WO2002024904A2 - Verfahren zur herstellung von ribonukleinsäure (rns) - Google Patents

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    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor

Definitions

  • RNA ribonucleic acid
  • the present invention relates to a process for the production of ribonucleic acid (RNA) of the desired sequence and a process for the identification of nucleic acid-secreting microorganisms, kits for carrying out the process, and the use of certain microorganisms in a process for the production of RNA.
  • RNA ribonucleic acid
  • RNA RNA synthesis reaction by "polymerizing" 5 'nucleoside di phosphates with elimination of phosphate to existing oligonucleotides, which serve as starters (primers). This reaction is catalyzed by the enzyme polynucleotide phosphorylase.
  • the base composition of the polynucleotide to be synthesized is not coded by a template, but is determined by the different range of building blocks, ie ribonucleotides.
  • An overview of the known process can be found in the Lexicon of Biochemistry, Volume 2, Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg, 2000; P. 303.
  • RNA can be produced by means of in vitro transcription, in which a template in the form of a DNA template for the synthesis of the RNA, as well as the use of DNA-dependent RNA polymerases, for example from the bacteriophages T3, T7 or SP6 , is required.
  • a detailed description of this method is given in "Sambrook, Fritsch, Maniatis in Molecular Cloning - Laboratory Manual", 2nd edition Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989, p. 10.32 ff.
  • RNA Ribonucleic acid
  • Phosphoamidite method which is described in the Lexicon of Biochemistry, Volume 2, Spectrum Academic Publishing House Heidelberg, 2000, p. 163.
  • RNA Ribonucleic acid
  • RNA e.g. used as a therapeutic.
  • so-called ribozymes i.e. to think of RNA molecules with catalytic properties.
  • Efforts are being made to produce complex artificial ribozymes which, like certain enzymes, have therapeutic or disease-preventing properties.
  • RNA molecules are also of great interest to the chemical industry because of their ability to catalyze a variety of chemical reactions. For an overview, see also Jaeger, L. Curr. Opin. Struct. Biol. 7 (1997) 324, and Narkilar G. T. u. Herschlag D., Annu. Rev. Biochem. 66 (1997) 19.
  • RNA molecules also play an important role as so-called antisense drugs.
  • antisense drugs This is understood to mean drugs which, due to their structure complementary to a gene or to an RNA or other nucleic acid, attach themselves to this nucleic acid and thereby block the realization of certain genetic information, ie transcription and translation. In animal experiments, it is with the help of such antisense. Medications managed to prevent pathological narrowing of the arteries. Other studies have been able to shrink malignant brain tumors. Furthermore, the proliferation and differentiation of stem cells could be controlled by using antisense constructs in vitro. In the United States, antisense drugs have already been tested in clinical trials for their effectiveness in leukemia and possible side effects tested. Treatment of AIDS with the help of these drugs is also being considered.
  • RNA is becoming increasingly important both in the biotechnological and in the pharmaceutical industry.
  • RNA production Despite this increasing need, the availability of sufficient amounts of RNA has not been resolved.
  • the known processes for RNA production cited above are exclusively extremely cost-intensive and complex production processes. Solvents that are toxic to humans are often used here. It is not possible to extend the described processes to large-scale manufacturing processes.
  • RNA oligonucleotides In the enzyme-independent chemical synthesis of RNA oligonucleotides described above, there is also the problem that the synthesis process stops at a length of approximately 80 nucleotides. Ie the production of longer-chain RNA molecules, which are often used for their efficient use as antisense Medicines are a requirement is not possible in this way.
  • the object of the present invention is therefore to provide a process for the preparation of ribonucleic acid (RNA) of the desired sequence, in which the disadvantages mentioned above are avoided.
  • RNA Ribonucleic acid
  • the inventors have recognized that the ability of certain microorganisms, which is described here for the first time as an example for various bacteria, to secrete RNA into the extracellularly surrounding medium is suitable for producing large amounts of RNA. It was particularly surprising and not to be expected that, for example, certain bacterial strains would release natural RNA from the cell after their synthesis. This secreted RNA can be enriched or isolated particularly easily and without great expense. The production of the RNA according to the invention does not require lysis of the microorganism cells len, which significantly simplifies the isolation and / or purification of the RNA.
  • RNA-containing supernatant can be separated from the cellular components by simple methods, for example by centrifugation.
  • RNA can be produced in very large quantities, ie in several milligrams per liter.
  • the desired sequence of interest can be an RNA of "natural origin", for example an mRNA that codes for a certain bacterial protein, or an rRNA, in particular in connection with the drug screening mentioned above for the development of new drugs.
  • the method according to the invention is therefore particularly suitable for the development of antibacterial or antibiotic active substances.
  • the method according to the invention is characterized by its simple feasibility and by a few manual operations, since both the provision of the microorganisms and the isolation of the secreted RNA can be largely automated. As a result, the method according to the invention is particularly suitable for industrial biotechnological or pharmaceutical manufacturing processes.
  • RNA secretion of RNA into the medium surrounding the cell was observed in individual mammalian cells.
  • Sitikov, AS and Munishkin, AV 1991, "Specific suppressor T-cells secret RNA", Doc. Akad. Nauk. SSSR, 318 (6), 1486-8, for two suppressor T cell lines maintained in a particular culture medium, detect RNA secreted in the medium.
  • RNA into the surrounding medium was shown on cultured chicken embryo fibroblasts, see Mclntosh, Alison, A.G. Adams, David H., 1985, "Further studies on the extrusion of cytosol macromolecules by cultured chick embryo fibroblast cells", Int. J. Bioche., 17 (2), 147-53.
  • RNA-secretory properties which are described in certain cells of higher eukaryotes, is not possible due to the complex cultivation conditions and the limited availability of these cells.
  • the microorganisms preferably bacteria, are genetically modified in such a way that they produce the RNA with the desired sequence.
  • the secretory bacteria examined after they have been genetically modified, ie, for example after their transformation with recombinant DNA fragments, secrete RNA molecules with the cloned-in sequence into the extracellular medium. Due to this property of the secretory bacteria large amounts of RNA with any nucleotide sequence can be produced according to the invention. This is important, for example, with regard to the production of the antisense medicines mentioned at the beginning.
  • the synthesis of a protein can of course only be blocked by an antisense construct, for example in the form of an RNA, if this sequence is complementary to the nucleic acid coding for the protein.
  • the corresponding complementary sequence can, for example, be cloned into an expression vector with which, for example, a secretory bacterial strain is then transformed.
  • Expression vector is understood to mean a genetic construct which is preferably produced recombinantly and which, after introduction into the bacterial host cell, permits the transcription of the desired sequence cloned into the vector.
  • Genetically modified bacteria are also to be understood as those in which the desired sequence has been stably integrated into the bacterial genome due to the use of recombinant DNA technology. The recombinant RNA expressed by the bacteria is then purified according to the invention in large quantities from the extracellular medium.
  • the fraction of the RNA which has the desired sequence is isolated after step b) of the method according to the invention.
  • This has the particular advantage that from the total of the secreted RNA, which can be contaminated, for example, by RNA of "natural origin", ie with an undesired sequence, only the species of RNA is obtained which has the desired sequence cloned into the expression vector , Any interfering RNA fractions are thus separated.
  • a preferred development of the invention is when the isolation and / or enrichment of the secreted RNA from step b) comprises gel filtration, preferably by means of Sephacryl.
  • chromatographic method advantageously enables the separation of molecules according to their size.
  • the secreted RNA from step b) can be easily separated from components of the extracellular medium which differ in size from the RNA, e.g. from secreted proteins.
  • sephacrylic a porous gel consisting of dextran and three-dimensionally crosslinked with N, N-methylene bisacrylaid, is particularly suitable for gel filtration as the separation medium.
  • bacteria are provided in culture in step a), which are selected from the group: Escherichia coli-ToplOF ', Escherichia coli-XLl, Escherichia co! I-JM105, Escherichia coli-JM109 , Bacillus subtilis-OSU22, Bacillus subtilis-OSM618, Agrobacterium tumefaciens-OSM ' .2277, Agrobacterium tumefaciens-DSM30205, Pseudomonas putida-DSM548 and strains which are genetically identical to the strains mentioned above or are genetic variants thereof.
  • the inventors have succeeded in proving an RNA-secreting property for the bacterial strains indicated. They are therefore particularly well suited for use in the method according to the invention.
  • a preferred embodiment of the invention is that the bacteria are cultivated in a medium which contains the following components, expressed in grams per liter: Na 2 HP0 4 , 4-8; KHP0 4 , 1-5; NaCl, 3-7; H 9 N 2 0 4 P, 0.5-7; MgSO 4 , 0.3-0.8; CaCl 2 , 0.008-0.012; and another component selected from the group: wheat starch, final concentration in the medium 8-12; Glycerin, final concentration in the medium 0.5-4; Sucrose, final concentration in the medium 0.5-4; Mannitol, final concentration in the medium 0.5-4; Corn starch, final concentration in the medium 0.5-4; and glucose, final concentration in the medium 0.5-4.
  • RNA by bacteria into the extracellular medium.
  • provision of such a culture medium creates the conditions for a particularly good implementation of the method according to the invention.
  • a medium is preferably used in the method for cultivating bacteria, which contains the following components, expressed in grams per liter: Na 2 HP0 4 , 4-8; KHP0 4 , 1-5; NaCl, 0.3-7; MgSO 4 , 0.3-0.8; CaCl 2 , 0.008-0.012; Glucose, 0.5-4; and another component selected from the group: yeast extract, final concentration in medium 3-7; Glutamate, final concentration in medium 3-7; Corn syrup, final concentration in the medium 3-7; and H 9 N 2 0 4 P, final concentration in the medium 0.5-3.
  • the method according to the invention can also be implemented with particularly high efficiency by this medium.
  • cultivate bacteria it is further preferred in this method to cultivate bacteria to use a medium which contains the following components, expressed in grams per liter: peptone, 5-15; Yeast extract, 1-10; NaCl, 1-10.
  • this medium is also particularly suitable for carrying out the process according to the invention.
  • the method according to the invention is used to produce a medicament.
  • RNA in the form of therapeutically active substances or drugs.
  • the production of RNA molecules which act as medicaments can be implemented particularly simply and efficiently.
  • a particular embodiment of the invention relates to a kit for performing the method according to the invention, which preferably contains a nucleic acid-secreting microorganism.
  • RNA of the desired sequence is obtained from the extracellular medium.
  • a bacterial strain which were recognized for the first time by the inventors and which are not to be expected, selected from the group: Escherichia coli-ToplOF ', Escherichia coli-XLl, Escherichia coli-JMl05, Escherichia coli-JM109, Bacillus subtilis-OSM221, Bacillus subtilis-DSM618, Agrobacterium tumefaciens-OSU5172, Agrobacterium tumefaciens-DSM30205, Pseudomonas putida-DSM548, and strains which are genetically identical to the strains mentioned above or are genetic variants thereof, is also the use of such a bacterial strain in a method according to the invention Production of RNA Subject of the present invention.
