２段階階乗子
計画(two-level factorial design)を行った（DuPont−
“Strategy of Experimentation ”，Rev. Ed. p.20ff,
Wilmington, Delaware, 1975 年10月）。
【００５２】脱 気 温 度 ビーズ量 ＋＝脱気 ＋＝70℃ ＋＝0.5 ml −＝非脱気 −＝30℃ −＝0.1 ml 以下のどの実験のコーディングも第１に脱気条件、第２
に浴内温度及び第３にビーズ量という一連の３つの記号
により計画されている。
【００５３】測定のプロトコールは以下の通りである。
7×108細胞／mlのMycobacterium nonchromogenicumの
細胞懸濁液 1mlを測定した量のガラスビーズを含むEppe
ndorf 管に加える。本発明の方法に従い、この管を浴内
で10分間超音波処理を行う。対照を調製し、超音波処理
をせずに同様な方法で処理した。試料及び対照を遠心分
離し、破砕されていない細胞を沈渣で除去し、細胞物質
の遊離を上述した255nmの紫外線吸収法（Ａ255 ハイブ
リダイゼーション）により測定した。
【００５４】脱気方法は超音波浴に沸騰した湯を満たし
温度が90℃に低下した時点で15分間超音波処理して行な
う。実験の結果を表IVに示した。
【００５５】 算出された因子効果は： (1) 脱 気 0.065 (2) 温 度 0.082 (3) ビーズ量 0.049 最小有効因子（minimum significant factor）は最小限
0.024と算出された。このように扱った全ての因子は細
胞破砕に重要である。浴の水温の高温での維持、脱気水
浴の使用及び管の中のビーズ量の増加により好適な細胞
破砕条件が得られる。
【００５６】本発明に使用されるビーズは異なった形や
大きさの様々な物質から成り、市販のビーズの多くは一
般に球状又は球形であるが、多くのビーズは不規則な形
であり、それでも有効である。市販のビーズには例えば
Amberlite, Dowex, Impandex, Potters 等がある。しか
し、本発明では他の種類のガラスビーズ、プラスチッ
ク、水晶、金属、金属酸化物、ラテックス及び砂やケイ
酸塩のような顆粒又は粒状物質も使用できる。故に、本
発明の方法の概念及び重要な特性に相反することがなけ
ればビーズ又はそれと等価の顆粒又は粒状物質を用いる
ことができる。
【００５７】Mycobacterium nonchromogenicumを異な
る種類の物質から成るビーズを用いた前述の方法により
超音波で処理した。超音波処理後、異なる種類のビーズ
による破砕率を測定するために上述したＡ255 測定のプ
ロトコールを用いた。その結果を以下の表Ｖに示した。
【００５８】表 Ｖ ビーズの種類 Ａ255 アッセイ ガラス 0.423 Amberlite 0.101 Dowex 50 0.287 砂 ０．１８０ さらに、破砕率に及ぼすビーズの大きさ及び組成の影響
を決定するために、前述の条件下で大きさや種類が異な
るガラスビーズをMycobacterium nonchromogenicumと共
に超音波処理を行った。結果は標準としてImpandexビー
ズを用いた破砕分画により標準化した。前述したＡ255
測定法を用いた。その結果を以下の表VIで示した。
【００５９】 表 VI 名 称 大きさ（mm） Ａ255 Ａ255 ／Ａ255 Impandex PO 337 0.850-0.600 0.402 0.73 HO 337 0.850-0.590 0.090 0.16 PO 060 0.150-0.106 0.517 0.95 HO 05 0.106-0.075 0.0 0.0 Impandex 0.3-0.2 0.546 1.0 PO 120 0.300-0.212 0.379 1.13 Impandex 0.3-0.2 0.335 1.0 HO 120 0.300-0.212 0.282 0.65 Impandex 0.3-0.2 0.432 1.0 Ｈ＝Potterのチタン酸バリウムガラス（高密度） Ｐ＝Potterのソーダライムガラス（低密度） 表VIのデータからわかるように、本発明の方法では様々
な種類のガラスビーズが有利に用いられる。さらに、ビ
ーズの大きさも細胞破砕の程度に影響を及ぼすと考えら
れる。実験から、直径約0.05mmから約1.0 mmのビーズが
効果的に細胞破砕を行うことが示されている。しかし、
本発明の方法は様々な種類や大きさのビーズに適用さ
れ、この範囲が限度とは考えられない。その上に、接頭
辞Ｈと呼ばれている高密度チタン酸バリウムガラスは他
のより低密度のガラスと同様には作用しないようであ
る。
【００６０】一度細胞が破砕され、その内容物が溶液中
に流出すると、その遺伝物質は遺伝プローブとのハイブ
リダイゼーションが可能である。その遺伝プローブはそ
の生物を同定、検出又は定量するために生物の核酸配列
と相補的な核酸配列から成る。ハイブリダイゼーション
反応法は特許出願中の２つの明細書“METHOD FOR DETEC
TION, IDENTIFICATION AND QUANTITATION OF NON-VIRAL
ORGANISMS”出願番号456,729，1983年 1月10日出願及
び“METHOD FOR DETECTING, IDENTIFYING ANDQUANTITAT
ING ORGANISMS AND VIRUSES”出願番号655,365 、1984
年 9月 4日出願に記載されている。これらの開示内容は
参考として本明細書中に編入されている。
【００６１】細胞から遊離された遺伝物質とそれと相補
的な核酸配列を持つ遺伝プローブとのハイブリダイゼー
ションを促進させるために、細胞及びビーズを入れる容
器内にハイブリダイゼーション促進のための至適反応条
件を与えるために様々な添加物も含有させることができ
る。それらの添加物には、緩衝液、キレート化剤、有機
