DE69121975T2

DE69121975T2 - Spezifischer Nachweis von Mycobacterium Tuberculosis

Info

Publication number: DE69121975T2
Application number: DE69121975T
Authority: DE
Inventors: Jean-Luc Guesdon; Dominique Thierry
Original assignee: Institut Pasteur de Lille
Current assignee: Institut Pasteur de Lille
Priority date: 1990-06-08
Filing date: 1991-06-07
Publication date: 1997-03-27
Anticipated expiration: 2011-06-08
Also published as: ES2093688T3; FR2663033B1; DK0461045T3; DE69121975D1; FR2663033A1; HK1000072A1; EP0461045A1; WO1991019004A1; CA2084894A1; JPH05507617A; EP0461045B1; ATE142702T1; GR3021781T3

Description

Die Erfindung bezieht sich auf eine spezifische Nukleinsäuresequenz von Mycobacterium tuberculosis, sowie besondere Fragmente dieser Sequenz, die geeignet sind, bei der Amplifikation der DNA, die vom Mykobakterium in einer biologischen Probe stammt, die Rolle von Nukleotidprimern zu übernehmen. Die Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zum Nachweis von Mycobacterium tuberculosis in einer biologischen Probe, wobei dieses Verfahren die besagten Nukleotidprimer verwendet.
Die Mykobakterien entsprechen der Gattung Mycobacterium, welche mindestens 54 unterschiedliche Arten aufweist.
Darunter sind ungefähr 10 für den Menschen oder das Tier pathogene oder schädliche. M. tuberculosis ist der Erreger der Tuberkulose.
Es ist bekannt, daß diese Krankheit ein größeres Problem des Gesundheitswesens darstellt; so gibt es derzeit zwischen 15 und 60 Millionen an Tuberkulose erkrankte Personen in der Welt, und 2 bis 3 Millionen Personen sterben jedes Jahr aufgrund dieser Infektion. In den entwickelten Ländern ist M. tuberculosis die häufigste Ursache von mykobakteriellen Infektionen. In Frankreich treten ungefähr 10&sup4; neue Fälle von Tuberkulose pro Jahr auf. Die Impfung mittels BCG (Calmette- und Guérin-Bazillus, ein abgeschwächter Stamm von M. bovis) ist weit davon entfernt, bei allen Populationen wirksam zu sein. Diese Wirksamkeit schwankt zwischen ungefähr 80 % in den westlichen Ländern wie England bis 0 % in Indien (Ergebnisse des letzten Impfversuchs in Chingleput). Darüber hinaus ist das Auftreten von Stämmen von M. tuberculosis, die gegenüber den üblichen Antituberkelmitteln resistent sind, und das Vorhandensein einer Korrelation zwischen Tuberkulose und AIDS, ein zusätzlicher Grund für die Dringlichkeit, ein rasches Nachweis- und Identifikationsverfahren für Mykobakterien zu entwickeln.
Eine in Florida durchgeführte Epidemiestudie hat z.B. gezeigt, daß 10 % der an AIDS leidenden Kranken zum Zeitpunkt der Diagnose von AIDS oder 18 Monate davor an Tuberkulose leiden. Bei diesen Kranken tritt in 60 % der Fälle die Tuberkulose in einer fein verteilten und somit durch die klassischen Diagnosekriterien, wie Lungen-Röntgenaufnahmen oder die Speichelanalyse, nicht lokalisierbaren Form auf.
Schließlich ist die Diagnose der Tuberkulose und anderer verwandter Mykobakteriosen aus unterschiedlichen Gründen schwer durchzuführen: die durch unterschiedliche Mykobakterien verursachten Lungenkrankheiten können klinisch, radiologisch oder histologisch nicht unterschieden werden; die Mykobakterien liegen häufig in kleiner Anzahl vor, und wenn sie durch die verwendeten klassischen Verfahren mengenmäßig nachweisbar sind, ist die Krankheit schon in der Entwicklung, und die Kranken sind für ihre Umgebung ansteckend; aufgrund der sehr langen Generationszeit dieser Bakterien (24 Stunden für M. tuberculosis im Vergleich zu 20 Minuten für E. coli) ist darüber hinaus die Kultur dieser Organismen schwierig. Daher braucht man 6 bis 8 Wochen, um die Keime zu identifizieren, und noch länger, um ein für die angemessene Behandlung der Kranken verwendbares Antibiogramm zu erhalten. Die Notwendigkeit eines Nachweistests, der keine Kultur der Keime erfordert und mit den pathologischen Proben unmittelbar verwendbar ist, selbst wenn die Keime in ihnen in geringen Konzentrationen vorliegen, ist somit unumgänglich. Es werden zur Zeit mehrere Techniken in der Klinik verwendet, um eine mykobakterielle Infektion zu identifizieren.
Zunächst muß der unmittelbare Nachweis der Mikroorganismen am Mikroskop genannt werden; diese Technik ist schnell, gestattet jedoch nicht die Identifizierung der beobachteten mycobakteriellen Art und ist in dem Maße unempfindlich, wie eine große Anzahl von Mikroorganismen in der Probe vorhanden sein muß (> 10&sup4;/ml), um einen zuverlässigen Nachweis zu ermöglichen (BATES J., CHEST, 1979, 76, (suppl.), 757 - 763).
Die Kulturen haben, wenn sie positiv sind, eine annähernd 100 %-ige Spezifizität und ermöglichen die Identifizierung der isolierten mykobakteriellen Art; allerdings kann, wie weiter oben ausgeführt, das Wachstum der Mykobakterien in vitro nur in drei bis sechs Wochen durchgeführt werden, und wenn wenig Mykobakterien am Infektionsort vorhanden sind, sind wiederholte Kulturen notwendig, um sich über ein positives Ergebnis zu vergewissern (BATES J. 1979 und BATES J. et al., Am. Rev. Respir. Dis. 1986, 134, 415 - 417).