  • the present invention furthermore relates to a method for identifying nucleic acid-secreting microorganisms, which comprises the following steps: a) provision of the microorganisms to be examined in culture,
  • yeast can also be analyzed in this method. This is due to the fact that yeasts can be cultivated analogously to bacteria due to their unicellularity in liquid media. Although RNA-secreting properties have so far only been shown by the inventors for certain bacterial strains, it is to be expected due to their similar metabolic properties and the analogous cultivation conditions that these can also be found in yeasts.
  • a preferred development of this method consists in transforming the microorganism with an expression vector coding for a test sequence and in detecting the test sequence in the extracellular medium.
  • test sequence can be detected relatively easily in the extracellular medium, for example if a sequence that does not occur naturally is used.
  • special hybridization probes can be used, which can optionally be coupled with marker molecules. This configuration thus enables the identification of a nucleic acid-secreting microorganism in a particularly simple and efficient manner.
  • the present invention also relates to a kit for carrying out the above-mentioned method, which preferably contains an expression vector coding for the test sequence.
  • the advantage of this embodiment also relates to a simplification of the implementation of the method due to the compilation of the necessary reagents or microorganisms or parts thereof.
  • RNA of "natural origin” shows ethidium bromide staining of secreted RNA of "natural origin" after electrophoretic separation in an agarose gel; exemplary for Bacillus subtilis-OSM22 7 in LB medium;
  • Fig. 2a elution profiles of secreted RNA "of natural origin” and proteins in the Sephacryl 200 column used for RNA purification;
  • Fig. 2d Ethidium bromide staining of secreted RNA "of natural origin" before and after purification on a Sephacryl 1000 column and of purified sequence-specific RNA after electrophoretic separation.
  • Example 1 Suitable strains of bacteria
  • the bacterial strain E. coli-ToplOF 1 can be obtained from Clontech (USA) and the strain E. coli-XLl are available from Stratagene (USA).
  • the bacterial strains E. ⁇ oli-JMl05 (DSM3949), E. ⁇ o! i-JM109 (DSM3423), B. subtilis-OSK2277, B. suJtilis-DSM618, A. tume faciens DSM5172, A. tumefaciens-OSM302Q5 and P. putida-DSM548 can be obtained from the DSMZ - German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH in Braunschweig.
  • the inventors were able to show that these strains are particularly suitable for the production of RNA.
  • Example 2 Suitable culture media
  • the bacteria are incubated in one of the culture media LB and MO to Mll shown in Table I below.
  • All media are sterilized at 120 ° C, 2 bar for 30 minutes.
  • Example 3 Expression vectors for the production of sequence-specific RNA
  • sequence-specific RNA pT-Adv plasmids (Clontech) with an insert cloned in according to the manufacturer's instructions are used as expression vectors, which e.g. can serve as a template for a test sequence.
  • sequence-specific inserts are created using polymerase chain reactions (PCR) using standard methods, precipitated with ethanol and resuspended in TE buffer (20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8).
  • PCR polymerase chain reactions
  • the ligation of the PCR products with the sequences 1, 2 and 3 with the pT-Adv plasmid is carried out according to the preparation instructions (Clontech) overnight at 10 ° C. in ligation buffer (6 mM Tris-HC1 pH 7.5; 6 mM MgCl 2 ; 5 mM NaCl; 0.1 mg / 1 BSA; 7 mM ß-mercaptoethanol; 0.1 mM ATP; 2 mM dithiothreitol; 1 mM spermidine with 1U DNA ligase (MBI Fermentas) in 10 ⁇ l final volume.
  • ligation buffer 6 mM Tris-HC1 pH 7.5; 6 mM MgCl 2 ; 5 mM NaCl; 0.1 mg / 1 BSA; 7 mM ß-mercaptoethanol; 0.1 mM ATP; 2 mM dithiothreitol; 1 mM spermidine with 1U DNA liga
  • the PCR product with sequence 4 is digested with the restriction enzymes Sacl and EcoRI and the PCR product with sequence 5 is digested with the restriction enzymes Hindlll and EcoRI.
  • the ligation of the PCR products with the sequences 4 and 5 with the pT-Adv plasmid is carried out overnight at 10 ° C. in ligation buffer with 1U DNA ligase (MBI Fermentas) in 10 ⁇ l final volume.
  • Competent cells of the secretory bacteria are transformed according to the following protocol: The cells are incubated with the plas id or ligation product on ice for 30 minutes. biert. Then ⁇ -mercaptoethanol is added to the cells according to the manufacturer's protocol, followed by heat shock at 42 ° C for 30 seconds. The mixture is then incubated on ice for 2 minutes. 60 ⁇ l of the mixture are then 250 ⁇ l SOC medium (Clontech) added and the cells are incubated at 200 rpm and 37 ° C. as a shake culture for 1 hour. The cells are then plated on LB agar plates with 100 ⁇ g / ml ampicillin and cultivated at 37 ° C. overnight.
  • Bacterial cultures are set up from the grown colonies and the plasmids with inserts are prepared according to the manufacturer's instructions using a Qiagen mini-prep kit.
  • the inserts are subjected to a sequencing reaction using a PE Applied Biosystems kit according to the manufacturer's instructions (Perkin Elmer).
  • the sequences are analyzed on a 377 DNA sequencer (Perkin Elmer). In this way it is checked whether the cloned insert has the desired sequence.
  • the secretory bacteria are cultivated by inoculating the strains in 3 ml of medium in 15 ml glass tubes, closed with aluminum lids. The culture tubes are incubated as shake cultures at 37 ° C and 200 rpm for 120 hours.
  • Example 6 Quantification of secreted RNA
  • RNA in the culture supernatant After 120 hours of cultivation, the amount of RNA in the culture supernatant is determined. Samples are taken from the culture and centrifuged at 14,000 g for 2 minutes at 4 ° C. 20 ⁇ l of the supernatant are then loaded onto a 1% agar gel with ethidium bromide and separated at 120 volts in TAE buffer (40 mM Tris acetate, 1 mM EDTA) for 20 minutes. The gel bands are visualized under UV light.
  • TAE buffer 40 mM Tris acetate, 1 mM EDTA
  • RNA is quantified using Ribogreen dye (Molecular Probes).
  • Ribogreen dye Molecular Probes
  • 10 ⁇ l of each sample are mixed with 10 ⁇ l of Ribogreen dye diluted 100 times and made up to a final volume of 200 ⁇ l with H 2 O bidist .
  • the fluorescence is then determined using a FluoStar fluorimeter (BMG) under an excitation wavelength of 485 nm and an emission wavelength of 538 nm.
  • BMG FluoStar fluorimeter
  • the calibration is carried out with a standard RNA from the cDNA cycle kit (Invitrogen).
  • Example 7 Strains of bacteria tested for secretion of RNA of "natural origin"
  • E. coli-JMlOl DSM3948
  • E. coli-DH5 ⁇ DSM6897
  • Table II Qualitative detection of the secretion of RNA of "natural origin" in different bacterial strains in LB medium The inventors were thus able to demonstrate RNA secretory properties, measured after cultivation in the LB medium, for all of the bacterial strains examined, with the exception of the two E. coli variants JM 101 (DSM3948) and DH5 ⁇ (DSM6897).
  • Example 8 RNA secretion in different culture media
  • RNA of "natural origin” The amount of RNA of "natural origin” from Bacillus subtilis-DSM2277 secreted into the extracellular medium is shown in various culture media (see Example 2).
  • RNA of "natural origin" in milligrams per liter of extracellular medium, determined by ethidium bromide staining after gel electrophoresis and using Ribogreen dye.
  • Table III Secretion of RNA of "natural origin" from Bacillus su £> tiIis-DSM2277 depending on the culture medium used
  • FIG. 1 The result of the ethidium bromide staining of the RNA of "natural origin" in the extracellular medium after gel electrophoretic separation in 1% agarose is shown in FIG. 1 as an example. The following was written in the individual tracks: Markers (1); 1 ul (2); 2 ul (3); 4 ⁇ l (4); 8 ul (5); 16 ul (6); 32 ul culture supernatant (7).
  • RNA In the case of a sequence-specific production of RNA but also of such "natural origin", it is important that after sufficient cultivation of the bacteria, the secreted RNA is further purified and analyzed. This can be done using various methods.
  • the extracellular RNA is purified by gel filtration with a 10 ml Sephacryl 200 column for natural bacteria or Sephacryl 1000 column (both Pharmacia) for transformed bacteria : After removing the cells by centrifugation at 13,000 g for 5 minutes at 4 ° C., 1 ml of the culture supernatant is added to the Sephacryl column previously equilibrated with TE buffer. The column is run at a flow rate of 1 ml / min and 1 ml fractions are collected.
  • RNA of "natural origin" which according to the inventors' knowledge usually consists of long-chain nucleic acid molecules, as well as extracellular protein and other components.
  • RNA, protein (BCA test) and salinity (conductivity measurement) are determined in the separated fractions. The RNA contained in the fractions is then identified on the basis of their different sizes by means of agarose gel electrophoresis.
  • the extracellular RNA can also be purified by electroelution: After removal of the cells by centrifugation at 13,000 g for 5 minutes at 4 ° C, the RNA in 600 ⁇ l of the Culture supernatant precipitated with 95% ethanol and 0.3 M sodium acetate. After resuspending the pellet in TE buffer, the RNA of "natural origin" is separated from sequence-specific RNA in 1% agarose with ethidium bromide staining. The bands are identified on the basis of the position to the marker.
  • RNA of "natural origin” and sequence-specific RNA are cut out and transferred to dialysis tubes in 1 ml TAE buffer for elution of the RNA from the gel. After 10 minutes of incubation at 120 V, the buffer is collected from the dialysis tube and the RNA is precipitated with 95% ethanol and 0.3 M sodium acetate. The pellet is resuspended in TE buffer.
  • FIG. 2a shows the elution profile of a Sephacryl 200 column to which the culture supernatant of an RNA-secreting bacterium is applied. It is clear here that the secreted RNA of "natural origin" is eluted in fractions 2, 3 and 4, while the protein is eluted with a maximum elution in fraction 6. The eluted amounts of protein can be determined using the left y-axis, the eluted RNA amounts using the right y-axis. Due to these clearly different elution maxima, a particularly good cleaning effect can be achieved by gel filtration.
  • FIG. 2b shows the separation of fractions 1 to 8 of the fractions shown in FIG.
  • RNA of "natural origin" is only found in fractions 2, 3 and 4, which is due to the concentrated elution peak of the RNA.
  • FIG. 2c shows an example of the result of an ethidium bromide staining of the gel electrophoretic separation of fractions in 1% agarose which contain E transformed from the extracellular culture medium.
