DE69635025T2

DE69635025T2 - Neues verfahren zum nachweis von cryptosporidium

Info

Publication number: DE69635025T2
Application number: DE69635025T
Authority: DE
Inventors: Una Morgan; Christopher Richard THOMPSON
Original assignee: Murdoch University
Current assignee: Cryptogen Pty Ltd Murdoch West Australien Au
Priority date: 1995-06-30
Filing date: 1996-06-25
Publication date: 2006-06-08
Anticipated expiration: 2016-06-26
Also published as: CA2225831A1; WO1997002281A1; ATE301189T1; NZ310371A; US6054275A; ZA965458B; EP0850249B1; JPH11508447A; EP0850249A1; DE69635025D1; AUPN391695A0; EP0850249A4; CA2225831C

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Feststellen von Mikroorganismen der Gattung Cryptosporidium und insbesondere von Cryptosporidium parvum.
Der Protozoenparasit Cryptosporidium parvum ist als eine wichtige Ursache für Durchfallerkrankung in erster Linie bei Säuglingen und jungen Kindern anerkannt (obwohl immunologisch gesunde Erwachsene auch empfänglich sind) und geht mit dauerhaftem Durchfall und schwerer Erkrankung bei schlecht ernährten Kindern einher. Er ist auch ein schwerwiegendes opportunistisches Pathogen in immunologisch geschwächten Individuen, welches schweren und nicht zurückgehenden Durchfall verursacht, der häufig einer Therapie widersteht. Von chronischer Cryptosporidiose wird bei bis zu 10% der Personen mit AIDS in den Vereinigten Staaten berichtet, und es gibt derzeit keine wirksamen therapeutischen Strategien zur Behandlung von Cryptosporidium-Infektion.
Die über Wasser erfolgende Übertragung dieses enterischen Parasiten ist eine Hauptsorge. Das infektiöse Stadium (Oozyste) von Cryptosporidium wird über den fäkal-oralen Weg übertragen, wobei infizierte Individuen Cryptosporidium-Oozysten ausscheiden. Tiere sowie Menschen können als Quelle für eine Umweltkontamination und eine Infektion des Menschen dienen. Die Oozyste ist in der Umwelt stabil und in der Lage, zu überleben und in eine routinemäßige Abwasserbehandlung einzudringen und ist beständig gegenüber einer Inaktivierung durch Trinkwasserdesinfektionsmittel. Es gibt mehrere Spezies von Cryptosporidium, aber von Cryptosporidium parvum wird angenommen, daß es den größten Teil der Säugerinfektionen verursacht. Cryptosporidium parvum-Oozysten sind beständig gegen Chlorungsverfahren, die normalerweise für die Wasserbehandlung verwendet werden, und eine Kontamination der Wasserversorgung kann ein massives Ausbrechen der Krankheit verursachen, wie beispielsweise das Ausbrechen von Cryptosporidiose 1994 in Milwaukee, was zu Durchfallerkrankung bei schätzungsweise 403.000 Menschen führte.
Bei Fehlen von wirksamen Arzneimitteln zur Behandlung dieser ubiquitären Infektion hängt die Kontrolle und klinische Handhabung von Cryptosporidiose von einer schnellen, genauen und empfindlichen Diagnose des Vorhandenseins des Parasiten sowohl in klinischen Proben als auch in Umweltproben ab.
Die klinische Diagnose von Cryptosporidium ist zeitaufwendig, unempfindlich und erfordert im allgemeinen das Fachkönnen von hochgradig ausgebildeten Anwendern. Es wurde kürzlich berichtet, daß die Detektionsgrenzen herkömmlicher diagnostischer Techniken für Cryptosporidium bei nur 50.000 Oozysten pro Gramm Fäkalien lag und daß die durchschnittlichen Oozystenverlu ste im Bereich von 51,2% bis 99,6% lagen. Darüber hinaus können die meisten allgemein verwendeten koprodiagnostischen Techniken dahingehend versagen, Cryptosporidiose in vielen immunologisch geschwächten und immunkompetenten Individuen festzustellen. Es wurden auf Immunologie basierende Detektionsmethoden unter Verwendung von Immunfluoreszenztests, enzymgekoppelten Immunabsorptionstests und auf Immunfluoreszenz basierenden diagnostischen Tests entwickelt, von denen einige nun kommerziell erhältlich sind. Enzymgekoppelte Immuntests besitzen, obwohl sie schnell und einfach durchzuführen sind, im allgemeinen eine geringe Empfindlichkeit im Bereich von 3 × 10⁵ bis 1 × 10³ Oozysten pro Gramm Fäkalien, und monoklonale Antikörper besitzen die Fähigkeit, an andere Mikroorganismen zu binden, d.h. unspezifisch zu färben. Darüber hinaus wurde von Cryptosporidium-Isolaten gezeigt, daß sie ein großes Maß an Antigenvariabilität aufweisen, und daher können diagnostische Antikörper nicht alle Isolate erkennen.
Eine Detektion von Cryptosporidium in der Umwelt umfaßt im allgemeinen das Filtern von großen Volumen an Wasser und dessen mikroskopische Untersuchung auf Cryptosporidium-Oozysten durch verschiedene Färbe- oder Immunmarkierungstechniken. Jedoch kann die Effizienz der Oozystengewinnung nur 1,3 bis 5,5% betragen. Kürzlich wurde ein alternatives Mittel zum Ernten von Oozysten durch Calciumcarbonatkoagulation beschrieben mit einer verbesserten Gewinnung im Bereich von 68% bis > 80%. Es wurden auch spezielle Flußzytometrie- und Zellsortierungstechniken entwickelt, um Oozysten in Wasserproben mit größerer Empfindlichkeit als herkömmliche Fluoreszenzmikroskopie zu detektieren. Obwohl diese Verfahren signifikant empfindlicher und beträchtlich schneller sind als herkömmliche Verfahren, sind sie auch teuer und erfordern nach wie vor das Fachkönnen von hochgradig ausgebildeten technischen Anwendern.
Die Entwicklung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) erlaubte eine spezifische und empfindliche Detektion von Pathogenen für die klinische Diagnose und die Umweltüberwachung. Für die Detektion von Cryptosporidium wurden diagnostische PCR-Primer beschrieben. Jedoch haben diese Primer den Nachteil, daß ihnen Empfindlichkeit fehlt und daß sie nur in der Lage sind, bestenfalls etwa 200 Cryptosporidium-Oozysten zuverlässig unter optimaler Bedingung zu detektieren. Darüber hinaus wurden die meisten der bis heute ausgewählten Primer nur an einer geringen Anzahl von Cryptosporidium-Isolaten getestet, und keiner von ihnen wurde direkt an Fäkalien getestet. Daher besteht ein Bedarf nach einem empfindlichen Detektionsverfahren, welches in der Lage ist, das Vorhandensein von Cryptosporidium in Fäkalien- und Umweltproben zu identifizieren.
Die WO 96/34978 und Webster et al., 1993 (Veterinary Parasitology, Band 50: 35–44) beschreiben die Verwendung von Nukleotiden für das ribosomale DNA-Gen von Cryptosporidium 18S für die Detektion von Cryptosporidium.
Die WO-A-9402635 beschreibt ein Verfahren zum Detektieren von Cryptosporidium parvum.
