WO2001068900A2 - Verfahren zum spezifischen nachweis von mikroorganismen durch polymerase-kettenreaktion - Google Patents

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WO2001068900A2
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria

Definitions

  • the invention relates to a method for the specific detection of microorganisms, in particular for differentiating them from closely related microorganisms, in a sample by means of polymerase chain reaction (PCR).
  • PCR polymerase chain reaction
  • the invention relates to a method for the specific detection of microorganisms of the genus Listeria below the species level as well as primers which can be used in this method.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the prerequisite for the specific detection of a microorganism by PCR is that these specific areas of a microbial genome, in particular the areas in which the primers are annealed, are unique, that is, they are only contained in the group of microorganisms to be detected or the microorganism to be detected.
  • the DNA of a closely related microorganism often shows only a slight deviation in the form of one or two bases from the target DNA sequence of the microorganism to be detected.
  • the primers used have only weak base mismatches with the DNA of closely related non-target microorganisms and therefore also provide amplificates with the DNA of these organisms.
  • weak base mismatches in the middle of the region to be bound or at the 5 'end of the primer are disadvantageous for a specific detection, since a complete binding of the primer to the target site is not necessary when the 3' end of the primer is extended.
  • the primer in the case of a base mismatch in the 5 'region or in the middle region of the primer, the primer can only bind partially, but can still be extended at the 3' end, since it is immaterial whether the end not to be extended is at the 5 'end binds or does not bind to the target region and thus stands out.
  • Such a method is particularly desirable for the detection of microorganisms in which the individual closely related species or strains have different properties, such as different virulence.
  • Listeria monocytogenes species eg Munk et al, Microb. Pathogen., 5 (1988), 49.
  • the genus Listeria is traditional Definition from Gram-positive, Catalase-positive, Oxidase-negative rods that are movable at 20 ° C. Using 16S rRNA sequences it was shown that they can be assigned phylogenetically to the Gram-positive bacteria with a low GC content. Listeria are characterized by an ubiquitous way of life and can therefore be isolated in large numbers from environmental samples of different origins and from food (eg Geuenich et al., Zbl. Bakt. Hyg., 179 (1984), 266-273).
  • L. monocytogenes While infection with L. monocytogenes is asymptomatic in most cases, or presents with mild flu-like symptoms such as fever or When vomiting occurs, serious complications can occur in infants and pregnant women, pregnant women or immunosuppressed people, such as transplant, cancer or HIV patients, due to dissemination of the pathogen in the body (e.g. Albritton et al, Clin. Invest. Med., 7 ( 1984)). In this connection, blood poisoning and infections with the liver and spleen are often observed. Since L.
  • monocytogenes can cross both the blood-brain barrier and the placental barrier, the pathogens also cause brain diseases such as meningitis and encephalitis and, in the case of transplacental infection, also severely damage the fetus, whose immature defense system prevents the listeria from spreading allows.
  • the most frequently described disease of the unborn child is granulomatosis infantiseptica, which is associated with widespread abscesses in the liver, kidneys, lungs, spleen, brain and skin of the embryo (e.g. Southwick et al, N. Eng. J. Med ., 334 (1996), 770-776). In pregnant women, infection with L. monocytogenes therefore results in the first
  • the infection cycle of L. monocytogenes is regulated by the complex interaction of numerous virulence genes.
  • the bacteria After adhesion to the eukaryotic host cell, the bacteria - even from non-professional phagocytic cells (e.g. epithelial cells, hepatocytes; Gaillard et al., Inf. Imm., 55 (1987), 2822-2829) - actively absorbed and are then located within a vacuole in the host cell.
  • This first step of the invasion is initiated by a number of different proteins, the internalins (inl) and p60, which is encoded by the invasion associated protein (iap) gene (Gaillard et al., Cell, 65 (1991), 1 127- 1 141).
  • Listeriolysin O a hemolysin, caused by the destruction of the vacuole in which the listeria are after infection, a release of the bacteria into the cytosol of the host cell.
  • the ActA enzyme polymerizes host cell-specific actin monomers predominantly on one pole of the bacterial cells, which results in a propeller-like effect for the bacteria. Through this "comet's tail" they move with one
  • the infection cycle is then closed by a phosphatidylcholine and a phosphatidylinositol-specific phosphophase C (PC-PLC, plcA, PI-PLC, plcB) which, in addition to listeriolysin O, destroy the double membrane.
  • PC-PLC, plcA, PI-PLC, plcB phosphatidylinositol-specific phosphophase C
  • Enrichment media Listeria must be isolated and then brought into pure culture (Lovett et al., Assoc. Off. Anal. Chem., 71 (1988), 658-660). Listeria pure cultures are also necessary for the serologically and biochemical methods which are also conventionally used, so that this evidence requires a time expenditure of up to 4 weeks.
  • phage typing e.g. Bannerman et al., Int. J. Food Microbiol., 31 (1996), 245-262
  • RFLP restriction fragment length polymorphism; e.g. Saito et ed., Microbiologica, 21 (1998), 87-92
  • MEE multilocus enzyme electrophoresis; Flint et al., Int. J. Food Microbiol., 31 (1996), 349-355
  • the interaction of listeria with lectins Finnelli et al., J. Clin.
  • PFGE pulsed field gel electrophoresis
  • monocytogenes is transformed with a vector in which the exclusively intracellularly activated promoter of the actA gene is cloned in front of a gene whose gene product is to be immunized, so that the gene can only be expressed within the host cells.
  • the gene of a phage lysine directed against Listeria which, also expressed intracellularly, induces the lysis of the bacteria and thus on the one hand prevents the spread of the pathogens in the body and on the other hand causes the release of the entire bacterial DNA.
  • This DNA can integrate into the genome of the host cells and also into antigen-presenting cells, whereupon it is expressed there and thus triggers an immune response in the body.
  • microorganisms can be detected and can also be distinguished from very closely related microorganisms, for example microorganisms of the same type, in particular L. monocytogenes, and also the advantages of PCR, in particular to use the fast and reproducible applicability even in complex samples. Further objects of the invention will become apparent from the following description. These objects are achieved by the subject matter of the independent claims, in particular based on the use of competitor primers described below in the detection method by PCR.
  • Reaction primers are used for non-target microorganisms specific primers (hereinafter referred to as competitor primers).
  • the reaction and competitor primers which are used in the method according to the invention are preferably developed on the basis of structural and / or functional genes of the microorganisms, these genes having both species-specific regions and strain-specific regions.
  • the competitor primers have an essential feature at the 3 'end of a dideoxynucleotide instead of the deoxynucleotide, thereby preventing chain extension by the polymerase. If these competitor primers with a sequence which is complementary to the non-target microorganisms are added to the reaction mixture, they bind to the non-target microorganisms with a higher specificity than the reaction primers. This prevents the reaction primers from attaching to the DNA of the non-target microorganisms and thus preventing the amplification of this DNA.
  • the method according to the invention enables the detection of microorganisms and their differentiation from closely related microorganisms, in particular the differentiation of different strains of the same type of microorganism, possible, in order to increase the stringency a temperature increase over the temperature range, which is necessary for the binding of the specific primer to its target region, is not necessary. This avoids that the binding of the specific primer to the target region is weakened by an increase in temperature and successful PCR amplification is therefore not possible. Furthermore, weak base mismatches can also be discriminated by the method according to the invention. Furthermore, base mismatches that are located in the center of the target region or at the 5 'end of the primer can be discriminated.
  • the method according to the invention can in particular for the specific detection of listeria also below the species level, i.e. at stem level.
  • species level i.e. at stem level.
  • a first step in the molecular biological strain differentiation of L. monocytogenes is the comparative sequence analysis of suitable genes or the corresponding proteins.
  • the 16S ribosomal RNA which has ideal properties for phylogenetic studies (Woese, Microbiol. Rev., 51 (1987), 221- 271), generally does not allow a distinction below the species level, since there are usually hardly any sequence differences.
  • RNA Have tribes One possibility to differentiate also within the species L. monocytogenes is the comparative analysis of structural and / or functional genes and, in the case of pathogenic microorganisms, in particular of virulence genes (Rasmussen et al, supra), which show increased variability within the individual compared to RNA Have tribes.
  • iap gene which codes for the protein p60
  • prfA gene which is a regulator of the virulence genes
  • the plcA gene which encodes the protein PC-PLC (phosphatidylcholine-specific phospholipase C)
  • the plcB gene which codes for the protein PI-PLC (phosphatidylinositol-specific phospholipase C)
  • the actA gene which codes for the protein ActA (actin-polymerizing Enzyme) encoded, as well as the hlyA gene, which codes for listeriolysin (hemolysin), which causes the destruction of the vacuole of the host cell.
  • Another essential object of the present invention are the DNA primers described above, which have been developed on the basis of structural and / or functional genes of the microorganisms, in particular of Listeria, the genes having both species-specific areas and strain-specific areas.
  • reaction and competitor primers according to the invention for the detection of I / sterz ⁇ microorganisms below the species level have been developed in particular on the basis of structural and / or functional genes from Listeria, comprising iap, prfA, plcA, plcB, actA and hlyA.
