DE3786661T2

DE3786661T2 - Verfahren zur freisetzung von rns und dns aus zellen.

Info

Publication number: DE3786661T2
Application number: DE87303641T
Authority: DE
Inventors: Elizabeth Dean; Barry Epstein; Kathleen Murphy; Ira Rosen
Original assignee: Gen Probe Inc
Current assignee: Gen Probe Inc
Priority date: 1986-03-20
Filing date: 1987-04-24
Publication date: 1993-11-04
Anticipated expiration: 2007-04-25
Also published as: EP0288618B1; US5374522A; JPS62236478A; AU7040487A; JPH0813272B2; CA1296604C; EP0288618A1; DE3786661D1; ATE91708T1; JPH0568553A; AU604684B2; JPH0528599B2

Description

ANWENDUNGSGEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Lysieren von Zellen, wobei sich die zellulären Bestandteile in die Lösung freisetzen können. Im spezielleren betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Freisetzen von RNA und DNA aus Mikroorganismen, worin eine Lösung von Mikroorganismen in einen Behälter eingebracht wird, der kleine Körnchen (Beads) von verschiedener Zusammensetzung enthält. Der Behälter wird dann in ein Ultraschallbad eingebracht, bis die Zellen lysiert und die Zellbestandteile freigesetzt sind. Eine Vielzahl von Zusatzstoffen, wie etwa Salze, Puffer, Reinigungsmittel, Gensonden, Antikörper, Enzyme, Chelatoren, organische Verbindung, etc. können ebenfalls in der Lösung vorhanden sein. Als Folge des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung kann ein ansonsten refraktärer, intakter Mikroorganismus, wie etwa Mycobacterium tuberculosis, der in einer klinischen oder biologischen Probe in einem offenen oder geschlossenen Behälter vorhanden ist, aufgeschlossen werden und die darin enthaltenen Zellbestandteile, einschließlich RNA und DNA, können freigesetzt und für den Nachweis in der Probe, die Identifizierung, die Quantitätsbestimmung oder andere diagnostische Verfahren mittels der Gensonden- oder Antikörpernachweis-Technologie, zur Verfügung gestellt werden.