  • coli ToplOF 'bacteria were purified by Sephacryl 1000 gel filtration. 20 ⁇ l of the corresponding fractions 7 (lane 1), 10 (lane 2), 12 (lane 3), 13 (lane 4) were applied in each case. It can be seen that RNA of "natural origin" (A) migrates through the agarose gel with a significant delay compared to sequence-specific RNA with one of the test sequences from Example 3 (B), which enables the simple separation of the two RNA species.
  • Fig. 2d the result of an ethidium bromide staining of the electrophoretic separation of samples in 1% agarose is shown, which results from the extracellular.
  • Cultivation medium of transformed E. coli-Top 10 F 'bacteria were purified by electroelution.
  • markers (lane M) aliquots of the unpurified RNA (lane 1), the RNA of "natural origin” (lane 2) and the sequence-specific RNA (lane 3) were separated.
  • RNA of "natural origin” (A) compared to sequence-specific RNA with one of the test sequences sequences from Example 3 (B) migrate through the agarose gel with a significant delay. It is therefore also possible to separate the two RNA species by electroelution.
  • the sequence of the secreted sequence-specific RNA is identified by gel filtration and / or ethanol precipitation or phenol / chlorophore extraction by RT-PCR.
  • the RNS is first heated to 65 ° C. for 10 minutes, incubated with random primers according to the manufacturer's instructions (cDNA Cycle TM Kit, Invitrogen) and incubated at 25 ° C. for 15 minutes.
  • the cDNA synthesis is carried out at 42 ° C. for one hour.
  • a PCR is then carried out using the standard primer Ml3 primer and M13 reverse primer and the newly synthesized cDNA (PCR conditions:
  • sequence-specific RNA molecules can be clearly characterized and identified by the RT-PCR and the size estimation of the secreted RNA via agarose gel electrophoresis.
  • the arrows on the side mark the running height of 1.6 and 1 kilobase or 1 and 0.5 kilobase nucleic acid molecules.
  • RNA of "natural origin” is identified by gel filtration and / or ethanol precipitation or phenol / chlorophore extraction by sequencing.
  • the RNA is first heated to 65 ° C. for 10 minutes, incubated with random primers according to the manufacturer's instructions (cDNA Cycle TM Kit, Invitrogen) and at 25 ° C. for 15 minutes. After adding the retrotanscriptase, the nucleotides and the buffer, the cDNA synthesis is carried out at 42 ° C. for one hour.
  • Rapid amplification of cDNA ends is subsequently carried out: After ligation overnight of a 5 '-phosphorylated anchor to the cDNA with RNA ligase, an extension is carried out using the primer complementary to the anchor. This reaction is followed by a second ligation with a 5'-phosphorylated anchor.
  • This cDNA is used as a template for a PCR, with the complementary anchor as a primer [PCR conditions: 94 ° C. for 20 seconds, (94 ° C. for 20 seconds, 50 ° C. for 1 minute, 72 ° C. for 1 minute 30 sec) x 35 cycles, 72 ° C for 10 min].
  • PCR products are cloned into a pAdvantage TM plasmid using the Advantage TM PCR Cloning Kit. After ethanol precipitation or phenol / chlorophore extraction, the PCR products are ligated overnight with the plasmid according to the manufacturer's instructions. ToplOF 'bacteria are transformed with the ligation product according to the manufacturer's instructions. Plasmids with inserts are prepared from transformed overnight bacterial cultures using a QiagenO miniprep kit. 200-500 ng of plasmid are used in the subsequent sequencing reaction with standard primers using a PE applied biosystem kit according to the manufacturer's instructions. The sequences are read with an ABI PE 377 DNA sequencer.
  • RNA of "natural origin" secreted by B. subtilis For RNA of "natural origin" secreted by B. subtilis, the inventors were able to sequence homologies to the gene sequence of the ribosomal protein L24 from B. notice subtilis. The total length of these secreted RNAs of "natural origin” examined is 12-15 kb. There are first indications that the sequenced section could be part of a polycistronic mRNA that is transcribed by the bacterial operon SlO-spc- ⁇ .

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Abstract

Es wird ein Verfahren zur Herstellung von Ribonukleinsäure (RNS) beschrieben, bei dem nukleinsäuresekretierende Mikroorganismen eingesetzt werden. Ferner wird ein Verfahren zur Identifizierung solcher Mickroorganismen sowie deren Verwendung beschrieben.

Description

Verfahren zur Herstellung von Ribonukleinsäure (RNS)
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Ribonukleinsäure (RNS) gewünschter Sequenz sowie ein Verfahren zur Identifizierung von nukleinsäuresekretierenden Mikroorganismen, Kits zur Durchführung der Verfahren, sowie die Verwendung bestimmter Mikroorganismen in einem Verfahren zur Herstellung von RNS.
Verfahren zur Herstellung von RNS sind im Stand der Technik bekannt. Dabei werden Polynukleotide z.B. in vitro in einer RNS- Synthesereaktion durch "Anpolymerisieren" von 5 ' -Nukleosiddi- hosphaten unter Phosphatabspaltung an vorhandene Oligonukleo- tide, die als Starter (Primer) dienen, hergestellt. Diese Reaktion wird durch das Enzym Polynukleotid-Phosphorylase katalysiert. In dem bekannten Verfahren wird die Basenzusammensetzung des zu synthetisierenden Polynukleotids nicht durch eine Matrize kodiert, sondern von dem unterschiedlichen Angebot an Bausteinen, d.h. Ribonukleotiden, bestimmt. Ein Überblick über das bekannte Verfahren findet sich in dem Lexikon der Biochemie, 2. Band, Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg, 2000; S. 303.
Des weiteren kann RNS mittels in vitro-Transkription hergestellt werden, bei der für die Synthese der RNS eine Matrize in Form eines DNS-Templates, sowie die Verwendung von DNS- abhängigen RNS-Polymerasen, beispielsweise aus den Bakteriopha- gen T3, T7 oder SP6, erforderlich ist. Eine detaillierte Beschreibung dieses Verfahrens ist in "Sambrook, Fritsch, Ma- niatis in Molecular Cloning - Laboratory Manual", 2. Auflage Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989, S. 10.32 ff. dargestellt.
Außerdem besteht nach dem Stand der Technik die Möglichkeit, RNS mittels chemischer Synthese durch Knüpfung von Phosphodie- sterbindungen zwischen den Nukleotiden ohne die Beteiligung von Enzymen herzustellen. Ein Beispiel hierfür ist die sogenannte. Phosphoamidit-Methode, die im Lexikon der Biochemie, 2. Band, Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg, 2000, S. 163 beschrieben ist.
Die biologische Bedeutung der RNS für alle lebenden Zellen liegt in der Übertragung der genetischen Information von der DNS zu den Orten der Proteinbiosynthese durch die sogenannte Messenger-RNS (mRNS) und in der Realisierung der Information bei der Proteinbiosynthese unter Beteiligung der sogenannten Transfer-RNS und der ribosomalen RNS (tRNS, rRNS).
Neben diesen physiologischen Aspekten nutzt die moderne Biotechnologie die Möglichkeit, RNS z.B. als Therapeutikum einzusetzen. Hier ist zum einen an sogenannte Ribozyme, d.h. an RNS- Moleküle mit katalytischen Eigenschaften, zu denken. Es gibt Bestrebungen, komplexe künstliche Ribozyme herzustellen, die analog zu bestimmten Enzymen therapeutische oder krankheitsvorbeugende Eigenschaften haben. Außerdem sind RNS-Moleküle aufgrund ihrer Fähigkeit, eine Vielfalt von chemischen Reaktionen zu katalysieren, auch für die chemische Industrie von großem Interesse. Für einen Überblick siehe hierzu auch Jaeger, L. Curr. Opin. Struct. Biol. 7 (1997) 324, und Narkilar G. T. u. Herschlag D., Annu. Rev. Biochem. 66 (1997) 19.
Eine weitere wichtige Rolle spielen RNS-Moleküle als sogenannte Antisense-Medikamente. Darunter versteht man Medikamente, die sich aufgrund ihrer zu einem Gen bzw. zu einer mRNS oder anderen Nukleinsäure komplementären Struktur an diese Nukleinsäure anlagern und dadurch die Realisierung einer bestimmten genetischen Information, d.h. Transkription und Translation, blockieren. Im Tierversuch ist es mit Hilfe solcher Antisense-. Medikamente gelungen, pathologische Arterienverengungen zu verhindern. In anderen Studien konnten maligne Hirntumoren zum Schrumpfen gebracht werden. Des weiteren konnte durch Verwendung von Antisensekonstrukten in vitro die Proliferation und Differenzierung von Stammzellen gesteuert werden. In den USA wurden Antisense-Medikamente bereits in klinischen Studien auf ihre Wirksamkeit bei Leukämie und eventuellen Nebenwirkungen getestet. Auch die Behandlung von Aids mit Hilfe dieser Medikamente wird angedacht.
Ein großer Bedarf an ausreichenden Mengen von RNS besteht auch im Zusammenhang mit der Entwicklung von neuen Wirkstoffen, die als Wirkort direkt an einer RNS ansetzen sollen. Für das hiermit verbundene notwendige Wirkstoffscreening zum Aufspüren einer solchen Substanz sind große Mengen von spezifischer RNS erforderlich.
Des weiteren besteht natürlich auch im Forschungsbereich, z.B. für in vitro-Translationsstudien bis hin zur Entwicklung von Gentherapien, verstärkter Bedarf an großen Mengen von RNS. Aus den vorstehend genannten Gründen ergibt sich eine zunehmende Bedeutung von RNS sowohl in der biotechnologischen als auch in der pharmazeutischen Industrie.
Trotz dieses ansteigenden Bedarfs ist die Verfügbarkeit von ausreichenden Mengen an RNS nicht gelöst. Bei den oben zitierten bekannten Verfahren zur RNS-Herstellung handelt es sich ausschließlich um äußerst kostenintensive und komplexe Herstellungsverfahren. Häufig werden hierbei auch für den Menschen toxische Lösungsmittel verwendet. Eine Ausweitung der beschriebenen Verfahren auf großmaßstabliche Herstellungsprozesse ist nicht möglich.
Bei der oben beschriebenen enzymunabhängigen chemischen Synthese von RNS-Oligonukleotiden besteht zusätzlich das Problem, daß der Syntheseprozeß ab einer Länge von circa 80 Nukleotiden abbricht. D.h. die Herstellung von längerkettigen RNS-Molekülen, die häufig für ihren effizienten Einsatz als Antisense- Medikament eine Voraussetzung sind, ist auf diese Art nicht möglich.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist deshalb, ein Verfahren zur Herstellung von Ribonukleinsäure (RNS) gewünschter Sequenz bereitzustellen, bei dem die vorstehend genannten Nachteile vermieden werden .