Serologische Techniken können sich unter gewissen Bedingungen als nützlich erweisen, doch ist ihre Verwendung wegen ihrer schwachen Empfindlichkeit und/oder schwachen Spezifizität begrenzt (DANIEL T. M. et al., Am. Rev. Respir. Dis., 1987, 135, 1137 - 1151).
Das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein von Mykobakterien kann auch durch Hybridisierung mit DNA oder RNA bestimmt werden, indem man spezifische Sonden der DNA-Sequenzen verwendet (KIEHN T. E. et al., J. Clin. Microbiol., 1987, 25, 1551 - 1552; ROBERTS M. C. et al., J. Clin Microbiol., 1987, 25, 1239 - 1243; DRAKE T. A. et al., J. Clin. Microbiol., 1987, 25, 1442 - 1445). Allerdings beruhen diese Verfahren auf dem Polymorphismus der Nukleotidsequenzen der verwendeten Fragmente oder auf dem Polymorphismus der benachbarten Bereiche und erfordern ebenfalls die Kultur der Mikroorganismen.
THIERRY et al. (Nucl. Acid Res., Bd. 18 Nr. 1, Seite 188) haben eine spezifische Sequenz des als IS 6110 bezeichneten Komplexes von Mycobacterium tuberculosis beschrieben. Die Autoren schlagen vor, diese Sequenz als Gensonde (Nukleinsonde) beim Nachweis von Mycobacterium tuberculosis zu verwenden.
Allerdings sind die in der Vielzahl der biologischen Proben enthaltenen Mengen an mykobakterieller DNA nicht ausreichend, um ein positives Signal abzugeben; die Hybridisierungstechnik mittels Gensonde erwies sich somit als ungeeignet für die Identifizierung mycobakterieller DNA, die unmitterbar aus biologischen Proben extrahiert wurde.
Gewisse Autoren haben vorgeschlagen, zur Überwindung dieses Problems die vom Mykobakterium stammende DNA spezifisch zu amplifizieren, indem man Nukleotidprimer bei einem Amplifikationsverfahren wie der Polymerase-Kettenreaktion (P.C.R.) verwendet. PATEL et al. (J. Clin. Microbiol., März 1990, 513 - 518) haben die Verwendung mehrerer Nukleotidprimer beschrieben, die ausgehend von einer Sequenz ausgewählt wurden, die als Sonde bei der Identifizierung von M. tuberculosis bekannt ist. Die Länge der unter Verwendung dieser Primer gewonnenen Fragmente unterscheidet sich jedoch von der erwarteten theoretischen Länge, und man erhielt mehrere Fragmente veränderlicher Größe. Darüber hinaus haben die Autoren das Nichtvorhandensein der Hybridisierung der amplifizierten Produkte mit dem Plasmid festgestellt, das zur Bestimmung der Primer diente. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, daß diese Primer beim Nachweis des Vorhandenseins von M. tuberculosis in einer biologischen Probe nicht geeignet wären und bestätigen, daß die Auswahl der Primer kritisch ist.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zum Nachweis von M. tuberculosis bereitzustellen, das gleichzeitig spezifisch, empfindlich und zuverlässig ist und das keine vorherige Kultur der Mykobakterien erfordert.
Die Erfindung bezieht sich auf ein Nukleinsäurefragment, das vom Genom des Mycobacterium tuberculosis abgeleitet ist, dadurch gekennzeichnet, daß es aus einer der Sequenzen I, II, III und IV besteht, die wie folgt definiert sind:
I : eine Sequenz aus den nachfolgenden A bis H:
A : 5' - CCCGCGGCAAAGCCCGCAGGACCACGATCG - 3'
B : 5' - CGACCCGCCAGCCCAGGATCCTGCGAGCGT - 3'
C : 5' - GGCGGGTCCAGATGGCTTGCTCGATCGCGT - 3'
D : 5' - GTTGGCGGGTCCAGATGGCTTGCTCGATCG - 3'
E : 5' - TCAAAGGGTTTGACAAATTAATGATTGGTC - 3'
F : 5' - TCGTGTACAAAATGTGGACAAGTA - 3'
G : 5' - TCGACGGACGTCGTGACCAGAAGTC - 3'
H : 5' - GTCGACACGCCTTCTGCACGGGAAGTCCTT - 3'
II : eine Sequenz, die mindestens 10 aufeinanderfolgende Basen aus einer der Sequenzen H umfaßt und eine Gesamtlänge von ungefähr 20 bis 40 Basen hat;
III : eine Sequenz mit einer Länge von 20 bis 40 Basen, die mit der Seqenz I oder mit Sequenz II hybridisiert und die vorzugsweise mindestens 80 % Homologie mit diesen aufweist;
IV : eine Komplementärsequenz zu einer der Sequenzen I, II oder III.
Die Erfindung bezieht sich auch auf ein Paar von Nukleinsäurefragmenten, die vom Genom des Mycobacterium tuberculosis abgeleitet sind, und die geeignet sind, in einer biologischen Probe die Rolle von Nukleotidprimern bei der Amplifikation der DNA, die vom besagten Myobakterikum stammt, zu übernehmen, dadurch gekennzeichnet, daß es aus zwei Sequenzen besteht, die aus den Sequenzen I bis IV nach Anspruch 1 ausgewählt sind.
Die Erfinder haben diese Serie von Nukleinsäurefragmenten identifiziert, die geeignet sind, ausgehend von der Sequenz IS 6110 (Nucl. Acid. Res. Band 18, Nr. 1, 1990) und den Sequenzen, welche an die Sequenz IS 6110 in dem Genom von M. tuberculosis angrenzen, die Rolle von Primern zu übernehmen. Letztere wurden im Rahmen dieser Erfindung durch die Erfinder identifiziert. Die in Nucl. Acid., Res., Band 18, Nr. 1, 1990, beschriebene Sequenz IS 6110 ist Teil der in Fig. 6 gezeigten Sequenz. Insbesondere erstreckt sich die Sequenz IS 6110 von den Basen 327 bis 1687 der Sequenz von Fig. 6.