  • the iap gene from L. monocytogenes is used for the development of the primers according to the invention because, due to its structure, which also has highly variable regions in addition to conserved regions, it is also an ideal molecule for distinguishing microorganisms of the genus Listeria is below the species level.
  • the protein p60 encoded by the iap gene is present in all species of the genus Listeria and is present extracellularly in large quantities in Listeria cultures. It is also bound to the cell membrane in small amounts (Ruhland et al, J. Gener. Microbiol, 139 (1993), 609-616). Based on SDS polyacrylamide The size determined by gel electrophoretic separation is 60 kDa, while the theoretically determined size of the processed protein is significantly smaller at 47.5 kDa (Köhler et al, Inf. Imm., 58 (1990), 1943-1950). This observation is due to the change in the rate of migration of p60 in the electric field due to the high isoelectric point of around 9.5 (Köhler et al, supra). The cause of the high isoelectric point is the large number of positively charged amino acids, especially lysine and arginine.
  • p60 in the infection cycle of the bacteria lies - together with the internalins - in the adhesion of the bacteria to the host cell. Because of its additional activity as essential murein hydrolase, p60 is also involved in later steps of cell division and is therefore of additional importance as housekeeping protein (Wuenscher et al, J. Bacteriol, 175 (1993), 3491-3501). Listeria mutated in the iap gene, so-called down mutants, only express a small amount of p60 and, as filamentous forms that are separated from one another only by septa, show a distinctly changed morphology.
  • Such mutants so-called R mutants due to their changed colony physiology, are avirulent (Köhler et al, supra; Bubert et al, supra) and can be broken down into different cell lines in the cell culture model, e.g. non-phagocytic 3T6 mouse fibroblasts do not penetrate.
  • variable areas can be found in the species L. monocytogenes and L. innocua, which have a recurring sequence of threonine-asparagine (TN) units, separated by a PSK (Pro-Ser-Lys) motif , The variable ranges differ in the number of TN units and thus allow a strain differentiation of the type L. monocytogenes due to the associated length polymorphisms of the iap gene coding for the p60 protein.
  • TN threonine-asparagine
  • the method according to the invention is illustrated in the following using the example of the detection of Z / ster / ⁇ -microorganisms, but it can be carried out correspondingly for all types of microorganisms by the person skilled in the art.
  • the iap gene from 34 different L. monocytogenes strains was analyzed. On the basis of the data obtained, a database was created in which, in addition to the iap sequences of 34 L. monocytogenes strains, the complete iap sequences of L. gr ⁇ yi, L. welshimeri, L. innocu ⁇ , L. ivanovii and four Strains of the species L. seeligeri were included.
  • the iap gene was able to assign the L. monocytogenes strains to three distinct groups in a clear and stable manner. These groups are referred to below as clusters or genovars (see Figure 2).
  • the DNA of a L. monocytogenes strain could also be identified in a DNA mixture. Since the clustering of the L. monocytogenes strains very likely correlates with differences in virulence, the competitor PCR according to the invention can be used to detect listeria as quickly as possible, and on the other hand the virulence of the germ causing the symptoms of a patient can be estimated. This leads to a significant relief in the diagnosis and therapy of corresponding diseases.
  • the primers according to the invention can thus be used in a further aspect of the present invention for the diagnosis of bacterial infections, in particular Listeria infections.
  • an in-vitro method for DNA amplification which differs from the previously known PCR methods by the possibility of distinguishing microorganisms even below the species level.
  • the development of Genovar-specific primers for the species L. monocytogenes is based on the creation of an extensive iap database. L. monocytogenes isolates can thus be assigned to one of the three genovars described above. Based on the extensive iap sequence analysis of various L. monocytogenes isolates, four sites within the iap gene were determined in the present invention which are suitable for the development of specific primers for each genovar. Table 1 below shows the PCR reaction primers according to the invention developed on the basis of the alignment:
  • the invention also includes primers which differ from the primers listed in the table in up to three bases, but nevertheless ensure specific hybridization and amplification.
  • the primers Due to the high similarity of the iap sequences between the three L. mottocytogenes development lines determined, the primers often have only a few and weak base mismatches to the corresponding binding regions of the respective non-target clusters and therefore lead to the formation of non-specific PCR products with the DNA of the corresponding tribes. In order to counter this problem, competitor primers were used in the method according to the invention which none
  • the invention also includes primers which differ from the primers listed in Table 2 in up to three bases, but which nevertheless ensure specific competition.
  • the following examples serve to illustrate the present invention without restricting it in any way.
  • Example 1 Detection of the three genovars of the Listeria monocytogenes strains
  • Oligonucleotides are used which contain a dideoxynucleotide at their 3 'end instead of the deoxynucleotide. This prevents chain extension of these competitor primers. Since chemical synthesis of an oligonucleotide which is terminated at the 3 'end by a dideoxynucleotide is not possible, the competitor primers according to the invention were produced biochemically by enzymatic labeling. Here, ddNTPs labeled or unlabeled by digoxygenin were added to the 3 'end of the oligonucleotide using terminal transferase. The following solutions were used:
  • the reaction mixture was mixed carefully, incubated for 15 min at 37 ° C. and then immediately cooled on ice. To stop the reaction, 2 ⁇ l stop solution and 2.5 ⁇ l 4 M LiCl were then added. To precipitate the products, 75 ⁇ l of ethanol were added and these were precipitated for at least 2.5 hours or overnight at ⁇ 20 ° C. The oligonucleotides were then centrifuged for 30 min at 14000 ⁇ m and 4 ° C. and washed with 150 ⁇ l 70%> ethanol. The precipitated and washed competitors were dried in vacuo (SpeedVac, Bachofer, Reutlingen), taken up in 100 ⁇ l H 2 O re ⁇ st and stored at -20 ° C.
  • vacuo SpeedVac, Bachofer, Reutlingen
  • the efficiency of the PCR is among others depending on the concentration of the amount of template used. To determine the optimal concentration, the PCR reactions were carried out with varying DNA concentrations of 10 to 1000 ng / ⁇ l (10, 20, 50, 100, 500 and 1000 ng / ⁇ l) and with undiluted DNA. A DNA concentration of 50 ng / ⁇ l proved to be optimal for the detection of the DNA of the microorganisms of all three clusters.
  • the specificity of the reactions is furthermore in the case of competitor PCR due to the correct concentration ratio of the competitors used to those used Reaction primers conditional.
  • concentration ratio of the competitors used to those used Reaction primers conditional.
  • at least 3 pmol of each individual competitor for 50 ⁇ l reaction mixture and 15 pmol of each PCR primer were necessary under the chosen conditions.
  • test series were also carried out in this context to determine the optimum MgCl 2 concentration in the reaction mixture After comparing the PCR bands from a MgCl 2 series with 15, 20, 25, 30, 35 and 40 mM MgCl 2, 40 mM very high MgCl concentration gave optimal results for the detection of the DNA of microorganisms of clusters I and II In contrast, a specific detection of the DNA of microorganisms of cluster III was only possible with a MgCl concentration of 25 mM.
  • the elongation times which were also optimized in several PCR experiments, were 20 seconds for the specific detection of the DNA of microorganisms of the cluster I, 15 seconds for the specific detection of the DNA of the microorganisms of the cluster II and 40 seconds for the specific detection of the DNA of the microorganisms of the cluster III.
  • the annealing temperatures and elongation times mentioned relate to the use of a capillary PCR device (Rapid Cycler Idaho Technologies, Idaho Falls, U.S.A.).
  • Figure 3 shows an example of the gel electrophoretic separation of PCR reactions for the specific detection of the DNA of microorganisms of cluster I with or without the competitors according to the invention, which shows this fact. It is without the use of the invention
  • Competitors found a weak non-specific band with non-target organisms (lane 10). When using competitors (see Table 2) the formation of this PCR product could be suppressed (lane 5). An increase in the annealing temperature alone did not achieve the desired success, since the formation of specific products was also inhibited at too high temperatures (not shown in Figure 3).
  • the following approach was carried out with a capillary PCR device (Rapid Cycler Idaho Technologies). MgCl and lOx BSA were also purchased from Rapid Cycler Idaho Technologies. The deoxynucleotide triphosphates used were from Pharmacia (Uppsala, Sweden) and the polymerase was obtained from Promega (Madison, USA).
  • Primer-R (15 pmol) l ul each 3 pmol competitor primer x ul
  • PCR The PCR. Products obtained were separated from the other components of the PCR reaction, such as primer, polymerase and buffer system, using the PCR purification kit (Qiagen, Hilden, Germany) for use as a template for the sequencing reaction. This purification is based on a column chromatographic separation. All buffers and reagents were included in the kit and were used in accordance with the enclosed manual. The concentration of the nucleic acid solutions (Clark and Swika, 1977) was determined in the spectrophotometer (Beckmann DU 650, Kunststoff).
  • the samples to be examined were mixed with application buffer before electrophoresis.
  • the nucleic acids were separated at a current of about 130 mA and at a maximum of 150 V voltage for about 1 to 2 hours.
  • the gel was then stained (10 ⁇ g ethidium bromide / ml H 2 O, 20 minutes, room temperature) and subsequently washed (10 minutes, room temperature).