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß das Verfahren folgende Schritte umfaßt:
a) Bereitstellung von Mikroorganismen, vorzugsweise von Bakterien, in Kultur, die zur Sekretion von RNS in das extrazelluläre Medium fähig sind,
b) Isolierung und/oder Anreicherung der von den Mikroorganismen in das extrazelluläre Medium sekretierten RNS.
Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe wird auf diese Weise vollkommen gelöst.
Die Erfinder haben nämlich erkannt, daß die hier erstmals beispielhaft für verschiedene Bakterien beschriebene Fähigkeit von bestimmten Mikroorganismen, RNS in das extrazellulär umgebene Medium zu sekretieren, zur Herstellung großer Mengen von RNS geeignet ist. Hierbei war es besonders überraschend und nicht zu erwarten, daß bspw. bestimmte Bakterienstämme natürliche RNS nach ihrer Synthese aus der Zelle ausschleusen. Diese sekre- tierte RNS läßt sich besonders einfach und ohne großen Kostenaufwand anreichern bzw. isolieren. Die erfindungsgemäße Herstellung der RNS erfordert keine Lyse der Mikroorganismenzel- len, was die Isolierung und/oder Aufreinigung der RNS ganz entscheidend vereinfacht. Die sekretorischen Mikroorganismen können sehr einfach in großvolumigen Fermentern kultiviert und der RNS-enthaltende Überstand kann mittels einfacher Methoden, z.B. durch Zentrifugation, von den zellulären Bestandteilen abgetrennt werden. Durch dieses erfindungsgemäße Verfahren läßt sich RNS in sehr großen Mengen, d.h. in mehreren Milligramm pro Liter, herstellen.
Bei der interessierenden, gewünschten Sequenz kann es sich insbesondere im Zusammenhang mit dem eingangs angesprochenen Wirkstoffscreening zur Entwicklung von neuen Wirkstoffen um eine RNS "natürlichen Ursprungs" handeln, beispielsweise um eine mRNS, die für ein bestimmtes bakterielles Protein kodiert, oder um eine rRNS. Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich folglich besonders für die Entwicklung antibakterieller bzw. anti- biotischer Wirkstoffe.
Des weiteren ist das erfindungsgemäße Verfahren durch seine einfache Durchführbarkeit und durch wenige manuelle Handgriffe charakterisiert, da sowohl die Bereitstellung der Mikroorganismen als auch die Isolierung der sekretierten RNS weitgehend automatisiert werden können. Dadurch wird das erfindungsgemäße Verfahren besonders für industrielle biotechnologische oderpharmazeutische Herstellungsprozesse geeignet.
Lediglich der Vollständigkeit halber sei an dieser Stelle erwähnt, daß in einzelnen Säugetierzellen eine Sekretion von RNS in das die Zelle umgebende Medium beobachtet wurde. So konnten z.B. Sitikov, A.S. und Munishkin, A.V., 1991, "Specific sup- presser T-cells secrete RNA", Dokl. Akad. Nauk. SSSR, 318 (6), 1486-8, für zwei Suppressor T-Zellinien, die in einem bestimmten Kulturmedium gehalten wurden, sekretierte RNS in dem Medium nachweisen. Ryazantseva, I.N., 1969, "Dynamic of RNA secretion into a culture medium by Ehrlich carcinoma cells in a Short- lift culture", Sb. Aspir. Rab., Kazan. Gos. Univ., Estestv. Nauki., 129-32, konnte an isolierten Karzinomzellen eine Sekretion von RNS in das Kulturmedium beobachten.
In einer weiteren Arbeit konnte an kultivierten Embryofibrobla- sten des Huhns eine Freisetzung von RNS in das umgebende Medium gezeigt werden, siehe Mclntosh, Alison, A.G. Adams, David H., 1985, "Further studies on the extrusion of cytosol macromole- cules by cultured chick embryo fibroblast cells", Int. J. Bio- che ., 17 (2), 147-53.
Eine industrielle Nutzung dieser an bestimmten Zellen höherer Eukaryonten beschriebenen RNS-sekretorischen Eigenschaften ist jedoch aufgrund der aufwendigen Kultivierungsbedingungen und der begrenzten Verfügbarkeit dieser Zellen nicht möglich.
In einer bevorzugten Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens sind die Mikroorganismen, vorzugsweise Bakterien, derart gentechnologisch modifiziert, daß diese die RNS mit gewünschter Sequenz produzieren.
Besonders überraschend ist bei der vorliegenden Erfindung, daß die untersuchten sekretorischen Bakterien, nachdem diese gentechnologisch modifiziert wurden, d.h. z.B. nach ihrer Transformation mit rekombinanten DNS-Fragmenten, RNS-Moleküle mit der einklonierten Sequenz in das extrazelluläre Medium sekretieren. Durch diese Eigenschaft der sekretorischen Bakterien lassen sich erfindungsgemäß große Mengen an RNS mit beliebiger Nukleotidsequenz herstellen. Dies ist z.B. im Hinblick auf die Herstellung der eingangs erwähnten Antisense-Medikamente wichtig. Die Synthese eines Proteins kann natürlich nur dann durch ein Antisense-Konstrukt, z.B. in Form einer RNS, blockiert werden, wenn diese Sequenz zu der für das Protein kodierenden Nukleinsäure komplementär ist. Hierbei ist es weiterhin ganz entscheidend, daß nur die Synthese des krankheitsassoziierten Proteins, nicht aber von anderen, möglicherweise essentiellen Proteinen gehemmt wird. Bei Kenntnis des zugrunde liegenden krank- heitserzeugenden Gens oder der Aminosäuresequenz des entsprechenden Genprodukts, d.h. Proteins, kann z.B. die entsprechend komplementäre Sequenz in einen Expressionsvektor kloniert werden, mit dem dann beispielsweise ein sekretorischer Bakterienstamm transformiert wird. Dabei wird unter Expressionsvektor ein vorzugsweise rekombinant hergestelltes genetisches Kon- strukt verstanden, das nach Einbringen in die Bakterienwirtszelle dort die Transkription der in den Vektor einklonierten gewünschten Sequenz erlaubt. Unter gentechnologisch modifizierten Bakterien sind auch solche zu verstehen, bei denen aufgrund des Einsatzes der DNA-Rekombinationstechnologie die gewünschte Sequenz stabil in das bakterielle Genom integriert wurde. Die von den Bakterien exprimierte rekombinante RNS wird dann erfindungsgemäß in großen Mengen aus dem extrazellulären Medium aufgereinigt.
In weiter bevorzugter Ausgestaltung der Erfindung erfolgt im Anschluß an den Schritt b) des erfindungsgemäßen Verfahrens eine Isolierung der Fraktion der RNS, die die gewünschte Sequenz aufweist . Dies hat den besonderen Vorteil, daß aus der Gesamtheit der Sekretierten RNS, die z.B. durch RNS "natürlichen Ursprungs", d.h. mit unerwünschter Sequenz, verunreinigt sein kann, nur die Spezies von RNS erhalten wird, die die gewünschte, in den Expressionsvektor einklonierte Sequenz aufweist. Eventuell störende RNS-Fraktionen werden somit abgetrennt.
Eine bevorzugte Weiterbildung der Erfindung ist es, wenn die Isolierung und/oder Anreicherung der sekretierten RNS aus Schritt b) eine Gelfiltration, vorzugsweise mittels Sephacryl, umfaßt.
Diese chromatographische Methode ermöglicht in vorteilhafter Weise die Trennung von Molekülen nach ihrer Größe. Dadurch läßt sich die sekretierte RNS aus Schritt b) auf einfache Art und Weise von Bestandteilen des extrazellulären Mediums, die sich in ihrer Größe von der RNS unterscheiden, z.B. von sekretierten Proteinen, abtrennen. Die Erfinder haben des weiteren erkannt, daß sich für die Gelfiltration als Trennmedium besonders Sephacryl, ein aus Dextran bestehendes poröses Gel, das mit N,N- Methylenbisacryla id dreidimensional vernetzt ist, eignet.
Weiter bevorzugt ist es, wenn in dem erfindungsgemäßen Verfahren in Schritt a) Bakterien in Kultur bereitgestellt werden,- die ausgewählt sind aus der Gruppe: Escherichia coli-ToplOF ' , Escherichia coli-XLl, Escherichia co!i-JM105, Escherichia coli- JM109, Bacillus subtilis-OSU22 , Bacillus subtilis-OSM618 , Agrobacterium tumefaciens-OSM' .2277 , Agrobacterium tumefaciens— DSM30205, Pseudomonas putida-DSM548 sowie Stämme, die mit den vorstehend genannten Stämmen genetisch identisch sind oder genetische Varianten davon sind. Den Erfindern ist es gelungen, für die angegebenen Bakterienstämme eine RNS-sekretierende Eigenschaft nachzuweisen. Sie eignen sich somit ganz besonders gut für den Einsatz in dem erfindungsgemäßen Verfahren.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung besteht darin, daß die Kultivierung der Bakterien in einem Medium erfolgt, das folgende Komponenten, angegeben in Gramm pro Liter, enthält: Na2HP04, 4-8; KHP04, 1-5; NaCl, 3-7; H9N204P, 0,5-7; MgS04, 0,3- 0,8; CaCl2, 0,008-0,012; und eine weitere Komponente, die aus der Gruppe ausgewählt ist: Weizenstärke, Endkonzentration in dem Medium 8-12; Glyzerin, Endkonzentration in dem Medium 0,5- 4; Saccharose, Endkonzentration in dem Medium 0,5-4; Mannitol, Endkonzentration in dem Medium 0,5-4; Maisstärke, Endkonzentration in dem Medium 0,5-4; und Glukose, Endkonzentration in dem Medium 0,5-4.
Die Verwendung solch eines Mediums ist nach Erkenntnis der Erfinder ganz besonders geeignet und förderlich für eine erhöhte Sekretion von RNS durch Bakterien in das extrazelluläre Medium. Insofern wird durch die Bereitstellung eines solchen Kulturmediums die Voraussetzung für eine besonders gute Realisierung des erfindungsgemäßen Verfahrens geschaffen.
Vorzugsweise wird in dem Verfahren zur Kultivierung von Bakterien andererseits ein Medium verwendet, das folgende Komponenten, angegeben in Gramm pro Liter, enthält: Na2HP04, 4-8; KHP04, 1-5; NaCl, 0,3-7; MgS04, 0,3-0,8; CaCl2, 0,008-0,012; Glukose, 0,5-4; und eine weitere Komponente, die aus der Gruppe ausgewählt ist: Hefeextrakt, Endkonzentration in dem Medium 3-7; Glutamat, Endkonzentration in dem Medium 3-7; Maissirup, End- konzentration in dem Medium 3-7; und H9N204P, Endkonzentration in dem Medium 0,5-3.
Auch durch dieses Medium läßt sich das erfindungsgemäße Verfahren mit besonders hoher Effizienz realisieren.