Laxer M. A. et al., 1991 (Amer J Trop Med Hyg Band 45: 688–694) beschreiben die Konstruktion von Primern und Sonden für die Detektion von Cryptosporidium parvum.
Angesichts der Schwere und der Unbehandelbarkeit einer Cryptosporidium-Infektion in Personen mit AIDS wird eine frühe Detektion von Cryptosporidieninfektion in HIV-infizierten oder AIDS-Patienten, die nur geringe Anzahlen von Oozysten ausscheiden können, zunehmend wichtig. Ein schneller, empfindlicher Test, der nur wenig oder keine Fachkenntnis auf selten des Anwenders erfordert, wäre von großem Vorteil bei der frühen Detektion von asymptomatischer oder schwacher Cryptosporidieninfektion in AIDS-Patienten. Sie würde die klinische Handhabung der Krankheit verbessern mit der Option der Einleitung einer Chemotherapie vor dem Einsetzen von Symptomen, was zu weniger Fällen führen würde, die zu schweren und häufig chronischen Infektionen von diesem Parasit voranschreiten.
Die vorliegende Erfindung stellt Nukleotidsequenzen bereit, welche in diagnostischen Tests zum Analysieren von Proben hinsichtlich einer Umweltkontamination durch Cryptosporidium-Oozysten und für die Diagnose von Cryptosporidium-Infektionen in Patienten verwendet werden können.
Daher besteht die Erfindung aus einer gereinigten und isolierten Cryptosporidium-DNA-Sequenz mit der Nukleotidsequenz
Vorzugsweise besteht die vorliegende Erfindung aus einem Verfahren zum Feststellen und/oder Identifizieren des Vorhandenseins von genomischem Material von Cryptosporidium in einer Probe, wobei das Verfahren die Stufen umfaßt, in denen man wenigstens einen Primer oder eine Sonde, der/die von der oben genannten Nukleotidsequenz abgeleitet ist, auswählt und dann diesen Primer oder diese Sonde dazu verwendet, das Vorhandensein von genomischem Material von Cryptosporidium festzustellen und/oder zu identifizieren, wobei der (die) Primer oder die Sonde nicht die Nukleotidsequenzen ACAATTAAT, CTTTTTGGT, AATTTATATAAAATATTTTGATGAA und TTTTTTTTTTTAGTAT sind.
Von der oben genannten Nukleotidsequenz können Oligonukleotide hergestellt werden, welche mit dem Cryptosporidium-Genom hybridisieren. Die Oligonukleotide können entweder als Primer oder als Sonde(n) zum Feststellen des Cryptosporidium-Genoms verwendet werden. Vorzugsweise sind der (die) Primer oder die Sonde(n) spezifisch für die Mikroorganismen der Spezies Cryptosporidium parvum.
Der (die) Primer oder die Sonde(n) für Cryptosporidium haben vorzugsweise eine Länge, welche die spezifische Detektion dieser Mikroorganismen erlaubt. Primer oder Sonde(n), welche 5 bis 8 Nukleotide lang sind, sollten für das Feststellen des Cryptosporidium-Genoms geeignet sein. Vorzugsweise können Sequenzen mit etwa 10 bis 50 Nukleotiden als Primer oder Sonde(n) verwendet werden. Besonders bevorzugt können in den Identifizierungsprotokollen Sequenzen mit etwa 15 bis 25 Nukleotiden verwendet werden, und etwa 20 bis 24 Nukleotide scheinen optimal zu sein.
Primer oder Sonde(n) können unter Verwendung von Routineverfahren ausgewählt und hergestellt werden, einschließlich Verfahren der automatisierten Oligonukleotidsynthese. Ein Komplement zu irgendeinem einzigartigen Abschnitt der oben genannten Nukleotidsequenz kann als Primer oder Sonde(n) verwendet werden, vorausgesetzt, daß es spezifisch an das Cryptosporidium-Genom bindet. Wenn es als Primer oder Sonde(n) verwendet wird, ist vollständige Komplementarität erwünscht, obwohl dies unnötig sein kann, wenn die Länge des Fragments vergrößert wird. Unter geeigneten Primern oder Sonden zum Feststellen und/oder Identifizieren von Cryptosporidium-Isolaten sind beispielsweise die folgenden Sequenzen:
Bevor die oben genannten Sonden oder Primer zum Feststellen und/oder Identifizieren von Cryptosporidium-Isolaten in diagnostischen Verfahren, wie solchen, die hierin diskutiert werden, verwendet werden, wird die zu analysierende Probe, wie beispielsweise eine Fäkalienprobe, vorzugsweise so behandelt, daß das darin enthaltene Nukleinsäurematerial extrahiert wird. Das resultierende Nukleinsäurematerial von der Probe kann dann Gelelektroforese oder anderen Größenauftrennungstechniken unterzogen werden; das Nukleinsäurematerial kann ohne Größenauftrennung geblottet werden; alternativ kann die Probe getestet werden, ohne daß sie solchen Techniken unterzogen wird. Ob eine Größenauftrennung in dem Identifizierungsprotokoll verwendet wird, wird von der Art des verwendeten Tests abhängen. Zum Beispiel kann eine Größenauftrennung in Hybridisierungstests geeignet sein.
Abhängig von dem Detektionsverfahren, welches zum Feststellen und/oder Identifizieren des Vorhandenseins von Cryptosporidium-Isolaten in einer Probe verwendet wird, können die Sonde(n) oder der (die) Primer markiert sein. Geeignete Markierungen und Verfahren zum Markieren von Sonden und Primern sind auf dem Gebiet bekannt. Zum Beispiel können Sonden oder Primer unter Verwendung von radioaktiven Desoxynukleotidmarkierungen markiert werden, die durch Nick-Translation aufgenommen werden, oder es können auch Endmarkierung, Biotinmarkierungen, Fluoreszenzmarkierungen oder Chemilumineszenzmarkierungen verwendet werden. Alternativ können für Cryptosporidium spezifische Polynukleotide auf Agarose- oder Polyacrylamidgelen unter Anwendung von z.B. Sichtbarmachung mit Ethidiumbromid/UV-Licht oder durch Silberfärbetechniken detektiert werden.
In einem Detektionsverfahren können für Cryptosporidium spezifische Polynukleotide, die von der Probe extrahiert wurden, mit einer markierten Sonde unter Hybridisierungsbedingungen von geeigneter Stringenz behandelt werden. Üblicherweise sind hochstringente Bedingungen erwünscht, um falsche Positive zu verhindern. Die Stringenz einer Hybridisierung wird durch eine Anzahl von Faktoren während der Hybridisierung und während des Waschverfahrens bestimmt, einschließlich Temperatur, Ionenstärke, Länge der Zeit und Konzentration von Reaktanten. Einem Fachmann auf dem Gebiet wird klar sein, wie diese Faktoren gemeinsam eingesetzt werden können, um die Stringenz einer Hybridisierung zu modifizieren.
Im allgemeinen wird erwartet, daß Cryptosporidium-DNA in Proben von infizierten Individuen und insbesondere in Umweltproben in niedrigen Konzentrationen vorhanden sein werden. Diese Menge kann die Notwendigkeit für eine Vervielfältigung der Nukleinsäuren vorschreiben, bevor sie detektiert werden können. Solche Vervielfältigungstechniken sind auf dem Gebiet bekannt.