  • the results were documented using a video documentation system (Cybertech CS-1 Image Documentation System) under UV radiation (302 nm, Bachofer transilluminator, Reutlingen) and the associated image capture computer (ICC / 4).
  • DNA gel extraction kit Boehringer, Mannheim, Germany
  • Figures Figure 1 Schematic structure of the iap gene, total length: 1454 bp for L. monocytogenes EGD.
  • Figure 2 According to the Neighbor Joining method (Woese, supra) iend gene developed dendrogram of all Listeria species based on nucleic acid sequences, including 34 L. monocytogenes strains; without using a filter.
  • Figure 3 Specific PCR for cluster I; Lanes 1, 6 and 1 1: length standard; Lanes 2 and 7: negative control without DNA; Lanes 3 and 8: positive control with L. monocytogenes sv 4ab; Lanes 4 and 9: detection of L. monocytogenes sv 4ab from a mixture with 5 other strains of other clusters; Lanes 5 and 10:

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum spezifischen Nachweis von Mikroorganismen und zu deren Unterscheidung von nahe verwandten Mikroorganismen in einer Probe durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zum spezifischen Nachweis von Mikroorganismen der Gattung Listeria unterhalb der Artebene sowie Primer, die bei diesem Verfahren eingesetzt werden können.

Description

Verfahren zum spezifischen Nachweis von Mikroorganismen durch Polymerase-Kettenreaktion
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum spezifischen Nachweis von Mikroorganismen, insbesondere zu deren Unterscheidung von nahe verwandten Mikroorganismen, in einer Probe durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zum spezifischen Nachweis von Mikroorganismen der Gattung Listeria unterhalb der Artebene sowie Primer, die bei diesem Verfahren eingesetzt werden können.
Durch das Verfahren der Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR; Saiki et al., Science, 293 (1988), 487-491) werden enzymatisch in vitro spezifische DNA-Bereiche amplifiziert. Diese Amplifizierung erfolgt durch eine Reihe von unterschiedlichen Temperatur-Zeitzyklen, die die Denaturierung der DNA, das Anlagern der Primer (Annealing), die Elongationsphase durch eine DNA- abhängige DNA-Polymerase und eine abschließende Elongation umfassen. Mittels der PCR können bestimmte Bereiche eines mikrobiellen Genoms, die für eine Gruppe oder eine Art von Mikroorganismen spezifisch sind, amplifiziert werden. Der Nachweis dieses Amplifikats zeigt, daß die DNA des Mikroorganismus tatsächlich in der untersuchten Probe vorhanden war.
Voraussetzung für den spezifischen Nachweis eines Mikroorganismus durch PCR ist jedoch, daß diese bestimmten Bereiche eines mikrobiellen Genoms, insbesondere die Bereiche, in denen das Annealing der Primer erfolgt, einmalig sind, also nur in der nachzuweisenden Mikroorganismengruppe oder dem nachzuweisenden Mikroorganismus enthalten sind. Häufig weist jedoch die DNA eines nahe verwandten Mikroorganismus von der DNA-Zielsequenz des nachzuweisenden Mikroorganismus nur eine geringe Abweichung in Form von ein oder zwei Basen auf. Somit ergibt sich häufig das Problem, daß die verwendeten Primer nur schwache Basenfehlpaarungen zur DNA nahe verwandter Nicht-Zielmikroorganismen besitzen und deshalb auch mit der DNA dieser Organismen Amplifikate liefern. Üblicherweise wurde bislang versucht, nahe verwandte Mikroorganismen während des Nachweisverfahrens dadurch zu diskriminieren, daß die Bedingungen während der PCR stringenter eingestellt werden, beispielsweise durch eine Temperaturerhöhung während der Annealing-Phase. Bei einer erhöhten Temperatur bindet dann der Primer nur an die spezifische Zielregion, nicht aber an die DNA- Region, die ein oder zwei Basen Fehlpaarungen im Vergleich zur DNA-Zielregion besitzt. Nachteilig an einer derartigen Temperaturerhöhung ist jedoch, daß auch die Bindung des Primers an die spezifische DNA-Zielregion geschwächt wird und dadurch eine Amplifikation des DNA-Zielbereiches verhindert werden kann.
Ferner sind schwache Basenfehlpaarungen in der Mitte des zu bindenden Bereichs oder am 5 '-Ende des Primers für einen spezifischen Nachweis nachteilig, da bei der Verlängerung des 3 '-Endes des Primers ein vollständiges Binden des Primers an die Zielstelle nicht notwendig ist. So kann beispielsweise bei einer Basenfehlpaarung im 5'-Bereich oder im mittleren Bereich des Primers der Primer zwar nur teilweise binden, aber trotzdem am 3 '-Ende verlängert werden, da es unerheblich ist, ob das nicht zu verlängernde Ende am 5 '-Ende an die Zielregion bindet oder nicht bindet und damit absteht.
Somit ist es eine wesentliche Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem Mikroorganismen durch PCR-Reaktion hochspezifisch und schnell nachgewiesen und dabei auch von naheverwandten Mikroorganismen unterschieden werden können. Ein derartiges Verfahren ist insbesondere zum Nachweis von Mikroorganismen wünschenswert, bei denen die einzelnen nahe verwandten Arten bzw. Stämme unterschiedliche Eigenschaften, wie zum Beispiel eine unterschiedliche Virulenz, aufzeigen.
So werden beispielsweise für einzelne Stämme der Art Listeria monocytogenes bedeutende Unterschiede in der Virulenz postuliert (z.B. Munk et al, Microb. Pathogen., 5 (1988), 49). Die Gattung Listeria besteht nach herkömmlicher Definition aus bei 20°C beweglichen Gram-positiven, Katalase-positiven, Oxidase- negativen Stäbchen. Anhand von 16S-rRNA-Sequenzen wurde gezeigt, daß sie phylogenetisch den Gram-positiven Bakterien mit niedrigem GC-Gehalt zugeordnet werden können. Listerien zeichnen sich durch eine ubiquitäre Lebensweise aus und können somit zahlreich aus Umweltproben unterschiedlicher Herkunft sowie aus Lebensmitteln isoliert werden (z.B. Geuenich et al., Zbl. Bakt. Hyg., 179 (1984), 266-273).
Bislang sind sechs Arten der Gattung Listeria beschrieben, von denen L. ivanovü nur bei Tieren eine Listeriose hervorruft, während L. monocytogenes humanpathogen ist. Dagegen handelt es sich bei den vier weiteren Vertretern der Gattung, L. innocua, L. welshimeri, L. seeligeri und L. grayi um nicht-pathogene Organismen.
Als Vertreter der psychrotrophen „Kühlschrankflora" geht von L. monocytogenes ein erhebliches Infektionsrisiko bei gekühlten Lebensmitteln aus (Hof et al., The role of Listeria monocytogenes and other Listeria spp. in foodborne infections, 2nd world congress on foodborne infections and intoxifications, Berlin, 1986). Infektionserkrankungen, die von Listerien ausgelöst werden, sind deshalb häufig auf kontaminierte Nahrung, vor allem auf infiziertes Geflügel, Milchprodukte und rohes Gemüse zurückzuführen (z.B. Beckers et al., The occurence of Listeria in Food, In: Foodborne listeriosis, Behr-Verlag, Hamburg, 1989). Weitere Infektionswege sind Kontaminationen mit Listerien in Lebensmittel-verarbeitenden Betrieben (Nesbakken et al., Int. J. Food Microbiol., 31 (1996), 161 -171) und infizierte Tiere (Jensen et al. , Int. J. Food Microbiol, 32 (1996), 209-216). So wurde ein möglicher Infektionsweg über Kühe beschrieben, die aufgrund einer Listeriose die Symptome einer Mastitis entwickelten, wobei durch diese Infektion indirekt eine Kontamination der Milch hervorgerufen wird.
Während eine Infektion mit L. monocytogenes in den meisten Fällen asymptomatisch verläuft, oder sich in leichten grippeähnlichen Symptomen wie Fieber oder Erbrechen äußert, können bei Kleinkindern und Säuglingen, schwangeren Frauen oder immunsupprimierten Personen, wie beispielsweise Transplantations-, Krebsoder HIV-Patienten, aufgrund einer Dissemination der Erreger im Körper schwere Komplikationen auftreten (z.B. Albritton et al, Clin. Invest. Med., 7 (1984)). In diesem Zusammenhang werden oftmals eine Blutvergiftung sowie Infektionen mit der Leber und Milz beobachtet. Da L. monocytogenes sowohl die Blut-Hirn- Schranke als auch die plazentale Barriere überwinden kann, rufen die Erreger außerdem Gehirnerkrankungen wie Meningitis und Encephalitis hervor und führen bei einer transplazentaren Infektion auch zu einer schweren Schädigung des Fötus, dessen unreifes Abwehrsystem die Ausbreitung der Listerien ermöglicht. Die dabei am häufigsten beschriebene Krankheit des ungeborenen Kindes ist die Granulomatosis infantiseptica, die mit verbreiteten Abszessen an Leber, Nieren, Lunge, Milz, Gehirn und der Haut des Embryo in Verbindung gebracht wird (z.B. Southwick et al, N. Eng. J. Med., 334 (1996), 770-776). Bei schwangeren Frauen führt eine Infektion mit L. monocytogenes daher in den ersten
Schwangerschaftsmonaten sehr wahrscheinlich zum Abort des Fötus, während es in späteren Phasen der Schwangerschaft zu Totgeburten kommen kann. Bei der Mutter verläuft die Infektion dagegen oft asymptomatisch oder äußert sich allenfalls in leichten grippalen Symptomen. Aus diesem Grund wird die Infektion meist nicht erkannt oder fehlgedeutet. Die konnatale Listeriose ist nach der Toxoplasmose die häufigste konnatale Infektion.