Weiter bevorzugt wird in diesem Verfahren zur Kultivierung von Bakterien ein Medium verwendet, das folgende Komponenten, angegeben in Gramm pro Liter, enthält: Pepton, 5-15; Hefeextrakt, 1-10; NaCl, 1-10.
Überraschenderweise eignet sich auch dieses Medium besonders gut für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens .
Besonders bevorzugt ist es, wenn das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels verwendet wird.
Wie bereits in der Einleitung dargelegt, besteht ein erhöhter Bedarf an RNS in Form von therapeutisch wirksamen Substanzen bzw. Arzneimitteln. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren läßt sich, insbesondere im Hinblick auf die Möglichkeit, beliebige Sequenzen konstruieren zu können, die Herstellung von als Arzneimittel wirksamen RNS-Molekülen besonders einfach und effizient realisieren.
Eine besondere Ausgestaltung der Erfindung betrifft ein Kit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, das vorzugsweise einen nukleinsäuresekretierenden Mikroorganismus enthält.
Dies hat den besonderen Vorteil, daß durch die Bereitstellung von sämtlichen oder von Teilen der erforderlichen Reagenzien bzw. Mikroorganismen eine einfache Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, selbst von angelernten Personen, wie dies z.B. in industriellen Laboratorien häufig der Fall ist, ermöglicht wird. Dadurch wird die Wahrscheinlichkeit einer fehlerhaften Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens minimiert.
Weiter bevorzugt ist es, wenn ein nukleinsäuresekretierender Mikroorganismus zur Gewinnung von RNS gewünschter Sequenz aus extrazellulärem Medium verwendet wird.
Dies hat den besonderen Vorteil, daß es auf diese Art und Weise es erstmals ermöglicht wird, in großen Mengen z.B. für die eingangs erwähnten Zwecke RNS beliebiger Sequenzen zu gewinnen. Dies ist mit den bisher bekannten Verfahren nicht möglich.
Aufgrund der durch die Erfinder erstmals erkannten und nicht zu erwartenden sekretorischen Eigenschaften eines Bakterienstamms, der ausgewählt ist aus der Gruppe: Escherichia coli-ToplOF ' , Escherichia coli-XLl, Escherichia coli-JMl05, Escherichia coli- JM109, Bacillus subtilis-OSM221 , Bacillus subtilis-DSM618 , Agrobacterium tumefaciens-OSU5172 , Agrobacterium tumefaciens- DSM30205, Pseudomonas putida-DSM548, sowie Stämme, die mit den vorstehend genannten Stämmen genetisch identisch sind oder genetische Varianten davon sind, ist auch die Verwendung solch- eines Bakterienstamms in einem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von RNS Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist des weiteren ein Verfahren zur Identifizierung von nukleinsäuresekretierenden Mikroorganismen, das folgende Schritte umfaßt: a) Bereitstellung der zu untersuchenden Mikroorganismen in Kultur,
b) Untersuchung des extrazellulären Mediums der Kultur auf das Vorhandensein von Nukleinsäuren.
Durch diese besondere Ausgestaltung läßt sich mittels einer neuen und erfinderischen Verwendung einfacher Methoden, die als solche im Stand der Technik bekannt sind, ein nukleinsäuresekretierender Mikroorganismus besonders effektiv und kostengünstig identifizieren. In diesem Verfahren können neben Bakterien z.B auch Hefen analysiert werden. Dies ist darauf zurückzuführen, daß man Hefen analog zu Bakterien aufgrund ihrer Einzelligkeit in flüssigen Medien kultivieren kann. Obwohl von den Erfindern RNS-sekretierende Eigenschaften bisher nur für bestimmte Bakterienstämme gezeigt werden konnten, ist es aufgrund ihrer ähnlichen Stoffwechseleigenschaften und der analogen Kultivierungsbedingungen zu erwarten, diese auch bei Hefen zu finden.
Eine bevorzugte Weiterbildung dieses Verfahrens besteht darin, daß der Mikroorganismus mit einem für eine Testsequenz kodierenden Expressionsvektor transformiert und die Testsequenz im extrazellulären Medium nachgewiesen wird.
Dies hat den besonderen Vorteil, daß sich eine Testsequenz relativ einfach im extrazellulären Medium nachweisen läßt, beispielsweise wenn eine nicht natürlich vorkommende Sequenz verwendet wird. Für den Nachweis dieser Testsequenz kommen z.B. spezielle Hybridisierungssonden in Frage, die wahlweise mit Markermolekülen gekoppelt sein können. Diese Ausgestaltung er- möglicht somit auf besonders einfache und effiziente Weise die Identifizierung eines nukleinsäuresekretierenden Mikroorganismus.
Es ist weiterhin besonders bevorzugt, wenn das vorstehend genannte Verfahren in einem der drei oben genannten Medien durchgeführt wird.
Dies hat den besonderen Vorteil, daß hiermit die Voraussetzungen für eine besonders hohe Nukleinsäureausbeute geschaffen werden .
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ebenfalls ein Kit zur Durchführung des vorstehend genannten Verfahrens, das vorzugsweise einen für die Testsequenz kodierenden Expressionsvektor enthält.
Der Vorteil dieser Ausgestaltung betrifft ebenfalls eine Vereinfachung der Durchführung des Verfahrens aufgrund der Zusammenstellung der erforderlichen Reagenzien bzw. Mikroorganismen oder Teilen davon.
Es versteht sich, daß die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
Die Erfindung wird nachstehend anhand von Beispielen erläutert, aus denen sich weitere Merkmale und Vorteile ergeben. Acht beigefügte Abbildungen sollen der Beschreibung der Erfindung dienen. Es zeigen:
Fig. 1 Ethidiumbromidfärbung von sekretierter RNS "natürlichen Ursprungs" nach elektrophoretischer Auftrennung im Agarosegel; beispielhaft für Bacillus subtilis-OSM22 7 in LB-Medium;
Fig. 2a Elutionsprofile von sekretierter RNS "natürlichen Ursprungs" und Proteinen bei der zur RNS- Aufreinigung verwendeten Sephacryl 200-Säule;
Fig. 2b Ethidiumbromidfärbung von sekretierter RNS "natürlichen Ursprungs" der Fraktionen 1 bis 8 aus der in Fig. 2a dargestellten Gelfiltration, nach elektrophoretischer Auftrennung im Agarosegel;
Fig. 2c Ethidiumbromidfärbung von sekretierter RNS "natürlichen Ursprungs" und sequenzspezifischer RNS nach Aufreinigung über eine Sephacryl 1000-Säule, nach elektrophoretischer Auftrennung; beispielhaft für transformierte Escherichia coli-ToplOF ' ; und
Fig. 2d Ethidiumbromidfärbung von sekretierter RNS "natürlichen Ursprungs" vor und nach Aufreinigung über eine Sephacryl 1000-Säule und von aufgereinigter sequenzspezifischer RNS nach elektrophoretischer Auftrennung.
Fig. 3a, b, c Ethidiumbromidfärbung von PCR-Produkten sequenzspezifischer RNS nach elektrophoretischer Auf- trennung im Agarosegel; beispielhaft für PCR- Produkte dargestellt, die die Testsequenzen aus Beispiel 3 aufweisen ,
Beispiel 1 : Geeignete Bakterienstämme
Der Bakterienstamm E. coli-ToplOF1 kann bei Clontech (USA) und der Stamm E . coli-XLl bei Stratagene (USA) bezogen werden. Die Bakterienstämme E . σoli-JMl05 (DSM3949), E . σo!i-JM109 (DSM3423), B . subtilis-OSK2277 , B . suJtilis-DSM618 , A . tume- faciens-DSM5172, A . tumefaciens-OSM302Q5 und P. putida-DSM548 können von der DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH in Braunschweig bezogen werden.
Die Erfinder konnten zeigen, daß sich diese Stämme besonders für die Herstellung von RNS eignen.
Beispiel 2 : Geeignete Kulturmedien
Die Bakterien werden in einem der in der Tabelle I nachstehend angezeigten Kulturmedien LB und MO bis Mll inkubiert.
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Tabelle I: Geeignete Kulturmedien
Alle Medien werden bei 120 °C, 2 bar für 30 Minuten sterilisiert.