BESCHREIBUNG DES STANDS DER TECHNIK

Die Revolution in der Biotechnologie hat großes Interesse am genetischen Aufbau von Zellen geweckt. Als Folge dessen wurden in den vergangenen 25 Jahren große Anstrengungen zur Bestimmung von Methoden unternommen, mit denen die Freisetzung von RNA und DNA aus Mikroorganismen erleichtert werden könnte. Die in einem Mikroorganimus enthaltene RNA und DNA kann beispielsweise wertvolle Informationen zum Nachweis eines Organismus' in einer klinischen oder biologischen Probe bieten. Hybridisierungs- Reaktionen unter Einbeziehung von Gensonden stützen sich auf die Freisetzung der genetischen Information aus der Zelle, um die Hybridisierung mit den komplementären Sequenzen der Nukleinsäuren auf den Gensonden zu erleichtern. Solche Hybridisierungs-Reaktionen können zum Isolieren, Nachweisen, Identifizieren und/oder Quantifizieren von Mikroorganismen eingesetzt werden, die in biologischen Proben vorhanden sind.
Einige Zellarten sind allerdings zugänglicher für die Lyse und Freisetzung ihrer zellulären Bestandteile, während andere Zellarten refraktärer sind. Eine Zelle dieser Art, nämlich Mycobacterium tuberculosis, die die ätiologische Ursache der Tuberkulose ist, läßt sich bekanntermaßen schwer aufschließen. Folglich ist es viel schwerer, die RNA und DNA, die in diesen in einer Art refraktären Organismen enthalten ist, die ihre Identifizierung mittels der Gensondentechnologie verhindert, auf zweckdienliche und wirksame Weise zu erhalten.
Von all den Infektionskrankheiten, von denen die Menschheit betroffen war, geht wohl die größte Zahl der Erkrankungen und Sterbefällen auf das Konto der Tuberkulose. Selbst heute, wo das Auftreten der Tuberkulose in den westlichen Ländern deutlich abgenommen hat, ist die Tuberkulose noch immer eine der häufigsten Infektionskrankheiten der Welt. Die derzeitigen Schätzungen gehen dahin, daß mehr als die Hälfte der Weltbevölkerung mit Tuberkelbazillen infiziert ist (Youmans, G.P., Tuberculosis, W.B. Saunders Company (1979)). Die jährlichen Gesamtkosten der Maßnahmen zur Kontrolle von Tuberkulose werden auf etwa US$ 600 Mio. pro Jahr allein in den Vereinigten Staaten geschätzt. (Bericht einer Konferenz: "Future Research in Tuberculosis: Prospects and Priorities for Elimination" 9 (5.-7. Juni 1985), zur Veröffentichung vorgelegt als Nachtrag im American Review of Respiratory Disease (im folgenden "Pittsfield Report" genannt).)
Am 5.-7. Juni 1985 sponsorten das Center for Disease Control (GDC), die National Institutes of Health (NIH), die American Thoracic Society (ATS) und die Pittsfield Antituberculosis Association (PATA) gemeinsam eine Konferenz, deren Ziel es war, die Forschungsgebiete von vorrangiger Wichtigekit zu erkennen, die die Abnahme der Erkrankungen aufgrund von Tuberkulose vielleicht beschleunigen und letztendlich die Tuberkulose in den Vereingten Staaten und der ganzen Welt besiegen könnten. Zu den Hindernissen, die als wesentlich bei der Kontrolle und dem Sieg über die Erkrankung erkannt wurden, zählten die derzeit verfügbaren langwierigen Diagnoseverfahren.
Ausgehend von einer weltweiten Infektionsrate mit Tuberkelbazillen von 50%, gehen die Schätzungen der Weltgesundheitsorganisation (WHO) derzeit dahin, daß innerhalb eines Jahres nicht weniger als 4 bis 5 Mio. neuer Fälle von Infektionen mit Tuberkulose auftreten werden. Wahrscheinlich wird eine ähnliche Zahl, nämlich weitere 4 bis 5 Mio. Fälle von nicht-infektiöser Tuberkulose, innerhalb eines Jahres zu verzeichnen sein. Über diese 8 bis 10 Mio. Fälle von Neurerkrankungen hinaus werden weltweit nicht weniger als 3 bis 4 Mio. Todesfälle pro Jahr auf Tuberkulose zurückzuführen sein. ("Pittsfield Report" auf S. 14)
Die Methoden, mit denen die Tuberkulose definiert und identifiziert wird, spiegeln den Zustand der Technologie zur Kontrolle von Tuberkulose wider. Der "Pittsfield Report" besagt auf S. l7: "Die Tuberkulose wird noch immer mit den Waffen des 19. Jahrhunderts bekämpft, die um die Jahrhundertwende als modern galten, die aber heute, angesichts der bevorstehenden Wende zum nächsten Jahrhundert, allmählich überholt sind." Infizierte Personen werden anhand ihrer Reaktionen auf den Tuberkulintest identifiziert, also im Grunde mit dem gleichen Verfahren, das Robert Koch entwickelt hat. Das Verfahren besteht noch immer darin, ein wenig aufgereinigtes Antigen in die Haut zu injizieren, die Pustel am Arm zu messen und zu versuchen, anhand dessen eine Tuberkulose-Infektion, eine Infektion mit anderen Mycobacterien oder irgendeine unspezifische Reaktion zu bestimmen.
Die Erkrankungsfälle werden weitgehend durch Isolieren der Tuberkelbazillen identifiziert. Trotz vieler Verbesserungen handelt es sich bei den angewandten bakteriologischen Verfahren im Grunde genommen um dieselben, wie sie von Pasteur, Ehrlich und Koch entwickelt wurden. Die Organismen werden angefärbt, unter dem Mikroskop untersucht und kultiviert. Der Verfahrensschritt der Kultivierung nimmt noch immer Wochen bis Monate in Anspruch und erfordert weitere biochemische und andere Tests zur Unterscheidung der Tuberkelbazillen von anderen Mycobakterien.
Mit dem Kommen der Gensondentechnologie, bei der Nukleinsäure-Sequenzen bereitgestellt werden, die komplementär zu den nachzuweisenden Organismen sind, in diesem Fall Mycbacterium tuberculosis, erkannten die Autoren des "Pittsfield Report" auf S. 76, wie wichtig es ist, einen Weg zur Freisetzung von Nukleinsäuren aus mycobakteriellen Mikroorganismen zu finden, um diese für die Hybridisierung mit der komplementären Sonde verfügbar zu machen:
"Ein Schlüsselaspekt bei der klinischen Verwendung von DNA-Sonden für den Nachweis von Mycobakterien ist das Proben-"Handling". Eine Grundbedingung für den Test ist die, daß die Nukleinsäure-Proben für die Hybridisierung mit der Sonde zur Verfügung stehen. Die Hybridisierungsmethode ist mit Sputum, Faezes, Serum, homogenisiertem Gewebe, spinaler Flüssigkeit und Urin anwendbar."
In Bezug auf die klinische Verfahrensweise wird im Bericht weiterhin festgestellt:
"Eine Hauptschwierigkeit bei der Verwendung von DNA-Sonden zum Nachweis von Mycobakterien ist das Aufschließen der mycobakteriellen Zellen zum Freisetzen der Nukleinsäuren für die Hybridisierung. Hierfür wurden bisher keine Methoden beschrieben: die Entwicklungsmethoden, um dies zu erreichen, sind aber wichtig." (Unterstreichung hinzugefügt)
Die Notwendigkeit einer einfachen Methode, die Zellen in wirksamer und für das klinische Labor geeigneten Weise sicher aufzuschließen, besteht ganz klar. Als allgemeinen Überblick über Zellfraktionierung und Lysemethoden, siehe Schnaitman, C.A., "Cell Fractionation", Manual of Methods for General Bacteriology, Ch. 5, 52-61 (Gerhardt, P. et al, Eds. 1981), Coakley, W.T. et al., "Disruption of Microorganisms", Adv. Microbiol. Physiol. 16:279-341 (1977) und Hughes, D.E. et al, "The Disintegration of Microorganisms", Methods in Microbiology , 5B, Ch. 1, 2-54 (Norris, J.R. and Ribbons, D.W., Eds. 1971).
Zu den Verfahren nach dem bisherigen Stand der Technik zur Extrahierung von RNA oder DNA aus refraktären Bakterien, wie etwa Mycobakterien, gehört auch der Rückgriff auf rigoroses physikalisches Mahlen oder Schütteln der Organismen, um die Freisetzung ihrer Zellbestandteile zu bewirken. (Siehe H. Venner, Acta Biol. Med. Ger., 11:806 (1963); M. Tsukamura, et al., Am. Rev. Respirat. Diseases, 81:403 (1960); Moore, et al., US-Patent-Nr. 4.295.613 mit dem Titel "Gerät zum Aufschließen bakterieller Zellen", veröffentlicht am 20. Oktober 1981). Solche Verfahren zeigen beträchtliche Nachteile: Erstens kann die Reibung, die aus der physikalischen Wechselwirkung der Mahlteilchen resultiert, zu beträchtlicher Wärmeentwicklung führen, was nachteilige Auswirkungen auf die genetischen Zellbestandteile, wie etwa DNA und RNA, zeigt, und kann diese für die nachfolgenden diagnostischen Verfahren unbrauchbar machen.
Auch sind viele Organismen, die vordem solch rigorose Bedingungen für die Extraktion ihrer Zellbestandteile erforderlich machten, extrem pathogen. Die Gesundheitsrisiken, die mit dem Mahlen dieser Mengen von Krankheitserregern in offenen Systemen verbunden sind, liegen auf der Hand.