Insgesamt liegt die anhand von zahlreichen epidemiologischen Studien in den U.S.A. und in Europa ermittelte Letalität der Listeriosen bei symptomatischem Verlauf trotz Therapie bei 30% (Sizmur et al, Lancet, 1 (1988), 1167).
Der Infektionszyklus von L. monocytogenes wird durch das komplexe Zusammenwirken zahlreicher Virulenzgene reguliert. Nach Adhäsion an die eukaryontische Wirtszelle werden die Bakterien - auch von nicht professionell phagozytischen Zellen (beispielsweise Epithelzellen, Hepatozyten; Gaillard et al., Inf. Imm., 55 (1987), 2822-2829) - aktiv aufgenommen und befinden sich daraufhin innerhalb einer Vakuole in der Wirtszelle. Dieser erste Schritt der Invasion wird von einer Reihe verschiedener Proteine, den Internalinen (inl) und p60, das vom invasion associated protein (iap)-Gen kodiert wird, initialisiert (Gaillard et al., Cell, 65 (1991 ), 1 127-1 141 ). Listeriolysin O (LLO), ein Hämolysin, verursacht durch die Zerstörung der Vakuole, in der sich die Listerien nach der Infektion befinden, eine Freisetzung der Bakterien ins Cytosol der Wirtszelle. Dort findet durch das Enzym ActA eine Polymerisierung von wirtszelleigenen Actin-Monomeren vorwiegend an einem Pol der Bakterienzellen statt, woraus für die Bakterien eine propellerähnliche Wirkung resultiert. Durch diesen „Kometenschweif" bewegen sie sich mit einer
Geschwindigkeit von bis zu 1 μm/s durch die Wirtszelle und gelangen so auch an die Zellmembran, von wo aus sie durch die Bildung Pseudopodien-ähnlicher Strukturen in die benachbarten Zellen eindringen. In diesen sind sie dann von einer Doppelmembran umgeben. Der Infektionszyklus wird anschließend von einer Phosphatidylcholin- und einer Phosphatidylinositol-spezfischen Phosphohpase C (PC-PLC, plcA, PI-PLC, plcB) geschlossen, welche neben dem Listeriolysin O eine Zerstörung der Doppelmembran bewirken.
Bislang sind zur Charakterisierung von L. monocytogenes nur aufwendige Isolierungsprozeduren bekannt, bei der zumeist über verschiedene
Anreicherungsmedien Listerien isoliert und anschließend in Reinkultur gebracht werden müssen (Lovett et al., Assoc. Off. Anal. Chem., 71 (1988), 658-660). Für die ebenfalls herkömmlich verwendeten serologischen und biochemischen Verfahren sind ebenfalls Listerien-Reinkulturen notwendig, so daß diese Nachweise einen Zeitaufwand von bis zu 4 Wochen erfordern.
Zur Unterscheidung verschiedener L. monocytogenes Stämme wurden in den letzten Jahren u.a. in Studien der WHO zahlreiche weitere Verfahren entwickelt. Von besonderer Bedeutung ist dabei das Verfahren der Serotypisierung (z.B. Seeliger et al., Serotyping of Listeria monocytogenes and Related Species, in: T. Bergen and J.R. Norris (Hrsg.), Methods in Microbiology, Vol. 13, New York: Academic Press, 31-39, 1979; Schönberg et al., International Journal of Food Microbiology, 32 (1996), 279-287). Dieses Verfahren beruht auf der molekularbiologischen Analyse der O- und H-Antigene von L. monocytogenes und wird als Routinennachweis in diagnostischen Labors verwendet.
Allerdings konnte in einer Studie über die Zuverlässigkeit der Serotypisierung einige der untersuchten Stämme nicht immer eindeutig bestimmt werden (Schönberg et al., supra). So können mit diesem Verfahren bislang nur 13 L. monocytogenes-Subtypen differenziert werden. Da insbesondere der Serotyp 4b von epidemiologischem
Interesse ist, diese Gruppe aber sehr inhomogene Ausprägungen aufzuweisen scheint (Rasmussen et al., Microbiol., 141 (1995), 2053-2061 ; Schönberg et al., supra), ist in diesem Fall eine Kombination mit weiteren Subtypisierungsmethoden zur genaueren Differenzierung des Serovars 4b unumgänglich.
Weitere Methoden basieren auf dem Nachweis anderer genetischer oder phänotypischer Merkmale der einzelnen Stämme. Beispiele hierfür sind die Phagentypisierung (beispielsweise Bannerman et al., Int. J. Food Microbiol., 31 (1996), 245-262), RFLP (restriction fragment length polymorphism; z.B. Saito et ed., Microbiologica, 21 (1998), 87-92), MEE (multilocus enzyme electrophoresis; Flint et al., Int. J. Food Microbiol., 31 (1996), 349-355), die Interaktion von Listerien mit Lektinen (Facinelli et al., J. Clin. Microbiol, 32 (1994), 2929-2935) oder Nachweise von Produkten bestimmter Virulenzgene, die mit spezifischen Antikörpern detektiert werden (Friedrich et al., Nachweis von L. monocytogenes sowie des Genus Listeria mittels p60-spezifischen Antikörpern, Tagung: 36. Arbeitstagung des Arbeitsgebietes Lebensmittelhygiene, Garmisch-Partenkirchen, 26.-29. September 1995, S. 75-80, Offset Köhler KG (Hrsg.)).
Diese zahlreichen Möglichkeiten zur Differenzierung der einzelnen Stämme von L. monocytogenes liefern allerdings nicht immer übereinstimmende und aufgrund ihrer häufig auf instabilen phänotypischen Ausprägungen basierenden Verfahrensweise häufig schlecht reproduzierbare Ergebnisse. So sind im Stand der Technik bereits eine Reihe von Verfahren beschrieben, die zwischen L. monocytogenes-Slämmen differenzieren, eine Detektion aller bekannten Isolate dieser Art mit einer Methode ist allerdings nicht möglich.
Mit Hilfe der Phagentypisierung können zwar sehr viele verschiedene Phagentypen determiniert werden, es gibt jedoch zahlreiche Isolate, die mit keinem bislang verwendeten Phagenset hinreichend exakt bzw. überhaupt typisiert werden können. Ferner ist dieses Verfahren zahlreichen Schwankungen aufgrund der hohen
Variabilität der Phagen unterworfen und kann nur schlecht reproduziert werden.
Des weiteren sind auf genotypischen Ausprägungen basierende Verfahren bekannt, die allgemein den auf den Phänotyp gerichteten Praktiken bezüglich der Reproduzierbarkeit und Detektierbarkeit zahlreicher Stämme überlegen sind. Hier stellt die Pulsed Field-Gelelektrophorese (PFGE) ein nahezu ideales Mittel zur Stammunterscheidung von L. monocytogenes dar. Allerdings erfordert die PFGE ein relativ hohes Maß an gerätetechnischer Ausstattung und kann daher nicht in jedem Labor durchgeführt werden.
Des weiteren wird bislang in vielen Labors eine Unterscheidung von L. monocytogenes mit Hilfe von Restriktionsendonukleasen vorgenommen, mittels derer alle Listerien erfaßbar und unterscheidbar sind.
Allen diesen im Stand der Technik beschriebenen Verfahren ist gemeinsam, daß sie nur auf Listerien-Reinkulturen angewendet werden können und somit mit diesen Verfahren kein Schnellnachweis von Listerien in Umwelt- oder Lebensmittelproben möglich ist. Es ist jedoch insbesondere bei Patienten, die ein auf Listeriose hindeutendes Krankheitsbild erkennen lassen, von entscheidender Bedeutung, die Ursache der Krankheit möglichst schnell aufzuklären. Deshalb ist es eine wesentliche Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen, das einen stammspezifischen Nachweis von Listerien auch aus komplexen Proben erlaubt.
Als zeitsparende molekularbiologische Nachweisverfahren wurden in den letzten Jahren u.a. zahlreiche Variationen der Polymerasekettenreaktion (Vaneechoutte et al, Int. J. Syst. Bacteriol, 48 (1998), 127-139; Graham et al, Can. J. Microbiol, 42 (1996), 1 155-1162; Bubert et al, Appl. Environ. Microbiol, 58 (1992), 2625-2632; u.a.), Hybridisierungen auf Nukleinsäureebene und Proteinnachweise mit Hilfe spezifischer Antiköφer sowie unterschiedliche Methoden der Gelelektrophorese, wie beispielsweise die PFGE (z.B. Brosch et al., Int. J. Food Microbiol, 32 (1996), 343- 355), entwickelt.