Beispiel 3 : Expressionsvektoren für die Herstellung von sequenzspezifischer RNS
Zur Herstellung der sequenzspezifischen RNS werden als Expressionsvektoren pT-Adv-Plasmide (Clontech) mit gemäß Herstelleranweisung einkloniertem Insert verwendet, das z.B. als Matrize für eine Testsequenz dienen kann. Die sequenzspezifischen Inserts werden hierzu mittels Polymerasekettenreaktionen (PCR) nach Standardmethoden erstellt, mit Ethanol gefällt und in TE- Puffer (20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8) resuspendiert. Beispielhaft sind für fünf von den Erfindern verwendete Inserts oder Testsequenzen die Basenabfolgen aufgeführt:
Sequenz 1
AAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACTAGTAACGG CCGCCAGTGTGCTGGAATTCGGCTTAAGCCGAATTCTGCAGATATCCATCACACTGGCGG CCGCTCGAGCATGCATCTAGAGGGCCCAATTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTACAATTCA CTGGCCGTCGTTTTAC
Sequenz 2
AAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACTAGTAACGG CCGCCAGTGTGCTGGAATTCGGCTTTGCTATGGATCCCGGCTAATCGTAAGTGCCTAATG GGGACGGTGGCTAATCGTGGCTAATCGTAAGTGCCTAATTGGCTAAACGTAAGTGCCTAA TCCACCGCAAAACGTTCTTTTTCAAAGTCTGTTGTCGATAATATACGCACCTCTCCTCGA ATACCGTGTGTATTGACAATTCGACCTACATTAAACCATTCCACGTTGTGTCAAGGTGAT ACCATTGTCCACCTAACTTCACTAAATTCCACGCATGTCCTTCTTGCCCCATAGGCACTT ACGATTAGCCACGTATTAGCACCACATTAGGCACTTACGATTAGCCAGGATCCATGGCAA TAGGCACTTACGATCAGCCAGGATCCGCGATTAGCCACCCATGGATTAGGAAGCCGAATT CTGCAGATATCCATCACACTGGCGGCCGCTCGAGCATGCATCTAGAGGGCCCAATTCGCC CTATAGTGAGTCGTATTACAATTCACTGGCCGTCGTTTTAC
Sequenz 3
AAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACTAGTAACGG CCGCCAGTGTGCTGGAATTCGGCTTGTACCTAATTGGCTAATCGTAAGTGCCTAATGTGA CCACGTGGATCCTGGCTAATCGTAAGTGCCTATTTGGCCAGAGCAAGGCACACCGCTTAC GCACGGCTTTATCCCGAGGCACCCGGCACTGCTCCAGGATCCTGGCTAATCGTAAGTGCC TATTACCGGCGGGCTAATCGTAAGTGCCTATGGTGGATCCTGGCTAATCGTAAGTGCCTA ATCCGTCCCGTGGTGGCTAATCGTAAGTGCCTAATCCCGGTGGGTGGCTAATCGTAAGTG CCTAATATCGTATGTGCCTAATTGGCTAATCGTAAGTGCCTAATGTGGCTAATCGTAAGT GCCTAATGGCACACCTTCAACAAGAACGCGATCTTGTTTAGGGAAAGCAGCTAGGGTTAC TCCTTCTTTGCCTTTGTCCTTACCAGTGATAACCTTAACCTTGTCACCTTTTCTTACATG CATGCTGTCGCACCACCTGGATTAGGCACTTACGATTAGCCAGGATCCACGTAGGTTCTT GCCATTAGGCACTTACGATTAGCACCGCACCCATTAGGCACTTACGATTAGTCAGGATCC AAGAACCTACGTGGTCCCAATTAGGCACTTACGATTAGCCAGGATCCACGTAGTTCTAGC CAATAGGCACTTACGATTAGCCAGGGTCCAAGCCGAATTCTGCAGATATCCATCACACTG GCGGCCGCTCGAGCATGCATCTAGAGGGCCCAATTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTACAA TTCACTGGCCGTCGTTTTAC
Sequenz 4
GAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTTGGTACCGAGCTCAAAAAAAAAAAAAAAA AAGTCGACCAGACCAAGTTACTCATATTACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAAT TTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTG AGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATC CTTTTTTTCTGCGCGAATTCTGCAGATATCCATCACACTGGCGGCCGCTCGAGCATGCAT CTAGAGGGCCCAATTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTACAATTCACTGGCCGTCGTTTTAC Sequenz 5
AAGCTTATGCGCTTGCTCCAGCTCCTGTTCAGGGCCAGCCCTGCCACCCTGCTCCTGGTT CTCTGCCTGCAGTTGGGGGCCAACAAAGCTCAGGACAACACTCGGAAGATCATAATAAAG AATTTTGACATTCCCAAGTCAGTACGTCCAAATGACGAAGTCACTGCAGTGCTTGCAGTT CAAACAGAATTGAAAGAATGCATGGTGGTTAAACTTACCTCATTAGCAGCATCCCTCTAC AAGGTGCATTTAACTATAAGTATACTGCCTGCCTATGTGACGACAATCCAAAAACCTTCT ACTGGGACTTTTACACCAACAGAACTGTGCAAATTGCAGCCGTCGTTGATGTTATTCGGG AATTAGGCATCTGCCCTGATGATGCTGCTGTAATCCCCATCAAAAACAACCGGTTTTATA CTATTGAAATCCTAAAGGTAGAATAAGAATTC
Die Ligation der PCR-Produkte mit den Sequenzen 1 , 2 und 3 mit dem pT-Adv-Plasmid erfolgt nach Herstellungsanweisung (Clontech) über Nacht bei 10 °C in Ligationspuffer (6 mM Tris- HC1 pH 7,5; 6 mM MgCl2; 5 mM NaCl; 0,1 mg/1 BSA; 7 mM ß- Mercaptoethanol; 0,1 mM ATP; 2 mM Dithiothreitol; 1 mM Spermi- din) mit 1U DNA-Ligase (MBI Fermentas) in 10 μl Endvolumen. Das PCR-Produkt mit der Sequenz 4 wird mit den Restriktionenzymen Sacl und EcoRI verdaut und das PCR-Produkt mit der Sequenz 5 wird mit den Restriktionenzymen Hindlll und EcoRI verdaut. Die Ligation der PCR-Produkte mit den Sequenzen 4 und 5 mit dem pT- Adv-Plasmid (entweder mit Sacl und EcoRI oder mit Hindlll und EcoRI verdaut) erfolgt über Nacht bei 10 °C in Ligationspuffer mit 1U DNA-Ligase (MBI Fermentas) in 10 μl Endvolumen.
Beispiel 4 : Transformation der sekretorischen Bakterien mit den Expressionsvektoren
Kompetente Zellen der sekretorischen Bakterien werden gemäß folgendem Protokoll transformiert: Die Zellen werden mit dem Plas id bzw. Ligationsprodukt während 30 Minuten auf Eis inku- biert. Anschließend wird ß-Mercaptoethanol zu den Zellen gemäß Herstellerprotokoll hinzugefügt, gefolgt von einem Hitzeschock bei 42 °C für 30 Sekunden. Der Ansatz wird direkt anschließend auf Eis für 2 Minuten inkubiert. 60 μl des Ansatzes werden daraufhin 250 μl SOC-Medium (Clontech) hinzugegeben und die Zellen werden bei 200 rpm und 37 °C als Schüttelkultur für 1 Stunde inkubiert. Anschließend werden die Zellen auf LB-Agarplatten mit 100 μg/ml Ampicillin ausplattiert und bei 37 °C über Nacht kultiviert.
Von den gewachsenen Kolonien werden Bakterienkulturen angelegt und zur Kontrolle werden mittels Qiagen Mini-Prep-Kit die Plasmide mit Inserts nach Herstellerangaben präpariert. Die Inserts werden mit einem PE Applied Biosystems Kit nach Herstellerangaben (Perkin Eimer) einer Sequenzierungsreaktion unterzogen. Die Analyse der Sequenzen wird auf einem 377 DNA-Sequenzer (Perkin Eimer) durchgeführt. Auf diese Art wird überprüft, ob das einklonierte Insert die gewünschte Sequenz aufweist.
Beispiel 5: Kultivierungsbedingungen
Die Kultivierung der sekretorischen Bakterien wird durch Inokulation der Stämme in 3 ml Medium in 15 ml-Glasröhrchen, verschlossen mit Aluminiumdeckeln, vorgenommen. Die Kulturröhrchen werden als Schüttelkulturen bei 37 °C und 200 rpm für 120 Stunden inkubiert . Beispiel 6: Quantifizierung der sekretierten RNS
Nach 120 Stunden der Kultivierung erfolgt die Bestimmung der RNS-Menge im Kulturüberstand. Dazu werden aus der Kultur Proben entnommen und mit 14.000 g für 2 Minuten bei 4 °C zentrifu- giert. 20 μl des Überstandes werden anschließend auf ein l%iges Agargel mit Ethidiumbromid geladen und bei 120 Volt für 20 Minuten in TAE-Puffer (40 mM Tris-Acetat, 1 mM EDTA) aufgetrennt. Die Gelbanden werden unter UV-Licht visualisiert .
Parallel dazu erfolgt eine RNS-Quantifizierung mittels Ribo- green-Farbstoff (Molecular Probes). Hierzu werden 10 μl jeder Probe mit 10 μl 100-fach verdünntem Ribogreen-Farbstoff vermischt und mit H2Obidest auf ein Endvolumen von 200 μl aufgefüllt. Die Fluoreszenz wird anschließend mit einem FluoStar Fluorimeter (BMG) unter einer Anregungswellenlänge von 485 nm und einer Emissionswellenlänge von 538 nm bestimmt. Die Kalibrierung wird mit einer Standard-RNS aus dem cDNS-Cycle Kit (Invitrogen) durchgeführt.
Beispiel 7 : Auf die Sekretion von RNS "natürlichen Ursprungs" untersuchte Bakterienstämme
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durch Ethidiumbromid-Färbung nach Agarose-Gelelektropho- rese; als Kontrolle wurden parallel Ansätze nach RNAse- Behandlung gefahren. In diesen Ansätzen konnte in keinem Fall RNS im extrazellulären Überstand nachgewiesen werden.1
Die Bakterienstämme E . coli-JMlOl (DSM3948) und E . coli- DH5α (DSM6897) wurden ebenfalls von der DSMZ in Braunschweig bezogen.
Tabelle II: Qualitativer Nachweis der Sekretion von RNS "natürlichen Ursprungs" bei verschiedenen Bakterienstämmen in LB-Medium Die Erfinder konnten somit für sämtliche der untersuchten Bakterienstamme, mit Ausnahme der beiden E. coli-Varianten JM 101 (DSM3948) und DH5α (DSM6897), RNS-sekretorische Eigenschaften, gemessen nach Kultivierung im LB-Medium, nachweisen.
Beispiel 8: RNS-Sekretion in verschiedenen Kulturmedien
Für die verschiedenen Bakterienstämme, für die die Erfinder zeigen konnten, daß sie zur Sekretion von RNS "natürlichen Ursprungs" in das extrazelluläre Medium fähig sind, wurde die Abhängigkeit der Sekretion von den verwendeten Kulturmedien untersucht. Beispielhaft ist die in das extrazelluläre Medium sekretierte Menge von RNS "natürlichen Ursprungs" von Bacillus subtilis-DSM2277 in verschiedenen Kulturmedien (siehe Beispiel 2 ) dargestellt.
Figure imgf000027_0001
Menge von RNS "natürlichen Ursprungs" in Milligramm pro Liter extrazellulärem Medium, bestimmt durch Ethidiumbromid-Färbung nach Gelelektrophorese und unter Verwendung von Ribogreen-Farbstoff .
Tabelle III: Sekretion von RNS "natürlichen Ursprungs" von Bacillus su£>tiIis-DSM2277 in Abhängigkeit des verwendeten Kulturmediums
Exemplarisch ist das Ergebnis der Ethidiumbromidanfärbung der RNS "natürlichen Ursprungs" im extrazellulären Medium nach gel- elektrophoretischer Auftrennung in 1 %iger Agarose in der Fig. 1 dargestellt. In den einzelnen Spuren wurde aufgetragen: Marker (1); 1 μl (2); 2 μl (3); 4μl (4); 8 μl (5); 16 μl (6); 32 μl Kulturüberstand (7).
Parallel wurde in einem weiteren Ansatz in vier verschiedenen Medien der Einfluß von den Medien zugegebenen Salzen auf die Sekretion von RNS "natürlichen Ursprungs" untersucht.
Figure imgf000028_0001
Tabelle IV: Einfluß von den Medien zugesetzten Salzen auf die Sekretion von RNS "natürlichen Ursprungs" von Bacillus subtilis- DSM2277
Es zeigt sich also eine deutliche Abhängigkeit der RNS- Sekretion von dem verwendeten Medium. Für Bacillus subtilis- DSM2277 läßt sich demnach bei Verwendung des Mediums M6 eine besonders hohe Ausbeute an sekretierter RNS "natürlichen Ursprungs" erzielen (siehe Tabelle III).