Die Erkenntnis dieser Probleme hat einige Forscher dazu veranlaßt, alternative Ansatzwege zum Aufschluß refraktärer Zellen zu suchen (siehe, zum Beispiel, L.G. Wayne and G.A. Diaz, J. Bacteriol., 93:1374 (1967); L.G. Wayne and W.M. Gross, "Isolation Of Deoxyribonucleic Acid From Mycobacteria", J. Bacteriol., 95:1481, (1968), worin Kulturen von Mycobacterium tuberculosis, M. kansasii, M. avium, M. gastri, M. flavescens, M. smegmatis, M. phlei und Gruppe II skotochromogene Mycobakterien, die in Glycerol-reichen Medien unter stark aeroben Bedingungen gezüchtet wurden, autolysieren, nachdem der Sauerstoff abrupt eingeschränkt worden war.) Dieses alternative Verfahren ist zeitaufwendig und teuer und macht eine große Zahl von Verfahrensschritten, einschließlich einer Stufe, bei der die Organismen gezüchtet werden müssen, erforderlich.
Vielleicht das wirksamste Verfahren zum Aufschließen mycobakterieller Zellen nach dem derzeitigen Stand der Technik ist das unter Verwendung einer Druckzelle. Bei diesem Verfahren wird die Lösung mycobakterieller Mirkoorganismen durch ein Loch mit einem sehr kleinem Durchmesser unter sehr hohem Druck geleitet. Beim Durchtritt durch dieses winzige Loch brechen die Mycobakterien durch die mechanischen Kräfte auf, und ihr Inhalt ergießt sich in die Lösung. Der Grad des Aufschlusses unter Verwendung dieses Verfahrens liegt im Bereich von 90 bis 100%. Solch ein System ist jedoch groß und teuer und erfordert ein Kühlsystem, um eine übermäßige Wärmeentwicklung und dadurch Beschädigung des Inhalts der lysierten Zellen zu vermeiden. Die Probenmengen müssen groß sein, und das Instrument muß zwischen den Durchgängen gereinigt und dekontaminiert werden. Schließlich ist beim "Handling" mit dem infektiösen Material ein großes Sicherheitsbehältersystem ("Containment"-System) erforderlich.
Alternativ dazu kann eine Lösung, die mycobakterielle Mikroorganismen enthält, einem sehr intensiven Ultraschallbeschuß ausgesetzt werden, was zur Lyse der Zellen führt. Einige Forscher verwenden Ultraschallgeräte, wie etwa leistungsfähige Ultraschallsonden (bekannt als "Sonifiers" oder "Sonicators"), zum Lysieren der Zellen. (Siehe Seiter, J.A. and Jay, J.M., "Application of Polyacrylamide Gel Electrophoresis to the Characterization and Identification of Arthrobacter Species", Int. J. Syst. Bacteriol., 30:460-465 (April, 1980).) Bei dieser Studie jedoch, die auch eine Proteincharakterisierung und Identifizierung bestimmter Arthrobacter-Stämme umfaßte, wurde ein "Sonicator"-Modell W350 (Heat Systems- Ultrasonics, Inc.) mit Körnchen zum Lysieren großer Mengen von Zellsuspensionen verwendet. Die Suspensionen bei Seiter, et al. wurden dann zur Abtrennung von festen Teilchen zentrifugiert, der Flüssigkeitsüberstand wurde abgeschöpft und einer Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterzogen, und die Proteinprofile wurden erstellt. Da die hochleistungsfähigen Ultraschallgeräte dieser Art beträchtlich Wärme entwickeln, sind Kühlmäntel oder Eisbäder zur Senkung der stufenweise steigenden Temperaturen erforderlich, die aber die zelluläre RNA oder DNA so beschädigen können, was auch häufig der Fall ist, daß sie mit der Sondentechnologie nicht mehr nachweisbar sind. Diese Tatsache ist durch eine ganze Anzahl von Quellen belegt. So wurde beispielsweise bei Salter, D.N. and Smith, R.H., "Protein Utilization in the Young Steer: Digestion and Nitrogen Retention of ¹&sup5;N-Labelled Rumen Bacterial Protein", British Journal of Nutrition, 51:531-539 (1984), eine Suspension von Pansenbakterien lysiert, indem eisgekühlte Anteile der Suspension mit hinzugefügten Glaskörnchen unter Verwendung eines Ultraschall-Desintegrators (Soniprobe; Dawe Instruments Ltd., London) Ultraschall-behandelt wurden. Diese Behandlung führte zu einem graduellen Anstieg der Temperatur auf 25 bis 30ºC und der Lyse von etwa 95% der Gesamtzahl an Bakterien. Die Analyse der Bakteriensuspension vor der Lyse und nach der abschließenden Dialyse der Lysetrümmer der Bakterien ergab jedoch, daß RNA und DNA durch diesen Vorgang vollständig zerstört waren.
Solche fühlerartigen Sonicator-Geräte können eine nachgewiesene Leistung von nicht weniger als 80 bis 100 W erbringen (siehe Closs, O., et al., "The Antigens of Mycobacterium bovis, Strain BCG, Studied by Crossed Immunoelectrophoresis: A Reference System", Scand. J. Immunol., 12:249-263 (1980). Bei dieser Studie wurden Suspensionen von Mycobacterium bovis-Bazillen in einer vollständig in Eiswasser getauchten Rosetten-Kältekammer unter Verwendung eines Branson "Sonifier"-Modells B-12 (Branson Sonic Power Co., Danbury, Conn.) bei einer gemessenen Leistung von 80 bis 100 W beschallt, um den Antigen-Aufbau von Mycobacterium bovis zu ermitteln. (Siehe auch Alliger, H., US-Patent-Nr. 3.558.066 mit dem Titel "Ultraschall-Extrahierung lebensfähiger Antigene aus Grampositiven Bakterien", veröffentlicht am 26. Januar 1971.) Im Gegensatz dazu arbeiten die bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendeten Ultraschallbäder bei geringerer Leistung und sind außerdem bequem, preiswert und kompakt. Kühlmäntel oder Eisbäder sind nicht erforderlich, da die Einheiten nicht die Leistung besitzen, daß die zu beschallende Suspension auf schädigende Grade erwärmt werden könnte. Außerdem können infektiöse Materialien bei diesem Verfahren in sicherer Weise "gehandled" werden. Die Ultraschallbäder können in eine biologische Sicherheitskabine eingebracht und die Röhren geschlossen werden, so daß keine gefährlichen Aerosole entstehen können, und nicht zuletzt können viele Proben gleichzeitig behandelt werden.
Schlußfolgernd kann gesagt werden, daß die dem derzeitigen Stand der Technik entsprechenden Druckzellen und Hochleistungs-Ultraschallgeräte zeitaufwendig und teuer sind und sich schlecht in sicher und wirksam handhaben lassen.
Demgemäß ist eine Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung die Bereitstellung eines einfachen und preiswerten Verfahrens zum Lysieren von Zellen, um die Freisetzung der darin enthaltenen zellulären Bestandteile zu erleichtern. Auch ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung die Bereitstellung eines Verfahrens zum Freisetzen von RNA und DNA aus Mikroorganismen, ohne die darin enthaltenen Nukleinsäuren beträchtlich zu beschädigen. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Freisetzung von RNA und DNA aus Mikroorganismen, die in einer ungereinigten biologischen, klinischen, Nahrungs- oder Umweltprobe enthalten sind. Wiederum eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines schnellen, wirksamen und preiswerten Verfahrens zum Nachweis in der Probe von RNA und DNA aus ungereinigten biologischen oder chemischen Proben, wie etwa Sputum, Faezes, Serum, Gewebe, Blut, Urin, spinale oder synoviale Flüssigkeit oder irgendeine andere Körperflüssigkeit, bei der Mikroorganismen vermutet werden, um den Nachweis, die Identifizierung und die quantitative Bestimmung von Mikroorganismen aus einer Probe in einem offenen oder geschlossenen Behälter zu erleichtern. Eine noch darüber hinausgehende Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Freisetzung des Zellinhalts aus refraktären Mikroorganismen.
Die vorliegende Erfindung stellt daher ein Verfahren zum Lysieren von Zellen bereit, umfassend das Aussetzen der Zellen einer Ultraschallenergie von kleiner oder gleich 0,2 W/ml in Gegenwart von Körnchen.