Ferner sind bereits zahlreiche Untersuchungen über PCR-Nachweise zur Unterscheidung von Listerien und zur Identifizierung von L. monocytogenes aus komplexem Material bekannt (z.B. Wang et al., Appl. Environ. Microbiol, 58 (1992), 2872-2931). Von Interesse sind hierbei Methoden wie die rep-PCR (repetitive element sequence based PCR; Jersek et al., Journal of Clinical Microbiology, 37 (1999), 103-109), RAPD (random amplification of polymoφhic DNA; Wernars et al, Int. J. Food Microbiol, 32 (1996), 325-341) oder die auf RNA- Ebene durchgeführte NASBA-Technik (Nucleic Acid Sequence Based
Amplification; Uyttendaele et al, Int. J. Food Microbiol, 27 (1995), 77-89). Diese Techniken dienen allerdings nur zur Differenzierung der Art L. monocytogenes von den restlichen Arten der Gattung Listeria und können nicht zur Unterscheidung einzelner Stämme innerhalb der Art L. monocytogenes verwendet werden.
Folglich ist es eine weitere wesentliche Aufgabe der Erfindung, reproduzierbare und schnelle PCR- Verfahren zur Unterscheidung einzelner Stämme insbesondere innerhalb der Art L. monocytogenes zu entwickeln, da für diese Stämme bedeutende Unterschiede in der Virulenz postuliert werden (z.B. Munk et al, supra). Die stammspezifischen Unterschiede in der Virulenz von L. monocytogenes spielen ebenfalls eine wesentliche Rolle bei einem Impfverfahren, bei dem dem zu immunisierenden Patienten mit Hilfe sogenannter DNA-Träger die DNA des Organismus, gegen den er geimpft werden soll, inokuliert wird (Dietrich et al, Nature Biotechnology, 16 (1998), 181-185). Aufgrund der Fähigkeit zur intrazellulären Vermehrung kann L. monocytogenes als DNA-Träger verwendet werden. Bei dieser Methode wird L. monocytogenes mit einem Vektor transformiert, in dem der ausschließlich intrazellulär aktivierte Promotor des actA-Gens vor ein Gen kloniert ist, gegen dessen Genprodukt immunisiert werden soll, so daß das Gen nur innerhalb der Wirtszellen exprimiert werden kann. Ebenfalls unter der Kontrolle des actA-Promotors steht das Gen eines gegen Listerien gerichteten Phagenlysins, das, ebenfalls intrazellulär exprimiert, die Lyse der Bakterien induziert und damit zum einen die Verbreitung der Erreger im Köφer verhindert und zum anderen die Freisetzung der gesamten bakteriellen DNA bewirkt. Diese DNA kann in das Genom der Wirtszellen und auch in Antigen-präsentierende Zellen integrieren, woraufhin sie dort exprimiert wird und damit eine Immunreaktion des Köφers auslöst. Da über die Risiken dieser Methode noch nichts genaues bekannt ist, ist es von großer Bedeutung, zumindest das Risiko einer Sekundärinfektion durch die Trägerorganismen ausschließen zu können. Dafür ist eine genaue Kenntnis der Virulenz des verwendeten Stammes von L. monocytogenes wesentlich.
Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem Mikroorganismen nachgewiesen werden können und auch von sehr nahe verwandten Mikroorganismen, beispielsweise Mikroorganismen derselben Art, insbesondere von L. monocytogenes, unterschieden werden können und dabei ebenfalls die Vorteile der PCR, insbesondere die schnelle und reproduzierbare Anwendbarkeit auch in komplexen Proben, zu nutzen. Weitere Aufgaben der Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung. Diese Aufgaben werden durch die Gegenstände der unabhängigen Ansprüche, insbesondere basierend auf der Verwendung von nachstehend beschriebenen Kompetitor-Primern bei dem Nachweisverfahren durch PCR, gelöst.
Vorteilhafte Ausgestaltungen sind in den Unteransprüchen beschrieben.
Diese Aufgabe wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zum spezifischen Nachweis von Mikroorganismen und zu deren Unterscheidung von nahe verwandten Mikroorganismen in einer Probe durch PCR folgendermaßen gelöst: zusätzlich zu den für den Ziel-Mikroorganismus spezifischen Primern (im folgenden als
Reaktions-Primer bezeichnet) werden für Nichtziel-Mikroorganismen spezifische Primer (im folgenden als Kompetitor-Primer bezeichnet) eingesetzt. Vorzugsweise werden die Reaktions- und Kompetitor-Primer, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden, auf Basis von Struktur- und/oder Funktionsgenen der Mikroorganismen entwickelt, wobei diese Gene sowohl artspezifische Bereiche als auch stammspezifische Bereiche aufweisen.
Die Kompetitor-Primer weisen bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform als wesentliches Merkmal am 3 '-Ende ein Didesoxynukleotid an Stelle des Desoxynukleotids auf, wodurch eine Kettenverlängerung durch die Polymerase verhindert wird. Werden diese Kompetitor-Primer mit einer Sequenz, die komplementär zu den Nichtziel-Mikroorganismen ist, dem Reaktionsansatz zugegeben, so binden sie mit einer höheren Spezifität als die Reaktions-Primer an die Nichtziel-Mikroorganismen. Dadurch wird die Anlagerung der Reaktionsprimer an die DNA der Nichtziel-Mikroorganismen und somit die Amplifikation dieser DNA verhindert.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren ist der Nachweis von Mikroorganismen und deren Unterscheidung von nahe verwandten Mikroorganismen, insbesondere die Unterscheidung von verschiedenen Stämmen derselben Art eines Mikroorganismus, möglich, wobei zur Erhöhung der Stringenz eine Temperaturerhöhung über den Temperaturbereich, der für das Binden des spezifischen Primers an seine Zielregion notwendig ist, nicht erforderlich ist. Dadurch wird vermieden, daß durch eine Temperaturerhöhung die Bindung des spezifischen Primers an die Zielregion geschwächt wird und dadurch eine erfolgreiche PCR-Amplifikation nicht möglich ist. Ferner können durch das erfindungsgemäße Verfahren auch schwache Basenfehlpaarungen diskriminiert werden. Des weiteren können Basenfehl- paarungen, die sich in der Mitte der Zielregion bzw. am 5 '-Ende des Primers befinden, diskriminiert werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren, im folgenden auch als Kompetitor-PCR bezeichnet, kann insbesondere zum spezifischen Nachweis von Listerien auch unterhalb der Artebene, d.h. auf Stammebene, eingesetzt werden. So gibt es innerhalb der Art L. monocytogenes verschiedene Isolate, die bislang vor allem durch die Methode der Serotypisierung (beispielsweise Schönberg et al, supra) voneinander unterschieden werden konnten, und die wahrscheinlich bedeutende Unterschiede in der Virulenz zeigen.
Ein erster Schritt zur molekularbiologischen Stammunterscheidung von L. monocytogenes stellt die vergleichende Sequenzanalyse geeigneter Gene oder der entsprechenden Proteine dar. Die ribosomale 16S-RNA, die für phylogenetische Untersuchungen ideale Eigenschaften aufweist (Woese, Microbiol. Rev., 51 (1987), 221-271), ermöglicht in der Regel keine Unterscheidung unterhalb des Artniveaus, da hier meist kaum noch Sequenzunterschiede vorliegen.
Eine Möglichkeit, auch innerhalb der Art L. monocytogenes zu differenzieren, ist die vergleichende Analyse von Struktur- und/oder Funktionsgenen und bei pathogenen Mikroorganismen insbesondere von Virulenzgenen (Rasmussen et al, supra), die eine im Vergleich zur RNA erhöhte Variabilität innerhalb der einzelnen Stämme aufweisen. Geeignete Gene für die Entwicklung von Primern, auf deren Basis ein spezifischen Nachweis von L/ster/α-Mikroorganismen durch PCR auch unterhalb der Artebene möglich ist, sind das iap-Gen, welches für das Protein p60 codiert, das prfA-Gen, welches ein Regulator der Virulenzgene ist, das plcA-Gen, welches für das Protein PC-PLC (Phosphatidylcholin-spezifische Phospholipase C) codiert, das plcB-Gen, welches für das Protein PI-PLC (Phosphatidylinositol-spezifische Phospholipase C) codiert, das actA-Gen, welches für das Protein ActA (Aktin- polymerisierendes Enzym) codiert, sowie das hlyA-Gen, welches für Listeriolysin (Hämolysin) codiert, das die Zerstörung der Vakuole der Wirtszelle bewirkt.
Ein weiterer wesentlicher Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind somit die vorstehend beschriebenen DNA-Primer, die auf der Basis von Struktur- und/oder Funktionsgenen der Mikroorganismen, insbesondere von Listeria, entwickelt worden sind, wobei die Gene sowohl artspezifische Bereiche als auch stammspezifische Bereiche aufweisen.
Die erfindungsgemäßen Reaktions- und Kompetitor-Primer zum Nachweis von I/sterzα-Mikroorganismen unterhalb der Artebene sind insbesondere auf der Basis von Struktur- und/oder Funktionsgenen von Listeria, umfassend iap, prfA, plcA, plcB, actA und hlyA, entwickelt worden.
Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das iap-Gen aus L. monocytogenes zur Entwicklung der erfindungsgemäßen Primer herangezogen, da es aufgrund seiner Struktur, die neben konservierten Regionen auch hochvariable Bereiche aufweist, ein ideales Molekül zur Unterscheidung von Mikroorganismen der Gattung Listeria auch unterhalb des Artniveaus ist.
Das vom iap-Gen kodierte Protein p60 ist in allen Arten der Gattung Listeria vorhanden und liegt in Listerienkulturen in großen Mengen extrazellulär vor. In geringen Mengen ist es auch an die Zellmembran gebunden (Ruhland et al, J. Gener. Microbiol, 139 (1993), 609-616). Die anhand von SDS-Polyacrylamid- gelelektrophoretischer Auftrennung ermittelte Größe liegt bei 60 kDa , während die theoretisch bestimmte Größe des prozessierten Proteins mit 47,5 kDa bedeutend kleiner ist (Köhler et al, Inf. Imm., 58 (1990), 1943-1950). Diese Beobachtung ist auf die veränderte Wanderungsgeschwindigkeit von p60 im elektrischen Feld aufgrund des hohen isoelektrischen Punkts von etwa 9,5 zurückzuführen (Köhler et al, supra). Die Ursache des hohen isoelektrischen Punkts ist die große Anzahl positiv geladener Aminosäuren, insbesondere von Lysin und Arginin.
Die Bedeutung von p60 im Infektionszyklus der Bakterien liegt - zusammen mit den Internalinen - in der Adhäsion der Bakterien an die Wirtszelle. Aufgrund seiner zusätzlichen Aktivität als essentielle Mureinhydrolase ist p60 auch an späteren Schritten der Zellteilung beteiligt und ist damit als housekeeping-Protein von zusätzlicher Bedeutung (Wuenscher et al, J. Bacteriol, 175 (1993), 3491-3501). Im iap-Gen mutierte Listerien, sog. Down-Mutanten, exprimieren nur noch eine geringe Menge an p60 und zeigen als filamentöse Formen, die nur durch Septen voneinander getrennt sind, eine deutlich veränderte Moφhologie. Solche Mutanten, sog. R- Mutanten aufgrund ihrer veränderten Koloniemoφhologie, sind avirulent (Köhler et al, supra; Bubert et al, supra) und können im Zellkulturmodell in verschiedene Zelllinien, wie z.B. nicht-phagozytische 3T6-Mausfibroblasten nicht eindringen.
In diesen vorstehend genannten Studien wurden anhand von Sequenzanalysen einzelne Bereiche des p60-Proteins mit charakteristischen Merkmalen beschrieben (siehe Abbildung 1). So sind innerhalb dieses Proteins bei den Arten L. monocytogenes und L. innocua hochvariable Bereiche zu finden, die eine immer wiederkehrende Folge von Threonin-Asparagin (TN)-Einheiten, getrennt durch ein PSK (Pro-Ser-Lys)-Motiv, aufweisen. Die variablen Bereiche unterscheiden sich in der Anzahl der TN-Einheiten und erlauben somit eine Stammunterscheidung der Art L. monocytogenes aufgrund der damit verbundenen Längenpolymoφhismen des für das p60-Protein codierenden iap-Gens. Das N-terminale Signalpeptid sowie weitere Bereiche am N-Terminus und am C-Terminus sind dagegen hochkonserviert. Die entsprechenden DNA-Bereiche können somit zur Unterschiedung innerhalb der Gattung Listeria herangezogen werden. Die zentrale Domäne des iap-Gens der vier weiteren Arten der Gattung, L. welshimeri, L. seeligeri, L. ivanovii und L. grayi, umfaßt an Stelle der repetitiven TN-Einheiten eine 54 Aminosäuren lange Insertion (Bubert et al, supra).
Das erfindungsgemäße Verfahren wird im folgenden am Beispiel des Nachweises von Z/ster/α-Mikroorganismen veranschaulicht, es ist jedoch für sämtliche Arten von Mikroorganismen für den Fachmann ohne weiteres entsprechend durchführbar.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde das iap-Gen von 34 verschiedenen L. monocytogenes-Stämmen analysiert. Auf der Basis der gewonnen Daten wurde eine Datenbank erstellt, in die neben den iap-Sequenzen von 34 L. monocytogenes- Stämmen auf die vollständigen iap-Sequenzen von L. grαyi, L. welshimeri, L. innocuα, L. ivanovii und von vier Stämmen der Art L. seeligeri aufgenommen wurden. Dabei konnte anhand des iap-Gens eine eindeutige und stabile Zuordnung der L. monocytogenes-Stämme zu drei distinkten Gruppen vorgenommen werden. Diese Gruppen werden im folgenden als Cluster oder Genovare bezeichnet (siehe Abbildung 2).
Alle bislang bekannten L. monocytogenes-Stämme konnten einem der drei identifizierten Genovare zugeordnet werden, wobei hochvirulente Stämme bislang nur dem Cluster II zugeordnet werden konnten. Eine Abschätzung der Virulenz hinsichtlich der Cluster I und III kann noch nicht getroffen werden.
Die im Stand der Technik bekannten PCR-gestützten Nachweise für L. monocytogenes (z.B. Bubert et αl., supra; Deneer et αl., Appl. Environ. Microbiol, 57 (1991), 606-609; Graham et αl., supra) können nur auf artspezifischer Ebene angewendet werden und erlauben keine exaktere Differenzierung von L. monocytogenes-Stämmen. Auf der Basis der iap-Sequenzen der jeweiligen Stämme konnten nun überraschenderweise clusterspezifische Primer entwickelt werden, mit deren Hilfe eine spezifische Detektion der drei L. monocytogenes-C uster ermöglicht wurde. Damit ist durch die erfindungsgemäßen Primer eine Differenzierung nahe verwandter Stämme unterschiedlicher Cluster mittels einer cluster spezifischen PCR möglich.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren zum spezifischen Nachweis von Mikroorganismen und deren Unterscheidung von nahe verwandten Mikroorganismen in einer Probe konnte die DNA eines L. monocytogenes-Stammes auch in einem DNA-Gemisch identifiziert werden. Da die Clusterbildung der L. monocytogenes- Stämme sehr wahrscheinlich mit Virulenzunterschieden korreliert, können mit der erfindungsgemäßen Kompetitor-PCR auf schnellstem Wege zum einen Listerien nachgewiesen werden, und zum anderen kann die Virulenz des die Symptome eines Patienten verursachenden Keims abgeschätzt werden. Dies führt zu einer bedeutenden Erleichterung der Diagnose und Therapie entsprechender Krankheiten.
Somit können die erfindungsgemäßen Primer bei einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung zur Diagnose von bakteriellen Infektionen, insbesondere von Listeria-Infektionen, verwendet werden.
Erfindungsgemäß wird ein in v/tro-Verfahren zur DNA-Amplifikation bereitgestellt, das sich von den bisher bekannten PCR-Verfahren durch die Möglichkeit der Unterscheidung von Mikroorganismen auch unterhalb der Artebene unterscheidet. Die Entwicklung Genovar-spezifischer Primer für die Spezies L. monocytogenes, mittels derer auch unterhalb der Artebenen noch eine Differenzierung möglich ist, basiert auf der Erstellung einer umfangreichen iap-Datenbank. Damit lassen sich erfindungsgemäß L. monocytogenes-lsolate einem der drei vorstehend beschriebenen Genovare zuordnen. Aufgrund der umfangreichen iap-Sequenzanalyse verschiedener L. monocytogenes- Isolate wurden bei der vorliegenden Erfindung vier Stellen innerhalb des iap-Gens bestimmt, die für die Entwicklung spezifischer Primer für jedes Genovar geeignet sind. In der folgenden Tabelle 1 sind die anhand des Alignments entwickelten erfindungsgemäßen PCR-Reaktionsprimer aufgeführt:
Tabelle
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Auch von der Erfindung umfaßt sind solche Primer, die sich von den in Tabelle aufgeführten Primern in bis zu drei Basen unterscheiden, aber dennoch eine spezifische Hybridisierung und Amplifizierung gewährleisten.