Die Erfinder konnten anhand dieser Daten am Beispiel von Bacillus sujbtilis-DSM2277 eine auffällige Abhängigkeit der RNS- Sekretion von den zugesetzten Salzen erkennen. Demnach bewirkt insbesondere die Zugabe von Eisensulfat eine verstärkte Sekretion von RNS in das extrazelluläre Medium (siehe Tabelle IV). Beispiel 9: Aufreinigung und Analyse der sekretierten RNS
Im Fall einer sequenzspezifischen Herstellung von RNS aber auch solcher "natürlichen Ursprungs" ist es wichtig, daß nach ausreichender Kultivierung der Bakterien die sekretierte RNS weitergehend aufgereinigt und analysiert wird. Dies kann über verschiedene Verfahren erfolgen.
a) RNS-Reinigung
Nach der Kultivierung der natürlichen bzw. transformierten Bakterien für 120 Stunden bei 37 °C und 200 rpm wird die extrazelluläre RNS durch Gelfiltration mit einer 10 ml Sephacryl 200-Säule bei natürlichen Bakterien bzw. Sephacryl 1000-Säule (beide Pharmacia) bei transformierten Bakterien gereinigt: Nach Entfernung der Zellen durch Zentrifugation bei 13.000 g für 5 Minuten bei 4 °C wird 1 ml des Kulturüberstandes auf die vorher mit TE-Puffer äquillibrierte Sephacryl-Säule gegeben. Die Säule wird mit einer Flußrate von 1 ml/min gefahren und es werden Fraktionen von 1 ml gesammelt. Aufgrund ihrer unterschiedlichen Größe können durch die Gelfiltration sequenzspezifische RNS, RNS "natürlichen Ursprungs", die nach Erkenntnissen der Erfinder üblicherweise aus langkettigen Nukleinsäuremolekülen- besteht, als auch extrazelluläres Protein und andere Bestandteile voneinander getrennt werden. In den aufgetrennten Fraktionen werden RNS-, Protein- (BCA-Test) und Salzgehalt (Leitfähigkeitsmessung) bestimmt. Die in den Fraktionen enthaltene RNS wird dann anhand ihrer unterschiedlichen Größe mittels Agarosegelelektrophorese identifiziert. Alternativ kann nach der Kultivierung der transformierten Bakterien für 120 Stunden bei 37 °C und 200 rpm die extrazelluläre RNS auch durch Elektroelution gereinigt werden: Nach Entfernung der Zellen durch Zentrifugation bei 13.000 g für 5 Minuten bei 4°C wird die RNS in 600 μl des Kulturüberstandes mit 95 % Ethanol und 0,3 M Natriumacetat gefällt. Nach Resuspendierung des Pellets in TE-Puffer wird die RNS "natürlichen Ursprungs" von sequenzspezifischer RNS in 1 %iger Agarose mit Ethidiumbromidfärbung getrennt. Die Identifikation der Banden erfolgt anhand der Lage zum Marker. Anschließend werden solche Stücke von Agarosebe- reichen ausgeschnitten, welche die RNS "natürlichen Ursprungs" und sequenzspezifische RNS enthalten, und zur Elution der RNS aus dem Gel jeweils in Dialyseschläuche in 1 ml TAE-Puffer überführt. Nach 10 Minuten Inkubation bei 120 V wird der Puffer aus dem Dialyseschlauch gesammelt und die RNS wird mit 95 % Ethanol und 0,3 M Natriumacetat gefällt. Das Pellet wird in TE-Puffer resuspendiert.
In der Fig. 2a ist das Elutionsprofil einer Sephacryl 200- Säule dargestellt, auf die der Kulturüberstand eines RNS- sekretierenden Bakteriums aufgetragen wird. Hierbei wird deutlich, daß die sekretierte RNS "natürlichen Ursprungs" in den Fraktionen 2, 3 und 4 eluiert wird, während das Protein verzögert, bei einem Elutionsmaximum in der Fraktion 6, eluiert wird. Die eluierten Proteinmengen lassen sich anhand der linken y-Achse, die eluierten RNS-Mengen anhand der rechten y-Achse bestimmen. Aufgrund dieser deutlich verschiedenen Elutionsmaxima läßt sich durch die Gelfiltration ein besonders guter Reinigungseffekt erzielen. In der Fig. 2b ist die Auftrennung der Fraktionen 1 bis 8 der in der Abbildung Fig. 2a dargestellten Fraktionen in einer l%igen Agarosegelelektrophorese durch anschließende Ethidiumbromidanfärbung dargestellt. Hierbei wurden jeweils 20 μl aufgetragen. Die RNS "natürlichen Ursprungs" findet sich nur in den Fraktionen 2 , 3 und 4 , was auf den konzentrierten Elutionspeak der RNS zurückzuführen ist.
In der Fig. 2c ist exemplarisch das Ergebnis einer Ethidiumbromidfärbung der gelelektrophoretischen Auftrennung von Fraktionen in l%iger Agarose gezeigt, die aus dem extrazellulären Kultivierungsmedium transformierter E . coli- ToplOF ' -Bakterien durch eine Sephacryl 1000-Gelfiltration aufgereinigt wurden. Hierbei wurden jeweils 20 μl der entsprechenden Fraktionen 7 (Spur 1), 10 (Spur 2), 12 (Spur 3), 13 (Spur 4) aufgetragen. Es zeigt sich, daß RNS "natürlichen Ursprungs" (A) gegenüber sequenzspezifischer RNS mit einer der Testsequenzen aus Beispiel 3 (B) deutlich verzögert durch das Agarosegel wandert, wodurch die einfache Trennung der beiden RNS-Spezies möglich wird.
In Abb. 2d ist exemplarisch das Ergebnis einer Ethidiumbromidfärbung der elektrophoretischen Auftrennung von Proben in l%iger Agarose gezeigt, die aus dem extrazellulären. Kultivierungsmedium transformierter E . coli-Top 10 F'- Bakterien durch eine Elektroelution aufgereinigt wurden. Hierbei wurden Marker (Spur M) , Aliquote der nicht gereinigten RNS (Spur 1), der RNS "natürlichen Ursprungs" (Spur 2) und der sequenzspezifischen RNS (Spur 3) aufgetrennt. Auch hier zeigt sich, daß RNS "natürlichen Ursprungs" (A) gegenüber sequenzspezifischer RNS mit einer der Testse- quenzen aus Beispiel 3 (B) deutlich verzögert durch das Agarosegel wandert. Deshalb ist auch eine Abtrennung der beiden RNS-Spezies durch Elektroelution möglich.
Das quantitative Ergebnis einer Gelfiltration auf Sephacryl 200 ist nachstehend exemplarisch an einem Beispiel dargestellt:
Figure imgf000032_0001
* Fluoreszenzfärbung ** BCA Test (Pierce) *** Leitfähigkeitsmessung jeweils durchgeführt an Fraktion 2
Es zeigt sich, daß durch Gelfiltration des extrazellulären Mediums 94 % der Proteine sowie 92 % des Salzes entfernt werden können. Dabei gehen lediglich geringfügige Mengen der RNS verloren. D.h. die sekretierte RNS kann mit relativ einfachen konventionellen Methoden gereinigt bzw. präpariert werden, was die Ausweitung des Verfahrens auf großmaßstabliche Verhältnisse möglich macht.
Identifizierung der sekretierten sequenzspezifischen RNS durch RT-PCR und Agarosegelelektrophorese
Die Sequenz der sekretierten sequenzspezifischen RNS wird nach der Gelfiltration und/oder Ethanolfällung bzw. Phenol/Chlorophorm-Extraktion durch RT-PCR identifiziert. Hierzu wird die RNS zunächst auf 65 °C für 10 Minuten erhitzt, mit Random-Primern nach Herstellervorschrift (cDNA Cycle™ Kit, Invitrogen) und bei 25 °C für 15 min inkubiert. Nach Zugabe der Retrotranskriptase, den Nukleotiden und des Puffers wird die cDNS-Synthese bei 42 °C für eine Stunde durchgeführt. Nachfolgend wird eine PCR mit dem Standard-Primer Ml3-Primer und M13-reverse Primer und der neusynthetisierten cDNS durchgeführt (PCR-Bedingungen:
94 C für 20 sec, (94 °C für 20 sec, 50 °C für 1 min, 72 °C für 1 min 30 sec) x 35 Zyklen, 72 °C für 10 min). Die PCR- Produkte werden parallel anhand ihrer Größe über eine 1 %ige Agarosegelektrophorese überprüft.
Durch die RT-PCR und die Größenabschätzung der sekretierten RNS über die Agarosegelektrophorese lassen sich die sequenzzpezifischen RNS-Moleküle eindeutig charakterisieren und identifizieren.
In den Figuren 3a, b und c sind die Auftrennungen von PCR- Produkten in einer l%igen Agarosegelektrophorese dargestellt, die Testsequenzen aus dem Beispiel 3 (Fig. 3a = 1: Sequenz 1, 2: Sequenz 2, 3: Sequenz 3, M: Marker; Fig. 3b = M: Marker, 4: Sequenz 4; Fig. 3c = M: Marker, 5: Sequenz 5) aufweisen. Die seitlich angebrachten Pfeile markieren die Laufhöhe von 1,6 und 1 Kilobasen bzw. 1 und 0,5 Kilobasen großen Nukleinsäuremolekülen.