Die Primer der Erfindung haben Eigenschaften, die wesentlich sind, um ihre Verwendung bei der selektiven Amplifikation von DNA von M. tuberculosis zu ermöglichen, nämlich das Nichtvorhandensein einer Homologie mit dem menschlichen Genom und das Nichtvorhandensein einer Amplifikation verwandter Sequenzen, die in der biologischen Probe vorhanden sein können (z. B. die Sequenz von E. coli IS 3411). Darüber hinaus haben die Erfinder festgestellt, daß die unter Verwendung der Primer der Erfindung gewonnenen Ergebnisse in dem Maße sehr zuverlässig sind, wie die Länge der gewonnenen Fragmente der erwarteten theroretischen Länge entspricht und sie eine konstante und nicht veränderliche Länge haben. Dies trifft selbst für Primerpaare zu, die zur Amplifikation sehr langer Fragmente führen (von etwa 1000 bis 1500 Basen), bei denen die Gefahr einer Unterbrechnung der Polymerisation wegen der Auswirkungen der Sekundärstruktur der Sequenz sehr groß ist.
Darüber hinaus bestätigt eine Verifizierung der Amplifikationsprodukte mittels Hybridisierung einer Gensonde, welche die in Fig. 6 gezeigte Sequenz oder ein Fragment dieser Sequenz enthält, die Zuverlässigkeit dieses Verfahrens. Dieses Ergebnis war nicht vorhersehbar.
Ausgehend von der Sequenz IS 6110 wäre es möglich, eine große Anzahl von Nukleotidprimern herzustellen, von denen jedoch wenige wirkungsvoll und/oder spezifisch wären.
Fig. 6 zeigt die Positionen der Primer A bis H bezüglich der gesamten Sequenz.
Fig. 7 zeigt die Restriktionskarte der Sequenz von Fig. 6.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung wird das Primerpaar aus den Sequenzen I bis IV derart ausgewählt, daß das Amplifikationsprodukt eine Länge zwischen etwa 100 und 300 Nukleotiden, z. B. zwischen etwa 100 und 200, hat. Paare, deren positiver Primer aus der Sequenz A besteht und deren negativer Primer aus einer der Sequenzen B, C und D besteht, werden besonders bevorzugt. Ein anderes besonders bevorzugtes Primerpaar ist eines, dessen positiver Primer aus der Sequenz H besteht und dessen negativer Primer aus der zur Sequenz G komplementären Sequenz besteht.
Die Primer der Erfindung können auch aus einer Sequenz II be- stehen, die eine Länge von 20 bis 40 Basen hat und die mindestens 10 aufeinanderfolgende Basen einer der Sequenzen A bis H umfaßt. Als Beispiel dieser Art von Primer können die Fragmente einer der Sequenzen A bis H genannt werden, die zwischen 20 und 30 Basen haben, oder auch eine der Sequenzen A bis H, denen Linker hinzugefügt wurden, wie z.B. ein Linker EcoRI, GAAT. Insbesondere bevorzugt man die Verwendung von Primern, deren fünf erste Nukleotide auf der Seite 3' 100 % homolog zu denjenigen sind, die in dem entsprechenden Teil der zu amplifizierenden Sequenz vorhanden sind.
Es ist ebenfalls möglich, als Primer eine Sequenz III zu verwenden, die eine Länge von 20 bis 40 Basen hat, die unter strengen Bedingungen mit der Sequenz I oder II hybridisiert. Diese Art von Sequenz hat im allgemeinen weniger als 80 % Homologie mit der Sequenz, zu der sie hybridisiert. Auf diese Weise ist es möglich, gewisse Basen der Sequenzen A bis H mit anderen Basen zu substituieren oder Basen an die Enden der Sequenzen A bis H hinzuzufügen. Die strengen Bedingungen sind die im Stand der Technik üblicherweise verwendeten.
Die Erfindung bezieht sich auch auf Sequenzen IV, welche zu einer der Sequenzen I, II oder III komplementäre Sequenzen sind, z. B. komplementär zu einer der Sequenzen A bis H.
Die Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins von Mycobacterium tuberculosis in einer biologischen Probe, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:
i) In-Kontakt-Bringen der biologischen Probe mit einem Paar von Nukleinsäurefragmenten, besagten Primern, gemäß der Erfindung, wobei die in der Probe enthaltene DNA gegebenenfalls zuvor für die Hybridisierung zugänglich gemacht wurde und in einen Zustand gebracht wurde, der die Hybridisierung der Primer an die DNA des Mycobacterium tuberkulosis erlaubt;
ii) Amplifikation der DNA des Mycobacterium tuberculosis;
iii) Nachweis der Amplifikation von DNA-Fragmenten, die dem von den Primern flankierten Fragment entsprechen, z.B. durch Gelelektrophorese;
iv) eventuelle Nachprüfung der Sequenz des amplifizierten Fragments, z.B. durch Hybridisierung mit einer spezifischen Sonde, durch Sequenzierung oder durch Restriktionsanalyse.
Die biologische Probe kann jede Art von Probe sein, welche M. tuberculosis enthalten kann, z.B. Speichel, Urin oder Blut. Normalerweise werden die Proben einer Behandlung unterzogen, um die DNA zu extrahieren und sie der Hybridisierung zugänglich zu machen. Diese Behandlungen sind im Stand der Technik bekannt.
Die während der Amplifikation herrschenden Bedingungen können sein wie folgt:

erster Zyklus:

i) etwa 94ºC 5 min )
ii) etwa 60ºC 1 min ) 1 x

folgende Zyklen:

i) etwa 94ºC 15 s )
ii) etwa 60ºC 1 min ) 20 bis 40 x

letzter Zyklus:

i) etwa 94ºC 15 s )
ii) etwa 60ºC 5 min ) 1 x
Der Nachweis der Amplifikation kann mittels Gelelektrophorese durchgeführt werden, z.B. auf mit Ethidiumbromid gefärbtem Agarosegel. Nach der Durchführung der Amplifikation ist es im Rahmen der Erfindung möglich, die Sequenz des amplifizierten Fragments z.B. durch Gensonden-Hybridisierung nachzuprüfen, wobei die Sonde mindestens einen Teil der Sequenz aufweist. Derartige Sonden sind Plasmide pMT01, welche die Basen 1 bis 1152 der Sequenz von Fig. 6 enthalten, und das Plasmid pMT02, welches die Basen 309 bis 1219 der besagten Sequenz enthält. Weitere geeignete Sonden wären jegliche Sonde mit einer Länge von etwa 20 bis 300 Basen, die unter strengen Bedingungen mit einem Teil der Sequenz IS 6110 hybridisieren kann, die sich zwischen den beiden ausgewählten Primern befindet. Besonders bevorzugte Sonden sind die folgenden Sequenzen J, K, L, M:
J : 5' - CTGATCCGGCCACAGCCCGTCCCGCCGATC - 3'
K : 5' - AGGCGTCGGTGACAAAGGCCACGTAGGCGA - 3'
L : 5' - CGAGGACCATGGAGGTGGCCATCGTGGAAG - 3'
M : 5' - TGCCCTCATTGGCAACGTTTGCGCCCTGCC - 3'
Die während eines derartigen Nachweises herrschenden Hybridisierungsbedingungen könnten sein wie folgt:

Hybridisierung : ca.65 bis 68 ºC

6 x SSC
10 % Dextran-Sulfat
5 x Denhardt's
10 mM EDTA
0,5 % SDA
100 µg
Lachssperma-DNA