Allgemein gesagt erfüllt die vorliegende Erfindung die oben beschriebenen Aufgaben mittels der überraschenden Entdeckung, daß Zellen oder Mikroorganismen in einer Lösung mit kleinen Körnchen verschiedener Zusammensetzung, zum Beispiel Glas, Kunststoff, Sand oder Silikate, Latex, Kristalle, Metalle, Metalloxide, etc. in einem Behälter, ihre Zellbestandteile, einschließlich RNA und DNA, innerhalb von Minuten in die Lösung freisetzten, wenn sie einer Beschallung, beispielsweise in einem Ultraschallbad (wie, zum Beispiel, der Art, die zum Reinigen von Schmuck und Laborgeräten verwendet wird) ausgesetzt waren. Die Ergebnisse zeigten, daß die Nukleinsäuren mittels der Nukleinsäure- Hybridisierungsmethode leicht nachgewiesen werden konnten und nicht, wie das manchmal bei anderen Arten von Ultraschallgeräten der Fall ist, zerstört wurden. Der Zellaufschluß erfolgte bei allen getesteten Mirkoorganismen, einschließlich der üblicherweise refraktären Mycobakterien, problemlos. Die in die Lösung im Behälter freigesetzte RNA und DNA steht dann beispielsweise zur Hybridisierung mit den komplementären Sequenzen von in Gensonden vorhandenen Nukleinsäuren zur Verfügung. Dieses Verfahren kann auch zur Freisetzung von Proteinen und Zellbestandteilen für Antikörper-Reaktionen eingesetzt werden. Bei dem Behälter, in den die Lösung aus Zellen und Körnchen eingebracht wird, kann es sich beispielsweise um ein Kunststoff-Reagenzröhrchen oder einen anderen geeigneten Behälter mit geeignetem Verschluß handeln. Alternativ dazu kann die Ultraschallenergie direkt auf die Lösung oder Suspension aus Zellen und Körnchen, beispielsweise mittels eines Schallüberträgers, übertragen werden, wodurch kein separater Behälter zur Aufnahme der Zellen und Körnchen mehr erforderlich ist. Eine Vielzahl von Zusatzstoffen, wie etwa Puffer, Reinigungsmittel, Gensonden, Antikörper, Enzyme, Chelatoren, Salze, organische Verbindungen, etc. können ebenfalls vorhanden sein, um die geeigneten Bedingungen für die Reaktion der freigesetzten RNA oder DNA mit der Gensonde zu schaffen, nachdem die Zellen durch die Ultraschallbehandlung gemäß dem Verfahren der Erfindung lysiert wurden. Daher wird in einer der Ausführungsformen des Verfahrens der vorliegenden Erfindung ein einstufiges, in der Probe durchzuführendes Verfahren zum Lysieren oder Aufschließen von Zellen in einer ungereinigten klinischen oder biologischen Probe beschrieben, bei der Freisetzung von genetischem Material in die Lösung erleichtert wird, zur Hybridisierung mit Gensonden, deren Nukleinsäuresequenz komplementär zur RNA oder DNA des Organismus' ist, dessen Gegenwart nachzuweisen ist. Die anderen, in der Lösung vorhandenen Zusatzstoffe, können von einem Fachmann auf dem Fachgebiet so variiert werden, daß die für die Anforderungen des speziellen Verfahrens bestgeeigneten Reaktionsbedingungen geschaffen werden.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Allgemein gesagt basiert das Verfahren der vorliegenden Erfindung auf der überraschenden Entdeckung, daß Zellen, die sich in einer Lösung mit Körnchen in einem Behälter befinden, lysieren, wenn sie einer Beschallung, beispielsweise in einem Ultraschallbad, ausgesetzt werden, wodurch ihre Zellbestandteile in die Lösung im Behälter, der erforderlichenfalls geschlossen sein kann, freigesetzt werden. Zu den Zellbestandteilen, deren Freisetzung mittels dem Verfahren der vorliegenden Erfindung erleichtert wird, zählen Desoxyribonukleinsäure (DNA) ud Ribonukleinsäure (RNA).
Bestimmte Zellarten erwiesen sich als sehr schwer aufschließbar. Bei einer Zelle dieser Art, Mycobacterium tuberculosis, handelt es sich um ein stäbchenförmiges Bakterium (Bazillus) mit einer dichten Zellwand, die aus komplexen Lipiden zusammengesetzt ist. Diese Bakterien sind bekanntermaßen schwer aufschließbar. Als Folge dessen wurden rigorose Bedingungen für die Lyse dieser Zellen vorgeschlagen und angewendet, von denen sich einige zu nachteilig ausgewirkt und dadurch die Nukleinsäuren beschädigt und für nachfolgende Verfahren oder Experimente unbrauchbar gemacht haben. Die Notwendigkeit, solche Zelltypen in zweckdienlicher, sicherer, wirksamer und preiswerter Weise zu lysieren, besteht jedoch und ist dringlich.
Die klinische Anwendung von RNA oder DNA-Proben für den Nachweis von Mycobakterien wurde hauptsächlich durch die Schwierigkeit behindert, die mycobakteriellen Zellen zur Bereitstellung der darin enthaltenen Nukleinsäuren für die Hybridisierung aufzuschließen. Ohne diese Grundvoraussetzung, nämlich die wirksame, sichere und preiswerte Freisetzung der zellulären RNA und DNA in die Lösung, kann die Hybridisierung nicht stattfinden, was den Wert der Gensonden als diagnostisches Mittel bei refraktären Zellen, wie etwa Mycobakterien, beträchtlich mindert. Vor der Erfindung der Anmelder wurden keine einfachen Methoden für eine entsprechende Lyse der Zellen, ohne daß dabei die RNA und/oder DNA für die Hybridisierung unbrauchbar gemacht wird, beschrieben.
Eine Vielzahl von Ultraschallbädern befinden sich im Handel, die zur Ausführung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung verwendet werden könnten. Branson Cleaning Equipment Company in Shelton, Connecticut, beispielsweise vermarktet etwa ein Dutzend Modelle unter dem Markennamen Bransonic mit Tankfassungsvermögen im Bereich von 10 ounces bis 8 gallons. Auch Mettler Electronics in Anaheim, Kalifornien, hat verschiedene Modelle mit Tankfassungsvermögen von 2,1 quarts bis 18 gallons auf dem Markt. Diese Ultraschallbäder empfehlen sich für Reinigungswerkzeuge, Schreibwerkzeuge, Schmuck, Maschinen, Motorteile, Düsen, Laborinstrumente, Schalter, Schlösser, Kraftfahrzeugteile, Glas, Keramik, Metalle, Hartkunststoffe, etc. Bei Ultraschall- Reinigungsbädern wie diesen werden piezoelektrische Schallübertäger verwendet, wie beispielsweise Bleititanatzirconat oder Bariumtitanat, oder ein nichtmagnetisierbarer Schallüberträger zur Umwandlung von elektrischer Eingangsenergie in Hochfrequenz- Ultraschallenergie. Diese mechanische Energie oder Schwingung wird dann auf die im Reinigungstank enthaltene Flüssigkeit übertragen und darin weitergeleitet. Die Bransonic - Ultraschallreiniger besitzen Frequenzen um 55 kHz, während die nominalen Hauptfrequenzen der oben genannten Mettler - Geräte im Bereich von 22-67 kHz liegen. Die Bezeichnung Ultraschall bezieht sich auf Frequenzen, die knapp oberhalb des Bereichs menschlichen Hörens liegen, also um 20 kHz. Alternativ dazu kann die Ultraschallenergie direkt an die Lösung oder Suspension aus Zellen und Körnchen herangebracht werden, zum Beispiel durch einen Schallüberträger, was einen separaten Behälter zur Aufnahme der Zellen und Körnchen unnötig macht. Eine Lösung oder Suspension von Zellen oder Mikroorganismen in gereinigter oder ungereinigter Form kann beispielsweise in einen Behälter oder "Well" oder eine Reihe von Behälter oder "Wells" eingebracht werden, die etwa aus einem Material wie Edelstahl bestehen, das zur Übertragung von Ultraschallenergie fähig ist. Der Well ist entweder an einem geeigneten Schallübertäger oder einem anderen, zur Umwandlung von Eingangsenergie in Ultraschallenergie fähigen Gerät, angebracht oder in dessen Nähe plaziert. Die Zellen und Körnchen können direkt in den Well oder die Reihe von Wells, die als Probenträger dienen, eingebracht werden oder können alternativ dazu in Behälter und in der im Well enthaltenen Flüssigkeit untergetaucht werden. Der Well kann zur Vermeidung von Auslaufen oder Aerosolbildung mit einem geeigneten Verschluß abgedeckt werden. Es sollte klar sein, daß die oben beschriebenen Ausführungsformen nur als Beispiele dienen und auch in anderen spezifischen Formen ausgeführt werden können, die mit dem Sinn und den wesentlichen Merkmalen der vorliegenden Erfindung übereinstimmen.
Zwar ist das Verfahren, mit dem Zellen durch Ultraschall lysiert werden, noch nicht völlig erschlossen, doch wird als gegeben vorausgesetzt, daß durch eine Flüssigkeit wandernde Ultraschallwellen aus sich abwechselnden Verdichtungen und Verdünnungen bestehen. Ist die Amplitude der Welle hoch genug, so bewirkt dies ein als "Kavitation" bekanntes Phänomen. Bei der Kavitation handelt es sich um das Aufbauen und Brechen mikroskopischer Blasen. Wachsen diese Blasen oder Hohlräume zu dem an, was mit dem Begriff "Resonanzgröße" bezeichnet wird, so brechen sie umgehend und heftig in einem Verdichtungszyklus zusammen, wodurch hohe lokale Druckveränderungen von vielleicht 20.000 Atmosphären entstehen. Dieser mechanische Schock, der auf eine Distanz von einigen wenigen Mikronen zu verzeichnen ist, ist bei den Hochleistungs-Instrumenten für die Lyse der Zellen verantwortlich. (Alliger, H. Ultrasonic Disruption, nachgedruckt aus American Laborator, Oktober 1975.)