Aufgrund der hohen Ähnlichkeit der iap-Sequenzen zwischen den drei ermittelten L. mottocytogenes-Entwicklungslinien weisen die Primer oft nur wenige und schwache Basenfehlpaarungen zu den entsprechenden Binderegionen der jeweiligen Nicht- Zielcluster auf und führen deshalb zur Bildung unspezifischer PCR-Produkte mit der DNA der entsprechenden Stämme. Um diesem Problem zu begegnen, wurden bei dem erfindungsgemäßen Verfahren Kompetitor-Primer eingesetzt, die keine
Basenfehlpaarung zu den entsprechenden Binderegionen der Nicht-Zielorganismen aufweisen. Ein wesentliches Merkmal dieser Kompetitoren ist ein Didesoxynukleotid an ihrem 3'-Ende. Binden nun die Kompetitoren an die entsprechende Binderegion der Nicht-Zielorganismen, wird die Bindungsstelle blockiert, und die PCR- Reaktionsprimer mit ihren schwachen Basenfehlpaarungen können nicht mehr unspezifisch binden. Eine Kettenverlängerung des Kompetitor-Primers ist aufgrund des 3'-Didesoxynukleotids nicht möglich. Die Bildung eines unspezifischen PCR- Produkts wird somit verhindert. Die Sequenzen der erfindungsgemäßen Kompetitor- Primer sind in Tabelle 2 aufgeführt, wobei K für G oder T, Y für C oder T, W für A oder T, und M für A oder C steht und die mit * markierten Basen Didesoxynukleotide sind. Bei den Kompetitor-Bezeichnungen bestimmt die römische Zahl vor dd (dd: Didesoxy) die Cluster, die mit Hilfe dieser Kompetitoren detektiert werden sollen, während die römische Zahl hinter dd für die Cluster steht, an welche die Kompetitoren binden sollen.
Tabelle 2
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Auch von der Erfindung umfaßt sind solche Primer, die sich von den in Tabelle 2 aufgeführten Primern in bis zu drei Basen unterscheiden, aber dennoch eine spezifische Kompetition gewährleisten. Die nachfolgenden Beispiele dienen der Erläuterung der vorliegenden Erfindung, ohne diese in irgendeiner Weise einzuschränken.
Beispiel 1 : Nachweis der drei Genovare der Listeria monocytogenes-Stämme
a) Enzymatische Markierung von Oligonukleotiden am 3'-Ende mittels terminaler Transferase Für die Durchführung der Kompetitor-PCR wurden als Kompetitor-Primer
Oligonukleotide eingesetzt, die an ihrem 3'-Ende an Stelle des Desoxynukleotides ein Didesoxynukleotid enthalten. Hierdurch wird eine Kettenverlängerung dieser Kompetitor-Primer verhindert. Da eine chemische Synthese eines Oligonukleotids, welches am 3 '-Ende durch ein Didesoxynukleotid abgeschlossen wird, nicht möglich ist, wurden die erfindungsgemäßen Kompetitor-Primer auf biochemischem Wege durch enzymatische Markierung hergestellt. Dabei wurden durch Digoxygenin markierte oder unmarkierte ddNTPs mittels terminaler Transferase an das 3 '-Ende des Oligonukleotids addiert. Dazu wurden die folgenden Lösungen verwendet:
- Terminale Transferase-Kit (Boehringer, Mannheim)
- Stoplösung: 0,2 M EDTA-Lösung (200 μl)
Glykogen (Sigma, Deisenhofen) (1 μl)
- Lithiumchlorid-Lösung (4 M LiCl)
Alle weiteren verwendeten Lösungen (CoCl2, Tailing Buffer) sind im Terminale Transferase-Kit enthalten. Der Reaktionsansatz hatte folgende Zusammensetzung:
Oligonukleotid lOO pmol
Tailing Buffer 4 μl
CoCl2 4 μl ddNTP (Boehringer,Mannheim) 1 μl
Terminale Transferase 1 μl (25 Einheiten)
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Der Reaktionsansatz wurde vorsichtig gemischt, für 15 min bei 37°C inkubiert und danach sofort auf Eis abgekühlt. Zum Beenden der Reaktion wurde anschließend 2 μl Stoplösung und 2,5 μl 4 M LiCl zugegeben. Zum Ausfällen der Produkte wurden 75 μl Ethanol zugegeben und diese für mindestens 2,5 Stunden oder über Nacht bei - 20°C gefällt. Anschließend wurden die Oligonukleotide für 30 min bei 14000 φm und 4°C zentrifugiert und mit 150 μl 70%> Ethanol gewaschen. Die gefällten und gewaschenen Kompetitoren wurden im Vakuum (SpeedVac, Bachofer, Reutlingen) getrocknet, in 100 μl H2Oreιπst aufgenommen und bei -20°C gelagert.
b) Durchführung der Kompetitor-PCR
Die Effizienz der PCR ist u.a. von der Konzentration der eingesetzten Menge an Template abhängig. Zur Bestimmung der optimalen Konzentration wurden die PCR- Reaktionen mit variierenden DNA-Konzentrationen von 10 bis 1000 ng/μl (10, 20, 50, 100, 500 und 1000 ng/μl) und mit unverdünnter DNA durchgeführt. Dabei erwies sich eine DNA-Konzentration von 50 ng/μl zum Nachweis der DNA der Mikroorganismen aller drei Cluster als optimal.
Die Spezifität der Reaktionen ist ferner im Falle der Kompetitor-PCR durch das richtige Konzentrationsverhältnis der eingesetzten Kompetitoren zu den eingesetzten Reaktionsprimern bedingt. Für eine spezifische Reaktion waren unter den gewählten Bedingungen mindestens 3 pmol jedes einzelnen Kompetitors für 50 μl Reaktionsansatz und 15 pmol jedes PCR-Primers notwendig.
Da neben der Annealingtemperatur auch die Konzentration an zweiwertigen Ionen, insbesondere von Mg"+-Ionen von Bedeutung für die Bildung spezifischer PCR- Produkte ist, wurden in diesem Rahmen auch Versuchsreihen zur Bestimmung der jeweils optimalen MgCl2-Konzentration im Reaktionsansatz durchgeführt. Eine mit 40 mM sehr hohe MgCl -Konzentration ergab nach einem Vergleich der PCR- Banden aus einer MgCl2-Reihe mit 15, 20, 25, 30, 35 und 40 mM MgCl2 optimale Ergebnisse für den Nachweis der DNA von Mikroorganismen der Cluster I und II. Ein spezifischer Nachweis der DNA von Mikroorganismen des Clusters III war dagegen nur bei einer MgCl -Konzentration von 25 mM möglich.
Für das Annealing erwiesen sich Temperaturen von 60 bzw. 57°C für den spezifischen Nachweis der DNA von Mikroorganismen der Cluster I und II und von 52°C für den spezifischen Nachweis der DNA von Mikroorganismen des Clusters III als optimal.
Die ebenfalls in mehreren PCR-Experimenten optimierten Elongationszeiten betrugen 20 Sekunden für den spezifischen Nachweis der DNA von Mikroorganismen des Cluster I, 15 Sekunden für den spezifischen Nachweis der DNA von Mikroorganismen des Cluster II und 40 Sekunden für den spezifischen Nachweis der DNA von Mikroorganismen des Cluster III. Die genannten Annealingtemperaturen und Elongationszeiten beziehen sich auf die Verwendung eines Kapillar-PCR-Gerätes (Rapid Cycler Idaho Technologies, Idaho Falls, U.S.A.).
Die Reaktionsbedingungen sind in der folgenden Tabelle 3 dargestellt: Tabelle 3
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c) Eignung der Kompetitoren zur Inhibierung unspezifischer PCR-Produkte Ohne die Verwendung der erfindungsgemäßen Kompetitoren (siehe Tabelle 2) trat bei den PCR-Reaktionen, mittels derer die DNAs von Mikroorganismen der Cluster I und II differenziert werden sollten, unabhängig von der Wahl des PCR-Programms unspezifische Produkte auf. Deren Bildung konnte durch die Verwendung der vorstehend erwähnten Kompetitoren verhindert werden.
In Abbildung 3 ist beispielhaft die gelelektrophoretische Auftrennung von PCR- Reaktionen zum spezifischen Nachweis der DNA von Mikroorganismen des Cluster I mit bzw. ohne die erfindungsgemäßen Kompetitoren abgebildet, die diesen Sachverhalt aufzeigt. Dabei ist ohne den Einsatz der erfindungsgemäßen
Kompetitoren eine schwache unspezifische Bande mit Nicht-Zielorganismen erkennbar (Spur 10). Bei der Verwendung von Kompetitoren (siehe Tabelle 2) konnte die Entstehung dieses PCR-Produkts unterdrückt werden (Spur 5). Eine Erhöhung der Annealingtemperatur allein brachte nicht den gewünschten Erfolg, da bei zu hohen Temperaturen auch die Bildung spezifischer Produkte inhibiert wurde (nicht in Abbildung 3 dargestellt). Dabei wurde der folgende Ansatz mit einem Kapillar-PCR-Gerät (Rapid Cycler Idaho Technologies) durchgeführt. MgCl und lOx BSA wurden von ebenfalls von Rapid Cycler Idaho Technologies bezogen. Die verwendeten Desoxynukleotidtriphosphate wurden von Pharmacia (Uppsala, Schweden), und die Polymerase wurde von Promega (Madison, USA) bezogen.