Waschen : ca. 65 ºC

- 2 x SSC(2 x 10 min)
2 x SSC + 0,1 % SDS (1 x 30 min)
0,1 x SSC(1 x 10 min)
1 x SSC entspricht 0,15 M NaCl und 0,05 M Natriumcitrat, und eine Lösung von 1 x Denhardt's entspricht 0,02 % Ficoll, 0,02 % Polyvinylpyrrolidon und 0,02 % Rinder-Albumin-Serum.
Weitere Mittel zum Nachprüfen der Amplifikationsprodukte bestehen in der direkten Sequenzierung des Fragments oder einer Restriktionsanalyse. Allerdings ist diese Nachprüfung kein obligatorischer Schritt des Verfahrens, da die Primer der Erfindung zu einer sehr getreuen Amplifikation der Sequenz führen.
Es muß gesagt werden, daß die erfindungsgemäße Amplifikation spezifisch für die DNA des Komplexes Mycobacterium tuberculosis ist (siehe z.B. Fig. 1A und B). Die bei der DNA von M. bovis-BCG, M. bovis und M. microti beobachtete Amplifikation verringert das Interesse an dem Verfahren umso weniger, als das diese Mykobakterien in der vom Menschen stammenden Probe nicht vorhanden sein können. M. bovis ist verantwortlich für die Tuberkulose bei Rindern, und M. microti ist der kausale Erreger der Tuberkulose bei Nagern. Die Primer der Erfindung führen zu keiner Amplifikation von DNA, die aus anderen Arten von Mykobakterien stammt, wie z.B. M. fortiutum, M. gordonae, M. avium, etc...
Außerdem amplifizieren die erfindungsgemäßen Primer keine DNA menschlicher oder bakterieller Herkunft (z.B. E. coli). Dies ist in Fig. 2 dargestellt.
Die Erfindung bezieht sich auch auf ein Kit für den Nachweis des Vorhandenseins des Mycobacterium tuberculosis in einer biologischen Probe, dadurch gekennzeichnet, daß es die folgenden Elemente umfaßt:
- ein Paar von Nukleinsäurefragmenten nach einem der Ansprüche 1 bis 5;
- die zum Durchführen einer Amplifikation der DNA notwendigen Reagenzien;
- gegebenenfalls einen Bestandteil, der die Nachprüfung der Sequenz des amplifizierten Fragments gestattet, insbesondere eine Gensonde, wie sie zuvor definiert wurde.
Die Erfindung bezieht sich darüber hinaus auf die in Fig. 6 dargestellte vollständige Sequenz. Die Erfinder haben festgestellt, daß diese Sequenz zwei geöffnete Leseraster enthält, von denen einer einem für Transposase kodierenden Gen ähnelt.
Die Erfindung wird nun anhand der nicht einschränkend aufzufassenden folgenden Beispiele veranschaulicht.

BEISPIELE

Beispiel 1: Auswahl und Synthese der Paare von Oligonukleotid-Primern

Ausgehend von der in Fig. 6 dargestellten vollständigen Sequenz wurden mehrere Paare von Oligonukleotid-Primern ausgewählt und synthetisiert. Diese Primerpaare sind weiter unten dargestellt. Für einige dieser Primerpaare sind die Sequenzen der Oligonukleotid-Sonden, die zum Nachweis der Amplifikationsprodukte verwendet werden können, dargestellt:

Primerpaar Nr. 1

positiver Primer: 5'- CCCGCGGCAAAGCCCGCAGGACCACGATCG - 3'
negativer Primer: 5'- CGACCCGCCAGCCCAGGATCCTGCGAGCGT - 3'
Länge des außerhalb von Primern amplifizierten Fragments: 141
Sonden des Paares Nr. 1
1) 5'- CTGATCCGGCCACAGCCCGTCCCGCCGATC - 3'
2) 5'- AGGCGTCGGTGACAAAGGCCACGTAGGCGA - 3'

Primerpaar Nr. 2

positiver Primer: 5'- CCCGCGGCAAAGCCCGCAGGACCACGATCG -3'
negativer Primer: 5'- GGCGGGTCCAGATGGCTTGCTCGATCGCGT -3'
Länge des außerhalb von Primern amplifizierten Fragments: 201
Sonden des Paares Nr. 2
1) 5'- CTGATCCGGCCACAGCCCGTCCCGCCGATC - 3'
2) 5'- CGAGGACCATGGAGGTGGCCATCGTGGAAG - 3

Primerpaar Nr. 3

positiver Primer : 5'- CCCGCGGCAAAGCCCGCAGGACCACGATCG - 3'
negativer Primer : 5'- GTTGGCGGGTCCAGATGGCTTGCTCGATCG - 3'
Länge des außerhalb von Primern amplifizierten Fragments: 204
Sonden des Paares Nr. 3
1) 5'- CTGATCCGGCCACAGCCCGTCCCGCCGATC - 3'
2) 5'- CGTCGAGGACCATGGAGGTGGCCATCGTGG - 3'

Primerpaar Nr. 4

positiver Primer : 5'- CCCGCGGCAAAGCCCGCAGGACCACGATCG - 3'
negativer Primer : 5'- TCAAAGGGTTTGACAAATTAATGATTGGTC - 3'
Länge des außerhalb von Primern amplifizierten Fragments: 740

Primerpaar Nr. 5

positiver Primer : 5'- CCCGCGGCAAAGCCCGCAGGACCACGATCG - 3'
negativer Primer : 5'- TCGTGTACAAAATGTGGACAAGTA - 3'
Länge des außerhalb von Primern amplifizierten Fragments: 770