Beim Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung wird jedoch nicht davon ausgegangen, daß die Zellen durch Kavitation aufgeschlossen werden. Dies wird als richtig angenommen, da die Zellen in Abwesenheit der kleinen Körnchen nicht aufbrechen. Anstelle dessen wird davon ausgegangen, daß der Ultraschall die Körnchen dazu bringt, durch die bakterielle Suspension oder Lösung zu schwingen, was zum Bruch der Zellen durch Scherung führt. Die exakte Wechselwirkung zwischen den winzigen Körnchen und den Ultraschallwellen ist zwar nicht bekannt, und die Anmelder wollen sich nicht durch eine Theorie festlegen oder einschränken, doch wird angenommen, dar die Ultraschallwellen den Körnchen eine Druckbewegung verleihen. Die Zellen sind dann der hohen Scherwirkung der sich bewegenden Körnchen ausgesetzt, was zu Bruch der Zellwand und anschließender Freisetzung der Zellbestandteile führt. Es ist jedoch wichtig, daß die Zellbestandteile nach ihrer Freisetzung in die Lösung nicht beschädigt werden. Die geringe Energiedichte des Ultraschallbades der vorliegenden Erfindung ist zwar leistungsfähig genug für die Lyse von Zellen, nicht aber für eine Zerstörung der freigesetzten RNA oder DNA. Weiterhin haben Experimente gezeigt, daß das Verfahren der vorliegenden Erfindung Zellen bei Zimmertemperatur (18ºC) und darüber wirksam lysiert. Dieser Parameter ist jedoch nicht als Beschränkung für den wirksamen Temperaturbereich der vorliegenden Erfindung zu betrachten.
Es wurde festgestellt, daß die Ultraschallmethode gemäß der vorliegenden Erfindung bei der Lyse von Zellen, selbst refraktärer Mikroorganismen, wie etwa Mycobakterien, in schneller, sicherer, wirksamer und preiswerter Weise wirksam ist, wodurch die Freisetzung der Zellbestandteile, einschließlich RNA und DNA, erleichtert wird.
Die Anmelder verglichen ihr Verfahren mit einem Verfahren zur Lyse von Zellen unter Verwendung einer Druckzelle. Das Druckzellen-Verfahren wurde deshalb als Bezugsverfahren für diesen Vergleich gewählt, weil nahezu alle Bakterien mittels dieses Verfahrens aufgeschlossen werden. Als Bakterien in Lösung wurden Mycobakterien verwendet. Das allgemeine Protokoll des oben genannten Vergleichs wird wie folgt beschrieben:
A. Eine Lösung, die Mycobakterien enthielt, wurde in vier Anteile aufgeteilt.
1) Ein Anteil wurde zweimal bei 18.000 psi durch eine Druckzelle geleitet.
2) Ein zweiter Anteil wurde zu Glaskörnchen in einem geschlossenen Behälter hinzugefügt, der in ein Ultraschall-Reinigungsbad eingebracht und einer Ultraschallbehandlung gemäß der vorliegenden Erfindung unterzogen wurde.
3) Ein dritter Anteil wurde in einen geschlossenen Behälter ohne Glaskörnchen eingebracht und der Ultraschallbehandlung wie bei (2) unterzogen.
4) Ein vierter Anteil blieb unbehandelt und diente als Kontrolle.
B. Jeder Anteil aus A. wurde dann zur Bestimmung des Prozentsatzes an Zellen, der lysiert war, untersucht. Die Menge der RNA, die in jeder Probe durch die spezifische Behandlung freigesetzt worden war, wurde durch die Kinetik der Nukleinsäure-Hybridisierung bestimmt. Ein Anteil jeder Probe wurde auf 0,48 M Phosphatpuffer (PB), 0,2% Natriumdodecylsulfat (SDS) eingestellt. Jeder Probe wurde zur RNA des Mycobacterium tuberculosis komplementäre, radioaktive DNA hinzugefügt und die Probe bei 72ºC inkubiert. Zu festgesetzten Zeiten wurden Anteile aus jeder Probe entnommen und auf 0,14 M PB, 0,02% SDS verdünnt. Die verdünnte Probe wurde dann auf einer Hydroxylapatit- (HA)-Säule untersucht, die auf 72ºC, 0,14 M PB, 0,02% SDS ausbalanciert war. Das zugrundeliegende HA-Fraktionierungs-Verfahren ist in Kohne and Britten, Procedures in Nucleic Acid Research (1971), eds. Cantoni and Davies, Harper & Row, Vol. 2, p. 500 (1971) beschrieben. Das kinetische Profil der Proben wurden dann zur Bestimmung der Konzentration der freien RNA in jeder Probe verglichen.
C. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 wiedergegeben. TABELLE I ZELLBEHANDLUNGS-VERFAHREN ANTEIL DER LYSIERTEN ZELLEN 1. Bei 18.000 psi zweimal durch Druckzelle geleitet 2. 10 Minuten im Ultraschall- Reinigungsbad mit Glaskörnchen. 3. 10 Minuten im Ultraschall- Reinigungsbad ohne Glaskörnchen. 4. Kontrolle.
Vergleiche der Lyse im Ultraschall-Reinigungsbad und der Lyse unter Verwendung der französichen Druckzelle wurden ebenfalls anhand einer Reihe verschiedener Bakterienarten angestellt. Die Proben wurden in zwei Teile aufgeteilt. 100 µl eines Teils wurden in ein Röhrchen gegeben, das eine entsprechende Menge an Glaskörnchen enthielt, und in einem Ultraschallbad 10 Minuten lang bei 75ºC unter Verwendung von entgastem Wasser behandelt (das Entgasungsverfahren bestand im Füllen des Ultraschallbads mit gekochtem Wasser und im Aussenden des Ultraschalls über 15 Minuten, sobald die Temperatur auf 90ºC gefallen ist). Die Probe wurden dann zehnfach verdünnt und 30 Minuten lang bei 3400 U/min. in einer Sorvall RC-3B- Zentrifuge unter Verwendung eines H6000A-Rotors zum Zentrifugieren der festen Teilchen zentrifugiert. Der zweite Teil jeder Probe wurde durch eine französische Druckzelle geleitet, dann zehnfach mit Wasser verdünnt und wie oben zentrifugiert. Die Freisetzung des Zellmaterials wurde mittels einer Untersuchung der UV-Absorption bei 255 nm gemessen. Die Absorption bei 255 nm wird als Index der Lyse von Zellen gewählt. Nukleinsäuren und Proteine sind die wichtigsten Substanzen, die zur Absorption bei dieser Wellenlänge beitragen. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle II in Einheiten von A&sub2;&sub5;&sub5; gezeigt, die in den Überstand derselben Suspension freigesetzt wurden. TABELLE II A&sub2;&sub5;&sub5; Ultraschall A&sub2;&sub5;&sub5; Franz. Druckzelle Organismus Legionella pneumophila Bäckerhefe Mycobacterium nonchromogenicum Escherichia coli Staphvlococcus aureus Bacillus subtilis
Legionella pneumophila und Escherichia coli sind Beispiel für Gram-negative Stäbchen. Bei Bacillus subtilis handelt es sich um ein Gram-positives Stäbchen, bei Staphylococcus aureus um einen Gram-positiven Kokkus und bei Mycobacterium nonchromogenicum um ein säurebeständiges Bakterium. Bäckerhefe schließlich ist ein Vertreter einer nichtbakteriellen Organismengruppe. Alle diese Organismen mit ihren unterschiedlichen Zellwandarten wurden unter Verwendung der vorliegenden Erfindung leicht aufgeschlossen.
Gemäß dem beschriebenen Verfahren wurde festgestellt, daß die Lyse von Zellen, auch refraktärer Zellen, selbst bei sehr geringen Energiedichten stattfindet, solange auch Körnchen in der Lösung vorhanden sind. Werden Ultraschallsonden direkt in den Behälter der Zellsuspensionen bei Ultraschall-Leistungen von 0,2 bis 3,0 W/ml eingebracht, so ist es wahrscheinlich, daß in erster Linie Oberflächenaktivität und Stoßwellen für die Zelldesintegration verantwortlich sind. (Siehe Coakley, et al., supra auf S. 303.) Die Anmelder haben die relativen Energiedichten der vorliegenden Erfindung mit einem typischen Hochleistungs-Ultraschallgerät verglichen und festgestellt, daß das Verfahren der vorliegenden Erfindung bei der Lyse von Zellen bei einer Leistung von beträchtlich weniger als 0,2 W/ml erfolgreich ist, solange auch Körnchen in der Lösung vorhanden sind. Ein Hochleistungs-Ultraschallgerät wurde 5 Minuten lang bei 200 ml Wasser betrieben. Dies führte zu einer Temperaturveränderung von 8,95ºC. Dies entspricht einer Leistung von 8,95 x 200 oder 1790 cal/5 min., oder einer Leistung von 25 W. Bei einem typischen Experiment konzentriert sich der Großteil der Leistung auf einen Einwirkbereich von 3 ml der Probe, was eine Energiedichte von etwa 8,3 W/ml ergibt. Im Vergleich dazu steigt die Temperatur beim Betreiben eines typischen Ultraschallbades mit 250 ml Wasser über 10 Min. um 10,4ºC an. Dies entspricht einer Leistung von 18 W pro Bad. Bei einem typischen Zellyse- Experiment gemäß der vorliegenden Erfindung enthält das Bad 750 ml Wasser. Dies ergibt eine Leistung von 0,024 W/ml. Gemäß diesem Vergleich besitzt das Ultraschallgerät eine 300fache leistung gegenüber dem Wasserbadreiniger. Die Anmelder haben jedoch festgestellt, daß dann, wenn die Zellösung auch Körnchen aus zusammengesetzten Stoffen, wie oben beschrieben, enthält, die Zellen selbst bei diesen geringen Leistungen lysieren.
Bei anderen Experimenten wurden Suspensionen von Mycobakterien in 1% Natriumdodecylsulfat (SDS) hergestellt und unter Verwendung einer Petroff-Hauser-Zählkammer gezählt. Sie wurden auf 7 x 10&sup8;/ml durch Verdünnen mit 1% SDS eingestellt und mittels einer französischen Druckzelle bei 1000 psi lysiert. Eine Probe von 1 ml derselben Suspension wurde in ein abgedecktes Eppendorf-Gefäß hinzugegeben, das 0,1 ml Glaskörnchen (0,1-0,3 mm) enthielt, und in einem Wasserbadreiniger (Mettler Electronics Cavitator ME 4.6) 10 Minuten lang bei Zimmertemperatur beschallt. Der Grad der Lyse wurde durch Messen der Menge an freigesetzter RNA mittels eines RNA-Assay bestimmt.

Reagenzien:

Reagenz 1:

0,96 M Natriumphosphatpuffer, pH-Wert 6,8
2.0% SDS
1 mM EDTA
1 mM EGTA

Probenlösung:

3,5 ml Reagenz 1
30 Mikroliter von mit ¹²&sup5;1 markierter TB-Probe in 0,14 M Phosphatpuffer und 0,02% SDS, bei einer Aktivität von 8.000 cpm/Mikroliter.

Reagenz 2:

0,14 M Natriumphosphatpuffer, pH-Wert 6,8
0,02% SDS
1 g Hydroxylapatit (HA) /50 ml

Reagenz 3:

0,14 M Natriumphosphatpuffer, pH-Wert 6,8
0,02% SDS

Verfahrensweise:

Die Proben bestanden aus 100 µl lysierter Zellsuspension und 100 µl Probenlösung. Die positive Kontrolle bestand aus 100 ul Probenlösung und 10 ul (0,5 ug/10 µl TB RNA ) und 90 µl Wasser. Die negative Kontrolle enthielt 100 µl Probenlösung und 100 µl Wasser. Die Gesamtzahl der Counts wurde mit 100 µl der Probe bestimmt.
Für jeden Zeitpunkt wurden gesonderte Probenröhren vorbereitet. Proben jeder aufgeschlossenen Zell- oder Gewebesuspension wurden nach 15, 30 und 120 Minuten gemessen. Die Proben und Kontrollen wurden bei 72ºC inkubiert. Nach der Inkubation wurden 5 ml des Reagenz 2 allen Proben und Kontrollen, mit Ausnahme des Maximalwerts und der HA-Kontrolle, hinzugefügt und die Proben wurden gevortext. Nach der 5-minütigen Inkubation bei 72ºC wurden die Teströhrchen gevortext und 1 Minute lang bei 1.500 U/min. in einer IEC 36 Well-Zentrifuge zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und 5 ml des Reagenz 3 wurden allen Proben und Kontrollen, mit Ausnahme des Maximalwerts, hinzugefügt. Die Proben wurden wie zuvor gevortext und zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und 5,5 ml Cytoszint hinzugefügt, gevortext und das Röhrchen in einem Szintillationszähler gemessen.
Die Counts der Ha-Proben dienten als Background und wurden von jeder Probe und der Gesamtzahl der Counts subtrahiert. Die so ermittelten Counts pro Probe wurden durch den Maximalwert dividiert und mit 100 multipliziert, um den Prozentsatz der Hybridisierung (%hyb) zu erhalten.
Der höchste Wert des %hyb bei einer vorgegebenen Probe war der %max. Die % Einzelstrang-RNA (%SS) ist gleich 100 (%max-%Hyb)/%max. Der Logarithmus (%SS) wurde gegen Zeit augetragen und die Halbwertszeit (t&sub1;&sub2;) aus der Zeit bestimmt, bei der der %SS = 0,5 ist. Die RNA-Konzentration ist:
[RNA] = 2(0,0023)/0,011/t&sub1;&sub2;
0,0023 ist der Wert für den halben Cot der TB-Probe. Der Wert 0,011 ist der Umrechnungsfaktor, um optische Dichte in Mikromol umzurechnen, und Faktor 2 ist erforderlich, um die Konzentration auf die Ausgangslösung zurückzurechnen.
Die Menge der RNA bezüglich der Zellzahl wurde mit 5,5 x 10&supmin;&sup9; µg/Zelle bestimmt.

Ergebnisse:

Das Verhältnis der RNA, die aus einer gegebenen Zellsuspension mittels des Ultraschall-Reinigungsbades mit Glaskörnchen (Son.) freigesetzt wurde, zur französischen Druckzelle (F.P.), ist in der nachfolgenden Tabelle III gezeigt. TABELLE III Verhältnis der durch Son./F.P. freigesetzten RNA Bakterium M. flavescens M. gordonae M. phlei M. simiae M. fortuitum M. terrae M. nonchromogenicum M. malmoense M. asiaticum M. vaccae M. smegmatis M. gastri M. szulgai M. triviale M. haemophilum M. kansasii M. marinum M. bovis M. bovis (BCG) M. africanum M. thermoresistibile M. tuberculosis M. chelonae M. scrofulaceum M. avium M. intracellulare
Dieses Beispiel verdeutlicht, daß alle diese sechsundzwanzig Mycobakterien-Stämme unter Verwendung des oben beschriebenen Ultraschall-Lyseverfahrens lysiert wurden.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung wurde zur Lyse von Zellen bei einer Vielzahl anderer, weniger refraktären Organismen als M. tuberculosis verwendet. Die Zellyse wurde mittels herkömmlicher Hybridisierungs-Assays mit Gensonden verifiziert. Die resultierenden hohen Hybridisierungswerte wiesen auf eine komplette Zellyse und die Bereitstellung intakter RNA hin.
Zur Bestimmung der optimalen Bedingungen für die Zellyse wurden Experimente durchgeführt. Es wurden acht Experimentreihen zur Bestimmung der relativen Wichtigkeit dreier Variablen für den Grad der Zellyse durchgeführt. Diese drei Variablen umfaßten:
(1) Die Menge des im Badewasser vorhandenen Gases
(2) Die Temperatur des Badewassers und
(3) die Menge der in den Röhrchen vorhandenen Körnchen.
Zwei verschiedene experimentelle Ausgangssituationen wurden gemäß folgendem Schema untersucht (Siehe DuPont - "Strategy of Experimentation", Rev. Ed. S. 20ff, Wilmington, Delaware, Oktober 1975): Entgasung Temperatur Körnchenmenge entgast nicht entgast
Jedes der folgenden Experiemente ist mittels einer Reihe von drei Symbolen kodiert, von denen das Erste für die Entgasungsbedingung, das Zweite für die Badtemperatur und das Dritte für die Körnchenmenge steht.
Das Assay-Protokoll war folgendes: Eine Zellsuspension von Mvcobacterium nonchromogenicum von 1 ml, die 7 x 10&sup8; Zellen/ml enthielt, wurde in ein Eppendorf-Gefäß zu einer abgemessenen Menge an Glaskörnchen hinzugegeben. Das Gefäß wurde dann 10 Min. lang in ein Ultraschallwasserbad gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung eingebracht.
Eine Kontrolle wurde vorbereitet und in derselben Weise behandelt, aber nicht beschallt. Die Proben und Kontrollen wurden zum Pelletieren der unaufgeschlossenen Zellen zentrifugiert und die Freisetzung des Zellmaterials mittels einer Untersuchung der UV-Absorption bei 255 nm (A&sub2;&sub5;&sub5;-Hybridisierung), wie oben beschrieben, gemessen.
Das Entgasungsverfahren bestand im Füllen des Ultraschallbades mit gekochtem Wasser und Aussenden des Ultraschalls über 15 Minuten, sobald die Temperatur auf 90ºC gefallen war. Die experimentellen Ergebnisse sind nachfolgend in Tabelle 4 gezeigt. TABELLE IV Experiment Code Durchschnittswert

Der ermittelte Faktor war:

(1) Entgasung 0,065
(2) Temperatur 0,082
(3) Körnchenmenge 0.049
Der kleinste signifikante Faktor wurde als 0,024 ermittelt. Daher sind alle behandelten Faktoren bei der Zellyse signifikant. Die Zellyse wird durch eine höhere Temperatur des Wasserbades unter Verwendung eines entgasten Wasserbades und durch Vermehrung der Körnchenmenge, die in den Röhrchen vorhanden ist, begünstigt.
Es ist klar, daß die bei der vorliegenden Erfindung verwendeten Körnchen sich aus einer Vielzahl verschiedener Materialien verschiedener Formen und Größen zusammensetzen können; viele der handelsüblichen Körnchenarten sind zwar im allgemeinen spherisch oder kugelförmig, doch können die Körnchen von unregelmäßiger Form und trotzdem wirksam sein. Zu den im Handel erhältlichen Körnchen zählen beispielsweise Amberlit, Dowex, Impandex, Potters, etc. Bei der vorliegenden Erfindung können jedoch auch andere Arten von Glaskörnchen, Kunststoffe, Kristalle, Metalle, Metalloxide, Latex und körnige oder zusammengesetzte Stoffe, wie etwa Sand oder Silikate, verwendet werden. Es sollte klar sein, daß Körnchen oder äquivalente körnige oder zusammengesetzte Stoffe ohne Abweichung vom Sinn oder den wesentlichen Merkmalen des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können.
Suspensionen von Mycobacterium nonchromogenicum wurden gemäß der beschriebenen Verfahrensweise unter Verwendung von Körnchen beschallt, die aus verschiedenen Stoffarten zusammengesetzt sind. Nach der Beschallung wurde das oben beschriebene A&sub2;&sub5;&sub5;-Assay-Protokoll zur Bestimmung des Grades des Zellyse mit verschiedenen Körnchenarten herangezogen. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle V beschrieben. TABELLE V Körnchenart A&sub2;&sub5;&sub5;-Assay Glas Amberlit Dowex 50 Sand
Weiterhin wurden Körnchen verschiedener Glasarten und -größen, zusammen mit Mycobacterium nonchromogenicum, einer Beschallung unter den zuvorgenannten Bedingungen ausgesetzt, um die Auswirkung von Körnchengröße und -zusammensetzung auf den Grad der Lyse zu bestimmen. Die Ergebnisse wurden unter Verwendung von Impandex-Körnchen als dem Standard normiert. Zur Messung der Ergebnisse, die in der nachfolgenden Tabelle VI wiedergegeben sind, wurde der zuvor beschriebene A&sub2;&sub5;&sub5;-Assay verwendet. TABELLE VI Bezeichnung Größe in mm A&sub2;&sub5;&sub5;/A&sub2;&sub5;&sub5; Impandex H = Bariumtitanatglas (hohe Dichte) von Potter P = Natriumkalkglas (niedrige Dichte) von Potter
Wie aus den Daten in Tabelle VI ersichtlich, können Körnchen verschiedener Glasarten beim Verfahren der vorliegenden Erfindung nutzbringend verwendet werden. Auch scheint sich die Körnchengröße auf den Grad der Zellauflösung auszuwirken. Experimente ergaben, daß Körnchen mit Durchmessern im Bereich von etwa 0,05 mm bis etwa 1,0 mm bei der Lyse von Zellen wirksam sind. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist jedoch auf einen breiten Bereich von Körnchengrößen und -arten anwendbar, und dieser Bereich wird nicht als Einschränkung erachtet. Weiterhin scheint das Bariumtitanatglas hoher Dichte, das oben mit dem Präfix H bezeichnet ist, nicht so wirksam zu sein wie andere Gläser niedrigerer Dichte.
Sind die Zellen lysiert und hat sich der Inhalt in die Lösung ergossen, so steht das genetische Material zur Hybridisierung mit Gensonden zur Verfügung. Die Gensonden setzen sich aus Nukleinsäuren zusammen, deren Sequenz komplementär zu der des Organismus' ist, dessen Gegenwart nachzuweisen, zu identifizieren oder zu quantifizieren ist. Das Verfahren der Hybridisierungsreaktion ist in zwei angemeldeten Patentanmeldungen beschrieben: "VERFAHREN ZUM NACHWEISEN, IDENTIFIZIEREN UND QUANTIFIZIEREN VON NICHT-VIRALEN ORGANISMEN", Seriennr. 456.729 und "VERFAHREN ZUM NACHWEISEN, IDENTIFIZIEREN UND QUANTIFIZIEREN VON ORGANISMEN UND VIREN", Seriennr. 655.365, eingereicht jeweils am 10. Januar 1983 und 4. September 1984. Diese Offenlegungen sind hierin in Form von Verweisen berücksichtigt.
Um die Hybridisierung des aus den Zellen freigesetzten genetischen Materials mit den komplementären Sequenzen der Nukleinsäuren in den Gensonden zu erleichtern, können dem Behälter, in den die Zellen und Körnchen eingebracht werden, auch eine Vielzahl von Zusatzstoffen hinzugefügt werden, die derart sind, daß sie optimale Reaktionsbedingungen für eine beschleunigte Hybridisierung schaffen. Zu solchen Zusatzstoffen können Puffer, Chelatoren, organische Verbindungen und Nukleinsäure-Ausfällmittel gehören, wie etwa Reinigungsmittel, Dihydroxylbenzol, Natriumdodecylsulfat, Natriumdiisobutylsulfosuccinat, Natriumtetradecylsulfat, Sarkosyl und die Alkalimetallsalze und Ammoniumsalze von SO- ²&sub4;, PO&supmin;³&sub4;, Cl&supmin;¹ und HCOO&supmin;¹. Solche Zusatzstoffe können von einem Fachmann auf diesem Fachgebiet zur Schaffung der optimalen Bedingungen für das Eintreten der Hybridisierungsreaktion verwendet werden. Diese Bedingungen für eine beschleunigte Hybridisierung von Einzelstrang- Nukleinsäuremolekülen in Doppelstrang-Moleküle sind Thema zweier angemeldeter US-Patentanmeldungen: "VERFAHREN ZUR BESCHLEUNIGTEN NUKLEINÄURE-RÜCKKOMBINIERUNG", Seriennr. 627.795, eingereicht am 5. Juli 1984 und "VERFAHREN ZUR BESCHLEUNIGTEN NUKLEINSÄURE-RÜCKKOMBINIERUNG", eingereicht am 6. Januar 1986, die eine teilweise Fortführung des oben beschriebenen Anwendungsverfahrens ist.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann an Zellen oder Mikroorganismen aus gereingten Proben oder ungereinigten klinischen Proben, wie etwa Sputum, Faezes, Gewebe, Blut, spinale oder synoviale Flüssigkeiten, Serum, Urin oder andere Körperflüssigkeiten, oder anderen Proben, wie etwa Umwelt- oder Nahrungsmittelproben durchgeführt werden. Vor dem Heranbringen der Ultraschallenergie an die Zellen oder Mikroorganismen gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung können die Zellen oder Mikroorganismen suspendiert oder in Lösung eingebracht werden. Die Zellen können auch zentrifugiert oder vor der Behandlung zu einer Trägersubstanz verarbeitet werden. Im Falle der oben erwähnten ungereinigten Proben können die Mikroorganismen intakt und unbehandelt in ihrer eigenen biologischen Umgebung der Ultraschallenergie ausgesetzt werden. Diese Proben können direkt von einem Patienten erhalten werden, bei dem pathogene Mikroorganismen vermutet werden, und sofort in einen geeigneten Behälter, der Körnchen enthält, eingebracht werden. Bei Umweltproben, wie etwa Wasserproben oder Nahrungsmittelproben, bei denen eine Kontaminierung mit Mikroorganismen vermutet wird, kann die vorliegende Erfindung ebenfalls Anwendung finden. Der Behälter kann dann abgedeckt und der Ultraschallenergie gemäß der vorliegenden Erfindung ausgesetzt werden. Zum Zwecke der Klarheit sollen die Begriffe Lösung und Suspension austauschbar verwendet werden.
Als Folge der Entdeckung der Anmelder lysieren Zellen oder Mikroorganismen, die in einer ungereinigten biologischen oder klinischen Probe in Lösung in einem geschlossenen oder offenen Behälter mit kleinen Körnchen vorhanden sind, wenn sie einer Ultraschallbehandlung, zum Beispiel in einem Ultraschallbad mit geringer Leistung unterzogen werden, zerstört oder aufgelöst, und setzen als Folge dessen RNA oder DNA in die Lösung frei. Bei RNA und DNA bleibt die Fähigkeit zur Bindung mit komplementären Sonden erhalten, sie wird also nicht wesentlich beschädigt gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung, da die Beschallung bei geringer Leistung erfolgt. Die Nukleinsäure der Mikroorganismen steht dann zur beschleunigten Hybridisierung mit Gensonden im gleichen Behälter zur Verfügung. Daher wird ein schnelles und wirksames System für ein geschlossenes, in der Probe vorzunehmendes, einstufiges Verfahren zum Lysieren von Zellen in einer klinischen, biologischen, Umwelt- oder Nahrungsmittelprobe zur erleichterten Freisetzung von RNA und DNA, und dem anschließenden Hybridisieren mit Gensonden in der Lösung beschrieben. Durch solch ein Verfahren können Mikroorganismen, wie beispielsweise Mycobakterien, schnell in ungereinigten klinischen Proben von Sputum, Faezes, Gewebe, Blut, synovialen oder spinalen Flüssigkeiten, Serum, Urin und anderen biologischen Proben nachgewiesen, identifiziert und quantifiziert werden. Die Einfachheit, Leichtigkeit, Bequemlichkeit und Geschwindigkeit eines solchen Systems bietet beträchtliche Vorteile gegenüber den komplizierten, vielstufigen Diagnoseverfahren, die derzeitig angewendet werden. Weiterhin dürfte dieses Verfahren auch zur Freisetzung von Antigenen aus Zellen für Reaktionen mit geeigneten Antikörpern nützlich sein.
Es sollte klar sein, daß die hierin beschriebenen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung als Beispiele für die Prinzipien dieser Erfindung dienen und daß andere Abwandlungen, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung liegen, möglich sind. Entsprechend ist die vorliegende Erfindung nur gemäß dem Rahmen der Ansprüche im Anhang eingeschränkt.

Claims

1. Verfahren zum Auflösen von Zellen, umfassend das Aussetzen der Zellen einer Ultraschallenergie von kleiner oder gleich 0,2 W/ml in Gegenwart von Körnchen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Frequenz der Ultraschallenergie größer als etwa 20 kHz ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin die Körnchen sich aus eineni Material zusammensetzen, ausgewählt aus einem der Bestandteile der Gruppe, bestehend aus Glas, Kunststoff, Latex, Kristallen, Metallen, Metalloxiden, Sand und Silikaten.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die Ultraschallenergie durch ein Ultraschallbad an die Zellen herangebracht wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin der Durchmesser der Körnchen im Bereich von etwa 0,05 mm bis etwa 1,0 mm liegt.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin die Zellen Mikroorganismen sind.

7. Verfahren nach Anspruch 6, worin die Mikroorganismen refraktär sind.

8. Verfahren nach Anspruch 7, worin der Mirkoorganismus ein Angehöriger der Gattung Mycobacterium ist.

9. Verfahren zum im wesentlichen beschädigungsfreien Freisetzen von Nukleinsäuren aus Zellen, umfassend das Einbringen einer Lösung oder Suspension der Zellen, aus denen Nukleinsäuren freigesetzt werden sollen, in einen Behälter, der ein Quantum an Körnchen enthält, und das Aussetzen dieses Behälters einer Ultraschallenergie von kleiner oder gleich 0,2 W/ml über einen ausreichend langen Zeitraum, um die Zellen aufzulösen und die Nukleinsäuren daraus in die Lösung freizusetzen.

10. Verfahren nach Anspruch 9, worin die Ultraschallenergie durch ein Ultraschall-Reinigungsbad an die Zellen herangebracht wird.

11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, worin die Körnchen sich aus einem Material zusammensetzen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Glas, Kunststoff, Latex, Kristallen, Metallen, Metalloxiden, Sand und Silikaten.

12. Verfahren nach Anspruch 10, worin die Temperatur der im Ultraschall-Reinigungsbad vorhandenen Flüssigkeit größer 18ºC ist.

13. Verfahren nach Anspruch 10, worin die im Ultraschall- Reinigungsbad vorhandene Flüssigkeit vor dem Heranbringen der Ultraschallenergie an die Zellen entgast wird.

14. Verfahren zum im wesentlichen beschädigungsfreien Freisetzen von Nukleinsäuren aus Mikroorganismen, die in einer ungereinigten Probe vorhanden sind, umfassend das Einbringen der Probe in einen Behälter in Gegenwart von Körnchen, und das Aussetzen des Behälters einer Ultraschallenergie in einem Ultraschallbad, wobei die Ultraschallenergiedichte des Ultraschallbades kleiner oder gleich 0,2 W/ml ist, über einen ausreichend langen Zeitraum, um die Mikroorganismen aufzulösen und die Nukleinsäuren daraus in die Lösung freizusetzen.

15. Verfahren nach Anspruch 14, worin die Probe eine klinische Probe ist, erhalten aus Sputum, Faezes, Serum, Blut, Gewebe, Urin, spinalen oder synovialen Flüssigkeiten oder irgendeinem anderen Körpergewebe oder -flüssigkeit.

16. Verfahren zur Feststellung der Gegenwart von Mikroorganismen in einer ungereinigten Probe, umfassend den Erhalt einer Probe, die als Träger von Mikroorganismen betrachtet wird, deren Gegenwart festzustellen ist, das Einbringen der Probe in einen geeigneten Behälter, der Körnchen enthält, das Dazugeben von Gensonden mit Nukleinsäuresequenzen, die komplemetär zu den Nukleinsäuresequenzen der RNA oder DNA des Mikroorganismus' sind, dessen Gegenwart festzustellen ist, das Aussetzen des Behälters einer Ultraschallenergie von kleiner oder gleich 0,2 W/ml über einen ausreichend langen Zeitraum, um die Mikroorganismen aufzulösen und die RNA und DNA der Mikroorganismen in die Lösung freizusetzen, das Hybridisieren der RNA und DNA mit den komplementären Sequenzen der in den Gensonden vorhandenen Nukleinsäuren, und das Bestimmen des Grades der Probenhybridisierung.

17. Verfahren nach Anspruch 16, worin die ungereinigte Probe eine klinische Probe ist, erhalten aus Sputum, Faezes, Blut, Gewebe, Serum, Urin, spinalen oder synovialen Flüssigkeiten des Patienten oder irgendeinem anderen Körpergewebe oder -flüssigkeit.

18. Verfahren nach Anspruch 16, worin die ungereinigte Probe eine Umweltprobe ist, bei der eine mikrobielle Kontamination vermutet wird.

19. Verfahren nach Anspruch 16, worin die ungereinigte Probe eine Lebensmittelprobe ist, bei der eine mikrobielle Kontamination vermutet wird.

20. Verfahren nach Anspruch 16, worin der Behälter auch Zusatzstoffe zur Erleichterung der Hybridisierung der vom Mikroorganismus freigesetzten RNA oder DNA mit der Gensonde enthält.

21. Verfahren nach Anspruch 20, worin die Zusatzstoffe Salze, Puffer, Chelatoren und Nukleinsäure-Ausfällmittel enthalten.

22. Verfahren nach Anspruch 21, worin der Puffer Natriumphosphat ist.

23. Verfahren nach Anspruch 21, worin die Chelatoren aus einem Bestandteile der Gruppe ausgewählt sind, die aus EDTA und EGTA besteht.

24. Verfahren nach Anspruch 21, worin die Nukleinsäure- Ausfällmittel aus einem Bestandteil der Gruppe ausgewählt sind, die aus Reinigungsmittel, Dihydroxybenzol, Natriumdodecylsulfat, Natriumdiisobutylsulfosuccinat, Natriumtetradecylsulfat, Sarkosyl und den Alkalimetallsalzen und Ammoniumsalzen von SO&sub4;&supmin;², PO&sub4;&supmin;³, Cl&supmin;¹ und HCOO&supmin;¹ besteht.

25. Verfahren, wie in einem der Ansprüche 16 bis 24 definiert, worin der Behälter in ein Ultraschall- Reinigungsbad eingebracht wird, das die Ultraschallenergie bereitstellt.

26. Untersuchung zur Bestimmung der Gegenwart oder der Menge eines zellulären Bestandteils aus einer Zelle in einer ungereinigten Probe, umfassend das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13.