Ein Verfahren, das zum Detektieren von Cryptosporidium-DNA besonders bevorzugt ist, beruht auf einem Test vom PCR-Typ, bei dem ein Satz von Primern, welche für Cryptosporidium-DNA hochgradig spezifisch sind, dazu verwendet wird, in einer Probe vorhandene Cryptosporidium-DNA zu vervielfältigen. Das Vorhandensein des resultierenden Produkts kann dann unter Anwendung von z.B. Visualisierung mit Ethidiumbromid/UV-Licht oder durch Silbertärbetechniken festgestellt werden. Alternativ könnte eine kolorimetrische Detektion des PCR-Produkts unter Verwendung von biotinylierten Primern verwendet werden, um Zeit zu sparen und die Notwendigkeit für Agarosegelelektroforese auszuschalten. Solch ein Test könnte auch so modifiziert werden, daß er für ein 96-Well-Mikrotiterformat für eine Verarbeitung von Proben in großer Menge geeignet ist.
Daher stellt die Erfindung in einer Ausführungsform ein Verfahren zum Feststellen und/oder Identifizieren von Mikroorganismen der Gattung Cryptosporidium bereit mit den Stufen, in denen man

(i) wenigstens einen Satz von Primern von der oben genannten Nukleotidsequenz auswählt, welche für Cryptosporidium-DNA spezifisch sind,
(ii) die Primer mit einer Probe mischt, von der man annimmt, daß sie Cryptosporidium-DNA enthält,
(iii) jede DNA, an welche die Primer in Stufe (ii) annealen, mittels der Polymerase-Kettenreaktion vervielfältigt und
(iv) das Vorhandensein des Produkts aus Stufe (i) feststellt, wobei der (die) Primer oder die Sonde nicht die Nukleotidsequenzen ACAATTAAT, CTTTTTGGT, AATTTATATAAAATATTTTGATGAA und TTTTTTTTTTTAGTAT sind.

Obwohl das oben genannte Verfahren allgemein auf eine oder mehrere Spezies von Cryptosporidium anwendbar ist, sind die Primer, die in Stufe (i) ausgewählt werden, hochgradig spezifisch für Cryptosporidium parvum.
Primerpaare, die zum Detektieren von Cryptosporidium parvum geeignet sein können, werden vorzugsweise unter den folgenden Sequenzen ausgewählt. In jedem beschriebenen Primersatz repräsentiert der zuerst erwähnte Primer den Vorwärtsprimer und der als zweites erwähnte Primer repräsentiert den Rückwärtsprimer.
Besonders bevorzugte Primerpaare, die in einem diagnostischen Verfahren zum Detektieren von Cryptosporidium parvum verwendet werden können, werden vorzugsweise unter den folgenden Primersätzen ausgewählt. In jedem beschriebenen Primersatz repräsentiert der zuerst erwähnte Primer den Vorwärtsprimer und der als zweites erwähnte Primer repräsentiert den Rückwärtspri-mer.
Wenn z.B. die Vorwärts- und Rückwärts-PCR-Primer GGTACTGGATAGATAGTGGA bzw. TCGCACGCCCGGATTCTGTA sind, dann wird ein DNA-Fragment von etwa 668 Nukleotiden bei Vervielfältigung von Cryptosporidium parvum-DNA erzeugt. Alternativ, wenn die Vorwärts- und Rückwärts-PCR-Primer GAGATTCTGAAATTAATTGG bzw. CCTCCTTCGTTAGTTGAATCC sind, dann wird ein DNA-Fragment von etwa 426 Nukleotiden nach Vervielfältigung von Cryptosporidium parvum-DNA erzeugt.
Die hierin beschriebenen Verfahren können dazu verwendet werden, das Vorhandensein oder Fehlen von Cryptosporidium-DNA festzustellen. Jedoch liefern sie wenig Information über die Lebensfähigkeit oder das Infektionspotential von Mikroorganismen in einer Probe. Daher kann/können das/die oben beschriebene(n) Detektionsverfahren mit einem oder mehreren Verfahren zum Testen der Cryptosporidium-Lebensfähigkeit kombiniert werden. Solche Verfahren sind auf dem Gebiet weithin bekannt. Zum Beispiel können Tests mit fluorogenem Vitalfarbstoff (z.B. unter Verwendung von Propidiumiodid) oder die Fähigkeit von Cryptosporidium, in vitro oder in vivo zu wachsen, dazu verwendet werden, die wahrscheinliche Infektiösität oder Virulenz der getesteten Proben zu bestimmen. Man sollte jedoch vorsichtig sein, wenn man solche Verfahren anwendet. Derzeitige Protokolle zum Konzentrieren von Oozysten, wie beispielsweise Percoll-Sucrose-Gradienten und Sucrose-Dichteflotation, können tatsächlich selektiv nicht lebensfähige Oozysten konzentrieren. Standardtests auf Lebensfähigkeit, wie Tests mit fluorogenem Vitalfarbstoff, können daher eine Neigung zur Detektion von nicht lebensfähigen Oozysten haben. Darüber hinaus untersuchen derzeitige Protokolle nur einen Anteil des gesamten Wasserkörpers, und die Lebensfähigkeit von detektierten Zysten und Oozysten bleibt unbestimmt.
Obwohl die vorliegende Erfindung Nukleotidsequenzen von Cryptosporidium und Verfahren zum Feststellen und/oder Identifizieren des Vorhandenseins von Cryptosporidium-Isolaten betrifft, ist es klar, daß die Sequenzen und Verfahren in der Form eines Kits für die Detektion von Cryptosporidium-Isolaten zur Verfügung gestellt werden kann. Vorzugsweise stellt das Kit Mittel zum Detektieren von Cryptosporidium parvum-Isolaten bereit.
Daher wird in einer Ausführungsform der Erfindung ein Kit zum Feststellen und/oder Identifizieren des Vorhandenseins von Cryptosporidium-Mikroorganismen in einer Probe bereitgestellt, wobei das Kit wenigstens eine Sonde oder einen Satz von Primern umfaßt, der/die für einen Bereich des Genoms von Cryptosporidium spezifisch ist/sind, wobei die Sonde oder die Primer aus der oben genannten Nukleotidsequenz ausgewählt ist/sind und wobei der/die Primer oder die Sonde nicht die Nukleotidsequenzen ACAATTAAT, CTTTTTGGT, AATTTATATAAAATATTTTGATGAA und TTTTTTTTTTTAGTAT sind.
Sonden und Primer können in diagnostischen Kits verpackt sein. Diagnostische Kits können die DNA-Sonde oder die DNA-Primer, welche markiert sein können, enthalten; alternativ können die Sonde oder die Primer unmarkiert sein, und die Bestandteile zum Markieren der Sonde oder zum Vervielfältigen der Cryptosporidium-DNA unter Verwendung der Primer können in dem Kit enthalten sein. Das Kit kann auch andere geeignet verpackte Reagenzien und Materialien enthalten, die für die jeweiligen Detektionsprotokolle benötigt werden. Das Kit kann z.B. Standards sowie Anleitungen zur Verwendung des Detektionskits enthalten.
Spezielle diagnostische Kits können auch die notwendigen Reagenzien zum Durchführen von fluorogenen Tests und/oder zum Züchten von Cryptosporidium in Zellkultur enthalten.
Die vorliegende Erfindung wird nun beispielhaft und nur unter Bezugnahme auf die folgenden Figuren beschrieben. Es ist klar, daß alle Temperaturbereiche und andere derartige Variablen, die in den Beispielen vorgeschrieben sind, nur als Hinweise angegeben sind, und daß Parameter außerhalb dieser Grenzen ebenfalls geeignete Ergebnisse liefern können.
1a repräsentiert ein mit Ethidiumbromid gefärbtes, 1%-iges Agarosegel, das die Spezifität der diagnostischen Primer 021 für Cryptosporidium zeigt. Spur 1 = Molekular gewichtsmarker; Spur 2 = C. parvum-DNA; Spur 3 = G. duodenalis-DNA; Spur 4 = menschliche DNA; Spur 5 = Fäkalien-DNA; Spur 6 = Tritrichomonas foetus-DNA; Spur 7 = C. serpentis-DNA; Spur 8 = Negativkontrolle (keine DNA). Der Molekulargewichtsmarker war 100 Bp-Leiter (Gibco BRL); kb = Kilobasen.
1b zeigt den Spezifitätstest der CP1-Primer. Spur 1 = Molekulargewichtsmarker; Spur 2 = C. parvum-DNA; Spur 3 = G. duodenalis-DNA; Spur 4 = menschliche DNA; Spur 5 = Fäkalien-DNA; Spur 6 = Tritrichomonas foetus-DNA; Spur 7 = Negativkontrolle (keine DNA). Molekulargewichtsmarker wie in 1a.
2a repräsentiert ein mit Ethidiumbromid gefärbtes, 1%-iges Agarosegel, das Produkte zeigt, die aus einer Vervielfältigung erhalten wurden, welche an 13 der 35 Cryptosporidium parvum-Isolate, die unter Verwendung der 021-Primer untersucht wurden, durchgeführt wurde. Spur 1 = Molekulargewichtsmarker; Spur 2 = L1; Spur 3 = H9; Spur 4 = C1; Spur 5 = H7; Spur 6 = H5; Spur 7 = H6; Spur 8 = H3; Spur 9 = H10; Spur 10 = H8; Spur 11 = H4; Spur 12 = H1; Spur 13 = C6; Spur 14 = H2; Spur 15 = Negativkontrolle. Molekulargewichtsmarker wie in 1a. Die Isolate H11–12, H15–H34, C1 und C7–9 wurden ebenfalls getestet und erzeugten bei Vervielfältigung die gewünschte 668 Bp große Bande (Daten nicht gezeigt).
2b zeigt den Parasitenursprung der Banden, die in 2a dargestellt sind. Das in 2a dargestellte Gel wurde auf Hybond N⁺ (Amersham) geblottet und mit internen Oligonukleotidsonden sondiert, um den Parasitenursprung von Banden zu bestätigen.
3 repräsentiert ein mit Ethidiumbromid gefärbtes, 1%-iges Agarosegel, das Produkte zeigt, die von einer Vervielfältigung erhalten wurden, welche an 28 der 39 Cryptosporidium-Isolate, die unter Verwendung der CP1-Primer untersucht wurden, durchgeführt wurde. Spur 1 = Molekulargewichtsmarker; Spur 2 = H1; Spur 3 = H2; Spur 4 = H3; Spur 5 = H5; Spur 6 = H6; Spur 7 = H7; Spur 8 = H8; Spur 9 = H9; Spur 10 = H10; Spur 11 = H11; Spur 12 = H12; Spur 13 = 15; Spur 14 = H16; Spur 15 = H17; Spur 16 = H18; Spur 17 = H19; Spur 18 = H20; Spur 19 = H21; Spur 20 = H22; Spur 21 = H23; Spur 22 = H24; Spur 23 = H25, Spur 24 = H26; Spur 25 = C1; Spur 26 = C2; Spur 27 = C6; Spur 28 = C7; Spur 29 = L1; Spur 30 = Negativkontrolle. Die Isolate F1, F9, F10, F11, F20, F21, F22, F35, F36 und F38 vervielfältigten ebenfalls die korrekte 446 Bp große Bande.
4a repräsentiert ein mit Ethidiumbromid gefärbtes, 1%-iges Agarosegel, das die Empfindlichkeit der 021-Primer zeigt. Spur 1 = Molekulargewichtsmarker; Spur 2 = 1 × 10⁵ C. parvum-Oozysten; Spur 3 = 1 × 10⁴ C. parvum-Oozysten; Spur 4 = 1 × 10³ C. parvum-Oozysten; Spur 5 = 100 C. parvum-Oozysten; Spur 6 = 10 C. parvum-Oozysten; Spur 7 = 1 C. parvum-Oozyste und Spur 8 = Negativkontrolle. Molekulargewichtsmarker wie in 1a.
4b repräsentiert ein mit Ethidiumbromid gefärbtes, 1%-iges Agarosegel, das die Empfindlichkeit der CP-Primer zeigt. Spur 1 = Molekulargewichtsmarker; Spur 2 = 1 × 10³ C. parvum-Oozysten; Spur 3 = 100 C. parvum-Oozysten; Spur 4 = 10 C. parvum-Oozysten; Spur 5 = 1 C. parvum-Oozyste; Spur 6 = Negativkontrolle (keine DNA). Molekulargewichtsmarker wie in 1a.
5a repräsentiert ein mit Ethidiumbromid gefärbtes, 1%-iges Agarosegel, das eine direkte Vervielfältigung von Cryptosporidium-DNA von Fäkalien unter Verwendung der 021-Primer zeigt. Spur 1 = Molekulargewichtsmarker; Spur 2 = H27; Spur 3 = H28; Spur 4 = H29; Spur 5 = H30; Spur 6 = Molekulargewichtsmarker; Spur 7 = H31; Spur 8 = H32; Spur 9 = H33; Spur 10 = H34. Molekulargewichtsmarker wie in 1a.
5b zeigt Vervielfältigungsprodukte von 9 Fäkalienproben unter Verwendung der CP1-Primer. Spur 1 = Molekulargewichtsmarker; Spur 2 = F1; Spur 3 = F9; Spur 4 = F10; Spur 5 = F11; Spur 6 = F20; Spur 7 = F21; Spur 8 = F22; Spur 9 = F35; Spur 10 = F36; Spur 11 = F38; Spur 12 = Negativkontrolle.
6 zeigt eine Ausrichtung von menschlichen und Kälbersequenzen des diagnostischen 02-Fragments.
Beispiele Cryptosporidium-Isolate
Isolate von Cryptosporidium sind in Tabelle 1 unten aufgelistet. Cryptosporidium-Isolate für eine RAPD-Analyse wurden von Fäkalien-DNA mittels PBS-Ether-Zentrifugation, gefolgt von Ficoll-Dichtezentrifugation, gereinigt, wie beschrieben von Morgan, Constantin, O'Donoghue, Meloni, O'Brien & Thompson (1995). "Molecular Characterisation of Cryptosporidium isolates from humans and other animals using RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) analysis. "American Journal of Tropical Medicine and Hygiene" 52 559–564. Alle Fäkalienproben wurden vor der Analyse bei 4°C ohne Konservierungsmittel für mehrere Wochen gelagert. Tabelle 1: Isolate von Cryptosporidium, die in dieser Studie verwendet wurden

(NB: PMH = Princess Margaret Hospital, Perth, Westaustralien; SHL = State Health Laboratorien, Westaustralien; CVL = Central Veterinary Laboratorien, südaustralische Abteilung für Landwirtschaft, Südaustralien; MAH = Moredun Animal Health Ltd., Edinburgh, Schottland, und USDA = United States Department of Agriculture, Maryland, USA; N/A = nicht verfügbar).
DNA-Isolierung
Für eine RAPD-Analyse wurde DNA von Cryptosporidium extrahiert, wobei das CTAB-Verfahren verwendet wurde, das von Yap und Thompson (1987). "CTAB precipitation of cestode DNA". Parasitology Today: 3: 220–222 beschrieben wurde. Cryptosporidium-Oozysten wurden in 200 μl Lysepuffer resuspendiert, welcher 0,25 M Sucrose, 50 mM Tris-HCl, 50 mM EDTA, 8% Triton-X-100, pH 7,5, enthielt. Die Oozysten wurden drei Einfrier-Auftau-Zyklen unterworfen und dann wurden 50 μl einer 10 mg/ml Proteinase K-Lösung hinzugefügt. Die Proben wurden für 1 Stunde bei 55°C inkubiert, und Nukleinsäure präzipitierte durch die Zugabe von 1 ml 2%-igem CTAB (Cetyltrimethylammoniumbromid). Nach Zentrifugation wurde das Pellet in 250 μl N.E.-Puffer (2,5 M NaCl, 10 mM EDTA, pH 7,7) gelöst und mit 250 μl T.E.-Puffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,5) verdünnt. Die Proben wurden anschließend einmal mit Chloroform extrahiert, mit 100%-igem Ethanol präzipitiert, mit 70%-igem Ethanol gewaschen und in T.E.-Puffer resuspendiert. In gleicher Weise wurde DNA von menschlichem Blut, menschlichen Fäkalien, Giardia duodenalis, Tritrichomonas foetus und c. seprentis für Kreuzhybridisierungsstudien isoliert.
PCR-Bedingungen und Primer
Die Auswahl von DNA-Primer(n) oder -Sonde(n) durch die Konstruktion und Durchmusterung von genomischen DNA-Bibliotheken ist eine arbeitsaufwendige und teure Übung. Jedoch wird das Verfahren zur Auswahl solcher Nukleotidsequenzen durch Anwendung der hierin nachfolgend beschriebenen Random Amplified Polymorphic DNA- (RAPD-) Technik für die Entwicklung von diagnostischen Sonden oder Primern erheblich vereinfacht. Bei dieser Technik werden geringe Mengen an DNA unter Verwendung eines einzelnen Oligonukleotids mit einer zufälligen Sequenz als ein Primer PCR unterzogen. Die Vervielfältigungsprodukte werden auf Agarose- oder Polyacrylamidgelen aufgelöst, was ein Muster liefert, das stammspezifisch ist. Viele der mittels RAPD-PCR erzeugten Produkte werden von den sich wiederholenden DNA-Sequenzen erhalten. Da diese Sequenzen häufig speziesspezifisch sind, ist RAPD-PCR potentiell ein schnelles Verfahren zur Entwicklung von speziesspezifischen diagnostischen PCR-Primern und -Sonden.
RAPD-Reaktionen wurden durchgeführt, wie es beschrieben wurde von Morgan, Constantine, O'Donoghue, Meloni, O'Brien & Thompson (1995). "Molecular Characterisation of Cryptosporidium isolates from humans and other animals using RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) analysis. "American Journal of Tropical Medicine and Hygiene" 52 559–564. Eine Auswahl an Primern wurde getestet und ist nachfolgend aufgelistet.
Vakuum-Blots. Dot-Blots und DNA-Hybridisierung
RAPD-Gele wurden unter Verwendung von 20 × SSC (0,3 M Na₃-Citrat, 3 M NaCl, pH-Wert auf 7,0 eingestellt) auf Hybond N⁺-Membrane (Amersham) als das Transfermedium vakuumgeblottet (BioRad). Nach dem Transfer wurde die DNA unter Verwendung eines GS Gene-Linker^TM UV-Vernetzers (BioRad) mittels UV-Licht mit den Membranen vernetzt. Sondenmarkierung wurde unter Verwendung von zwei verschiedenen nicht-radioaktiven Markierungssystemen durchgeführt. Das ECL (Enhanced Chemiluminescence) Direktmarkierungskit, das von Amersham erhalten wurde, wurde dazu verwendet, sämtliche doppelstrangige DNA zu markieren, und das DIG (Digoxigenin) Oligonukleotid-3'-Ende-Markierungs- und -Detektionskit, das von Boehringer Mannheim erhalten wurde, wurde zur Markierung von Oligonukleotiden verwendet. Für die mei sten Hybridisierungen wurden 100 ng DNA (bei einer Konzentration von 10 ng/μl) markiert und in einem Hybridisierungsvolumen von 10 ml verwendet. Alle Hybridisierungen wurden in einem Hybaid^TM-Grillofen (BioRad) durchgeführt. Für Dot-Blots wurde DNA auf Hybond N⁺-Membran (Amersham) unter Verwendung eines Vakuumverteilers (BioRad) übertragen. DNA wurde unter Anwendung des oben beschriebenen UV-Vernetzungsverfahrens an die Membran gebunden.
Southern-Blots von RAPD-Profilen wurden an DNA hybridisiert, die von menschlichem Blut, Giardia duodenalis, menschlichen Fäkalien und Cryptosporidium parvum isoliert worden war. RAPD-Banden, welche nur an Cryptosporidium-DNA und nicht an die anderen getesteten DNAs hybridisierten, wurden für die weitere Analyse ausgewählt. Die Primer R-2817, INS, PER, Y22, SP6, [GAA]⁵ und [GACA]⁴ erzeugten alle Profile, die in variierendem Maße mit menschlicher, Fäkalien- oder Giardia-DNA kreuzreagierten. Der Primer R4 erzeugte jedoch ein einfaches Profil, welches nur mit Cryptosporidium-DNA kreuzreagierte (Daten nicht gezeigt). Eine Bande von etwa 750 Bp wurde aus einem Gel mit niedrigem Schmelzpunkt unter Anwendung des Spritzenverfahrens, das von Li & Ownby (1993). "A rapid method for extraction of DNA from agarose gels using a syringe". Biotechniques 15: 976–978, beschrieben wurde, gereinigt, erneut vervielfältigt, und es wurde durch Dot-Blots gezeigt, daß sie für Cryptosporidium spezifisch war. Die als 021 bezeichnete Bande wurde dann kloniert und sequenziert.
Klonierung von PCR-Produkten
Banden, die für Cryptosporidium spezifisch waren, wurden direkt in den pGEM T-Vektor (Promega) ligiert. Ligationsprodukte wurden in Escherichia coli HB101 transformiert, und weiße Kolonien wurden unter Verwendung von PCR durchmustert. Die Hälfte jeder weißen Kolonie wurde mit einem sterilen Zahnstocher abgenommen und zu 50 μl Lösung von TE-Puffer, der 1% Triton-X-100 enthielt, gegeben. Der Zahnstocher wurde herumgewirbelt, um die Zellen zu entfernen, und dann entsorgt. Diese Röhrchen wurden anschließend bei 95°C für 10 Minuten inkubiert, um die Zellen zu lysieren, für 5 Minuten zentrifugiert, um Zelltrümmer zu entfernen, und der Überstand wurde in ein sauberes Röhrchen überführt.
Ein aliquoter Teil von 5 μl von diesem Überstand wurde in eine PCR-Reaktion mit den M13-Vorwärts- und -Rückwärtsprimern eingesetzt. Kurz gefaßt wurden 5 μl rohes Lysat in 67 mM Tris-HCl (pH 7,6), 16,6 mM (NH₄)₂SO₄, 2 mM MgCl₂, 200 μM von jedem dNTP, 12,5 pmol jedes Primers, 0,5 Einheiten Tth Plus (Biotech International) und sterilem destilliertem Wasser vervielfältigt. Die Reaktionen wurden auf einem OmniGene Thermozykler (Hybaid) unter Verwendung der folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt. Ein Zyklus bei 94°C für 2 Minuten, 55°C für 2 Minuten und 72°C für 2 Minuten, gefolgt von 30 Zyklen bei 94°C für 30 Sekunden, 55°C für 1 Minute und 72°C für 2 Minuten mit einem abschließenden Zyklus bei 94°C für 30 Sekunden, 55°C für 1 Minute und 72°C für 10 Minuten. Ein aliquoter Teil (5–10 μl) des vervielfältigten Produkts wurde dann auf einem 1%-igen Agarosegel laufen gelassen und bezüglich der Größe geprüft.
Wenigstens 10 weiße Kolonien von jeder Ligation wurden unter Verwendung des oben beschriebenen PCR-Protokolls hinsichtlich des Vorhandenseins von Insertionen geprüft. Insertionen wurden unter Verwendung von Sac II- und Pst I-Restriktionsenrymen (Pharmacia) ausgeschnitten, auf einem 1%-igen Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt Elektroforese unterzogen und die Insertion unter Anwendung des Spritzenverfahrens aus dem Gel gereinigt. An diesem Punkt wurden die Insertionen erneut mittels Dot-Blots hinsichtlich Spezifität geprüft, und für Cryptosporidium spezifische Insertionen wurden für eine Sequenzierung ausgewählt.
Sequenzierung und Synthese von Primern
Sequenzierung wurde unter Verwendung des von Applied Biosystems gelieferten Taq DyeDeoxy^TM Terminator Cycle Sequencing Kit durchgeführt. Sequenzen wurden unter Verwendung der Programme Seqed und DNA-Strider aneinander ausgerichtet und mit den Datenbanken Genebank und EMBL hinsichtlich Sequenzhomologie verglichen. Eine Anzahl von Primersequenzen wurden unter Verwendung des Computerprogramms Amplify^TM von der 021-Sequenz entworfen, und Oligonukleotide wurden mittels DNA-Express synthetisiert.
Primer
Die 021-Vorwärts- und 021-Rückwärtsprimer, die bei Vervielfältigung von Cryptosporidium parvum-DNA ein 668 Bp großes Fragment erzeugten, sind unten aufgelistet. Ein Oligonukleotid, das bezüglich der von den 021-Primern vervielfältigten Sequenz innen liegt, wurde ebenfalls synthetisiert für eine Verwendung als eine Sonde zur Bestätigung des Parasitenursprungs des vervielfältigten Produkts. Ein zweiter Satz von Primern, der als CP1-Vorwärts und -Rückwärts bezeichnet wurde, und ein innen liegendes Oligonukleotid, das als CPI bezeichnet wurde, wurden ebenfalls von der 021-Sequenz entworfen. Diese Primer erzeugten ein etwa 426 Bp großes Fragment bei Vervielfältigung von Cryptosporidium-DNA.
Die Sequenz des diagnostischen Fragments ist unten gezeigt, wobei die Positionen, an welchen die Primer binden, unterstrichen sind. Die CP1-Vorwärts- und -Rückwärtsprimer sind als innerhalb der von den 021-Primern spezifizierten Sequenz bindend gezeigt und erzeugen ein 426 Bp großes Fragment bei Vervielfältigung.
Diagnostische PCR-Bedingungen
Die PCR-Bedingungen für die diagnostischen 021-PCR-Primer bestanden aus 67 mM Tris-HCl (pH 7,6), 16,6 mM (NH₄)₂SO₄, 1,5 mM MgCl₂, 200 μM von jedem dNTP, 6,5 pmol von jedem Primer, 0,25 Einheiten Tth Plus (Biotech International) und sterilem destilliertem Wasser. Reaktionen wurden auf einem OmniGene Thermozykler (Hybaid) unter Verwendung der folgenden Zyklenbedingungen durchgeführt. Ein Zyklus bei 94°C für 2 Minuten, 58°C für 2 Minuten und 72°C für 2 Minuten, gefolgt von 40 Zyklen bei 94°C für 30 Sekunden, 58°C für 1 Minute und 72°C für 2 Minuten mit einem abschließenden Zyklus bei 94°C für 30 Sekunden, 58°C für 1 Minute und 72°C für 10 Minuten. Die PCR-Bedingungen für die CP1-Primer waren im wesentlichen die gleichen, ausgenommen daß 2 mM MgCl₂ und eine Annealingtemperatur von 59°C verwendet wurden.
Diagnostischer Test
Für das Testen der Empfindlichkeit wurden rohe Oozystenpräparationen in 10 μl T.E. resuspendiert. Durch Reihenverdünnungen wurden abnehmende Konzentrationen von Oozystensuspensionen hergestellt. Für eine direkte PCR-Analyse von Fäkalienproben wurden 0,5 g Fäkalien mit 4 ml PBS gemischt, und diese Aufschlämmung wurde dann 1:20 in T.E. verdünnt. Die Proben wurden dann dreimal eingefroren und aufgetaut, für 5 Minuten gekocht, für 1 Minute zentrifugiert, um Trümmer zu entfernen, und dann wurden 5–10 μl des Überstandes direkt zu der PCR-Reaktion zugegeben.
Die oben genannten Oligonukleotidsequenzen sind dahingehend einzigartig, daß ein Vergleich der von dem 021-Klon erhaltenen Sequenzinformation mit den Datenbanken Genebank und EMBL keine Homologie von irgendeiner Signifikanz lieferte. Die Spezifität der von dem 021-Klon entworfenen Primer wurde getestet, indem PCR-Reaktionen an DNA durchgeführt wurden, die von Giardia duodenalis, menschlichem Blut, menschlichen Fäkalien, Tritrichomonas foetus und C. serpentis extrahiert worden war. Mit beiden Sätzen von Primern wurde DNA der korrekten Größe nur von Cryptosporidium parvum-DNA vervielfältigt. Mit keiner der anderen getesteten DNAs wurde eine Vervielfältigung beobachtet (siehe 1a und b).
Die Primer wurden auch an Cryptosporidium von sowohl menschlichem als auch Rinderursprung getestet und die PCR-Produkte durch Hybridisierung an das innen liegende Oligonukleotid bestätigt. Diese diagnostischen Primer wurden dann dazu verwendet, über 40 verschiedene Isolate von Cryptosporidium parvum von sowohl menschlichem als auch Rinderursprung zu vervielfältigen (aufgelistet in Tabelle 1), um zu bestimmen, ob die Primer einige oder alle Isolate erkennen würden. Alle getesteten Isolate erzeugten bei Vervielfältigung die korrekte Größe (siehe 2a, 2b und 3).
Das in 2a dargestellte Gel wurde dann auf Hybond N⁺ (Amersham) geblottet und mit den Sonden des innen liegenden Oligonukleotids sondiert, um den Parasitenursprung der Banden zu bestätigen (2b).
Die Vervielfältigungsprodukte der CPF-Primer wurden ebenfalls mit einem innen liegenden Oligonukleotid sondiert, um den Parasitenursprung der Banden zu bestätigen. In allen Fällen hybridisierte das 446 Bp große Vervielfältigungsprodukt stark mit dem innen liegenden Oligo, was zeigte, daß die Reaktion für Cryptosporidium spezifisch war (Daten nicht gezeigt).
Bezüglich der Detektionsgrenzen der Primer wurde gefunden, daß sie bei einer Oozyste lagen (siehe 4a) sowohl mit den 021- als auch den CP1-Primern (siehe 4b), wenn aus Rohpräparationen von Oozysten vervielfältigt wurde.
Die Primer wurden auch zur reproduzierbaren Vervielfältigung von Cryptosporidium direkt aus gekochten Fäkalien verwendet (siehe 5a). Die meisten der acht getesteten Fäkalienproben enthielten relativ niedrige Anzahlen an Oozysten (im Bereich von 1 × 10³ bis 5 × 10⁵ Oozysten pro Gramm Fäkalien, wobei eine Probe, H20, 1,5 × 10⁶ Oozysten pro Gramm Fäkalien enthielt). Anders als die anderen Proben war eine Probe, H27, ein fester Stuhl, und es war notwendig, eine rohe PBS-Ether-Extraktion von dieser Probe durchzuführen, um ein reproduzierbares Vervielfältigungsprodukt zu erhalten (siehe 5a).
5b zeigt Vervielfältigungsprodukte von 9 Fäkalienproben unter Verwendung der CP1-Primer. Spur 1 = Molekulargewichtsmarker; Spur 2 = F1; Spur 3 = F9; Spur 4 = F10; Spur 5 = F11; Spur 6 = F20; Spur 7 = F21; Spur 8 = F22; Spur 9 = F35; Spur 10 = F36; Spur 11 = F38; Spur 12 = Negativkontrolle.
Die Sequenzen der zwei menschlichen und der zwei Kälberisolate von Cryptosporidium parvum wurden über die Länge des diagnostischen Fragments verglichen, um das Ausmaß an Sequenzkonservierung zwischen den Isolaten zu bestimmen (siehe 6). Direkte PCR-Sequenzierung wurde unter Verwendung des von Applied Biosystems gelieferten Taq DyeDeoxy^TM Terminator Cycle Sequencing Kit durchgeführt. Die Sequenzen wurden unter Verwendung des CLUSTAL V Mehrsequenzausrichtungsprogramms aneinander ausgerichtet. Die Ausrichtung zeigt, daß die Sequenzen zwischen Isolaten konserviert sind, jedoch mit einer Anzahl von Sequenzunterschieden zwischen den menschlichen und den Kälberisolaten. Diese Befunde sind in Übereinstimmung mit RAPD-Analysen an diesen Isolaten, die von Morgan, Constantine, O'Donoghue, Meloni, O'Brien & Thompson (1995). "Molecular Characterisation of Cryptosporidium isolates from humans and other animals using RAPD (Random Applied Polymorphic DNA) analysis". American Journal of Tropical Medicine and Hygiene" 52 559–564, beschrieben wurden, welche über genetische Unterschiede zwischen menschlichen und Kälberisolaten berichteten. Die beobachteten Unterschiede zwischen den menschlichen und den Kälberisolaten sind nicht ausreichend, um eine Primerbindung zu stören, und sowohl menschliche als auch Kälberisolate werden bei Verwendung von sowohl den 021- als auch den CP1-Primern vervielfältigt (Primersequenzen sind unterstrichen). Unter den gegebenen Unterschieden zwischen den menschlichen und den Kälberisolaten wäre es jedoch möglich, Primer zu konstruieren, welche zwischen menschlichen und tierischen Isolaten unterscheiden konnten (d.h. einen Satz von Primern, der nur menschliche Isolate vervielfältigen würde, und einen zweiten Satz, der nur Kälber-/Tierisolate vervielfältigen würde). Primer, die für tierische oder menschliche Isolate spezifisch sind, wären sehr nützlich in Übertragungsstudien und auch für die Umweltanalyse bei der Bestimmung der wahrscheinlichen Quelle von einer Kontamination der Wasserversorgung (d.h. Mensch oder Tier).
Die oben genannte Sequenz wurde analysiert, um zu bestimmen, ob die Sequenz von einem codierenden oder einem nicht codierenden Abschnitt von DNA stammte oder nicht. Es wurde eine Anzahl von Computerprogrammen verwendet, einschließlich CODON PREFERENCE, welches ein rasterspezifischer Genauffinder ist, der versucht, Protein codierende Sequenzen anhand der Ähnlichkeit von deren Codongebrauch gegenüber einer Codonhäufigkeitstabelle oder anhand der Tendenz ihrer Zusammensetzung (üblicherweise GC) in der dritten Position jedes Codons zu erkennen. Eine Analyse der Sequenz unter Verwendung dieser Programme legt jedoch nahe, daß das 021-Fragment wahrscheinlich keine codierenden Bereiche enthält.
Die RAPD-Analyse wurde dazu verwendet, diagnostische Primer für Cryptosporidium parvum zu entwickeln, von denen gezeigt wurde, daß sie sowohl spezifisch als auch empfindlich sind. Sowohl die 021- als auch die CP1-Primer scheinen sehr spezifisch für Cryptosporidium zu sein, können bereits nur eine Oozyste feststellen und können Cryptosporidium direkt aus gekochten Fäkalien vervielfältigen. Über 47 verschiedene Isolate von Cryptosporidium parvum von sowohl menschlichem als auch Rinderursprung von verschiedenen geographischen Orten wurden unter Verwendung dieser Primer durchmustert und alle vervielfältigten die Bande mit der korrekten Größe, was anzeigt, daß die von den Primern begrenzte Sequenz unter den Isolaten konserviert ist.
Der Spezifitätstest der RAPD-Primer umfaßte nicht Cryptosporidium baileyi-, Cryptosporidium meleagridis- oder Cryptosporidium muris-DNA, da eine Quelle für dieses Material nicht einfach zur Verfügung stand. Obwohl berichtet wurde, daß Cryptosporidium muris im Rind in den Vereinigten Staaten vorkommt, und Oozysten, die Cryptosporidium baileyi ähneln, von einem immunologisch geschwächten menschlichen Patienten gewonnen wurden, werden diese Spezies von Cryptosporidium nicht allgemein im Viehbestand und insbesondere nicht vom Menschen berichtet. Eine weitere Optimierung des Tests ist erforderlich, um die Vervielfältigung von allen Cryptosporidium-Isolaten direkt von Fäkalien ohne jegliche vorherige Aufreinigung zu ermöglichen.
Die hierin beschriebenen RAPD-Primer könnten sowohl in der Diagnose von Cryptosporidium von Fäkalienproben als auch in der Umweltüberwachung verwendet werden. Das Ausmaß an Fachkenntnis, das für eine mikroskopische Identifizierung von Cryptosporidium-Oozysten erforderlich ist, die niedrige Empfindlichkeit derzeitiger diagnostischer Verfahren und die variierende Fachkenntnis zwischen Laboratorien und Technikern können in vielen Fällen dazu führen, daß eine schwache Cryptosporidieninfektion undiagnostiziert bleibt. Ein einfaches PCR-Detektionssystem, das Primer der vorliegenden Erfindung verwendet, sollte die Detektion und Diagnose von Cryptosporidium erheblich verbessern.