Primerpaar Nr. 6

positiver Primer : 5'- TCGACGGACGTCGTGACCAGAAGTC - 3'
negativer Primer : 5'- CGACCCGCCAGCCCAGGATCCTGCGAGCGT - 3'
Länge des außerhalb von Primern amplifizierten Fragments: 980

Primerpaar Nr. 7

positiver Primer : 5'- TCGACGGACGTCGTGACCAGAAGTC - 3'
negativer Primer : 5'- GGCGGGTCCAGATGGCTTGCTCGATCGCGT - 3'
Länge des außerhalb von Primern amplifizierten Fragments: 1040

Primerpaar Nr. 8

positiver Primer : 5'- TCGACGGACGTCGTGACCAGAAGTC - 3'
negativer Primer : 5'- TCGTGTACAAAATGTGGACAAGTA - 3'
Länge des außerhalb von Primern amplifizierten Fragments: 1550

Primerpaar Nr. 9

positiver Primer: 5'- GTCGACACGCCTTCTGCACGGGAAGTCCTT - 3'
negativer Primer: 5'- GACTTCTGGTCACGACGTCCGTCGAA - 3'
Länge des außerhalb von Primern amplifizierten Fragments: 219
Sonde des Paares Nr. 9:
5'- TGCCCTCATTGGCAACGTTTGCGCCCTGCC - 3'

Beispiel 2: Nachprüfung der Spezifizität der Primer bezüglich anderer Arten von Mykobakterien

Die Spezifizität der Primer wurde nachgeprüft unter Verwendung von DNA unterschiedlicher Bakterienarten, die der Gattung Mycobacterium angehören.
Die aus Proben unterschiedlicher Arten von Mycobacteria stammende gesamte DNA wird einer Amplifikation mittels der Technik der "Polymerase Chain Reaktion" (P. C. R.) ausgesetzt, indem man das in Beispiel 1 gezeigte Primerpaar Nr. 1 verwendet.
Die Parameter der Schritte der P.C.R. wurden wie folgt ausgewählt:

erster Zyklus:

i) etwa 94ºC 5 min )
ii) etwa 60ºC 1 min ) 1 x

folgende Zyklen:

i) etwa 94ºC 15 s )
ii) etwa 60ºC 1 min ) 20 bis 40 x

letzter Zyklus:

i) etwa 94ºC 15 s )
ii) etwa 60ºC 5 min ) 1 x
Die Amplifikationsprodukte werden durch Elektrophorese in Agarosegel und Färbung mit Ethidiumbromid analysiert.
Fig. 1A zeigt die Ergebnisse. Die in Fig. 1A gezeigten Bahnen entsprechen den folgenden Proben:
1 - Größenmarkierer
2 - Mycobacterium tuberculosis
3 - M. bovis-BCG
4 - M. bovis
5 - M. Microti
6 - M. fortiutum
7 - M. gordonae
8 - M. intracellularae
9 - M. paratuberculosis
10 - M. scrofulaceum
11 - M. avium
12 - TE-Puffer
Fig. 1B zeigt die gewonnenen Ergebnisse, wenn das Plasmid pMT02 (markiert durch AAF gemäß Kourilsky et al, französische Patentanmeldung 8 124 131) als Sonde für die in diesem Beispiel gewonnenen Amplifikationsprodukte verwendet wurde. Der Aufbau des Plasmids pMT02 ist in Beispiel 6 beschrieben.

Beispiel 3: Nachprüfung der Spezifizität der Primer bezüglich der von Escherichia Coli oder menschlichen Zellen stammenden DNA

Menschliche DNA kann die zu analysierenden Proben kontaminieren. Das in Beispiel 2 beschriebene Amplifikationsverfahren wird auf Proben von Gesamt-DNA in der Gegenwart des Primerpaares Nr. 1 angewandt.
Die Amplifikationsprodukte werden mittels Elektrophorese in Agarosegel und Färbung mit Ethidiumbromid analysiert. Fig. 2 zeigt die Ergebnisse, wobei die unterschiedlichen Spuren den folgenden Proben entsprechen:
1 - Mycobacterium tuberculosis
2 - menschliche DNA
3 - Mycobacterium tuberculosis + menschliche DNA
4 - DNA von Escherichia coli
5 - TE-Puffer