Standardansatz für eine Reaktion ohne Kompetitoren: Chemikalie Endkonzentration Volumen lO BSA 5 μl
10x MgCl2 (25 mM) 5 μl lOx dNTPs (2,5 mM) 5 μl
Primer-V (15 pmol) l μl
Primer-R (15 pmol) l μl
H*)Orpinst ad 50 ul
Taq-Polymerase 0,3 μl
DNA (50 ng) 3 μl rdansatz für eine Reaktion mit Kompetitoren:
Chemikalie Endkonzentration Volumen lOx BSA 5 μl
10x MgCl2 (25-40 mM) 5 μl lOx dNTPs (2,5 mM) 5 μl
Primer-V (15 pmol) l μl
Primer-R (15 pmol) l μl je 3 pmol Kompetitor-Primer x μl
H?Oreinst ad 50 ul
Taq-Polymerase 0,3 μl DNA (50 ng) 2 μl Programmierung des Thermocyclers
Primeφaar iap-412-I-V/iap-1047-I-R (spezische PCR für Cluster I) Einleitende Denaturierung 94°C 4 min Denaturierung 94°C 20 s Annealing 60°C 15s 55 Zyklen Elongation 72°C 20 s Abschließende Elongation 72°C 1 min
Primeφaar iap-820 II-V/iap-1047-II-R (spezifische PCR für Cluster II) Einleitende Denaturierung 94°C 4 min
Denaturierung 94°C 20 s Annealing 57°C 15 s 35 Zyklen Elongation 72°C 15s Abschließende Elongation 72°C 1 min
Primeφaar iap-217-III-V/iap- 1047-III-R (spezifische PCR für Cluster III) Einleitende Denaturierung 94°C 4 min Denaturierung 94°C 20 s Annealing 52°C 15s 35 Zyklen Elongation 72°C 40s
Abschließende Elongation 72°C 1 min
Die erhaltenen PCR.-Produkte wurden für die Verwendung als Template zur Sequenzierreaktion mit Hilfe des PCR Purification-Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) von den weiteren Bestandteilen der PCR-Reaktion wie Primer, Polymerase und Puffersystem abgetrennt. Diese Reinigung beruht auf einer säulenchromatographischen Auftrennung. Alle Puffer und Reagenzien waren im Kit enthalten und wurden entsprechend dem beigelegten Handbuch eingesetzt. Die Konzentrationsbestimmung der Nukleinsäurelösungen (Clark und Swika, 1977) erfolgte im Spektralphotometer (Beckmann DU 650, München).
Zur qualitativen Analyse der einzelnen Nukleinsäurepräparationen wurde eine horizontale Agarosegelelektrophorese durchgeführt (Elektrophoreseapparatur: Gel Electrophoresis GNA-100, Pharmacia, Uppsala, Schweden; Gelwanne: Typ H3 Elektrophoresewanne 1 1 x 14 cm für 100 ml Gelvolumen, Gibco-BRL, Eggenstein). Dabei wurden im einzelnen folgende Lösungen verwendet:
- Auftragspuffer: 25% (w/v) Ficoll (Sigma, Deisenhofen)
50 mM EDTA 0,5%) (w/v) Bromphenolblau 0,5%o (w/v) Xylencyanol
- TAE-Puffer: 40 mM Tris
10 mM Natriumacetat 1 mM EDTA pH 8,0
- Agarosegel: l-2%ig in TAE-Puffer
- Längenstandard:
75 bp-12,2kb DNA-Leiter (KBL; Boehringer, Mannheim)
Die zu untersuchenden Proben wurden vor der Elektrophorese mit Auftragspuffer versetzt Die Auftrennung der Nukleinsäuren erfolgte bei einer Stromstärke von etwa 130 mA und bei maximal 150 V Spannung für etwa 1 bis 2 Stunden. Anschließend wurde das Gel gefärbt (10 μg Ethidiumbromid/ml H2O, 20 Minuten, Raumtemperatur) und nachfolgend gewässert (10 Minuten, Raumtemperatur). Die Dokumentation der Ergebnisse erfolgte mit einem Videodokumentationssystem (Cybertech CS-1 Image Documentation System) unter UV-Durchstrahlung (302 nm, Bachofer Transilluminator, Reutlingen) und dem dazugehörigen Image Capture Computer (ICC/4).
Für die Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen wurde ein Reinigungskit verwendet (DNA Gel Extraktions Kit, Boehringer, Mannheim, Deutschland) entsprechend den Angaben des Herstellers.
Abbildungen Abbildung 1 : Schematischer Aufbau des iap-Gens, gesamte Länge: 1454 bp bei L. monocytogenes EGD.
Abbildung 2: Nach dem Neighbour Joining- Verfahren (Woese, supra) anhand des iap-Gens entwickeltes, auf Nukleinsäuresequenzen basierendes Dendrogram aller Listeria- Arten, davon 34 L. monocytogenes-Stämme; ohne Verwendung eines Filters.
Abbildung 3: Spezifische PCR für Cluster I; Spuren 1 , 6 und 1 1 : Längenstandard; Spuren 2 und 7: Negativkontrolle ohne DNA; Spuren 3 und 8: Positivkontrolle mit L. monocytogenes sv 4ab; Spuren 4 und 9: Nachweis von L. monocytogenes sv 4ab aus einem Gemisch mit 5 weiteren Stämmen anderer Cluster; Spuren 5 und 10:
Spezifitätskontrolle mit der DNA zweier Stämme aus Cluster II und III; Spuren 2 bis 5: PCR mit Kompetitoren; Spuren 7 bis 10: PCR ohne Kompetitoren.

Claims

Ansprüche
1. Verfahren zum spezifischen Nachweis von Mikroorganismen in einer Probe durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR), dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich zu den für den Ziel-Mikroorganismus spezifischen Primern (Reaktions- Primern) für Nichtziel-Mikroorganismen spezifische Primer (Kompetitor-Primer) eingesetzt werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktionsund Kompetitoφrimer auf Basis von Struktur- und/oder Funktionsgenen der Mikroorganismen entwickelt werden, wobei die Gene sowohl artspezifische Bereiche als auch stammspezifische Bereiche aufweisen.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktions- und Kompetitoφrimer auf Basis von Struktur- und/oder Funktionsgenen von Listeria entwickelt werden.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktionsund Kompetitoφrimer auf Basis von Struktur- und/oder Funktionsgenen ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus iap, prfA, plcA, plcB, actA und hlyA, entwickelt werden.
5. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Kompetitor-Primer am 3 '-Ende ein Didesoxynukleotid aufweisen.
6. DNA-Primer, dadurch gekennzeichnet, daß sie auf der Basis von Struktur- und/oder Funktionsgenen der Mikroorganismen entwickelt sind, wobei die Gene sowohl artspezifische Bereiche als auch stammspezifische Bereiche aufweisen.
7. Primer nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß sie auf der Basis von Struktur- und/oder Funktionsgenen von Listeria entwickelt sind.
8. Primer nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß sie auf Basis von Struktur- und/oder Funktionsgenen ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus iap, prfA, plcA, plcB, actA und hlyA, entwickelt sind.
9. Primer nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß sie spezifisch für Genovare der Art Listeria monocytogenes sind.
10. Primer nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß sie ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus: a) 5'-TAC TTA ACT GAC AAA GCA GT-3'; b) 5'-ATT CGT ATT AGT ATT TGA GTT TG-3'; c) 5'-ACT AAC ACT AAC ACA AAT GC-3'; d) 5'-GGA GTT TGT ATT AGT ATT GGT A-3'; e) 5'-AAT GAG GTC GCT AAA ACA GA-3'; f) 5'-TGT GTT CGT GTT TGT ATT TGT G-3'; g) Sequenzen, die sich von den Sequenzen a) bis f) um bis zu 3 Basen unterscheiden; und h) Sequenzen, die die Sequenzen a) bis g) umfassen.
11. Primer nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß sie ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus: a) 5'-TAC TTA ACT GAC AAA GTA G*-3'; b) 5'-ATT CGT ATT GGA GTT TGT ATT-A*-3'; c) 5'-AGC-ATT-TGT-GTT-CGT-GTT-T*-3'; d) 5 ' -ACK- AA Y-AC A-AAT-AC W-GCT-M*-3 ' ; e) 5'-AGT-ATT-TGA-GTT-TGT-ATT-AGT-AT*-3'; f) 5 '-TGT-GTT-CGT-GTT-TGT-ATT-TGT* -3 ' ; g) 5 '-GAG-GTK-GCT-GCT-GCT-G*-3 ' ; h) 5 ' -GG A-GTT-TGT-ATT-AGT- ATT-GGT*-3 ' ; i) Sequenzen, die sich von den Sequenzen a) bis h) um bis zu 3 Basen unterscheiden; und j) Sequenzen, die die Sequenzen a) bis i) umfassen, wobei K für G oder T, Y für C oder T, W für A oder T und M für A oder C steht und die mit * markierten Basen vorzugsweise Didesoxynucleotide sind.
12. Verwendung der Primer nach einem der Ansprüche 6 bis 1 1 in einem Verfahren zum spezifischen Nachweis von Mikroorganismen, insbesondere zu deren Unterscheidung von nahe verwandten Mikroorganismen in einer Probe durch Polymerase-Kettenreaktion.
13. Verwendung der Primer nach einem der Ansprüche 9 bis 1 1 in einem Verfahren zum spezifischen Nachweis von Genovaren der Art Listeria monocytogenes in einer Probe durch Polymerase-Kettenreaktion.
14. Verwendung der Primer nach einem der Ansprüche 6 bis 1 1 zur Diagnose und Therapie von bakteriellen Infektionen, insbesondere von Z/s/eπα-Infektionen.
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