DE19851156C1

DE19851156C1 - Verfahren zur Isolierung von Plasmid-DNA

Info

Publication number: DE19851156C1
Application number: DE19851156A
Authority: DE
Inventors: Uwe Michelsen; Karl Holschuh
Original assignee: Merck Patent GmbH
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 1998-11-06
Filing date: 1998-11-06
Publication date: 2000-04-27
Anticipated expiration: 2018-11-07
Also published as: EP1127114A1; US6548253B1; WO2000029562A1; JP2003521228A

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung von Plasmid-DNA aus Mikroorganismenkulturen mit Hilfe von Festphasenkörpern. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man DOLLAR A a) die Mikroorganismenkultur auf einen sauren pH-Wert bringt, mit den Festphasenkörpern mischt, inkubiert und abtrennt, DOLLAR A b) die an den Festphasenkörpern immobilisierten Mikroorganismen resuspendiert, lysiert, mit einem neutralisierenden Bindepuffer versetzt, inkubiert, die Festphasenkörper abtrennt und verwirft, DOLLAR A c) den Überstand erneut mit Festphasenkörpern versetzt, inkubiert, anschließend abtrennt und die Plasmid-DNA mit einem Elutionspuffer von den Festphasenkörpern eluiert.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung von Plasmid-DNA aus Mikroorganismenkulturen mit Hilfe von Festphasenkörpern.

In der Molekularbiologie werden Mikroorganismen (z. B. Escherichia coli, Salmonella typhimurium u. a.) seit langem für Klonierungsexperimente ver wendet. Hierzu wird extrachromosomale DNA, die sogenannte Plasmid- DNA, als Vehikel für zu klonierende, spezifische DNA-Stücke eingesetzt. Eine alltägliche Aufgabenstellung für den Fachmann besteht darin, die richtige Bakterienpopulation mit dem gesuchten Plasmid-Klon zu finden. Verschiedene chemische Verfahren sind beschrieben, Plasmid-DNA aus Mikroorganismen zu isolieren. Allen diesen Methoden ist gemeinsam, daß zunächst die Mikroorganismen durch Zentrifugation abgetrennt werden, um das Nährmedium zu entfernen. Das Nährmedium muß möglichst quantitativ entfernt werden und der erhaltene Mikroorganismenniederschlag muß vollständig in einem Resuspensionspuffer resuspendiert werden.

WO 89/02436 beschreibt ein Verfahren zur Auftrennung von Molekülen, die zumindest ein DNA-Fragment enthalten. DE 36 39 949 offenbart ein Verfahren zur Trennung langkettiger Nukleinsäuren. In WO 97/08306 wird eine Vorrichtung mit Filtrationseinsatz offenbart, in der Plasmid-DNA mittels eines Verfahrens isoliert werden kann, das mehrere Filtrationsschritte beinhaltet.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Isolierung von Plasmid-DNA aus Mikroorganismen zur Verfügung zu stellen, das zur Entfernung des Nährmediums keinen Zentrifugationsschritt benötigt.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Isolierung von Plasmid- DNA aus Mikroorganismenkulturen mit Hilfe von Festphasenkörpern, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man

a) die Mikroorganismenkultur auf einen sauren pH-Wert bringt, mit den Festphasenkörpern mischt, inkubiert und abtrennt,
b) die an den Festphasenkörpern immobilisierten Mikroorganismen re suspendiert, lysiert, mit einem neutralisierenden Bindepuffer versetzt, inkubiert, die Festphasenkörper abtrennt und verwirft,
c) den Überstand erneut mit Festphasenkörpern versetzt, inkubiert, an schließend abtrennt und die Plasmid-DNA mit einem Elutionspuffer von den Festphasenkörpern eluiert.

Als Festphasenkörper kommen Kieselgele, Silicate oder glasartige Materialien, vorzugsweise magnetische Festphasenkörper mit Kiesel geloberfläche in Frage, insbesondere magnetische Silica-Partikel.

Überraschenderweise wurde gefunden, daß Bakterien unter bestimmten Pufferbedingungen an magnetisierbare Festphasenkörper mit Kieselgel oberfläche unspezifisch binden und direkt aus dem Nährmedium magne tisch abgetrennt werden können. Unter Ausnutzung der magnetischen Trennung kann in den Folgeschritten nach bekannten Verfahren die Plasmid-DNA von genomischer DNA getrennt und gereinigt werden. Die Erfindung zeichnet sich dadurch aus, daß sie alle Verfahrensschritte der Plasmid-Isolierung automatisierbar macht.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird beispielsweise so durchgeführt, daß eine Bakterienkultur, die über Nacht in einem Wachstumsmedium inkubiert wurde, mit Hilfe von Puffern oder Säuren auf einen sauren pH-Wert einge stellt wird. Anschließend werden magnetische Partikel hinzugegeben, wenige Minuten inkubiert und die Partikel im magnetischen Feld abge trennt. Der Überstand wird verworfen und die an den Partikeln anhaftenden Bakterien in einem Resuspensionspuffer resuspendiert. Danach wird ein Lysispuffer zugegeben, gemischt und wenige Minuten bei Raumtemperatur inkubiert; ein neutralisierender Bindepuffer (N-Bindepuffer) wird zugege ben, gemischt und die Partikel werden im magnetischen Feld abgetrennt. Der Überstand wird in ein neues Reagenzgefäß überführt, Partikel zugege ben, gemischt und im magnetischen Feld abgetrennt. Die Partikel mit der gebundenen Plasmid-DNA werden mit Waschpuffer gewaschen und schließlich wird die Plasmid-DNA mit Elutionspuffer eluiert.

Bei den Mikroorganismenkulturen handelt es sich vorzugsweise um E. Coli oder E. Coli-Mutanten, wie W3110, JM109, RR1, XL-1 Blue u. a. Diese Kulturen werden in der Regel über Nacht z. B. in einem LB-Medium (10 g Trypton, 5 g Hefe-Extrakt, 10 g Kochsalz im Liter) bei 37°C inkubiert.

Eine entsprechend hergestellte Kultur wird mit Hilfe von Puffern oder Säuren auf einen pH-Bereich von 1 bis 4, vorzugsweise pH 2, eingestellt. Geeignete Puffer sind solche, die in diesem pH-Bereich eine ausreichende Pufferkapazität besitzen, z. B. Formiat-, Acetat-, Citratpuffer oder auch Säuren wie Salzsäure. 1 ml der Bakterienkultur wird z. B. mit 0,1 ml 1 N Salzsäure angesäuert und mit 5-50 µl einer Suspension (50 mg/ml) von magnetischen Silica-Partikeln versetzt, eine Minute inkubiert und im magnetischen Feld abgetrennt. Es hat sich gezeigt, daß in der Regel 15 µl der Partikelsuspension ausreichen um mehr als 50% der Bakterien abzu trennen.

Die an den Partikeln anhaftenden Bakterien werden in einem Resuspensi onspuffer resuspendiert. Der Puffer sollte in der Lage sein, einen pH-Wert im Bereich von 7 bis 9 aufrechtzuerhalten; ein geeigneter Resuspensions puffer besteht z. B. aus Tris-HCl, EDTA und RNase A.

Die resuspendierten Bakterien werden mit einem Lysispuffer versetzt, ge mischt und bei Raumtemperatur einige Minuten inkubiert. Der Lysispuffer besteht z. B. aus Natronlauge und SDS. Anschließend wird ein neutralisie render Bindepuffer (N-Bindepuffer) zugesetzt, gemischt und die Partikel im magnetischen Feld abgetrennt und verworfen. Der N-Bindepuffer sollte einen pH-Wert im Bereich von 4 bis 6 aufrechterhalten; ein geeigneter N- Bindepuffer besteht z. B. aus Guanidin-HCl und Kaliumacetat.

Der Überstand wird in ein neues Reagenzgefäß überführt, es werden er neut Partikel zugegeben, gemischt und die mit der Plasmid-DNA beladenen Partikel werden im magnetischen Feld abgetrennt und mit Waschpuffer gewaschen. Dieser Puffer sollte im pH-Bereich von 5 bis 7 puffern, wobei die DNA an den Partikeln gebunden bleibt. Ein geeigneter Waschpuffer besteht z. B. aus Tris-HCl und EDTA.

Die anschließende Elution der Plasmid-DNA erfolgt mit einem Elutions puffer. Der dazu verwendete Elutionspuffer sollte einen pH-Bereich von 7,5 bis 9,5, vorzugsweise 8 bis 9 aufrechterhalten. Geeignete Puffer sind z. B. Tris-HCl-Puffer, Tricin, Bicin und andere Puffer, die in diesem pH-Bereich puffern, vorzugsweise Tris-HCl. Gegebenenfalls kann der Elutionspuffer Chelatoren wie EDTA und/oder andere Substanzen enthalten. Die Puffer konzentration sollte 5 bis 10 mM, vorzugsweise etwa 10 mM betragen. Gegebenenfalls kann der Puffer noch geringe Mengen EDTA, z. B. 1 mM, enthalten. Die so eluierte Nucleinsäure ist direkt, ohne weitere Reinigungs schritte, für molekularbiologische Anwendungen, wie z. B. für Ampifikations reaktionen (PCR, NASBA) einsetzbar.

Beispiel Materialien

Mikrozentrifugenröhrchen
Partikelsuspension: 50 mg/ml
Resuspensionspuffer:
50 mM Tris-HCl, pH8,0/10 mM EDTA/5 mg/ml RNase A
Lysispuffer: 200 mM NaOH/1% SDS
N-Bindepuffer: 5.3 M Gua-HCl/0.7 M Kaliumacetat, pH 4,8
Waschpuffer: 10 mM Tris-HCl/1 mM EDTA, pH 6,5
Elutionspuffer: 10 mM Tris-HCl/1 mM EDTA, pH 8,5

Verfahrensschritte

1. Eine Bakterienkultur (1 ml) wird mit 0,1 ml 1 N Salzsäure und 10 µl magnetischen Silica-Partikeln gemischt, eine Minute inkubiert und im magnetischen Feld abgetrennt,
2. der Überstand wird verworfen und die an den Partikeln haftenden Bakterien in 100 µl Resuspensionspuffer resuspendiert,
3. 200 µl Lysispuffer werden hinzugegeben, gemischt und 5 Minuten inkubiert,
4. 400 µl N-Bindepuffer werden hinzugegeben, gemischt und die Partikel abgetrennt,
5. der Überstand wird in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen überführt,
6. es werden 10 µl Partikelsuspension hinzugegeben, gemischt und die Partikel werden abgetrennt; der Überstand wird verworfen,
7. die Partikel werden zweimal mit Waschpuffer gewaschen und mit 50 µl Elutionspuffer eluiert.

Claims

1. Verfahren zur Isolierung von Plasmid-DNA aus Mikroorganismen kulturen mit Hilfe von Festphasenkörpern, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) die Mikroorganismenkultur auf einen sauren pH-Wert bringt, mit den Festphasenkörpern mischt, inkubiert und abtrennt,
b) die an den Festphasenkörpern immobilisierten Mikroorganismen resuspendiert, lysiert, mit einem neutralisierenden Bindepuffer versetzt, inkubiert, die Festphasenkörper abtrennt und verwirft,
c) den Überstand erneut mit Festphasenkörpern versetzt, inkubiert, anschließend abtrennt und die Plasmid-DNA mit einem Elutions puffer von den Festphasenkörpern eluiert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikro organismen Escherichia coli oder E. Coli-Mutanten verwendet werden.

3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Festphasenkörper magnetische Festphasenkörper mit Kiesel geloberfläche verwendet werden.

4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß als magnetische Festphasenkörper Kieselgele, Silicate oder glasartige Materialien verwendet werden.

5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß als magnetische Festphasenkörper Silica-Partikel verwendet werden.

6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der saure pH-Wert mit Hilfe von Puffern oder Säuren auf einen pH-Wert im Bereich von 1 bis 4 eingestellt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der pH- Wert mit Salzsäure eingestellt wird.