化合物及び洗剤、ジヒドロキシベンゼン、ドデシル硫酸
ナトリウム、ジイソブチルスルホサクシネートナトリウ
ム、テトラデシル硫酸ナトリウム、並びにＳＯ4 -2、Ｐ
Ｏ4 -3、Ｃｌ-1及びＨＣＯＯ-1のサルコシル、アルカリ
金属及びアンモニウム塩等の核酸沈澱剤等がある。これ
らの添加物はハイブリダイゼーション反応が起るための
至適条件を与えるために当業者によって利用される。一
本鎖核酸分子から二本鎖核酸分子へのハイブリダイゼー
ションを促進させる条件については出願中の２つの米国
特許“ACCELERATED NUCLEIC ACID REASSOCIATION METHO
D”出願番号 627,795、1984年 7月 5日出願及びその一
部継続出願である“ACCELERATED NUCLEIC ACID REASSOC
IATION METHOD ”1986年 1月 6日出願の明細書に開示さ
れている。
【００６２】本発明の方法は精製された試料又は唾液、
糞便、組織、血液、脊髄液、滑液、血清、尿若しくは他
の体液等の未精製臨床試料又は環境、食物試料中の細胞
あるいは微生物に対して行うことができる。
【００６３】本発明の方法では、細胞又は微生物に超音
波エネルギーを作用させる前に細胞又は微生物を溶液中
に懸濁ないし載置させることができる。処理の前に細胞
をさらに遠心分離するか又はのり状にすることもでき
る。上述した未精製試料の場合、細胞又は微生物は超音
波エネルギーを作用させる前は処理されることなく完全
なままそれら自身の生物学的環境中で存在している。こ
れらの試料を病原微生物を保持している疑いのある患者
からち直接採取し、直ちにビーズの入った適当な容器に
採取する。微生物の混入があると考えられる水試料のよ
うな環境的試料又は食物試料にも又、本発明の適用が可
能である。本発明によればその容器にふたをして、超音
波処理を行うことができる。明快にするために、溶液及
び懸濁液という用語は使用上、相互変換可能である。
【００６４】出願人の発見の結果、小型ビーズを入れた
閉鎖又は開放容器内の未精製な生物学的あるいは臨床的
試料中に存在する細胞又は微生物を、例えば低出力超音
波浴で超音波処理し、溶解又は破砕して、その結果溶液
中にＲＮＡ及びＤＮＡを得ることができる。本発明の方
法ではそのような低出力密度であるため、ＲＮＡ及びＤ
ＮＡは大きな損傷を受けず相補的な遺伝プローブと結合
する能力を保持する。次に、この微生物の核酸を用いて
同一の容器中で遺伝プローブとのハイブリダイゼーショ
ンが促進される。従って、臨床的、環境的、食物又は生
物学的試料中の細胞を破砕し、ＲＮＡ及びＤＮＡの遊離
を促進させ、溶液中で遺伝プローブと前述の核酸をハイ
ブリダイゼーションさせる、閉鎖された、試料中の一段
階法として迅速かつ効率の良いシステムが開示される。
この本発明方法により、唾液、糞便、組織、血液、滑液
又は脊髄液、血清、尿等の未精製の臨床試料及び他の未
精製の生物学的試料中から、例えばmycobacteriaのよう
な微生物を迅速に検出、同定及び定量することができ
る。簡単、容易、便利及び迅速なこのようなシステムは
一般に行われている複雑な多段式診断法と比べて明らか
な利点を有する。その上、この方法は適切な抗体との反
応のために細胞から抗原を遊離させる際にも利用でき
る。
【００６５】本文中に述べた具体例は本発明の原理を説
明するもので、本発明の範囲内で他の変更をおこなうこ
とができるものである。それ故に、この発明は添付した
特許請求の範囲のみに従って限定されるものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｍ 1/42 2104−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/10 (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:32） (72)発明者 バリー・エプスタイン アメリカ合衆国、カリフオルニア・92111、 サン・デイエゴ、ビロイト・アベニユー・ 6954 (72)発明者 アイラ・ローズン アメリカ合衆国、カリフオルニア・92111、 サン・デイエゴ、マウント・アケイデイ ア・ブールバード・4088 (72)発明者 エリザベス・デイーン アメリカ合衆国、カリフオルニア・92020、 エル・ケイジヨン、パイン・ドライブ・ 1323

Claims (6)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 一定量の直径が0.05〜1.0 mmの範囲にあ
    るビーズを含む容器内に細胞の溶液又は懸濁液を入れ、
    充分な時間、出力密度が0.2 W/mlを越えない超音波を作
    用させて細胞を破砕し、該細胞内のＲＮＡおよびＤＮＡ
    を溶液に放出する方法。
  2. 【請求項２】 前記ビーズの直径が0.1 mm〜0.5 mmの範
    囲にあることを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載
    の方法。
  3. 【請求項３】 前記細胞が不応性微生物の細胞であるこ
    とを特徴とする特許請求の範囲第１項又は第２項に記載
    の方法。
  4. 【請求項４】 前記不応性微生物が Mycobacterium属に
    属する微生物であることを特徴とする特許請求の範囲第
    ３項に記載の方法。
  5. 【請求項５】 超音波浴を用いて前記超音波を該容器に
    作用させる特許請求の範囲第１〜４項のいずれかに記載
    の方法。
  6. 【請求項６】 前記超音波浴に入れる液体をあらかじめ
    脱気させた後に超音波を作用させることを特徴とする特
    許請求の範囲第５項に記載の方法。
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