Identifizierung der sekretierten RNS "natürlichen Ursprungs" durch Sequenzierung Die sekretierte RNS "natürlichen Ursprungs" wird nach der Gelfiltration und/oder Ethanolfällung bzw. Phenol/Chlo- rophorm-Extraktion durch Sequenzierung identifiziert. Hierzu wird die RNS zunächst auf 65 °C für 10 Minuten erhitzt, mit Random-Primern nach Herstellervorschrift (cDNA Cycle™ Kit, Invitrogen) und bei 25 °C für 15 Minuten inkubiert. Nach Zugabe der Retrotanskriptase, der Nukleotide und des Puffers wird die cDNS-Synthese bei 42°C für ein Stunde durchgeführt. Nachfolgend wird eine Rapid- Amplifikation von cDNS-Enden durchgeführt: Nach Ligation über Nacht eines 5 ' -phosphorylierten Ankers an die cDNS mit RNS-Ligase wird eine Verlängerung unter Verwendung des zum Anker komplementären Primers vorgenommen. An diese Reaktion schließt sich eine zweite Ligation mit einem 5'- phosphorylierten Anker an. Diese cDNS wird als Template für eine PCR benutzt, mit dem komplementären Anker als Primer [PCR-Bedingungen: 94 °C für 20 sec, (94 °C für 20 sec, 50 °C für 1 min, 72°C für 1 min 30 sec) x 35 Zyklen, 72 °C für 10 min]. Diese PCR-Produkte werden in einen pAdvantage™-Plasmid mit dem Advantage™ PCR Cloning Kit kloniert. Nach Ethanolfällung bzw. Phenol/Chlorophorm- Extraktion werden die PCR-Produkte über Nacht mit dem Plasmid nach Herstellervorschrift ligiert. ToplOF'- Bakterien werden mit dem Ligationsprodukt nach Herstellervorschrift transformiert. Plasmide mit Inserts werden aus transformierten Übernacht-Bakterien-Kulturen mit einem QiagenO-Miniprep Kit präpariert. 200 - 500 ng Plasmid werden in die anschliessende Sequenzierungsreaktion mit Standardprimern unter Verwendung eines PE Applied Biosy- stems Kit nach Herstellervorschrift eingesetzt. Die Sequenzen werden mit einem ABI PE 377 DNA Sequenzer gelesen. Die Erfinder konnten für RNS "natürlichen Ursprungs", die von B. subtilis sekretiert wird, in einem 112 bp langen Abschnitt Sequenzhomologien zur Gensequenz des ribosomalen Proteins L24 von B . subtilis feststellen. Die Gesamtlänge dieser untersuchten sekretierten RNS "natürlichen Ursprungs" beträgt 12-15 kb. Erste Hinweise liegen vor, wonach es sich bei dem sequenzierten Abschnitt um einen Teil einer polycistronischen mRNA handeln könnte, die von dem bakteriellen Operon SlO-spc-α transkribiert wird.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung von Ribonukleinsäure (RNS) gewünschter Sequenz, dadurch gekennzeichnet, daß es folgende Schritte umfaßt:
a) Bereitstellung von Mikroorganismen, vorzugsweise von Bakterien, in Kultur, die zur Sekretion von RNS in das extrazelluläre Medium fähig sind,
b) Isolierung und/oder Anreicherung der von den Mikroorganismen in das extrazelluläre Medium sekretierten RNS.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikroorganismen, vorzugsweise Bakterien, derart gentechnologisch modifiziert sind, daß diese die RNS mit gewünschter Sequenz produzieren.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß im Anschluß an den Schritt b) aus der RNS die Fraktion isoliert wird, die die gewünschte Sequenz aufweist.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß Schritt b) eine Gelfiltration, vorzugsweise mittels Sephacryl, umfaßt.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4 , dadurch gekennzeichnet , daß in dem Schritt a) Bakterien in Kultur bereitgestellt werden, die ausgewählt sind aus der Gruppe: Escherichia cσli-ToplOF ' , Escherichia coli-XLl, Escheri- chia σo!i-JM105, Escherichia colϊ-JM109, Bacillus subti2is-DSM2277, Bacillus sujbtilis-DSM618, Agrobacterium tumefaciens-OSK5172 r Agrobacterium tumefaciens- DSM30205, Pseudomonas putida-DSM548, sowie Stämme, die mit den vorstehend genannten Stämmen genetisch identisch sind oder genetische Varianten davon sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung von Bakterien in einem Medium erfolgt, das folgende Komponenten, angegeben in Gramm pro Liter, enthält: Na2HP04, 4-8; KHP04, 1-5; NaCl, 3-7; H9N204P, 0,5-7; MgS04, 0,3-0,8; CaCl2, 0,008-0,012; und eine weitere Komponente, die aus der Gruppe ausgewählt ist: Weizenstärke, Endkonzentration in dem Medium 8-12; Glyzerin, Endkonzentration in dem Medium 0,5-4; Saccharose, Endkonzentration in dem Medium 0,5-4; Mannitol, Endkonzentration in dem Medium 0,5-4; Maisstärke, Endkonzentration in dem Medium 0,5-4; und Glukose, Endkonzentration in dem Medium 0,5-4.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung von Bakterien in einem Medium erfolgt, das folgende Komponenten, angegeben in Gramm pro Liter, enthält: Na2HP04, 4-8; KHP04, 1-5; NaCl, 0,3-7; MgS04, 0,3-0,8; CaCl2, 0,008-0,012; Glukose, 0,5-4; und eine weitere Komponente, die aus der Gruppe ausgewählt ist: Hefeextrakt, Endkonzentration in dem Medium 3-7; Glutamat, Endkonzentration in dem Medium 3-7; Maissirup, Endkonzentration in dem Medium 3-7; und H9N204P, Endkonzentration in dem Medium 0,5-3.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung von Bakterien in einem Medium erfolgt, das folgende Komponeten, angegeben in Gramm pro Liter, enthält: Pepton, 5-15; Hefeextrakt, 1-10; NaCl 1-10.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Herstellung eines Arzneimittels.
10. Kit zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 9.
11. Kit nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß es einen nukleinsäuresekretierenden Mikroorganismus enthält.
12. Verwendung eines nukleinsäuresekretierenden Mikroorganismus zur Gewinnung von RNS gewünschter Sequenz aus extrazellulärem Medium.
13. Verwendung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus ein Bakterienstamm ist, der ausgewählt ist aus der Gruppe: Escherichia coli-ToplOF ' , Escherichia coli-XLl, Escherichia co!i-JM105, Escherichia coli- JM109, Bacillus subtilis-OSM2277 , Bacillus subtilis- " DSM618, Agrobacterium tumefaciens-OSM5l 2 , Agrobacterium turne faciens-DSM30205 , Pseudomonas putida-DSM548 , sowie Stämme, die mit den vorstehend genannten Stämmen genetisch identisch sind oder genetische Varianten davon sind.
14. Verfahren zur Identifizierung von nukleinsäuresekretierenden Mikroorganismen, das folgende Schritte umfaßt: a) Bereitstellung der zu untersuchenden Mikroorganismen in Kultur,
b) Untersuchung des extrazelluären Mediums der Kultur auf das Vorhandensein von Nukleinsäuren.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus mit einem für eine Testsequenz kodierenden Expressionsvektor transformiert und die Testsequenz im extrazellulären Medium nachgewiesen wird.
16. Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung von Bakterien in einem Medium erfolgt, das folgende Komponenten, angegeben in Gramm pro Liter, enthält: Na2HP04, 4-8; KHP04, 1-5; NaCl, 3-7; H9N204P, 0,5-7; MgS04, 0,3-0,8; CaCl2, 0,008-0,012; und eine weitere Komponente, die aus der Gruppe ausgewählt ist: Weizenstärke, Endkonzentration in dem Medium 8-12; Glyzerin, Endkonzentration in dem Medium 0,5-4; Saccharose, Endkonzentration in dem Medium 0,5-4; Mannitol, Endkonzentration in dem Medium 0,5-4; Maisstärke, Endkonzentration in dem Medium 0,5-4; und Glukose, Endkonzentration in dem Medium 0 , 5-4.
17. Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung von Bakterien in einem Medium erfolgt, das folgende Komponenten, angegeben in Gramm pro Liter, enthält: Na2HP04, 4-8; KHP04, 1-5; NaCl, 0,3-7; MgS04, 0,3-0,8; CaCl2, 0,008-0,012; Glukose, 0,5-4; und eine weitere Komponente, die aus der Gruppe ausgewählt ist: Hefeextrakt, Endkonzentration in dem Medium 3-7; Glutamat, Endkonzentration in dem Medium 3-7; Maissirup, Endkonzentration in dem Medium 3-7; und HgN204P, Endkonzentration in dem Medium 0,5-3.
18. Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung von Bakterien in einem Medium erfolgt, das folgende Komponenten, angegeben in Gramm pro Liter, enthält: Pepton, 5-15; Hefeextrakt, 1-10; NaCl, 1-10.
19. Kit zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 14 bis 18, mit einem für die Testsequenz kodierenden Expressionsvektor.
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009063969A1 (ja) * 2007-11-14 2009-05-22 National University Corporation Toyohashi University Of Technology Ｒｎａ製造方法及びプロモーター
US20150064771A1 (en) * 2011-08-12 2015-03-05 Mello Biotechnology, Inc. Inducible gene expression composition for using eukaryotic pol-2 promoter-driven transcription in prokaryotes and the applications thereof
US20150132805A1 (en) * 2012-08-10 2015-05-14 Mello Biotech Taiwan Co., Ltd. Composition for producing microrna precursors as drugs for enhancing wound healing and production method of the microrna precursors
WO2017025120A1 (en) 2015-08-07 2017-02-16 Curevac Ag Process for the in vivo production of rna in a host cell
WO2018179834A1 (en) * 2017-03-28 2018-10-04 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing rna

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HARA T ET AL: "RNA PRODUCTION BY BACILLUS-MESENTERICUS-NIGER" JOURNAL OF FERMENTATION TECHNOLOGY, Bd. 59, Nr. 5, 1981, Seiten 341-346, XP008007596 ISSN: 0385-6380 *
KOLODNY G M ET AL: "SECRETION OF RNA BY NORMAL AND TRANSFORMED CELLS" EXPERIMENTAL CELL RESEARCH, Bd. 73, Nr. 1, 1972, Seiten 65-72, XP008007484 ISSN: 0014-4827 *

Cited By (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009063969A1 (ja) * 2007-11-14 2009-05-22 National University Corporation Toyohashi University Of Technology Ｒｎａ製造方法及びプロモーター
JPWO2009063969A1 (ja) * 2007-11-14 2011-03-31 国立大学法人豊橋技術科学大学 Ｒｎａ製造方法及びプロモーター
US9637747B2 (en) * 2011-08-12 2017-05-02 Mello Biotechnology, Inc. Inducible gene expression composition for using eukaryotic pol-2 promoter-driven transcription in prokaryotes and the applications thereof
US20150118734A1 (en) * 2011-08-12 2015-04-30 Mello Biotechnology, Inc. Inducible gene expression composition for using eukaryotic pol-2 promoter-driven transcription in prokaryotes and the applications thereof
US20150064771A1 (en) * 2011-08-12 2015-03-05 Mello Biotechnology, Inc. Inducible gene expression composition for using eukaryotic pol-2 promoter-driven transcription in prokaryotes and the applications thereof
US9783811B2 (en) * 2011-08-12 2017-10-10 Mello Biotechnology, Inc. Inducible gene expression composition for using eukaryotic pol-2 promoter-driven transcription in prokaryotes and the applications thereof
US20150132805A1 (en) * 2012-08-10 2015-05-14 Mello Biotech Taiwan Co., Ltd. Composition for producing microrna precursors as drugs for enhancing wound healing and production method of the microrna precursors
US10196662B2 (en) * 2012-08-10 2019-02-05 Mello Biotechnology, Inc. Composition for producing microRNA precursors as drugs for enhancing wound healing and production method of the microRNA precursors
WO2017025120A1 (en) 2015-08-07 2017-02-16 Curevac Ag Process for the in vivo production of rna in a host cell
EP3699288A1 (de) 2015-08-07 2020-08-26 CureVac AG Verfahren zur in-vivo-herstellung von rna in einer wirtszelle
WO2018179834A1 (en) * 2017-03-28 2018-10-04 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing rna
CN110494567A (zh) * 2017-03-28 2019-11-22 味之素株式会社 生产rna的方法
US11046986B2 (en) 2017-03-28 2021-06-29 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing RNA
US11884951B2 (en) 2017-03-28 2024-01-30 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing RNA

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