Beispiel 4: Verwendung der Primer bei DNA biologischer Proben

10 µl der amplifizierten Proben, die von der Expektoration Tuberkulosekranker stammen, werden auf ein 2 %-iges Agarosegel in einem TGA-Puffer (0,04 M Tris-Acetat, 0,001 M EDTA) und 1 µg/ml EtBr aufgebracht. Die Amplifikation wird durch das Verfahren der Polymerase Chain Reaktion (P.C.R.) nach Saiki et al (Science, 1988, 239, 487 - 491) durchgeführt, indem man 12,5 pmol der Oligonukleotide (Primerpaar Nr. 1) und DNA von biologischen Proben mit 2U Taq-Polymerase in einem Puffer aus 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 2,4 mM MgCl&sub2;, 300 µM Desoxyribonukleotide und 100 µg/ml Gelatine verwendet. Das Endvolumen der Reaktion ist 100 µl. Die Parameter der P.C.R.-Schritte wurden auf die folgende Weise ausgewählt: 1 min bei 94 ºC, 1 min bei 50 ºC, 1 min bei 72 ºC, und dies während 40 Zyklen.
Fig. 3 zeigt die Ergebnisse der Analyse auf Agarosegel nach P.C.R. dieser Proben. Die Bahnen 1 bis 11 entsprechen biologischen Proben, die von 11 unterschiedlichen Personen stammen. Diese Ergebnisse wurden duch unmittelbares Ablesen am Mikroskop nachgeprüft und bestätigten die durch Amplifikation erzielten Ergebnisse:
negative biologische Proben beim direkten Lesen:
Zeilen 1-3-4-5-6-9-10;
positive biologische Proben beim direkten Lesen:
Zeilen 2-7-8-11;
Die amplifizierten Banden werden unter UV sichtbar gemacht.

Beispiel 5: Auf Agarosegel durchgeführte Analyse von M. tuberculosis - DNA, die mit unterschiedlichen Paaren von Oligonukleotiden amplifiziert wurde

10 µl der amplifizierten Proben werden auf ein 2 %-iges Agarosegel gebracht. Die Amplifikation wird nach dem schon beschriebenen Verfahren unter Verwendung mehrerer in Beispiel 1 beschriebener Primerpaare durchgeführt.
Fig. 4 zeigt diese Ergebnisse:
Linie 1: Primerpaar Nr. 8
Linie 2: Primerpaar Nr. 7
Linie 3: Primerpaar Nr. 6
Linie 4: Primerpaar Nr. 5
Linie 5: Primerpaar Nr. 4
Linie 6: Primerpaar Nr. 2
Linie 7: Primerpaar Nr. 1
Linie 8: negative Kontrolle
M = Markierer
Die amplifizierten Banden werden unter UV sichtbar gemacht.
Diese Ergebnisse bestätigen, daß die amplifizierten Fragmente eine der theoretischen Länge entsprechende Länge haben, die auf der Grundlage des Abstands zwischen jedem Primer berechnet wird. Überraschend ist, daß trotz der Verwendung gewisser Primerpaare, die zur Amplifikation sehr langer Fragmente führen, keine Unterbrechnung der Polymerisation, die sich aus einer Sekundärstruktur der Sequenz ergibt, beobachtet wird.
Die Ergebnisse wurden durch Hybridisierung mit dem Plasmid pMT01 nachgeprüft (CNCM I-900, hinterlegt am 25.08.89), welches die Basen 1 bis 1152 der in Fig. 6 dargestellten Sequenz enthält.

Beispiel 6: Aufbau des Plasmids pMT02

Das Plasmid pMT02 wurde in dem Vektor pUC18 durch Klonierung eines Fragments aus 900 Paaren von Basen Hind III/Bam HI aufgebaut, die aus der Sequenz IS 6110 hervorgehen (dieses Fragment entspricht den Basen 309 bis 1219 der in Fig. 6 dargestellten Sequenz).
Das Plasmid pMT02 kann während der Nachprüfung der amplifizierten Sequenzen als Sonde dienen. Die Spezifizität von pMT02 wurde mittels Southern Blot nach vollständiger Verdauung unterschiedlicher mykobakterieller DNA durch Bam HI bestimmt.
Die Ergebnisse sind in Fig. 5 gezeigt.
Die unterschiedlichen Bahnen der Fig. 5 haben die folgenden Bedeutungen:
1 - M. tuberculosis )
2 - M. bovis-BCG )
3 - M. bovis )
4 - M. microti ) tuberculosis-Komplex
5 - M. paratuberculosis )
6 - M. tntracellularae )
7 - M. scrofulaceum )
8 - M. avium ) avium-Komplex

Claims

1. Nukleinsäurefragment, das vom Genom des Mycobacterium tuberculosis abgeleitet ist, dadurch gekennzeichnet, daß es aus einer der Sequenzen I, II, III und IV besteht, die sich wie folgt definieren:

I: eine Sequenz aus den nachfolgenden Sequenzen A bis H:

A : 5' - CCCGCGGCAAAGCCCGCAGGACCACGATCG - 3'

B : 5' - CGACCCCCCAGCCCAGGATCCTGCGAGCGT - 3'

C : 5' - GGCGGGTCCACATGGCTTGCTCGATCGCGT - 3'

D : 5' - GTTGGCGGGTCCAGATGGCTTGCTCGATCG - 3'

E : 5' - TCAAAGGGTTTGACAAATTAATGATTGGTC - 3'

F : 5' - TCGTGTACAAAATGTGGACAAGTA - 3'

G : 5' - TCGACGCACGTCGTGACCAGAAGTC - 3'

H : 5' - GTCGACACGCCTTCTGCACGGGAAGTCCTT - 3'

II: eine Sequenz, die wenigstens 10 aufeinanderfolgende Basen aus einer der Sequenzen A bis H umfaßt und die eine Gesamtlänge von ungefähr 20 bis 40 Basen aufweist,

III: eine Sequenz mit einer Länge von 20 bis 40 Basen, die mit der Sequenz I oder mit der Sequenz II hybridisiert und die vorzugsweise mindestens 80 % Homologie mit diesen aufweist.

