JPH0630638B2 - ナイセリア特異的ｄｎａプローブ及び病原性のナイセリア種ｎ．ゴノロエエ及びｎ．メニンギチジスの少なくとも１種を検出する方法 - Google Patents
ナイセリア特異的ｄｎａプローブ及び病原性のナイセリア種ｎ．ゴノロエエ及びｎ．メニンギチジスの少なくとも１種を検出する方法Info
- Publication number
- JPH0630638B2 JPH0630638B2 JP2162997A JP16299790A JPH0630638B2 JP H0630638 B2 JPH0630638 B2 JP H0630638B2 JP 2162997 A JP2162997 A JP 2162997A JP 16299790 A JP16299790 A JP 16299790A JP H0630638 B2 JPH0630638 B2 JP H0630638B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- neisseria
- species
- pathogenic
- meningitidis
- gonoroe
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/871—Neisseria
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、ナイセリア属(Neisseria)に特異的なDNAプロ
ーブ及び病原性のナイセリア種N．ゴノロエエ(gonorrho
eae)及びN．メニンギチジス(meningitidis)の少なくと
も１種を検出する方法に関する。
ーブ及び病原性のナイセリア種N．ゴノロエエ(gonorrho
eae)及びN．メニンギチジス(meningitidis)の少なくと
も１種を検出する方法に関する。
従来の技術 ナイセリア属は近縁のグラム陰性双球菌の１群であり、
これには病原性の種もまた非病原性の種も包含される。
これには病原性の種もまた非病原性の種も包含される。
病原性の種はN.ゴノロエエ及びN．メニンギチジスであ
る。これらと共に、上部呼吸路の生理的フローラの成分
である若干の非病原性のものもある。
る。これらと共に、上部呼吸路の生理的フローラの成分
である若干の非病原性のものもある。
N．ゴノロエエは、今日でもなお非常に頻度の高い届出
義務のある世界的感染症〔世界保健統計年報(World Hea
lth Statistics Annual)（１９７９）、ジュネーブ在、
WHO〕である淋疾の病原体である。米国だけで１年に数
百万症例が記録され、この病気の治療をおこたると例え
ば前立腺炎、腹膜炎及び関節炎のような重大な後遺症が
起り得る。感汚はしばしば初めは無症候で進行し、それ
故多くのキヤリアが知らずに病気を拡げることになる。
義務のある世界的感染症〔世界保健統計年報(World Hea
lth Statistics Annual)（１９７９）、ジュネーブ在、
WHO〕である淋疾の病原体である。米国だけで１年に数
百万症例が記録され、この病気の治療をおこたると例え
ば前立腺炎、腹膜炎及び関節炎のような重大な後遺症が
起り得る。感汚はしばしば初めは無症候で進行し、それ
故多くのキヤリアが知らずに病気を拡げることになる。
従来この病気の診断に使われた方法は患者の性及び症状
に左右されていた：２４〜４８時間恒温保持しなければ
ならない培養及び培養微生物をグラム染色法、炭水化物
分解、凝集、けい光−抗体−スクリーニング等を介して
検定。広汎性淋疾の場合、血液培養を行なうかもしくは
羅患部分の試料を取得しなければならず、総体的に非常
に経費のかかる処置である。
に左右されていた：２４〜４８時間恒温保持しなければ
ならない培養及び培養微生物をグラム染色法、炭水化物
分解、凝集、けい光−抗体−スクリーニング等を介して
検定。広汎性淋疾の場合、血液培養を行なうかもしくは
羅患部分の試料を取得しなければならず、総体的に非常
に経費のかかる処置である。
N．メニンギチジスは細菌性脳膜炎の病原体の１つであ
る。すべての伝染性髄膜炎のほぼ２０％はメニンゴコツ
クス(Meningococcus)により誘発される。この病気が発
生する前提は、病毒性メニンゴコツクス（主に血清群
Ａ、Ｂ又はＣ）による咽頭腔の生着並びに免疫系の十分
な防御力の欠損である。
る。すべての伝染性髄膜炎のほぼ２０％はメニンゴコツ
クス(Meningococcus)により誘発される。この病気が発
生する前提は、病毒性メニンゴコツクス（主に血清群
Ａ、Ｂ又はＣ）による咽頭腔の生着並びに免疫系の十分
な防御力の欠損である。
髄膜炎の確実な診断は従来細菌学的に可能であつたに過
ぎない。決定的な工程はこの場合にもまた培養である。
更に、他のグラム陰性でオキシダーゼ陽性コックスに対
する区別化のために鑑別診断を実施する：糖利用、血清
群特異的抗体との凝集反応等。
ぎない。決定的な工程はこの場合にもまた培養である。
更に、他のグラム陰性でオキシダーゼ陽性コックスに対
する区別化のために鑑別診断を実施する：糖利用、血清
群特異的抗体との凝集反応等。
それ故、両方の病原性ナイセリア種の診断的検出は殆ん
どの場合に、少なくとも２４時間の恒温保持時間を必要
とする培養の実施を前提とする。この際に、培養が−特
にN．ゴノロエエの−非常に困難であるという問題があ
る。両方の種を培養するには選択培地を使用するが、こ
の培地上では非病原性のナイセリア、例えばN．ラクタ
ミカ(lactamica)の成長可能である。このため、厳密で
経費のかかる生化学的区別化によつてのみ排除し得る混
同の危険が生じる。それ故、迅速かつ特異的に病原性ナ
イセリア種の検出を可能にする診断試験を開発すること
が既に試みられた。このための１つの可能性は、迅速性
という観点から核酸ハイブリツド形成の技術であるよう
に思われる。それ故、Nゴノロエエに関してはこの技術
による検出法を確立する試みが既に成されており、その
際にとりわけ次の核酸プローブに集中した：rRNAに相補
性である配列（ヨーロツパ公開特許第０２７２００９
号）、N．ゴノロエエで優先的に産生する隠性プラスミ
ド上の配列〔Totten及びその他共著、“J.Inf.Di
s．，”、１４８，４６２頁（1983年）及びPerin及びそ
の他共著、“J.Inf.Dis．”、１５２，５９頁（１９８
６年）〕及び経費のかかるスクリーニング法により見出
すことのできる未知の機能の配列（ヨーロツパ公開特許
第０２３７７３７号）。
どの場合に、少なくとも２４時間の恒温保持時間を必要
とする培養の実施を前提とする。この際に、培養が−特
にN．ゴノロエエの−非常に困難であるという問題があ
る。両方の種を培養するには選択培地を使用するが、こ
の培地上では非病原性のナイセリア、例えばN．ラクタ
ミカ(lactamica)の成長可能である。このため、厳密で
経費のかかる生化学的区別化によつてのみ排除し得る混
同の危険が生じる。それ故、迅速かつ特異的に病原性ナ
イセリア種の検出を可能にする診断試験を開発すること
が既に試みられた。このための１つの可能性は、迅速性
という観点から核酸ハイブリツド形成の技術であるよう
に思われる。それ故、Nゴノロエエに関してはこの技術
による検出法を確立する試みが既に成されており、その
際にとりわけ次の核酸プローブに集中した：rRNAに相補
性である配列（ヨーロツパ公開特許第０２７２００９
号）、N．ゴノロエエで優先的に産生する隠性プラスミ
ド上の配列〔Totten及びその他共著、“J.Inf.Di
s．，”、１４８，４６２頁（1983年）及びPerin及びそ
の他共著、“J.Inf.Dis．”、１５２，５９頁（１９８
６年）〕及び経費のかかるスクリーニング法により見出
すことのできる未知の機能の配列（ヨーロツパ公開特許
第０２３７７３７号）。
しかしこれらのすべての方法には、ナイセリア属が、遺
伝的には相互に区別するのが難しい緊密に類縁性の微生
物の群であるという問題がある。遺伝的相同性の程度は
特にN．ゴノロエエとN．メニンギチジスとでは著しく高
い。染色体DNAのDNA／DNA−ハイブリツド形成は９３％
の相同性を示す〔Hoke及びVedros共著、“Ing.J.Sys.Ba
ct．”、３２，５７頁（1982年）〕。著しく強い相同性
は病原性ナイセリア種に限定されるのではなく、むしろ
例えば形質転換実験及びDNAハイブリツド形成により、
N．メニンギチジスとN．ラクタミカも同様に相互に緊密
に相同であることを明らかにすることができた。
伝的には相互に区別するのが難しい緊密に類縁性の微生
物の群であるという問題がある。遺伝的相同性の程度は
特にN．ゴノロエエとN．メニンギチジスとでは著しく高
い。染色体DNAのDNA／DNA−ハイブリツド形成は９３％
の相同性を示す〔Hoke及びVedros共著、“Ing.J.Sys.Ba
ct．”、３２，５７頁（1982年）〕。著しく強い相同性
は病原性ナイセリア種に限定されるのではなく、むしろ
例えば形質転換実験及びDNAハイブリツド形成により、
N．メニンギチジスとN．ラクタミカも同様に相互に緊密
に相同であることを明らかにすることができた。
発明が解決しようとする課題 それ故、本発明の課題は、DNA−ハイブリツド形成技術
を介して病原性と非病原性のナイセリア種を区別し、そ
れ故病原性の種の定性的及び定量的検出を可能にする特
異的な検出プローブを開示することであつた。
を介して病原性と非病原性のナイセリア種を区別し、そ
れ故病原性の種の定性的及び定量的検出を可能にする特
異的な検出プローブを開示することであつた。
課題を解決するための手段 本発明により、この課題は、オリゴヌクレオチドOpa
１、Opa２、Opa３、ＰIII、Pil１、IgA１及びIgA２の群
類から選択された病原性ナイセリア種特異的DNAプロー
ブにより解決される。本発明によるヌクレオチドのDNA
配列を表Iに記載する。
１、Opa２、Opa３、ＰIII、Pil１、IgA１及びIgA２の群
類から選択された病原性ナイセリア種特異的DNAプロー
ブにより解決される。本発明によるヌクレオチドのDNA
配列を表Iに記載する。
本発明によるDNAプローブは、殆んどもつぱら病原性の
種に産生するナイセリア−蛋白質の遺伝子の一定の部分
に相当する。これは蛋白質のIgA１−プロテアーゼ〔Poh
lner及びその他共著、“Nature”、２３５，４５８頁
（1987年）〕、ピリン〔Haas及びその他共著、“Cel
l”、４４，１０７頁（１９８６年）、Perry及びその他
共著、“Gene”、６０，８５頁（１９８７年）〕、蛋白
質II〔Stern及びその他共著、“Cell”、４７，６１
（１９８６年）、Stern及びその他共著、“Mol.Microbi
ol．１，５頁（１９８７年）〕、蛋白質III〔Gotschlic
h著、“J.Exp.Med．”、１６５，４７１頁（1987年）〕
である。
種に産生するナイセリア−蛋白質の遺伝子の一定の部分
に相当する。これは蛋白質のIgA１−プロテアーゼ〔Poh
lner及びその他共著、“Nature”、２３５，４５８頁
（1987年）〕、ピリン〔Haas及びその他共著、“Cel
l”、４４，１０７頁（１９８６年）、Perry及びその他
共著、“Gene”、６０，８５頁（１９８７年）〕、蛋白
質II〔Stern及びその他共著、“Cell”、４７，６１
（１９８６年）、Stern及びその他共著、“Mol.Microbi
ol．１，５頁（１９８７年）〕、蛋白質III〔Gotschlic
h著、“J.Exp.Med．”、１６５，４７１頁（1987年）〕
である。
前記の蛋白質に関する殆んどの遺伝子は既にハイブリツ
ド形成の研究で使われており、その際に相応する蛋白質
の全遺伝子と部分的に細菌ゲノムの側位の(flankierend
e)配列も含有するプラスミドを使用した〔Aho及びその
他共著、“Infect.Immun．”、５５，１００９頁（1987
年）、Horn及びその他共著、“Diagn.Microbiol.Infec
t.Dis．”４，１０１頁（１９８６年）〕。しかしなが
らこれらの検索プローブのいずれを用いても病原性の種
の特異的検出をすることはできず、また両方の病原性の
種の区別化もできなかつた。
ド形成の研究で使われており、その際に相応する蛋白質
の全遺伝子と部分的に細菌ゲノムの側位の(flankierend
e)配列も含有するプラスミドを使用した〔Aho及びその
他共著、“Infect.Immun．”、５５，１００９頁（1987
年）、Horn及びその他共著、“Diagn.Microbiol.Infec
t.Dis．”４，１０１頁（１９８６年）〕。しかしなが
らこれらの検索プローブのいずれを用いても病原性の種
の特異的検出をすることはできず、また両方の病原性の
種の区別化もできなかつた。
しかしながら、前記の遺伝子の一定の部分に相当する本
発明によるプローブを用いることにより、病原性のナイ
セリア種を非病原性のナイセリア種並びに非ナイセリア
種から著しく特異的に区別化することができ、かつ付加
的にプローブのうちのいくつかを用いると両方の種N．
ゴノロエエとN．メニンギチジスとを特異的に区別化す
ることができ驚異的である。
発明によるプローブを用いることにより、病原性のナイ
セリア種を非病原性のナイセリア種並びに非ナイセリア
種から著しく特異的に区別化することができ、かつ付加
的にプローブのうちのいくつかを用いると両方の種N．
ゴノロエエとN．メニンギチジスとを特異的に区別化す
ることができ驚異的である。
本発明によるプローブは少なくとも１４個の長さのヌク
レオチドであり、かつその5′−及び／又は3′−末端に
更にヌクレオチドを、殊にヌクレオチド５個までを有し
ていてよい。ヌクレオチド４０個の全長を上廻るべきで
ない。
レオチドであり、かつその5′−及び／又は3′−末端に
更にヌクレオチドを、殊にヌクレオチド５個までを有し
ていてよい。ヌクレオチド４０個の全長を上廻るべきで
ない。
この際に、付加的なヌクレオチドは任意のヌクレオチド
であつてよいが、これらのヌクレオチドが、相応する蛋
白質中で5′−もしくは3′−末端に存在するヌクレオチ
ドと同じであると優れている。
であつてよいが、これらのヌクレオチドが、相応する蛋
白質中で5′−もしくは3′−末端に存在するヌクレオチ
ドと同じであると優れている。
本発明により特に優れているオリゴヌクレオチドOpa１
＊、Opa２＊、Opa３＊、ＰIII＊、Pil1*、IgA１＊及びIg
A２＊は実施例中の表IIに挙げられている。
＊、Opa２＊、Opa３＊、ＰIII＊、Pil1*、IgA１＊及びIg
A２＊は実施例中の表IIに挙げられている。
更に、本発明によるナイセリア特異的DNAプローブは種
々の形で存在することができる。それは本願のオリゴヌ
クレオチドとして、相補オリゴヌクレオチドでハイブリ
ツド形成して二本鎖DNAフラグメントとして又はナイセ
リア種からのDNAに対する相同性を有していない他の配
列、例えばクローン化用ベクターと連合して存在してよ
い。この際に、例えばM13のような一本鎖ベクター及び
例えばpBR322誘導体のような二本鎖ベクターにおける区
別化の可能性も生じる。しかしながら殊に一本鎖の又は
二本鎖形の個々のオリゴヌクレオチドも相互に結合可能
であり、それ故オリゴヌクレオチドの２種以上がベクタ
ー中に存在する。二本鎖形を使用する場合、実際の検出
反応の前に変性によりプローブを一本鎖に分離する。
々の形で存在することができる。それは本願のオリゴヌ
クレオチドとして、相補オリゴヌクレオチドでハイブリ
ツド形成して二本鎖DNAフラグメントとして又はナイセ
リア種からのDNAに対する相同性を有していない他の配
列、例えばクローン化用ベクターと連合して存在してよ
い。この際に、例えばM13のような一本鎖ベクター及び
例えばpBR322誘導体のような二本鎖ベクターにおける区
別化の可能性も生じる。しかしながら殊に一本鎖の又は
二本鎖形の個々のオリゴヌクレオチドも相互に結合可能
であり、それ故オリゴヌクレオチドの２種以上がベクタ
ー中に存在する。二本鎖形を使用する場合、実際の検出
反応の前に変性によりプローブを一本鎖に分離する。
本発明の他の優れた実施形では、核酸プローブを標識し
ておく。これは原則的にすべての公知の核酸標識法、例
えば放射性標識、即ち放射性同位体の導入あるいは殊に
非放射性標識、例えば修飾ヌクレオチドの導入により可
能である。
ておく。これは原則的にすべての公知の核酸標識法、例
えば放射性標識、即ち放射性同位体の導入あるいは殊に
非放射性標識、例えば修飾ヌクレオチドの導入により可
能である。
本発明の他の目的は、病原性のナイセリア種N．ゴノロ
エエ及びN．メニンギチジスの少なくとも一方を、ハイ
ブリツド形成プローブを用いてハイブリツド化条件下に
かつブリツド形成を検出して前記の種を検出する方法で
あり，これは特異的検出のために本発明によるDNAの１
つを使用することを特徴とする。
エエ及びN．メニンギチジスの少なくとも一方を、ハイ
ブリツド形成プローブを用いてハイブリツド化条件下に
かつブリツド形成を検出して前記の種を検出する方法で
あり，これは特異的検出のために本発明によるDNAの１
つを使用することを特徴とする。
本発明にはDNAプローブは、病原性因子をコードする染
色体ナイセリアDNAの断片とも、またRNA、つまり病原性
因子遺伝子の転写産物であるmRNAのその部分ともハイブ
リツド形成する。それ故、本発明方法では、病原性ナイ
セリア属の種の存在又は不存在を定量的かつ定性的に測
定することができる。更に、本発明方法により両方の病
原性ナイセリア属の種の区別化も可能である。
色体ナイセリアDNAの断片とも、またRNA、つまり病原性
因子遺伝子の転写産物であるmRNAのその部分ともハイブ
リツド形成する。それ故、本発明方法では、病原性ナイ
セリア属の種の存在又は不存在を定量的かつ定性的に測
定することができる。更に、本発明方法により両方の病
原性ナイセリア属の種の区別化も可能である。
両方の病原性の種を検出するに当つた、本発明によりプ
ローブＰIII、Pil１、IgA２及びOpa１並びに有利にプロ
ーブＰIII＊、Pil１＊、IgA２＊及びOpa１を使用し、そ
のうちプローブＰIII、Pil１、ＰIII＊、Pil１＊、IgA
２及びIgA２＊は特に優れている。
ローブＰIII、Pil１、IgA２及びOpa１並びに有利にプロ
ーブＰIII＊、Pil１＊、IgA２＊及びOpa１を使用し、そ
のうちプローブＰIII、Pil１、ＰIII＊、Pil１＊、IgA
２及びIgA２＊は特に優れている。
表IIIから明らかなように、プローブOpa１及びOpa１＊
を用いると非病原性のナイセリア種とのハイブリツド形
成が僅かに生じる。しかしこの両方のプローブも定性試
験に十分に適している。場合により、試験結果が陽性の
場合は他のプローブの１つを用いて再検査を実施し得
る。
を用いると非病原性のナイセリア種とのハイブリツド形
成が僅かに生じる。しかしこの両方のプローブも定性試
験に十分に適している。場合により、試験結果が陽性の
場合は他のプローブの１つを用いて再検査を実施し得
る。
ナイセリア・ゴノロエエだけを検出するかもしくはナイ
セリア・メニンギチジスから区別化するには、本発明で
はプローブIgA１及びOpa２並びに有利にはIgA１＊及びO
pa２＊を使用し、その際にIgA１及びIgA＊は非病原性の
ナイセリア種との相互作用がないので特に優れている。
セリア・メニンギチジスから区別化するには、本発明で
はプローブIgA１及びOpa２並びに有利にはIgA１＊及びO
pa２＊を使用し、その際にIgA１及びIgA＊は非病原性の
ナイセリア種との相互作用がないので特に優れている。
N．メニンギチジスだけを検出するには本発明ではプロ
ーブOpa３及び有利にOpa３＊を使用する。
ーブOpa３及び有利にOpa３＊を使用する。
本発明によるプローブの少なくとも１つとのハイブリツ
ド形成による検出は、核酸をハイブリツド形成を検出す
るための公知の方法により実施することが出来る。DNA
−DNA−ハイブリツド形成はサザン(Southern)により初
めて記載され〔“J.Mol.Biol．”、９８，５０８頁（１
９７５年）〕、その後更に開発された。すべての好適な
核酸ハイブリツド形成バツチ、例えば固相ハイブリツド
形成、溶液中でのハイブリツド形成、サンドイツチ−ハ
イブリツド形成、２成分ハイブリツド形成を適用するこ
とができる。検出はプローブの放射性又は非放射性の標
識により行なう。
ド形成による検出は、核酸をハイブリツド形成を検出す
るための公知の方法により実施することが出来る。DNA
−DNA−ハイブリツド形成はサザン(Southern)により初
めて記載され〔“J.Mol.Biol．”、９８，５０８頁（１
９７５年）〕、その後更に開発された。すべての好適な
核酸ハイブリツド形成バツチ、例えば固相ハイブリツド
形成、溶液中でのハイブリツド形成、サンドイツチ−ハ
イブリツド形成、２成分ハイブリツド形成を適用するこ
とができる。検出はプローブの放射性又は非放射性の標
識により行なう。
本発明により一定のナイセリア特異的DNAプローブを使
用することにより、体液及び塗沫標本中の病原性のナイ
セリア種の存在を、それ故、患者の感染を誘発するその
存在を迅速かつ確実に検出することができる。ここでは
細菌の培養は必要ではなく、また他の細菌と区別化する
ために他の方法で試験する必要もない。本発明方法によ
り近縁の病原性と非病原性のナイセリア種を区別するこ
とができる。
用することにより、体液及び塗沫標本中の病原性のナイ
セリア種の存在を、それ故、患者の感染を誘発するその
存在を迅速かつ確実に検出することができる。ここでは
細菌の培養は必要ではなく、また他の細菌と区別化する
ために他の方法で試験する必要もない。本発明方法によ
り近縁の病原性と非病原性のナイセリア種を区別するこ
とができる。
実施例 次に実施例により本発明を詳説する。
スロツト・ブロツト(Slot-Blot)装置を用いて次のナイ
セリア種の染色体DNAをその都度装置のスロツト上にニ
トロセルロースフイルター上に施した。
セリア種の染色体DNAをその都度装置のスロツト上にニ
トロセルロースフイルター上に施した。
−病原性ナイセリア種： N．ゴノロエエ：７種の異なる分離物 N．メニンギチジス：７種の異なる分離物 −非病原性ナイセリア種： N．ラクタミカ、N．ムコサ(mucosa)、N．スブフラバ(Su
bflava)、N．ペルフラバ(pelflava)、N．シツカ(Sicc
a)、N．エロンガタ(elongata)、N．キネレア(cinere
a)、N．フラバ(flava)、N．デニドリフイカンス(denidr
ificans) −非ナイセリア種： ヘモフイルス・インフルエンゼ(Haemophilusinfluenz
e)、ヘモフイルス・パラインフルエンゼ(Haemophilus p
arainfuenzae)、ストレプトコツクス・サリバリウム(St
reptococcus salivarius)、ストレプトコツクス・ムタ
ンス(Streptococcus mutans)、ストレプトコツクス・ア
ガラクチエ(Streptococcus agalactiae)、スタフイロコ
ツクス・アウレウス(Staphylococus aureus)、スタフイ
ロコツクス・エピデルミジス(Staphylococus epidermid
is)、スタフイロコツクス・サプロフイチクス(Staphylo
cocus saprophyticus)、エシエリヒア・コリ(Escherich
ia coli)。
bflava)、N．ペルフラバ(pelflava)、N．シツカ(Sicc
a)、N．エロンガタ(elongata)、N．キネレア(cinere
a)、N．フラバ(flava)、N．デニドリフイカンス(denidr
ificans) −非ナイセリア種： ヘモフイルス・インフルエンゼ(Haemophilusinfluenz
e)、ヘモフイルス・パラインフルエンゼ(Haemophilus p
arainfuenzae)、ストレプトコツクス・サリバリウム(St
reptococcus salivarius)、ストレプトコツクス・ムタ
ンス(Streptococcus mutans)、ストレプトコツクス・ア
ガラクチエ(Streptococcus agalactiae)、スタフイロコ
ツクス・アウレウス(Staphylococus aureus)、スタフイ
ロコツクス・エピデルミジス(Staphylococus epidermid
is)、スタフイロコツクス・サプロフイチクス(Staphylo
cocus saprophyticus)、エシエリヒア・コリ(Escherich
ia coli)。
染色体DNAの調製はシユテルン(Stern)及びその他〔“Ce
ll”、３７，４４７頁（１９８４年）〕による記録によ
り行なつた。
ll”、３７，４４７頁（１９８４年）〕による記録によ
り行なつた。
このために、フイルターを装置中に張設し、真空にしか
つ個々のプロツト点を２００μの２×緩衝液で加湿し
た（２×緩衝液：２mol／NaCl、５０m mol／トリス
−HCl、pH7.5、１m mol／ＥＤＴＡ）。DNAに５０m mo
l／トリス−HCl、pH7.5及びm mol／EDTAを加えかつ
３分間煮沸して変性した。
つ個々のプロツト点を２００μの２×緩衝液で加湿し
た（２×緩衝液：２mol／NaCl、５０m mol／トリス
−HCl、pH7.5、１m mol／ＥＤＴＡ）。DNAに５０m mo
l／トリス−HCl、pH7.5及びm mol／EDTAを加えかつ
３分間煮沸して変性した。
引続いて、バツチを直ちに氷上に移し、５０μの２×
緩衝液を添加しかつこの溶液をスロツト中にピペツト添
加した。スロットを１００μの１×緩衝液（２×緩衝
液を１：１で水稀釈した）で後洗浄し、フイルターを装
置から取りはずしかつ真空中で乾燥させた。ハイブリツ
ド形成は基本的に既に記載した方法〔Southern著、“J.
Mol.Biol．”、９８，５０３頁（１９７５年）〕により
行なつた。
緩衝液を添加しかつこの溶液をスロツト中にピペツト添
加した。スロットを１００μの１×緩衝液（２×緩衝
液を１：１で水稀釈した）で後洗浄し、フイルターを装
置から取りはずしかつ真空中で乾燥させた。ハイブリツ
ド形成は基本的に既に記載した方法〔Southern著、“J.
Mol.Biol．”、９８，５０３頁（１９７５年）〕により
行なつた。
種特異性を確定するために合成核酸プローブをフイルタ
ー結合した種々のナイセリア種からの染色体DNAに対し
てハイブリツド形成した。このために、ニトロセルロー
スフイルターを２時間１×VHP中４２℃で予備ハイブリ
ツド形成した〔２×VHP：0.1％牛血清アルブミン、0.1
％フイコール(Ficoll)４０００００、0.1％ポリビニル
ブロピリドン、１％グリセリン、1.8mol／NaCl、５０
m mol／Na2HPO4及び１０mg／ｍニシン精液DNA〕。V
HP中に含有されているニシン精液DNAは予め８０℃に加
熱することにより変性した。
ー結合した種々のナイセリア種からの染色体DNAに対し
てハイブリツド形成した。このために、ニトロセルロー
スフイルターを２時間１×VHP中４２℃で予備ハイブリ
ツド形成した〔２×VHP：0.1％牛血清アルブミン、0.1
％フイコール(Ficoll)４０００００、0.1％ポリビニル
ブロピリドン、１％グリセリン、1.8mol／NaCl、５０
m mol／Na2HPO4及び１０mg／ｍニシン精液DNA〕。V
HP中に含有されているニシン精液DNAは予め８０℃に加
熱することにより変性した。
ハイブリツド形成はハイブリツド形成炉中４２℃で行な
つた。予備ハイブリツド形成緩衝液を除去しかつハイブ
リツド形成緩衝液(HP)中の32P標識したオリゴヌクレオ
チドプローブに代えた（HP：１×VHP及び核酸プローブ
のGC含量に応じて０〜３０％のホルムアミドの添加）。
HPは使用前に８０℃に加熱した。少なくとも６時間のハ
イブリツド形成時間後、フイルターを洗浄緩衝液（WP：
3.6m mol／NaCl、１００m mol／Na2HPO4、0.05％SD
S）中で初めに２回室温で、次に２回４２℃で洗浄し
た。洗浄温度はプローブのGC含量に相応して最高６８℃
まで高めた。実際の最高洗浄温度並びにホルムアミド含
量は表IIにも記載した。この表に使用した核酸プローブ
の配列を掲載する。
つた。予備ハイブリツド形成緩衝液を除去しかつハイブ
リツド形成緩衝液(HP)中の32P標識したオリゴヌクレオ
チドプローブに代えた（HP：１×VHP及び核酸プローブ
のGC含量に応じて０〜３０％のホルムアミドの添加）。
HPは使用前に８０℃に加熱した。少なくとも６時間のハ
イブリツド形成時間後、フイルターを洗浄緩衝液（WP：
3.6m mol／NaCl、１００m mol／Na2HPO4、0.05％SD
S）中で初めに２回室温で、次に２回４２℃で洗浄し
た。洗浄温度はプローブのGC含量に相応して最高６８℃
まで高めた。実際の最高洗浄温度並びにホルムアミド含
量は表IIにも記載した。この表に使用した核酸プローブ
の配列を掲載する。
Claims (2)
- 【請求項１】オリゴヌクレオチドOpa１、Opa２、Opa
３、ＰIII、Pil１、IgA１及びIgA２又はこれらに相補的
な配列の群類から選択されたナイセリア特異的DNAプロ
ーブ。 - 【請求項２】病原性のナイセリア種N．ゴノロエエ及び
N．メニンギチジスの少なくとも１種をハイブリツド形
成プローブを用いてハイブリツド形成条件及びハイブリ
ツド形成の検出下に検出する方法において、特異的検出
のためにオリゴヌクレオチドOpa１、Opa２、Opa３、ＰI
II、Pil１、IgA１及びIgA２又はこれらに相補的な配列
の群類から選択されたナイセリア特異的DNAプローブを
使用することを特徴とする、病原性のナイセリア種N．
ゴノロエエ及びN．メニンギチジスの少なくとも１種を
検出する方法。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3920492 | 1989-06-22 | ||
| DE3925613.8 | 1989-08-02 | ||
| DE3925613A DE3925613A1 (de) | 1989-06-22 | 1989-08-02 | Neisseria-spezifische dna-sonde |
| DE3920492.8 | 1989-08-02 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0339098A JPH0339098A (ja) | 1991-02-20 |
| JPH0630638B2 true JPH0630638B2 (ja) | 1994-04-27 |
Family
ID=25882236
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2162997A Expired - Lifetime JPH0630638B2 (ja) | 1989-06-22 | 1990-06-22 | ナイセリア特異的ｄｎａプローブ及び病原性のナイセリア種ｎ．ゴノロエエ及びｎ．メニンギチジスの少なくとも１種を検出する方法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5162199A (ja) |
| EP (1) | EP0404161B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0630638B2 (ja) |
| AT (1) | ATE120498T1 (ja) |
| DE (2) | DE3925613A1 (ja) |
| ES (1) | ES2069626T3 (ja) |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5453355A (en) * | 1990-01-26 | 1995-09-26 | Abbott Laboratories | Oligonucleotides and methods for the detection of Neisseria gonorrhoeae |
| US5256536A (en) * | 1990-11-09 | 1993-10-26 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Nucleotide probe for Neisseria gonrrhoeae |
| US5550040A (en) * | 1993-06-23 | 1996-08-27 | Hoffman-La Roche Inc. | Method, reagents and kits for the detection of Neisseria gonorrhoeae |
| US20020055101A1 (en) * | 1995-09-11 | 2002-05-09 | Michel G. Bergeron | Specific and universal probes and amplification primers to rapidly detect and identify common bacterial pathogens and antibiotic resistance genes from clinical specimens for routine diagnosis in microbiology laboratories |
| CA2222305A1 (en) * | 1995-06-07 | 1996-12-19 | Gen-Probe Incorporated | Nucleic acid probes and amplification oligonucleotides for neisseria species |
| US5747252A (en) * | 1995-06-07 | 1998-05-05 | Gen-Probe Incorporated | Nucleic acid probes and amplification oligonucleotides for Neisseria species |
| US5994066A (en) | 1995-09-11 | 1999-11-30 | Infectio Diagnostic, Inc. | Species-specific and universal DNA probes and amplification primers to rapidly detect and identify common bacterial pathogens and associated antibiotic resistance genes from clinical specimens for routine diagnosis in microbiology laboratories |
| US20100267012A1 (en) | 1997-11-04 | 2010-10-21 | Bergeron Michel G | Highly conserved genes and their use to generate probes and primers for detection of microorganisms |
| US20030049636A1 (en) * | 1999-05-03 | 2003-03-13 | Bergeron Michel G. | Species-specific, genus-specific and universal DNA probes and amplification primers to rapidly detect and identify common bacterial and fungal pathogens and associated antibiotic resistance genes from clinical specimens for diagnosis in microbiology laboratories |
| CA2937907C (en) | 1999-09-28 | 2017-08-22 | Geneohm Sciences Canada Inc. | Nucleic acids, methods and kits for the detection of campylobacter |
| US7807802B2 (en) * | 2002-11-12 | 2010-10-05 | Abbott Lab | Polynucleotides for the amplification and detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae |
| EP1789582B1 (en) * | 2004-08-05 | 2010-10-06 | Jeroen Bosch Ziekenhuis | Neisseria gonorrhoeae detection using the 5' untranslated region of the opa gene |
| WO2011004397A1 (en) | 2009-07-07 | 2011-01-13 | Council Of Scientific & Industrial Research | Nucleic acid primers, probe and method for detection of neisseria gonorrhoeae |
| US10167520B2 (en) | 2011-12-06 | 2019-01-01 | Scot E. Dowd | Universal or broad range assays and multi-tag sample specific diagnostic process using non-optical sequencing |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4358535A (en) * | 1980-12-08 | 1982-11-09 | Board Of Regents Of The University Of Washington | Specific DNA probes in diagnostic microbiology |
| US4446230A (en) * | 1981-10-30 | 1984-05-01 | Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education | Test method for the laboratory diagnosis of Gonorrhea and test strain of neisseria gonorrhoeae |
| US4900659A (en) * | 1986-01-30 | 1990-02-13 | Enzo Biochem, Inc. | Nucleotide sequence composition and method for detection of Neisseria gonorrhoeae and method for screening for a nucleotide sequence that is specific for a genetically distinct group |
| AU7015287A (en) * | 1986-03-19 | 1987-09-24 | Cetus Corporation | Detection of nucleic acid sequence using liquid hybridization method |
| CA1339351C (en) * | 1987-10-15 | 1997-08-26 | Michael S. Urdea | Nucleic acid multimers and amplified nucleic acid hybridization assays using same |
| DE68907772T2 (de) * | 1988-04-15 | 1993-11-04 | Innogenetics Nv | Hybridisationssonden zum nachweis von neisseria-staemme. |
| US5047523A (en) * | 1988-08-02 | 1991-09-10 | Ortho Diagnostic Systems Inc. | Nucleic acid probe for detection of neisseria gonorrhoea |
-
1989
- 1989-08-02 DE DE3925613A patent/DE3925613A1/de not_active Withdrawn
-
1990
- 1990-05-31 US US07/531,226 patent/US5162199A/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-06-21 DE DE59008790T patent/DE59008790D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-06-21 AT AT90111779T patent/ATE120498T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-06-21 EP EP90111779A patent/EP0404161B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-06-21 ES ES90111779T patent/ES2069626T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-06-22 JP JP2162997A patent/JPH0630638B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE59008790D1 (de) | 1995-05-04 |
| DE3925613A1 (de) | 1991-01-03 |
| ATE120498T1 (de) | 1995-04-15 |
| US5162199A (en) | 1992-11-10 |
| EP0404161A3 (de) | 1991-04-10 |
| EP0404161B1 (de) | 1995-03-29 |
| JPH0339098A (ja) | 1991-02-20 |
| EP0404161A2 (de) | 1990-12-27 |
| ES2069626T3 (es) | 1995-05-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ieven et al. | Relevance of nucleic acid amplification techniques for diagnosis of respiratory tract infections in the clinical laboratory | |
| JP3109599B2 (ja) | １６Ｓ及び２３ＳｒＲＮＡ遺伝子間のスペーサー領域から誘導される非ウイルス微生物検出用ハイブリダイゼーションプローブ | |
| Ikryannikova et al. | Misidentification of alpha-hemolytic streptococci by routine tests in clinical practice | |
| Kaltenboeck et al. | Detection and strain differentiation of Chlamydia psittaci mediated by a two-step polymerase chain reaction | |
| EP2267161B1 (en) | Primers, probes and kits for the detection of bacterial species belonging to the genus bartonella | |
| EP0421725B1 (en) | Nucleic acid probes for the detection of Lyme disease spirochetes | |
| JPH0630638B2 (ja) | ナイセリア特異的ｄｎａプローブ及び病原性のナイセリア種ｎ．ゴノロエエ及びｎ．メニンギチジスの少なくとも１種を検出する方法 | |
| EP1012328A2 (en) | Dna-sequence-based diagnosis of mastitis from a milk sample | |
| Van Steenbergen et al. | Genomic DNA fingerprinting by restriction fragment end labeling. | |
| JPH08510386A (ja) | ポリメラーゼ鎖反応によるサルモネラ菌の同定 | |
| JP2010532987A (ja) | 試料において病原体を検出および分析する方法 | |
| Wang et al. | Development of a DNA microarray to identify the Streptococcus pneumoniae serotypes contained in the 23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine and closely related serotypes | |
| JPH05507617A (ja) | 結核菌の特異的検出 | |
| Avila‐Campos et al. | Arbitrarily primed‐polymerase chain reaction for identification and epidemiologic subtyping of oral isolates of Fusobacterium nucleatum | |
| US5173401A (en) | Detection of neisseria gonorrohoeae | |
| CN103160587B (zh) | 10种常见致病军团菌的基因分型芯片及检测用试剂盒 | |
| Arriaga et al. | Detection of Rhodococcus equi by polymerase chain reaction using species-specific nonproprietary primers | |
| Minnick et al. | Identification of Bartonella using PCR; genus-and species-specific primer sets | |
| JPS6188900A (ja) | 媒質中の所定微生物、特にレギオネラの検出用プロ−ブおよび検出方法 | |
| Newcombe et al. | PCR-single-stranded confirmational polymorphism analysis for non-culture-based subtyping of meningococcal strains in clinical specimens | |
| WO2018130692A1 (en) | Rapid antimicrobial susceptibility testing and phylogenetic identification | |
| CN114574603A (zh) | 荚膜型和非荚膜型流感嗜血杆菌的rpa-lfs检测引物探针组合及其应用 | |
| WO2006029014A2 (en) | rRNA OLIGONUCLEOTIDE PROBES FOR SPECIFIC DETECTION OF MYCOBACTERIA AND METHODS OF USE THEREOF | |
| Shivachandra et al. | Molecular diagnostic approaches for haemorrhagic septicaemia [HS]: A Review | |
| Balganesh et al. | Rapid diagnosis of acute pyogenic meningitis by a combined PCR dot-blot assay |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090427 Year of fee payment: 15 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100427 Year of fee payment: 16 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100427 Year of fee payment: 16 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110427 Year of fee payment: 17 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term | ||
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110427 Year of fee payment: 17 |