Ausbrüche von Cryptosporidiose in Kindertagesstätten werden häufig berichtet (Alpert et al. 1986; Crawford et al. 1988, Diers & McCallister 1989, Ferson & Young 1992, Hanna & Brooks 1995) und Familienmitglieder sind während solcher Ausbrüche häufig betroffen. Ein Anteil von jeder Gruppe ist asymptomatisch und kann als Träger der Infektion zu Verwandten und in die Gemeinschaft dienen. Daher ist das öffentliche Gesundheitsproblem der Übertragung auf die Gemeinschaft aus diesen Stätten ein wichtiges und erfordert weitere Bewertung und Kontrolle. Bei Untersuchungen, die bei Ausbrüchen von Durchfall vorgenommen wurden, wurden jedoch häufig beschränkte diagnostische Tests eingesetzt, die dazu neigten, Mittel zu verwenden, die in mikrobiologischen Standardlaboratorien einfach identifizierbar sind (Thompson 1994). Empfindliche, molekülbasierte Werkzeuge, wie die hierin beschriebenen PCR-Primer, werden es ermöglichen, daß genauere molekularepidemiologische Studien durchgeführt werden, um nicht nur die tatsächliche Verbreitung von Cryptosporidium in der Gemeinschaft, sondern auch die mit einer Infektion einhergehenden Risikofaktoren zu bestimmen.
Eine jüngere Erhebung in den Vereinigten Staaten, die von Clancy et al. (1994) "Commercial labs: how accurate are they?" Journal of the American Water Works Association. 86: 89–97 durchgeführt wurde, offenbarte, daß kommerzielle Laboratorien einen Mangel an Kenntnis beim Testen von Wasserproben hinsichtlich Giardia und Cryptosporidium aufwiesen. Mit der Implementierung der Informationssammelregel (ICR) 1995 in den Vereinigten Staaten, welche das Testen auf Giardia und Cryptosporidium in Wassersystemen, die mehr als 10.000 Menschen versorgen, vorschreibt, ist die Entwicklung von genauen und empfindlichen Untersuchungen auf Cryptosporidium von großer Bedeutung.
Als ein Ergebnis dieser Studie werden hochgradig empfindliche und spezifische diagnostische PCR-Primer für Cryptosporidium entwickelt.
Literatur

ALPERT, G. L. M., BELL, C. E., KIRKPATRICK, L. D., BUDNICK, J. M., CAMPOS, H. M., FRIEDMAN, H. M. und PLOTKIN, S. A. (1986) Outbreak of cryptosporidiosis in a day-care centre. Pediatrics. 77, 152–156.
CRAWFORD, F. G., VERMUND, S. H., MA, J. Y. und DECKELBAUM, R. J. (1988). Asymptomatic cryptosporidiosis in a New York City day care centre. Paediatrc Infectious Disease Journal. 7, 806.
DIERS, J. & McCALLISTER, G. L. (1989). Occurrence of Cryptosporidium in home daycare centres in West-Central Colorado. Journal of Parasitology. 75, 637–638.
FERSON, M. J. & YOUNG, L. C. (1992). Cryptosporidium and coxsackievirus B5 causing epidemic diarrhoea in a child-care centre. Medical Journal of Australia. 156, 813.
HANNA, J. & BROOKS, D. (1995). Cryptosporidiosis in a child day-care centre. Communicable Disease Intelligence. 19, 6–7.
THOMPSON, S. C. (1994). Infectious diarrhoea in children – controlling transmission in the child care setting. Journal of Paediatric Child Health. 30, 210–219.

SEQUENZINFORMATION SEQ. ID. NO. 1:
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Gereinigte und isolierte Cryptosporidium-DNA-Sequenz mit der Nukleotidsequenz
Verfahren zum Feststellen und/oder Identifizieren des Vorhandenseins von genomischem Material von Cryptosporidium in einer Probe, wobei das Verfahren die Stufen umfaßt, in denen man: (i) wenigstens einen Primer oder eine Sonde von der Nukleotidsequenz gemäß Patentanspruch 1 auswählt und (ii) den (die) Primer oder die Sonde dazu verwendet, das Vorhandensein von genomischem Material von Cryptosporidium in der Probe festzustellen und/oder zu identifizieren, wobei der (die) Primer oder die Sonde nicht die Nukleotidsequenzen ACAATTAAT, CTTTTTGGT, AATTTATATAAAATATTTTGATGAA und TTTTTTTTTTTAGTAT sind.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei das genomische Material von Cryptosporidium in der Probe durch einen Hybridisierungsassay festgestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Sonde oder der (die) Primer wenigstens 5 Nukleotide lang ist (sind).
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Sonde oder der (die) Primer etwa 10 bis 50 Nukleotide lang ist (sind).
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Sonde oder der (die) Primer etwa 20 bis 24 Nukleotide lang ist (sind).
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Sonde oder der (die) Primer unter einer der folgenden Sequenzen ausgewählt ist (sind):
Verfahren zum Feststellen und/oder Identifizieren von Mikroorganismen der Gattung Cryptosporidium mit den Stufen, in denen man: (i) wenigstens einen Satz von Primern von der in Patentanspruch 1 definierten Nukleotidsequenz auswählt, welche für Cryptosporidium-DNA spezifisch sind, (ii) die Primer mit einer Probe mischt, von der man annimmt, daß sie Cryptosporidium-DNA enthält, (iii) das (die) Produkt(e) aus Stufe (ii) mittels der Polymerase-Kettenreaktion vervielfältigt, (iv) das Vorhandensein des Produkts aus Stufe (iii) feststellt, wobei der (die) Primer oder die Sonde nicht die Nukleotidsequenzen ACAATTAAT, CTTTTTGGT, AATTTATATAAAATATTTTGATGAA und TTTTTTTTTTTAGTAT sind.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Primer unter den folgenden Primerpaaren ausgewählt sind:
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Primer unter den folgenden Primerpaaren ausgewählt sind:
Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Primerpaar GGTACTGGATAGATAGTGGA (Vorwärtsprimer) und TCGCACGCCCGGATTCTGTA (Rückwärtsprimer) ist.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Primerpaar GAGATTCTGAAATTAATTGG (Vorwärtsprimer) und CCTCCTTCGTTAGTTGAATCC (Rückwärtsprimer) ist.
Verfahren nach Anspruch 2 oder 8, wobei das Verfahren eine weitere Stufe des Testens der Lebensfähigkeit und/oder der Infektiosität von Cryptosporidium-Organismen in der Probe umfaßt.
Kit für das Feststellen von Cryptosporidium-Isolaten, wobei der Kit wenigstens eine Sonde oder einen Primer bzw. Primer, ausgewählt von der in Patentanspruch 1 definierten Nukleotidsequenz, enthält, welcher in der Lage ist, Cryptosporidium-Isolate festzustellen, wobei der (die) Primer oder die Sonde nicht die Nukleotidsequenzen ACAATTAAT, CTTTTTGGT, AATTTATATAAAATATTTTGATGAA und TTTTTTTTTTTAGTAT sind.
Kit nach Anspruch 14, wobei der Kit ein unter den Primern, die in einem der Ansprüche 9, 10, 11 oder 12 definiert sind, ausgewähltes Primerpaar enthält.