IV: eine Komplementärsequenz zu einer der Sequenzen I, II oder III.

2. Paar von Nukleinsäurefragmenten, die vom Genom den Mycobacterium tuberculosis abgeleitet sind und die geeignet sind, in einer biologischen Probe die Rolle von Nukleotidprimern bei der Amplifikation der DNA, die vom besagten Mycobacterium stammt, zu übernehmen, dadurch gekennzeichnet, daß es aus zwei Sequenzen besteht, die aus den Sequenzen I bis IV nach Anspruch 1 ausgewählt sind.

3. Fragmentpaar nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens einer der Bestandteile des Paares aus einer Sequenz besteht, die zu der Gruppe I gehört.

4. Fragmentpaar nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß es zum einen aus einer der Sequenzen A oder G und zum anderen aus einer der Sequenzen B, C, D, E, F besteht oder als weitere Möglichkeit aus der Sequenz H und aus der Komplementärsequenz zur Sequenz G besteht.

5. Fragmentpaar nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es zum einen aus der Sequenz A und zum anderen aus einer der Sequenzen B, C oder D besteht.

6. Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins von Mycobacterium tuberculosis in einer biologischen Probe, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:

i) In-Kontakt-Bringen der biologischen Probe mit einem Paar von Nukleinsäurefragmenten, besagten Primern, nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die in der Probe enthaltene DNA ggf. zuvor für die Hybridisierung zugänglich gemacht wurde und in einen Zustand gebracht wurde, der die Hybridisierung der Primer an die DNA des Mycobacterium tuberculosis erlaubt,

ii) Amplifikation der DNA des Mycobacterium tuberculosis,

iii) Nachweis der Amplifikation von DNA-Fragmenten, die dem Fragment entsprechen, das von den Primern flankiert ist, z. B. durch Gelelektrophorese,

iv) eventuelle Nachprüfung der Sequenz des amplifizierten Fragments, z. B. durch Hybridisierung mit einer spezifischen Sonde, durch Sequenzierung oder durch Restriktionsanalyse.

7. Nachweisverfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß während der Amplifikation der DNA folgende Bedingungen herrschen:

erster Zyklus:

i) etwa 94ºC 5 min )

ii) etwa 60ºC 1 min ) 1 X

folgende Zyklen:

i) etwa 94ºC 15 s )

ii) etwa 60ºC 1 min ) 20 bis 40 X

letzter Zyklus:

i) etwa 94ºC 15 s )

ii) etwa 60ºC 5 min ) 1 X

8. Gensonde, die geeignet ist, die Amplifikationsprodukte nachzuweisen, die aus einem Nachweisverfahren nach einem der Ansprüche 6 oder 7 resultieren, dadurch gekennzeichnet, daß sie umfaßt:

i) entweder eine Sequenz mit einer Länge von etwa 20 bis 300 Basen, die in der Lage ist, mit einem der Teil der Sequenz IS 6110, die sich zwischen den beiden Primern befindet, zu hybridisieren,

ii) oder das Plasmid pMT02, das durch Einsetzen des Fragments HindIII-BamHI, das den Basen 309 bis 1219 der Sequenz der Fig. 6 entspricht, in das Plasmid pUC18 entsteht.

9. Gensonde nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Gesamtlänge von 20 bis 300 Basen aufweist und wenigstens 20 aufeinanderfolgende Basen einer der folgenden Sequenzen J, K, L oder M umfaßt:

J : 5' - CTGATCCGGCCACAGCCCGTCCCGCCGATC - 3'

K : 5' - AGGCGTCGGTCACAAAGGCCACGTAGGCGA - 3'

L : 5' - CGAGGACCATGGAGGTGGCCATCGTGGAAG - 3'

M : 5' - TGCCCTCATTGGCAACGTTTGCGCCCTGCC - 3'

10. Kit für den Nachweis des Vorhandenseins des Mycobacterium tuberculosis in einer biologischen Probe, dadurch gekennzeichnet, daß es folgende Elemente umfaßt:

- ein Paar von Nukleinsäurefragmenten nach einem der Ansprüche 1 bis 5,

- die notwendigen Reagenzien, um eine Amplifikation der DNA zu bewirken,

- ggf. einen Bestandteil, der die Nachprüfung der Sequenz des amplifizierten Fragments erlaubt, insbesondere eine Gensonde nach einem der Ansprüche 8 oder 9.

11. Für das Mycobacterium tuberculosis spezifische Nukleinsäuresequenz, die folgende Sequenz aufweist: