JPH05507617A

JPH05507617A - 結核菌の特異的検出

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Publication number: JPH05507617A
Application number: JP91510731A
Authority: JP
Inventors: ゲスドン，ジヤン―リユツク; テイエリー，ドミニク
Original assignee: アンステイテユ・パストウール
Priority date: 1990-06-08
Filing date: 1991-06-07
Publication date: 1993-11-04
Also published as: HK1000072A1; CA2084894A1; FR2663033B1; EP0461045A1; DK0461045T3; ATE142702T1; GR3021781T3; DE69121975T2; DE69121975D1; ES2093688T3; WO1991019004A1; EP0461045B1; FR2663033A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】結核菌の特異的検出本発明は、１阻１蛙吐匡り国旺阻蛙旺１（結核菌）の特異的核酸配列、及び、生物サンプル中でＭ　ａｏｂｉｃｔｅｒｉｕｍ　（マイコバクテリウム）に由来のＤＮＡを増幅するときに核酸プライマーの機能を果たす上記配列の特定フラグメントに関する８本発明はまた、前記核酸プライマーを用いて行なう生物サンプル中のむ五旦ｂａａ↓ｅｒｉμＬユｕｂｅＩＣｕｌｏｓｉｓ−の検出方法に関する。

マイコバクテリアは、異なる５４以上の種を含む１競旺ｃｔｅｒｉｕ−属に対応する。

これらの種のうちの約１０種がヒトまたは動物の病原体または日和見感染体となる。　Ｎ、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓはヒト結核の病因である。

結核が公衆衛生的に重大な問題であることは知られている。実際、現在でも、世界中で１５００万人〜６０００万人の結核患者が存在しており、この感染症によって毎年２００万人〜３００万人が死亡している。開発途上国で最も多発するマイコバクテリア感染症の原因はＭ、ｔｕｂｅｒｅｕｌｏｓ江である。フランスでは、毎年新しく約１万人の結核患者が発病する。　Ｂ　ＣＧ　（Ｂａｃｉｌｌｅ　ｄｅ　Ｃａｌｍｅｔｔｅ　ｅｔ　Ｇｕｅｒｉｎ　（カルメツトゲラン菌ワクチン）　−Ｍ、ｂｏｖｉｓ　（ウシ結核菌）の弱毒株）によるワクチン接種は全人口に有効であるとはとても言えない、この有効性は、西欧諸国、例えばイギリスでは約８０％であるがインドでは０％というように国によって大きな開きがある（　Ｃｈｉｎｇｌｅｐｕｔのワクチン接種の最新結果）、更に、常用の抗結核薬に耐性のＭ、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓが出現していること、及び結核患者とエイズ患者との間に相関間係が存在すること、などの理由も加わったため、マイコバクテリアの速やかな検出及び同定方法の開発が急務となっている。

例えば、フロリダで行なった疫学調査では、エイズ患者の１０％は、エイズと診断された時点またはその１８箇月前から結核に罹患していることが判明しな、このうちの６０％の患者の結核は、胸部レントゲン写真または喀痰検査のような従来の診断基準では検出できない播種性結核として発症している。

最後に、結核及びその他の同族のマイコバクテリア感染症の診断は種々の理由から難しい０種々のマイコバクテリアによって生起される胸部疾患は臨床医学的、放射線医学的または組織学的に鑑別できない、マイコバクテリアはしばしば微量で存在し、従来から使用されている方法で検出可能な量になったときには病気が既に進行しており、病人の周囲は感染されている。更に、これらの菌は世代時間が極めて長いので（Ｅ、　ｅｏｌｉ　（大腸菌）の２０分閏に比べて１ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓは２４時間）、その培養が難しい、病原菌を同定し、次いで患者の適正治療に使用できる抗生物質試験の結果を得るためには６〜８週間を要する。このため、菌培養が不要で且つ病理サンプルに直接使用できる検出試験方法、特にサンプル中の病原菌の存在量が微量の場合にも使用できる検出試験方法が是非とも必要である。

マイコバクテリア感染症を同定するなめに臨床医学ではいくつかの方法が現在使用されている。

まず、顕微鏡による微生物の直接観察がある。この方法は、迅速であるが、観察されたマイコバクテリアの種を同定することができない、また、信顆性のある検出結果を得るためにはサンプル中に多数の微生物（＞１０’／ｍｌ）が存在していなければならない（ＢＡＴＥＳ、Ｊ、、ＣＩ（ＥＳＴ、１９７９．７６、（ｓｕｐｐｌ、）　、　７５７〜７６３）　。

培養物は、陽性であるときは１００％に近い特異性を有し、単離されたマイコバクテリアの種の同定が可能である。

しかしながら、上記のように、マイコバクテリアの１ｎｖｉｔｒｏ増殖には３〜６週閏を要するので、感染サイトにマイコバクテリアが少数しか存在していないときは、陽性結果を確認するために培養を反復する必要がある（ＢＡＴＥＳ、Ｊｏ、１９）９及びＢＡＴＥＳ、　Ｊ、ら、＾ｙａ、　Ｒｅｖ、　Ｒｅ５ｐｉｒ、　Ｄｉｓ、、１９８６．１３４．４１５〜４１７）　。

いくつかの症例では血清学的方法も有効であることが判明したが、この方法は感度及び／または特異性が低いのでその使用が限られる（ＤＡＮＩＥＬ　Ｔ、　Ｍ、ら、３ｍ、　Ｒｅｖ、　Ｒｅ５ｐｉｒ。

Ｄｉｓ、、１９８７．１３５．１１３７〜１１５１）　。

また、ＤＮＡ配列の特異的１０−プを使用し、ＤＮＡまたはＲＮＡとのハイブリダイゼーションによってマイコバクテリアの有無を判定することも可能である（ＫＩＥＨＮ　Ｔ、　Ｅ。

ら、Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、１９８７−２５．１５５１〜１５５２　、　ＲＯＢＥＲＴＳＮ、　Ｃ，ら、Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、１９８７．２５．１２３９〜１２４３　。

ＤＲＡＫＥ　Ｔ、＾、ら、Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　、１９８７．２５．１４４２〜１４４５）　、　Ｌかしながらこれらの方法は、使用されるフラグメントのヌクレオチド配列の多形現象、または、隣接領域の多形現象に依存するものであり、やはり微生物の培養が必要である。

ＴＨＩＥＲＲＹら（Ｎｕｅｌ、＾ｅｉｄ　Ｒｅｓ、、Ｖｏｌ、、　１８、Ｎｏ、ｌ、ｐ１８８）は、Ｍ　ｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ複合体の特異的配列を記載し、Ｉｓ　６１１０と命名した。著者らは、この配列をＭ　ｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ検出のための核酸１０ −プとして使用することを提案している。

しかしながら、多数の生物サンプル中に存在するマイコバクテリアＤＮＡの量は、陽性シグナルを与えるためには不十分である。従って、核酸プローブによるハイブリダイゼーション法は、生物サンプルから直接抽出されたマイコバクテリアＤＮＡの同定には適していないことが判明した。

何人かの研究者は、この問題を解決するために、ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐ、Ｃ，Ｒ，）のような増幅方法において核酸プライマーを使用することによってマイコバクテリウムに由来のＤＮＡを特異的に増幅させることを提案した。

ＰＡ置ら（Ｊ、　Ｃｌ１ｏ、、Ｍｉｅｒｏｂｉｏｌ、、Ｍａｒ、　１９９０．５１３〜５１８）は、Ｍ、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを同定するためのプローブとして周知の配列から選択された複数の核酸プライマーの使用を記載している。

しかしながら、これらのプライマーを使用して得られたフラグメントの長さは、予想された理論的長さとは違っており、種々のサイズの複数のフラグメントが得られな、更に、研究者らは、増幅産物がプライマーの決定に用いられたプラスミドとのハイブリダイゼーションを行なわないことを観察した。これらの結果は、これらのプライマーが、生物サンプル中のＮ、　ｔｕｂｅｒｅｕｌｏｓｉｓの存在の検出には適していないことを示しており、また、プライマーの選択が極めて重要であることを証明している。

本発明の目的は、特異性、感受性及び信頼性に優れており、同時にマイコバクテリアを予め培養することが不要なＮ、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの検出方法を提供することである０本発明ハ、５ヱ記Ｖ±ロエム１−１上虹且１」エム−のゲノムに由来しており、以下のごとく定義される配列１．ＩＩ、■及び■：Ｉ：配列Ａ−Ｈのいずれか１つから選択される配列：Ａ　：　５　’　−ＣＣＣＧＣＧＧＣＡ＾＾ＧＣＣＣＧＣＡＧＧＡＣＣＡＣＧＡＴＣＧ−３’Ｂ　：　５　’　− ＣＧＡＣＣＣＧＣＣＡＧＣＣＣＡＧＧＡＴＣＣＴＣＣＧＡＧＣにＴ−３”Ｃ：　５　’　−１１；にＣＧＩＩ；にＴＣＣＡＧＡＴＧＧＣＴＴＧＣＴＣＣＡＴＣＧＣ［；Ｔ−３’Ｄ　：　５　”　−ＧＴＴＧにＣＧＧＧＴＣＣＡＧＡＴＧＧＣＴＴＧＣＴＣＧＡＴＣＧ−３′Ｅ　：　５　′　−丁ＣＡ＾＾ＧＧにＴＴＴＩＩ：ＡＣ＾＾＾ＴＴ＾＾ＴＧＡＴＴＧＧＴＣ−３’Ｆ　：　５　’　−ＴＣにＴにＴＡＣ＾＾＾＾ＴＧＴＧＧＡＣ＾＾ＧＴ＾−３′Ｇ　：　５　′−ＴＣＧＡＣＧＧＡＣｔｌ：ＴＣＧＴＧＡＣＣＡＧ＾＾ＧＴＣ−３’Ｈ：　５　”　−ＧＴＣ（：ＡＣＡＣにＣＣＴＴＣＴＧＣＡＣにににへ＾ＧＴＣＣＴＴ−３′■：配列Ａ〜Ｈの１つに含まれる１０個以上の連続塩基を含み約２０〜４０塩基の全長を有する配列；ＩＩＩ：配列Ｉまたは配列■とハイブリダイズし、好ましくはこれらの配列と８０％以上の相同性を有する２０〜４ｏ塩基の長さを有する配列； ■：配列■、■または四のいずれか１つに相補的な配列：のいずれか１つを含むことを特徴とする核酸フラグメントに関する。

本発明はまた、Ｎ　ｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのゲノムに由来し、生物サンプル中でこのＭ　ｃｏｂｉｃｔｅｒｉｕ＋＊−に由来のＤＮＡを増幅させるときに核酸プライマーの機能を果たし得る核酸フラグメント対に関する。このフラグメント対の特徴は、請求項１に記載の配列Ｉ〜■から選択された２つの配列から構成されることである。

本発明者らは、プライマーの役割を果たす一連の核酸フラグメントを配列ＩＳ　６１１０（Ｎｕｃｌ、＾ｅｉｄｓ、　Ｒｅｓ、、Ｖｏｌ　１８　Ｎｏ、１．１９９０）から同定し、また、Ｍ、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのゲノム内で配列ＩＳ　６１１０に接する配列を同定した。

後者の配列は本発明者らによって同定され本発明の範囲に包含される。　Ｎｕｃｌ、＾ａｉｄｓ、　Ｒｅｓ、、Ｖｏｌ　１８　Ｎｏ、１．１９９ｏに記載された配列ＩＳ　６１１０は図６に示す配列の一部である。より詳細には、配列ＩＳ　６１１０は図６の配列の塩基３２７から１６８７までの配列である。

本発明のプライマーは、Ｍ、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのＤＮＡの選択的増幅に使用できるという本質的な特徴、即ち、ヒトゲノムとの相同性がなく生物サンプル中に存在し得る同族の配列（例えばＥ、　ｅｏｌｉの配列ＩＳ　３４１１）を増幅させないという本質的な特徴を有している。更に、発明者らは、本発明のプライマーを使用して得られたフラグメントの長さが予想した理論的長さに一致し、フラグメントが変動しない一定の長さを有するので、得られた結果が信頼できることを確認した。フラグメントが極めて長いときく約１０００〜１５００塩基）、従って増幅中に配列の二次構造効果のために重合中断の危険性が極めて高い場合にも、本発明のプライマ一対を使用したフラグメントの増幅は同様の信頼性を示す。

更に、図６に示す配列または該配列のフラグメントを含む核酸プローブのハイブリダイゼーションによって増幅産物を検定することによって方法の信頼性が確認された。このような結果は予想外であった。

配列ＩＳ　６１１０からは多数の核酸プライマーを調製することが可能であったが、有効な及び／または特異的なプライマーは極めて少数であった。

図６は、完全配列に対するプライマーＡ−Ｈの位置を示す。

図７は、図６の配列の制限地図を示す。

本発明の実施態様によれば、増幅産物が約１００〜３゜Ｏヌクレオチド、例えば約１００〜２００ヌクレオチドの長さを有するように配列Ｉ〜■のうちからプライマ一対を選択する。正のプライマーが配列Ａから成り、負のプライマーが配列Ｂ、Ｃ及びＤから成るプライマ一対が特に好ましい、特に好ましい別のプライマ一対は、正のプライマーが配列Ｈから成り、負のプライマーが配列Ｇの相補的配列から成るプライマ一対である。

本発明の１ライマーはまた、２０〜４０塩基の長さを有し配列Ａ〜Ｈのいずれか１つを構成する１０個以上の連続塩基を含む配列■から構成され得る。この種のプライマーの例は、２０〜３０塩基を有する配列Ａ〜Ｈのいずれか１つのフラグメント、または、リンカ−２例えばＥｃｏＲＩリンカ−１ＧＡＡＴが付加された配列Ａ−Ｈのいずれか１つのフラグメントである。特に、３′側の最初の５個のヌクレオチドが増幅すべき配列の対応する部分に存在するヌクレオチドと１００％相同性を有しているプライマーを使用するのが好ましい。

また、緊縮性条件下で配列■または■とハイブリダイスする２０〜４０塩基の長さを有する配列■をプライマーとして使用することも可能である。この種の配列は概して、ハイブリダイスの対象となる配列と８０％以上の相同性を有している。このようにして、配列Ａ−Ｈのいくつかの塩基を別の塩基で置換することまたは配列Ａ〜Ｈの末端に塩基を付加することが可能である。緊縮性条件は、当業界で常用の緊縮性条件である。

本発明はまた、配列Ｉ、■または■のいずれか１つに相補的な配列、例えば配列Ａ〜Ｈのいずれか１つに相補的な配列から成る配列■に関する。

本発明はまた、生物サンプル中のＭ　ｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの存在を検出するために、以下の段階、即ち、（ｉ）必要な場合には生物サンプル中のＤＮＡをハイブリダイゼーションし易いように予め処理し、生物サンプルとプライマーと呼ばれる本発明の核酸フラグメント対とを、プライマーがＭ　ｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのＤＮＡとハイブリダイゼーションし得る条件下に接触させ、（ｉｉ　）　Ｍ　ｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのＤＮＡを増幅させ。

（ｉｉｉ　）プライマーによって包囲されたフラグメントに対応するＤＮＡフラグメントの増幅を例えばゲル電気泳動によって証明し、（ｉｖ　＞例えば特異的プローブとのハイブリダイゼーション、配列決定または制限部位解析によって増幅フラグメントの配列を検定する任意の段階とを含むことを特徴とする方法に関する。

生物サンプルは、Ｍ、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを含み得るいかなるサンプルでもよく、例えば、痰、尿、血液、などがある。

通常は、ＤＮＡを抽出しハイブリダイゼーションし易くするためにサンプルを処理する。これらの処理は当業者に周知である。

増幅中には以下の条件を使用し得る。

第１サイクル：　（ｉ）約９４℃　５分間（１回）　（ｉｉ　）約６０℃　１分間第２サイクル以ｆｉ：（ｉ）約９４℃　１５秒間（２０〜４０回）（ｉｉ）約６０℃　１分間最終サイクル：　（ｉ）約９４℃　１５秒間（１回）　（ｉｉ　）約６０℃　５分間増幅の証明は、例えばエチジウムプロミドで染色したアガロースゲルを用いるゲル電気泳動によって行なう０本発明によれば、増幅処理のあとで、例えば核酸プローブのハイブリダイゼーションによって増幅フラグメントの配列を検証し得る。このプローブは、配列の少なくとも一部分を含む、このようなプローブとしては、図６の配列の塩基１から１１５２までを含むプラスミドｐＭＴＯ１，該配列の塩基３０９から１２１９１でを含むプラスミドｐＭＴＯ２がある。その他にも、選択された２つのプライマー間に存在する配列ＩＳ　６１１０の一部分と緊縮性条件下にハイブリダイズし得る２０塩基以上の長さのいかなるプローブも適当なプローブとして使用し得る。特に好ましいプローブは、以下の配列Ｊ、に、Ｌ、Ｍ＋Ｊ　：　５　’　−ＣＴＩ；ＡＴＣＣＣＧＣＣＡＣＡＧＣＣＣＧＴＣＣＣＧＣＣＧＡＴＣ−３’に：５′−＾１．ｆ；Ｃｆ；ＴＣＣにＴＧＡＣ＾＾＾ＧにＣＣＡＣＣＴＡににＣＧ＾−３′Ｌ　：　５　′−ＣＧＡＧＧＡＣＣＡＴにＧＡＧＧＴＧＧＣＣＡＴＣＧＴＧに＾＾Ｇ−３′Ｍ：５′〜ＴＧＣＣＣＴＣＡＴＴＧにＣ＾＾ＣＧＴＴＴ（：ＣＧＣＣＣＴＧＣＣ−３’から成る。

このような検証処理には以下のハイブリダイゼーション条件を使用し得る：ハイブリダイゼーション：約６５℃〜６８℃：６ＸＳＳＣ１０１硫酸デキストラン５　Ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ’　ｓ１０■ＨのＥＤＴＡ００５％５ＤＡ１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ洗浄　：約６５℃　：２ＸＳＳＣ（１０分、２回）２Ｘ　ＳＳＣ＋　Ｏ，Ｌ＄５ＯＳ（３０分、１回）０、ｌＸ５ＳＣ（１０分、１回）ＩＸＳＳＣは、０．１５ＭのＮａＣｌと０．０５Ｍのクエン酸ナトリウムに対応し、１ＸＤｅｎｈａｒｄｔ’　ｓ溶液は、０．０２％のＦｉｃｏｌ　ｌ、０．０２％のポリビニルピロリドン及び０．０２％のウシ血清アルブミンに対応する。

増幅産物を確認するための別の手段では、フラグメントを直接配列決定するか、または制限地図で解析する。いずれにしても、この確認は方法の強制段階ではなく、本発明のプライマーによれば極めて忠実な配列の増幅が得られる。

注目すべきは、本発明の増幅が１凶旦に鱈」旦ｒｉｕｅ−真曲尺二」工１ｏｓｉｓ複合体のＤＮＡに特異的なことである（例えば図ＩＡ及びＢ参照）　、　Ｍ、　ｂｏｖｉｓ−ＢＣＧ−Ｍ、　ｂｏｖｉｓ及びＮ、　ｍ１ｃｒｏｔｉのＤＮＡの増幅がＩ［察されるが、これらのマイコバクテリアはヒト由来のサンプル中に存在し得ないので、これらの増幅が本発明方法の利点を損なうことはない。Ｎ、　ｂｏｖｉｓはウシの結核の病原体である０Ｍ、　＋＊１ｅｒｏｔｉは誓書類の結核の原因物質である６本発明のプライマーは、Ｍ、　ｆｏｒｔｉｕｔｕｍ、Ｈ− ｏｒｄｏｎａｅ、Ｍ、　ａｖｉｕｓ、などのような別種のマイコバクテリアに由来のＤＮＡを全く増幅させない。

更に、本発明のプライマーは、ヒトまたは細菌（例えばＥ、　ｅｏｌｉ）由来のＤＮＡを増幅させない、これを図２に示す。

本発明ハまた。生物サンフル中（１）Ｈｃｏｂａｃｔｅｒｉｕ簡ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの存在を検出するためのキットを提供する０本発明のキットの特徴は、一請求項１から５のいずれか一項に記載の核酸フラグメント対と、 −ＤＮＡを増幅させるために必要な試薬と、−任意に、増幅されたフラグメントの配列を確認し得る成分、より特定的には請求項８から１０のいずれか一項に記載の核酸プローブとを含むことである。

本発明は更に、図６に示す完全配列に関する６本発明者らは、この配列が２つの読取枠を含み、一方の読取枠がトランスボザーゼをコードする遺伝子に似ていることを確認した。

本発明を以下に非限定実施例によって説明する。

１：　Ｉゴ　し　ドブ−マー　の　ム図６に示す完全配列から、複数のオリゴヌクレオチドプライマ一対を選択及び合成した。これらのプライマ一対を以下に示す、これらのプライマ一対のいくつかに関しては、増幅産物を検出するために使用し得るオリゴヌクレオチドプローブの配列も示す。

プライマー　Ｎｏ、１正のプライマー：５　′　−ＣＣＣ（、ＣＧＧＣ＾＾＾ＣＣＣＣＧＣＡににＡＣＣＡＣＧＡＴＣに −３′負のプライマー：５　’　−ＣＧＡＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＡＧＣＡＴＣＣＴにＣＧＡＧＣＧＴ− ３’プライマーを除く増幅フラグメントの長さ：１４１プライマ一対Ｎｏ、１のプローブ（１）　５　’　−ＣＴＣＡＴＣＣＣにＣＣＡＣＡＧＣＣＣＧＴＣＣＣＧＣＣＣＡＴＣ−３”（２）５’−八ＧＧＣ［；ＴＣにＧＴＧＡＣ＾＾＾にＧＣＣＡＣにＴＡにＧＣＧ＾−３′プーイマ−Ｎ００２正のプライマー：５　”　−ＣＣＣＧＣＧＧＣ＾＾＾ＧＣＣＣＧＣＡ（ｌｌ：ＡＣＣＡＣにＡＴＣＧ−３”負のプライマｍ：５　’　−ＣＧＣＧ（：ＣＴＣＣＡＧＡＴＧＧＣＴＴＧＣＴＣＧＡＴＣにＣＧＴ −３’プライマーを除く増幅フラグメントの長さ：２０１プライマ一対Ｎｏ、２のプローブ（１）　５　”　−ＣＴＧＡＴＣＣＧにＣＣＡＣＡＧＣＣＣＧＴＣＣＣｔｌ：ＣＣＧＡＴＣ−３′（２）　５　′−Ｃ［；ＡＧｌｌ：ＡＣＣＡＴ［；ＣＡＧ［；Ｔｌ；ＣＣＣＡＴＣＣＴにＧ＾＾Ｇ−３′ブー　マー　Ｎｏ。

正のプライマー：５　’　−ＣＣＣＣＣにＧＣ＾＾＾［；ＣＣＣＧＣＡににＡＣＣＡＣＣＡＴＣＧ −３’負のプライマｍ：５　”　−ＧＴＴＧＧＣＧｔｌ：ＣＴＣＣＡＧＡＴＧＧＣＴＴＧＣＴＣにＡＴＣＧ−３′プライマーを除く増幅フラグメントの長さ：２０４プライマ一対Ｎ０９３のプローブ（１）　５　’　−ＣＴＧＡＴＣＣＣＧＣＣＡＣＡＧＣＣＣＧＴＣＣＣＧＣＣＧＡＴＣ−３’（２）　５　”　−ＣＧＴＣＧＡＧＧＡＣＣＡＴＧＩ；ＡＧＧＴにＧＣＣＡＴＣＧＴＧＧ−３’ブー　マー　Ｎｏ、４正のプライマｍ：５　’　−ＣＣＣＧＣにＧＣ＾＾＾ＧＣＣＣＧＣＡＧＧＡＣＣＡＣＧＡＴＣに− ３’負のプライマー：５′−ＴＣ＾＾＾ＧＣＧＴＴＴにＡＣ＾＾＾ＴＴ＾＾ＴＧＡＴＴＧＩ；ＴＣ−３ ’プライマーを除く増幅フラグメントの長さニア４０１−　マー　Ｎ００５正のプライマー：５　’　−ＣＣＣＣＣＧ（、Ｃ＾＾＾にＣＣＣＧＣＡＧにＡＣＣＡＣＧＡＴＣＧ −３’負のプライマー：５’−ＴＣにＴＧＴＡＣ＾＾＾＾ＴＧＴにＧＡＣ＾＾ＧＴ＾−３′プライマーを除く増幅されたフラグメントの長さ＝７７０ブーイマー　Ｎｏ、６正のプライマー：５’−ＴＣＧＡＣＧＧＡＣＧＴＣＧＴＧＡＣＣＡＧ＾＾ＧＴＣ−３’負のプライマー：５　’　−Ｃ［；ＡＣＣＣＧＣＣＡＧＣＣＣＡＣにＡＴＣＣＴＧＣＧＡにＣＧＴ −３′プライマーを除く増幅フラグメントの長さ：９８０プーイマー　Ｎｏ、７正のプライマー：５’−ＴＣＧＡＣにＧＡＣにＴＣＧＴＧＡＣＣＡＣ＾＾ＧＴＣ−３’負のプライマー：５　′−にＧＣＧＧＧＴＣＣＡＧＡＴＧＧＣＴＴＧＣＴＣＣＡＴＣＣＣにＴ−３ ’プライマーを除く増幅フラグメントの長さ：１０４０ブー　マー　ＮＯ３８正のプライマー：５’−ＴＣＧＡＣＧにへＣｌｌ；ＴＣＧＴＧＡＣＣＡＩ；＾＾ＧＴＣ−３’負のプライマー：５’−ＴＣ［；ＴＧＴＡＣ＾＾＾＾ＴＧＴにＧＡＣ＾＾ＧＴ＾−３′プライマーを除く増幅フラグメントの長さ：１５５０プーイマー　Ｎｏ、９正のプライマー：５　”　−ＧＴＣＧＡＣＡＣＧＣＣＴＴＣＴＧＣＡＣＧにに＾＾ＧＴＣＣＴＴ− ３′負のプライマｍ：５　′　−ＧＡＣＴＴＣＴＧＧＴＣＡＣにＡＣにＴＣＣＧＴＣＧ＾＾−３′プライマーを除く増幅フラグメントの長さ：２１９プーイマ−ＮＯ１９のプローブ５　’　−ＴＧＣＣＣＴＣＡＴＴにＧＣ＾＾ＣＧＴＴＴＧＣＧＣＣＣＴＧＣＣ− ３”２：　のマイコバク−１アに・　るプーイマーのＩＬＬＬへ１ＬＭ　ｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｓ＋−属の種々の細菌種のＤＮＡを使用してプライマーの特異性を検証した０種々のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍのサンプルから得られた全ＤＮＡを、実施例１に示したプライマ一対Ｎ０１１を用い「ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐ　、Ｃ、Ｒ＞ｊ法で増幅処理した。

Ｐ　、Ｃ、Ｒ、の種々の段階のパラメータを以下のごとく選択した：第１サイクル：　（ｉ）９４℃　５分間（１回）　（ｉｉ　）　６０℃　１分間第２サイクル以後：（ｉ）９４℃　１５秒間（２０〜４０回）　（ｉｉ　）　６０℃　１分間最終サイクル　（ｉ）９４℃　１５秒間（１回）　（ｉｉ　）　６０℃　５分間増幅産物をアガロースゲル電気泳動及びエチジウムプロミド染色によって分析した。

図ＩＡは結果を示す０図ＩＡの番号欄は以下のサンプルに対応する。

図ＩＢは、この実施例で得られた増幅産物に対するプローブとして、（Ｋｏｕｒ　ｉ　１ｓｋｙら、フランス特許出ｆｆ８１２４１３１に記載のＡＡＦによって標識された）プラスミドｐＭＴＯ２を使用したときに得られた結果を示す。プラスミドｐＭＴＯ２の構築に関しては実施例６で説明する。

３：　たζヒト　に　のＤＮＡに７ライマーの、の　− ヒトＤＮＡは分析すべきサンプルに混入し得る。実施例２に記載の増幅方法をプライマ一対Ｎｏ、Ｌの存在下に全ＤＮＡサンプルに適用する。

増幅産物をアガロースゲル電気泳動及びエチジウムプロミド染色によって分析する。図２は結果を示す０図２の番号欄は以下のサンプルに対応する。

１　、Ｍ　ｅｏｂａｃｔｅｒｉｕ＋＊　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ２、ヒトＤＮＡ３　、　Ｍ　ｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｅｕｌｏｓｉｓ＋ヒトＤＮＡ４　、　Ｅｓｅｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉのＤＮＡ５、ＴＥバッファ４：　ンプルのＤＮＡに　るプライマーの結核患者の痰から得られた１０μｌの増幅サンプルをＴＡＥバッフｙ（０，０４ＭのＴｒｉｓ−酢酸塩、０．００１ＭのＥＤＴＡ）及び１μｇ／ｍｌのＥｔＢｒ中の２％アガロースゲルに載せた。１２．５ピコモルのオリゴヌクレオチド（プライマ一対Ｎｏ、１）と生物サンプルのＤＮＡとを２ＵのＴａｑポリメラーゼと共に、５０ｍＭのＫＣＩバッファ、１０ｍＭのＴｒ　ｉ　５−ＨＣｌ　（ｐＨ８，３）　、２．４ｍＭのＭｇＣｌ２，３００ＭＭのデオキシリボヌクレオチド及び１００μｇ／ｍｌのゼラチン中で使用し、５ａｉｋｉら（Ｓｃ　１ｅｎｃｅ、１９８８．２３９．４８７〜４９１）に従ってポリメラーゼ連鎧反応（Ｐ　、Ｃ、Ｒ，）法で増幅させた。最終反応量は１００μｌである。Ｐ、Ｃ，Ｒ，の諸段階のパラメータを以下のごとく選択しな：９４℃で１分間、５０℃で１分間、７２℃で１分間を４０サイクル。

図３はこれらのサンプルのＰ　、Ｃ、Ｒ、後のアガロースゲル分析結果を示す、欄１〜１１は異なる１１人の被検者から得られた生物サンプルに対応する。これらの結果を、直接顕微鏡観察によって確認し、増幅によって得られた結果を検証した。

直接読取で陰性の生物サンプル：番号欄１．３．４．５．６．９．１０、直接読取で陽性の生物サンプル：番号欄２．７．８．１１増幅されたバンドを紫外線下で可視化する。

５：　々の　１ゴ　フレ　ド　ｆＨ，ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　Ｄ　Ｎ　Ａの　ロース　ル１０μｌの増幅サンプルを２％のアガロースゲルに載せる。実施例１に記載の複数のプライマ一対を用いて前記の方法によって増幅させる。その結果を図４に示す。

１：１ライマ一対Ｎ０１８２ニプライマー対Ｎｏ、７３ニプライマー対Ｎ００６４ニプライマー対ＮＯ６５５ニプライマー対Ｎｏ、４６：プライマ一対Ｎｏ、２７：プライマ一対Ｎ０１１８：陰性対照Ｍ＝ママ−−。

増幅バンドを紫外線下に可視化する。

これらの結果は、増幅フラグメントが、各プライマー間の間隔に基づいて計算された理論的長さに呼応する長さであることを証明する。いくつかのプライマ一対は極めて長いフラグメントを増幅させるために使用されたが、配列の二次構造の結果として生じる重合の中断が全く観察されなかったことは驚異である。

結果を、口６に示す配列の塩基１から１１５２までを含むプラスミドｐ　ＭＴ　０１　（ＣＮＣＨｌ−９００，１９８９年８月２５日寄託）のハイブリダイゼーションによって検証した。

６：ブースミド　ＭＴＯ２の配列ＩＳ　６１１０（図６に示す配列の塩基３０９から１２１９までに対応するフラグメント）に由来の９００塩基対のＨｉ　ｎ　ｄｌｌＩ／Ｂ　ａｍＨＩフラグメントをベクターｐＵｃ１８中でクローニングすることによってプラスミドｐＭＴＯ２を構築した。

プラスミドｐＭＴＯ２は増幅された配列を検証する際のプローブとして機能する０種々のマイコバクテリアのＤＮＡをＢａｍＨＩによって完全消化した後のサザンプロットによってｐＭＴＯ２の特異性を決定した。

結果を図５に示す。

図５の種々の番号欄は以下のサンプルを示す。

１　、　Ｍ、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　（結核菌）４　、　Ｍ、　ｍ１ｃｒｏｔｉ　（ミクロティ）５、【−上ａｒａｔ頂じエヨｄ旦１ｉ−（バラ結核菌）６　、　Ｍ、　１ｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒａｅ　（イントラセルラエ）７　、　Ｍ、　ｇＣｒｏｆｕｌｓ＋ｅｅｕｍ　（スクロフラセウム）３　、　Ｍ、　ａｖｉｕｓ　（トリ結核菌）１〜４までは結核症候群、５〜８までは鳥類症候群ｎｒＸ口！！　３Ｍｌ　２３４５６７８９１０１１ＦｅｃＮＢ　４Ｍ１２３４５６７８Ｍ１１Ｇυ冨！　ＳＯコ− ！」１本発明は、結核菌のゲノムに由来し、以下のごとく定義される配列１、■、■及び■：ｌ：配列Ａ〜Ｈのいずれか１つから選択される配列：Ａ　：　５　’　−ＣＣＣにＣＧにＣ＾＾＾ＧＣＣＣＧＣＡＧＧＡＣＣＡＣＧＡＴＣＣ−３’Ｂ　：　５　 ’　−ＣＧＡＣＣＣＧＣＣＡＧＣＣＣＡＧＧＡＴＣＣＴＧＣＧＡＧＣＧＴ−３’ Ｃ：　５　′−にＧＣＧＧＧＴＣＣＡにＡＴＧにＣＴＴ［、ＣＴＣにＡＴＣＣＣにＴ−３’Ｄ　：　５　’　−ＧＴＴＧＧＣにＧＧＴＣＣＡ［；ＡＴＣＧＣＴＴＧＣＴＣＧＡＴＣＧ−３”Ｅ：５’−ＴＣ＾＾＾ＧＧＧＴＴＴＧＡＣ＾＾＾ＴＴ＾＾ＴＧＡＴＴににＴＣ−３”Ｆ　：　５　’　−ＴＣＧＴＧＴＡＣ＾＾＾＾ＴＧＴにＧＡＣ＾＾ＧＴ＾−３′Ｇ　：　５　’　−ＴＣＧＡＣＧ（：ＡＣＧＴＣＧＴＧＡＣＣＡＧ＾＾ＧＴＣ−３’Ｈ：　５　’　−ＧＴＣにＡＣＡＣＧＣＣＴＴＣＴＧＣＡＣＧＧＧ＾＾ＧＴＣＣＴＴ−３’■：配列Ａ〜Ｆの１つに由来する１０以上の連続する塩基を含み約２０〜４０塩基の全長を有する配列；■：配列Ｉまたは配列■とハイブリダイズし、好ましくはこれらの配列に８０％相同性を有する２０〜４０塩基の長さを有する配列： ■：配列Ｉ、■または■のいずれか１つに相補的な配列：のいずれか１つを含むことを特徴とする核酸フラグメントを提供する。

ｐ腔！ＩＩ審報告 □＾−７．勘ＰＣＴ／ＦＲ９１１００４５７国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．結核菌のゲノムに由来し、以下のごとく定義される配列Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶ：Ｉ：配列Ａ〜Ｈのいずれか１つから選択される配列：Ａ：【配列があります】Ｂ：【配列があります】Ｃ：【配列があります】Ｄ：【配列があります】Ｅ：【配列があります】Ｆ：【配列があります】Ｇ：【配列があります】Ｈ：【配列があります】ＩＩ：配列Ａ〜Ｈの１つに含まれる１０以上の連続する塩基を含み約２０〜４０塩基の全長を有する配列；ＩＩＩ：配列Ｉまたは配列ＩＩとハイブリダイズし、好ましくはこれらの配列と８０％以上の相同性を有する２０〜４０塩基の長さを有する配列；ＩＶ：配列Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩのいずれか１つに相補的な配列；を含むことを特徴とする核酸フラグメント。
２．結核菌のゲノムに由来し、生物サンプル中で結核菌に由来のＤＮＡを増幅させるときに核酸プライマーの機能を果たし得る核酸フラグメント対であって、請求項１に記載の配列Ｉ〜ＩＶから選択された２つの配列から構成されることを特徴とするフラグメント対。
３．対を成すフラグメントの少なくとも１つが、配列Ｉのグループに属する配列から成ることを特徴とする請求項２に記載のフラグメント対。
４．一方が配列ＡまたはＧのいずれか１つから成り、他方が配列Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦもしくはＨのいずれか１つまたは配列Ｇに相補的な配列から成ることを特徴とする請求項２または３に記載のフラグメント対。
５．一方が配列Ａから成り、他方が配列Ｂ、Ｃ、Ｄのいずれか１つから成ることを特徴とする請求項４に記載のフラグメント対。
６．以下の段階、即ち、（ｉ）必要な場合には、ＤＮＡがハイブリダイゼーションし易い状態になるように生物サンプルを予め処理しておき、生物サンプルとプライマーと呼ばれる請求項１から５のいずれか一項に記載の核酸フラグメント対とを、プライマーが結核菌のＤＮＡにハイブリダイゼーションし得る条件下に接触させ、（ｉｉ）結核菌のＤＮＡを増殖させ、（ｉｉｉ）プライマーによって包囲されたフラグメントに対応するＤＮＡフラグメントの増幅を例えばゲル電気泳動によって検出し、（ｉｖ）任意に、例えば特異的プローブとのハイブリダイゼーション、配列決定または制限部位解析によって増幅フラグメントの配列を検証する段階を含むことを特徴とする生物サンプル中の結核菌の存在の検出方法。
７．ＤＮＡを増幅するために、以下の条件、即ち、第１サイクル：（ｉ）約９４ ℃　５分間（１回）（ｉｉ）約６０℃　１分間第２サイクル以後：（ｉ）約９４℃　１５秒間（２０〜４０回）（ｉｉ）約６０ ℃　１分間最終サイクル：（ｉ）約９４℃　１５秒間（１回）（ｉｉ）約６０℃ 　５分間を使用することを特徴とする請求項６に記載の検出方法。
８．生物サンプル中の結核菌の特異的ＤＮＡの存在をハイブリダイゼーションによって検出し、特に、請求項６または７に記載の検出方法で得られた増幅産物を検証するために、２つの核酸プライマー間に存在する配列ＩＳ　６１１０の一部とハイブリダイズし得る少なくとも２０塩基の長さを有する配列を含むことを特徴とする核酸プローブ。
９．以下の配列Ｊ、Ｋ、ＬまたはＭ：Ｊ：【配列があります】Ｋ：【配列があります】Ｌ：【配列があります】Ｍ：【配列があります】のいずれか１つから成る２０以上の連続する塩基を含むことを特徴とする請求項８に記載の核酸プローブ。
１０．配列ＩＳ　６１１０の塩基３０９から１２１９までを含むプラスミドｐＭＴ０２から成ることを特徴とする請求項８に記載の核酸プローブ。
１１．−請求項１から５のいずれか一項に記載の核酸フラグメント対と、 −ＤＮＡを増幅させるために必要な試薬と、−任意に、増幅されたフラグメントの配列を検証し得る成分、より特定的には請求項８から１０のいずれか一項に記載の核酸プローブとを含むことを特徴とする生物サンプル中の結核菌の存在を検出するためのキット。
１２．以下の配列：【配列があります】を有する結核菌の特異的核酸配列。