EP1127114A1 - Verfahren zur isolierung von plasmid-dna - Google Patents

Verfahren zur isolierung von plasmid-dna

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EP1127114A1
EP1127114A1 EP99969895A EP99969895A EP1127114A1 EP 1127114 A1 EP1127114 A1 EP 1127114A1 EP 99969895 A EP99969895 A EP 99969895A EP 99969895 A EP99969895 A EP 99969895A EP 1127114 A1 EP1127114 A1 EP 1127114A1
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EP
European Patent Office
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solid phase
buffer
plasmid dna
separated
mixed
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP99969895A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Karl Holschuh
Uwe Michelsen
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Merck Patent GmbH
Original Assignee
Merck Patent GmbH
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Publication date
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C12N15/1013—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by using magnetic beads

Definitions

  • the invention relates to a method for isolating plasmid DNA from microorganism cultures with the aid of solid phase bodies.
  • microorganisms e.g. Escherichia coli, Saimonella typhimurium, etc.
  • extrachromosomal DNA the so-called plasmid DNA
  • An everyday task for the person skilled in the art is to find the right bacterial population with the plasmid clo ⁇ sought.
  • Various chemical methods have been described for isolating plasmid DNA from microorganisms. All these methods have in common that the microorganisms are first separated by centrifugation in order to remove the nutrient medium. The nutrient medium must be removed as quantitatively as possible and the microorganism precipitate obtained must be completely resuspended in a resuspension buffer.
  • the object of the present invention is to provide a method for isolating plasmid DNA from microorganisms which does not require a centrifugation step to remove the nutrient medium.
  • the invention relates to a method for isolating plasmid DNA from microorganism cultures with the aid of solid phase bodies, which is characterized in that a) the microorganism culture is brought to an acidic pH, mixed with the solid phase bodies, incubated and separated, b) the microorganisms immobilized on the solid phase body are resuspended, lysed, mixed with a neutralizing binding buffer, incubated, the solid phase body is separated and discarded, c) the supernatant is again mixed with solid phase bodies, incubated, then separated and the plasmid DNA is eluted from the solid phase bodies with an elution buffer.
  • the solid phase bodies are silica gels, silicates or glassy ones
  • Materials preferably magnetic solid-phase bodies with a silica gel surface, in particular magnetic silica particles.
  • bacteria bind non-specifically to magnetizable solid-phase bodies with a silica gel surface and can be magnetically separated directly from the nutrient medium. Furthermore, it was found that the bacteria captured in this way can be resuspended, lysed and also separated as a compact magnetic precipitate together with the genomic DNA, the plasmid DNA remaining in the supernatant.
  • the invention is characterized in that it makes all process steps of the plasmid isolation automatable.
  • the process according to the invention is carried out, for example, in such a way that a bacterial culture which has been incubated overnight in a growth medium is adjusted to an acidic pH using buffers or acids. Magnetic particles are then added, incubated for a few minutes and the particles separated in a magnetic field. The supernatant is discarded and the bacteria adhering to the particles are resuspended in a resuspension buffer. After that, a
  • Lysis buffer added, mixed and incubated for a few minutes at room temperature; a neutralizing binding buffer (N-binding buffer) is added, mixed and the particles are separated in a magnetic field. The supernatant is transferred to a new reagent vessel, particles are added, mixed and separated in a magnetic field. The particles with the bound plasmid DNA are washed with washing buffer and finally the plasmid DNA is eluted with elution buffer.
  • the microorganism kits are preferably E. coli or E. coli mutants, such as W3110, JM109, RR1. XL-1 Blue et al. These cultures are generally incubated at 37 ° C. overnight, for example, in an LB medium (10 g tryptone, 5 g yeast extract, 10 g common salt in liters).
  • a correspondingly prepared culture is adjusted to a pH range of 1 to 4, preferably pH 2, using buffers or acids.
  • Suitable buffers are those which have sufficient buffering capacity in this pH range, e.g. Formate, acetate, citrate buffers or acids such as hydrochloric acid.
  • 1 ml of the bacterial culture is e.g. acidified with 0.1 ml of 1 N hydrochloric acid and mixed with 5-50 ⁇ l of a suspension (50 mg / ml) of magnetic Siiica particles, incubated for one minute and separated in a magnetic field. It has been shown that generally 5-15 ⁇ l of the particle suspension are sufficient to separate more than 50% of the bacteria. The number of particles used here exceeds the number of bacteria by a factor of 10-30.
  • the bacteria adhering to the particles are resuspended in a resuspension buffer.
  • the buffer should be able to maintain a pH in the range of 7-9; a suitable resuspension buffer is e.g. from Tris-HCI, EDTA and RNase A.
  • the resuspended bacteria are mixed with a lysis buffer, mixed and incubated at room temperature for a few minutes.
  • the lysis buffer consists, for example, of sodium hydroxide solution and SDS.
  • a neutralizing binding buffer (N-binding buffer) is then added, mixed, and the particles are separated in the magnetic field and discarded.
  • the N-binding buffer should maintain a pH in the range of 4 to 6; a suitable N-binding buffer consists, for example, of a guanidinium salt and potassium acetate.
  • both buffer components can also be used separately and one after the other (see example 2).
  • the supernatant is transferred to a new reagent vessel, particles are added again, mixed, and the particles loaded with the plasmid DNA are separated off in a magnetic field and washed with washing buffer.
  • This buffer should buffer in the pH range of 5 to 7, with the DNA remaining bound to the particles.
  • Wash buffer is e.g. from Tris-HCI and EDTA.
  • the subsequent elution of the plasmid DNA is carried out with an elution buffer.
  • the elution buffer used for this should maintain a pH range of 7.5 to 9.5, preferably 8 to 9.
  • Suitable buffers are e.g. Tris-HCl buffer, tricin, bicin and other buffers that buffer in this pH range, preferably Tris-HCl.
  • the elution buffer can optionally contain chelators such as EDTA and / or other substances.
  • the buffer concentration should be 5 to 10 mM, preferably about 10 mM. If necessary, the buffer can still contain small amounts of EDTA, e.g. 1 mM included.
  • the nucleic acid eluted in this way is directly, without further purification steps, for molecular biological applications, such as can be used for ampification reactions (PCR, NASBA).
  • Microcentrifuge tube particle suspension 50 mg / ml
  • Resuspension buffer 50 mM Tris-HCl, pH 8.0 / 10 mM EDTA / 5 mg / ml
  • RNase A lysis buffer 200 mM NaOH / 1% SDS
  • N-binding buffer 5.3 M Gua-HCl / 0.7 M potassium acetate, pH 4.8 Wash buffer: 10 mM Tris-HCl / 1 mM EDTA, pH 6.5 Elution buffer: 10 mM Tris-HCl / 1 mM EDTA, pH 8.5 steps
  • a bacterial culture (1 ml) is mixed with 0.1 ml of 1N hydrochloric acid and 10 ⁇ l of magnetic silica particles, incubated for one minute and separated in a magnetic field, 2. The supernatant is discarded and those adhering to the particles
  • the particles are washed twice with washing buffer and eluted with 50 ⁇ l elution buffer.
  • Microcentrifuge tube particle suspension 50 mg / ml
  • Resuspension buffer 50 mM Tris-HCl, pH 8.0 / 10 mM EDTA / 5 mg / ml RNase A
  • Lysis buffer 200 mM NaOH / 1% SDS
  • Neutralization buffer 3 M potassium acetate, pH 5.5
  • Binding buffer 5 M guanidinium thiocyanate
  • Wash buffer 10 mM Tris-HCl / 1 mM EDTA, pH 6.5
  • Elution buffer 10 mM Tris-HCl / 1 mM EDTA, pH 8.5
  • a bacterial culture (1 ml) is mixed with 50 ⁇ l of 1 N hydrochloric acid and 10 ⁇ l of magnetic silica particles, incubated for five minutes and separated in a magnetic field, 2. the supernatant is discarded and the bacteria adhering to the particles are resuspended in 200 ⁇ l resuspension buffer,
  • the particles are washed twice and the plasmid DNA eluted with 50 ⁇ l elution buffer.

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung von Plasmid-DNA aus Mikroorganismenkulturen mit Hilfe von Festphasenkörpern. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man a) die Mikroorganismenkultur auf einen sauren pH-Wert bringt, mit den Festphasenkörpern mischt, inkubiert und abtrennt, b) die an den Festphasenkörpern immobilisierten Mikroorganismen resuspendiert, lysiert, mit einem neutralisierenden Bindepuffer versetzt, inkubiert, die Festphasenkörper abtrennt und verwirft, c) den Überstand erneut mit Festphasenkörpern versetzt, inkubiert, anschließend abtrennt und die Plasmid-DNA mit einem Elutionspuffer von den Festphasenkörpern eluiert.

Description

Verfahren zur Isolierung von Plasmid-DNA
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung von Plasmid-DNA aus Mikroorganismenkulturen mit Hilfe von Festphasenkörpern.
In der Molekularbiologie werden Mikroorganismen (z.B. Escherichia coli, Saimonella typhimurium u.a.) seit langem für Klonierungsexperimente verwendet. Hierzu wird extrachromosomale DNA, die sogenannte Plasmid- DNA, als Vehikel für zu klonierende, spezifische DNA-Stücke eingesetzt. Eine alltägliche Aufgabenstellung für den Fachmann besteht darin, die richtige Bakterienpopulation mit dem gesuchten Plasmid-Kloπ zu finden. Verschiedene chemische Verfahren sind beschrieben, Plasmid-DNA aus Mikroorganismen zu isolieren. Allen diesen Methoden ist gemeinsam, daß zunächst die Mikroorganismen durch Zentrifugation abgetrennt werden, um das Nährmedium zu entfernen. Das Nährmedium muß möglichst quantitativ entfernt werden und der erhaltene Mikroorganismenniederschlag muß vollständig in einem Resuspensionspuffer resuspendiert werden.
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Isolierung von Plasmid-DNA aus Mikroorganismen zur Verfügung zu stellen, das zur Entfernung des Nährmediums keinen Zentrifugationsschritt benötigt.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Isolierung von Plasmid- DNA aus Mikroorganismenkulturen mit Hilfe von Festphasenkörpem, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man a) die Mikroorganismenkultur auf einen sauren pH-Wert bringt, mit den Festphasenkörpem mischt, inkubiert und abtrennt, b) die an den Festphasenkörpem immobilisierten Mikroorganismen re- suspendiert, lysiert, mit einem neutralisierenden Bindepuffer versetzt, inkubiert, die Festphasenkörper abtrennt und verwirft, c) den Überstand erneut mit Festphasenkörpem versetzt, inkubiert, anschließend abtrennt und die Plasmid-DNA mit einem Elutionspuffer von den Festphasenkörpern eluiert.
Als Festphasenkörper kommen Kieselgele, Silicate oder glasartige
Materialien, vorzugsweise magnetische Festphasenkörper mit Kieselgeloberfläche in Frage, insbesondere magnetische Silica-Partikel.
Überraschenderweise wurde gefunden, daß Bakterien unter bestimmten Pufferbedingungen an magnetisierbare Festphasenkörper mit Kieselgel- oberfiäche unspezifisch binden und direkt aus dem Nährmedium magnetisch abgetrennt werden können. Weiterhin wurde gefunden, daß die so eingefangenen Bakterien resuspendiert, lysiert und als kompakter magnetischer Niederschlag mitsamt der genomischen DNA ebenso abgetrennt werden können, wobei die Plasmid DNA im Überstand verbleibt. Die
Erfindung zeichnet sich dadurch aus, daß sie alle Verfahrensschritte der Plasmid-Isoiierung automatisierbar macht.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird beispielsweise so durchgeführt, daß eine Bakterienkuitur, die über Nacht in einem Wachstumsmedium inkubiert wurde, mit Hilfe von Puffern oder Säuren auf einen sauren pH-Wert eingestellt wird. Anschließend werden magnetische Partikel hinzugegeben, wenige Minuten inkubiert und die Partikel im magnetischen Feld abgetrennt. Der Überstand wird verworfen und die an den Partikeln anhaftenden Bakterien in einem Resuspensionspuffer resuspendiert. Danach wird ein
Lysispuffer zugegeben, gemischt und wenige Minuten bei Raumtemperatur inkubiert; ein neutralisierender Bindepuffer (N-Bindepuffer) wird zugegeben, gemischt und die Partikel werden im magnetischen Feld abgetrennt. Der Überstand wird in ein neues Reagenzgefäß überführt, Partikel zugege- ben, gemischt und im magnetischen Feld abgetrennt. Die Partikel mit der gebundenen Plasmid-DNA werden mit Waschpuffer gewaschen und schließlich wird die Plasmid-DNA mit Elutionspuffer eluiert. Bei den Mikroorganismenkuituren handelt es sich vorzugsweise um E. Coli oder E. Coli -Mutanten, wie W3110, JM109, RR1. XL-1 Blue u.a. Diese Kulturen werden in der Regel über Nacht z.B. in einem LB-Medium (10 g Trypton, 5 g Hefe-Extrakt, 10 g Kochsalz im Liter) bei 37 °C inkubiert.
Eine entsprechend hergestellte Kultur wird mit Hilfe von Puffern oder Säuren auf einen pH-Bereich von 1 bis 4, vorzugsweise pH 2, eingestellt. Geeignete Puffer sind solche, die in diesem pH-Bereich eine ausreichende Pufferkapazität besitzen, z.B. Formiat-, Acetat-, Citratpuffer oder auch Säuren wie Salzsäure. 1 ml der Bakterienkultur wird z.B. mit 0,1 ml 1 N Salzsäure angesäuert und mit 5-50 μl einer Suspension (50 mg/ml) von magnetischen Siiica-Partikeln versetzt, eine Minute inkubiert und im magnetischen Feld abgetrennt. Es hat sich gezeigt, daß in der Regel 5- 15 μl der Partikelsuspension ausreichen, um mehr als 50 % der Bakterien abzutrennen. Die Anzahl der hier verwendeten Partikel übersteigt die Anzahl der Bakterien circa um einen Faktor 10-30.
Die an den Partikeln anhaftenden Bakterien werden in einem Resuspensi- onspuffer resuspendiert. Der Puffer sollte in der Lage sein, einen pH-Wert im Bereich von 7 bis 9 aufrechtzuerhalten; ein geeigneter Resuspensions- puffer besteht z.B. aus Tris-HCI, EDTA und RNase A.
Die resuspendierten Bakterien werden mit einem Lysispuffer versetzt, gemischt und bei Raumtemperatur einige Minuten inkubiert. Der Lysispuffer besteht z.B. aus Natronlauge und SDS. Anschließend wird ein neutralisierender Bindepuffer (N-Bindepuffer) zugesetzt, gemischt und die Partikel im magnetischen Feld abgetrennt und verworfen. Der N-Bindepuffer sollte einen pH-Wert im Bereich von 4 bis 6 aufrechterhalten; ein geeigneter N- Bindepuffer besteht z.B. aus einem Guanidiniumsalz und Kaliumacetat. Beide Pufferkomponenten können jedoch auch getrennt und nacheinander eingesetzt werden (siehe Beispiel 2). Der Überstand wird in ein neues Reagenzgefäß überführt, es werden erneut Partikel zugegeben, gemischt und die mit der Plasmid-DNA beladenen Partikel werden im magnetischen Feld abgetrennt und mit Waschpuffer gewaschen. Dieser Puffer sollte im pH-Bereich von 5 bis 7 puffern, wobei die DNA an den Partikeln gebunden bleibt. Ein geeigneter
Waschpuffer besteht z.B. aus Tris-HCI und EDTA.
Die anschließende Elution der Plasmid-DNA erfolgt mit einem Elutionspuffer. Der dazu verwendete Elutionspuffer sollte einen pH-Bereich von 7,5 bis 9,5, vorzugsweise 8 bis 9 aufrechterhalten. Geeignete Puffer sind z.B. Tris-HCI-Puffer, Tricin, Bicin und andere Puffer, die in diesem pH-Bereich puffern, vorzugsweise Tris-HCI. Gegebenenfalls kann der Elutionspuffer Chelatoren wie EDTA und/oder andere Substanzen enthalten. Die Puffer- konzentratioπ sollte 5 bis 10 mM, vorzugsweise etwa 10 mM betragen. Gegebenenfalls kann der Puffer noch geringe Mengen EDTA, z.B. 1 mM, enthalten. Die so eluierte Nucleinsäure ist direkt, ohne weitere Reinigungsschritte, für molekularbiologische Anwendungen, wie z.B. für Ampifikations- reaktionen (PCR, NASBA) einsetzbar.
Beispiel 1
Materialien
Mikrozentrifugenröhrchen Partikelsuspension: 50 mg/ml
Resuspensionspuffer: 50 mM Tris-HCI, pH8,0 / 10 mM EDTA / 5 mg/ml RNase A Lysispuffer: 200 mM NaOH / 1 % SDS
N-Bindepuffer: 5.3 M Gua-HCI / 0.7 M Kaliumacetat, pH 4,8 Waschpuffer: 10 mM Tris-HCI / 1 mM EDTA, pH 6,5 Elutionspuffer: 10 mM Tris-HCI / 1 mM EDTA, pH 8,5 Verfahrensschritte
1. Eine Bakterienkultur (1 ml) wird mit 0, 1 ml 1 N Salzsäure und 10 μl magnetischen Silica-Partikeln gemischt, eine Minute inkubiert und im magnetischen Feld abgetrennt, 2. der Überstand wird verworfen und die an den Partikeln haftenden
Bakterien in 100 μl Resuspensionspuffer resuspendiert,
3. 200 μl Lysispuffer werden hinzugegeben, gemischt und 5 Minuten inkubiert,
4. 400 μl N-Bindepuffer werden hinzugegeben, gemischt und die Partikel abgetrennt,
5. der Überstand wird in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen überführt,
6. es werden 10 μl Partikelsuspension hinzugegeben, gemischt und die Partikel werden abgetrennt; der Überstand wird verworfen,
7. die Partikel werden zweimal mit Waschpuffer gewaschen und mit 50 μl Elutionspuffer eluiert.
Beispiel 2
Materialien
Mikrozentrifugenröhrchen Partikelsuspension: 50 mg/ml
Resuspensionspuffer: 50 mM Tris-HCI, pH8,0 / 10 mM EDTA / 5 mg/ml RNase A
Lysispuffer: 200 mM NaOH / 1 % SDS
Neutralisierungspuffer: 3 M Kaliumacetat, pH 5,5
Bindungspuffer: 5 M Guanidiniumthiocyanat Waschpuffer: 10 mM Tris-HCI / 1 mM EDTA, pH 6,5
Elutionspuffer: 10 mM Tris-HCI / 1 mM EDTA, pH 8,5
Verfahrensschritte
1. Eine Bakterienkultur (1 ml) wird mit 50 μl 1 N Salzsäure und 10 μl magnetische Silica-Partikeln gemischt, fünf Minuten inkubiert und im magnetischen Feld abgetrennt, 2. der Überstand wird verworfen und die an den Partikeln haftenden Bakterien in 200 μl Resuspensionspuffer resuspendiert,
3. 200 μl Lysispuffer werden hinzugegeben, gemischt und 5 Minuten inkubiert, 4. 200 μl Neutralisierungspuffer werden hinzugegeben, gemischt und die
Partikel mitsamt dem Niederschlag abgetrennt,
5. der Überstand wird in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen überführt,
6. es werden das gleiche Volumen Bindepuffer sowie mindestens 10 μl Partikelsuspension hinzugegeben, gemischt und die Partikel werden abgetrennt; der Überstand wird verworfen,
7. die Partikel werden zweimal gewaschen und die Plasmid DNA mit 50 μl Elutionspuffer eluiert.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Isolierung von Plasmid-DNA aus Mikroorganismenkulturen mit Hilfe von Festphasenkörpem, dadurch gekennzeichnet, daß man a) die Mikroorganismenkultur auf einen sauren pH-Wert bringt, mit den Festphasenkörpem mischt, inkubiert und abtrennt, b) die an den Festphasenkörpem immobilisierten Mikroorganismen resuspendiert, lysiert, mit einem neutralisierenden Bindepuffer versetzt, inkubiert, die Festphasenkörper abtrennt und verwirft, c) den Überstand erneut mit Festphasenkörpem versetzt, inkubiert, anschließend abtrennt und die Plasmid-DNA mit einem Elutionspuffer von den Festphasenkörpem eluiert.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismen Escherichia coli oder E. Coli-Mutanten verwendet werden.
3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Festphasenkörper magnetische Festphasenkörper mit Kieselgeloberfläche verwendet werden.
4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß als magnetische Festphasenkörper Kieselgele, Silicate oder glasartige Materialien verwendet werden.
5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß als magnetische Festphasenkörper Silica-Partikel verwendet werden. - o -
6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der saure pH-Wert mit Hilfe von Puffern oder Säuren auf einen pH-Wert im Bereich von 1 bis 4 eingestellt wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der pH- Wert mit Salzsäure eingestellt wird.
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